DD240391A1 - Verfahren zur herstellung von nuklease-haltigen enzymkonzentraten - Google Patents

Abstract

Das vorgeschlagene Verfahren zur Herstellung nukleasehaltiger Enzymkonzentrate hat die Aufgabe, aus Kulturfiltraten von technischen Sekundaermetabolitfermentationen von Streptomyceten als Nebenprodukt nukleasehaltige Enzymkonzentrate zu gewinnen. Diese Aufgabe wird in der Weise geloest, dass die nukleolytischen Bestandteile solcher Filtrate bei wenigstens 0,1%iger Neutralsalzkonzentration unter neutralen p H-Bedingungen und Temperaturen unter 37C an Kaolin adsorbiert und die hierbei entstandenen Nuklease-Kaolin-Adsorbate mechanisch vom Kulturfiltrat abgetrennt werden. Die nukleasehaltigen Enzymkonzentrate werden nach Waschen mit 0,1- bis 0,6%iger phosphatgepufferter Kochsalzloesung (p H-Wert im Neutralbereich) mit neutralen Puffern hoher Ionenstaerke eluiert und schliesslich durch Faellung mit Neutralsalz, vorzugsweise mit Ammoniumsulfat, erhalten. Nach dem Verfahren werden im Enzymkonzentrat jeweils 70% bis 90% der nukleolytischen Gesamtaktivitaet akkumuliert.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nukleasehaltigen Enzymkonzentraten aus Sekundärmetabolitfermentationen. Hinsichtlich des Herstellungsverfahrens liegt das Anwendungsgebiet der Erfindung somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen und in der chemischen Industrie.

Nukleasehaltige Enzymkonzentrate sowie die aus ihnen durch weitere Aufreinigung gewinnbaren Nukleasen finden vielfältige Anwendung in verschiedenen Industriezweigen, beispielsweise in der chemisch-pharmazeutischen Industrie zur Herstellung von Nukleinsäurebasen oder in der Nahrungsgüter- und in der Futtermittelindustrie zur Herstellung von nukleinsäurearmen

Proteinen mikrobieller Herkunft. . .

Nukleasen werden auch als Therapeut!ka gegen eine Reihe von durch Viren hervorgerufenen Krankheiten eingesetzt. Nukleasen werden weiterhin zur Entfernung von Nukleinsäuren bei Enzymherstellungsverfahren verwendet. Schließlich werden Nukleasen in breitem Umfang für mikrobiologische und biochemische Untersuchungen eingesetzt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Nukleasen katalysieren den Abbau von Nukleinsäuren zu Poly-, Oligo- oder Mononukleotiden. Die Enzyme sind substratspezifisch für Ribonukleinsäure (Ribonukleasen) einer- und für Desoxyribonukleinsäure (Desoxyribonukleasen) andererseits.

Von Streptomyceten ist zunächst bekannt, daß generell beide Nuklease-Arten extrazellulär im Kulturmedium auftreten (T.YanagidaandH.Ogawara, J. Antibiotics, 33, [1980] 1206; Y. Nakao, in: Microbial production of nucleic acid related substances.

[Eds.: K.Ogata, S.Kinoshita,T.Tsunoda, K.Aida), pp.87-100, Kodansha Ltd., 1976).

Berichtet worden ist auch über die Herstellung von Nukleasen aus Aspergillus oryzae und aus Penicillum citrinum (M. Fujimoto .

et al., Agric. Biol. Chem.,39 [1975] 1991-2145). In diesen Verfahren werden bekannte Methoden der Enzymgewinnung und -reinigung angewendet (Ausfällung mit Neutralsalzen oder mit wassermischbaren Lösungsmitteln bzw. thermische Einengungsverfahren).

Für die labormäßige Herstellung einer Nuklease aus Staphylococcus aureus werden Phosphocellulose oder kationische Ionenaustauscher eingesetzt (L Moravek et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 61 [1968] 636-643).

Eine halophile Desocyribonuklease wurde im Läbormaßstab aus Micrococcus varians durch Ultrafiltration und anschließende

Sephadex-Filtration erhalten (Patentschrift US 3896000). . .

Nachteilig ist bei den'zuletzt angeführten Verfahren jeweils die Verwendung von spezifischen, teuren Adsorbentien (Affinitätschromatographie), so daß ihr Einsatz im industriellen Maßstab nicht in Erwägung gezogen werden kann. Außerdem werden in diesen technischen Lösungen immer nur bestimmte Einzelenzyme adsorbiert.

Die anderen angeführten Verfahren kommen für eine großvolumige Produktion ebenfalls nicht in Betracht, wenn sie als Nebenverfahren zu technischen Sekundärmetabolitfermentationen, insbesondere zu Antibiotikumfermentationen, betrieben werden sollen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, nukleasehaltige Enzymkonzentrate auf einfache Weise herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfach durchführbares Verfahren zu beschreiben, mit dem in hoher Effektivität nukleasehaltige Enzymkonzentrate als Nebenprodukt technischer Sekundärmetaboiitfermentationen von Streptomyceten gewonnen werden können. " '

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug dadurch gelöst, daß die Kulturfiltrate von technischen Sekundärmetabolitfermentationen, vorzugsweise von technischen Antibiotikumfermentationen, von Streptomyceten zwecks Adsorption unter neutralen pH-Bedingungen mit Kaolin versetzt werden.

in seinerweiteren Ausgestaltung ist das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß den Kulturfiltraten solcher Fermentationen zunächst 1,0g/l bis6,0g/l Neutralsalz, vorzugsweise Kochsalz, zugegeben werden. Die erhaltenen Lösungen, die also eine Neutralsalzkonzentration von wenigstens 1,0 g/l aufweisen, werden bei neutralen pH-Werten (pH 6,5 bis pH 7,5) und bei Temperaturen bis zu 37°C pro Liter mit 60g bis 100g, vorzugsweise 80 g, Kaolin versetzt (Rührdauer: 10 Minuten bis 30 Minuten). . ^:

Die gebildeten Nuklease-Kaolin-Adsorbate werden anschließend mechanisch, vorzugsweise durch Zentrifugation, vom Kulturfiltrat abgetrennt. Unter dieser Verfahrensführung werden in Kulturfiltraten obiger Kennzeichnung vorhandene andere Enzyme, z. Bi Proteasen, Amylasen oder Phosphatasen, nur in geringem Maße an Kaolin gebunden (zu weniger als 10% ihrer Ausgangsmenge).

Wie anhand der mikrobiellen Turimycin- und der mikrobiellen Nourseothficin-Herstellung festgestellt werden korinte, verbleibt bei dieser Verfahrensführung der in den zugrunde liegenden Fermentationen primär interessierende Sekundärmetabolit nahezu vollständig im Kulturfiltrat, aus welchem er unbeeinträchtigt seiner spezifischen Aufarbeitung zugeführt werden kann. Im abschließenden Teil besteht das Verfahren aus einer Wasch-und einer Fällungsstufe. In der Waschstufe werden die Nuklease-Kaolin-Adsorbate mehrfach unter neutralen pH-Bedingungen (pH 6,5 bis pH 7,5) mit phosphatgepufferter Neutralsalzlösung (mit einem Neutralsalzgehalt von 1,0g/l bis 6,0g/l) gewaschen. Als Neutralsalz wird bevorzugt NaCI eingesetzt. In der Fällungsstufe erfolgt auf an sich bekannte Weise die Elution der nukleolytischen Enzymkomplexe mit neutralen Puffern hoher lonenstärke; hierbei werden im Enzym konzentrat 70% bis 90% der nukleolytischen Gesamtaktivität akkumuliert. Durch Fällung mit Neutralsalz, vorzugsweise mit Ammoniumsulfat, werden aus den somit vorliegenden Rohenzymlösungen schließlich die verfahrensgemäßen nukleasehaltigen Enzymkonzentrate gewonnen.

So hergestellte nukleasehaltige Enzymkonzentrate können unter anderem direkt zur Hydrolyse von nukleinsäurehaltigen Produkten pflanzlicher, tierischer bzw. mikrobieller Herkunft verwendet werden, um beispielsweise Futtermittel mit dem gewünschten niedrigen Gehaltan Desoxyribonukleinsäure herzustellen.

Eine gegebenenfalls gewünschte Weiterreinigung der nukleasehaltigen Enzymkonzentrate kann nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise mittels Ionenaustausch- oder Affinitätschromätographie, vorgenommen werden. Die Vorteile der Erfindung werden zusammengefaßt wie folgt gesehen:

— Im vorgeschlagenen Verfahren werden nur leicht zugängliche Einsatzstoffe benötigt.

— Bei hoher Enzymausbeute ermöglicht das vorgeschlagene Verfahren eine effektive Anreicherung der nukleolytischen Aktivität, wobei im Vergleich zu den bisher bekannten technischen Lösungen nur ein geringer Aufwand an Energie und Apparatekapazität erforderlich ist. Die Volumenverringerung, der kostenaufwendigste Schritt bisheriger mikrobieller Nuklease-Herstellungsverfahren, wird nunmehr auf einfache und effektivere Weise möglich.

— Das Verfahren läßt die anschließende Sekundärmetabolit- bzw. Antibiotikumgewinnung aus den ursprünglich bereitgestellten Kulturfiltraten einer technischen Fermentation unbeeinträchtigt.

— Das Verfahren läßt ebenso eine eventuelle Gewinnung von proteasehaltigen Enzymkonzentraten (mit Kieselgel) aus den ursprünglich bereitgestellten Kulturfiltrate einer technischen Fermentation unbeeinträchtigt.

— Die Spezifität der Adsorption an Kaolin führt neben der Konzentrierung der nukleolytischen Aktivität auch zur Abtrennung einer Vielzahl anderer Komponenten; die verfahrensgemäße Adsorptionsstufe stellt also für den Fall, in dem eine weitere Reinigung der nukleasehaltigen Konzentrate angestrebt wird, gleichzeitig den ersten Reinigungsschritt dar.

— Das Verfahren ist bei allen Antibiotikum- bzw. Sekundärmetabolitfermentationen, die im technischen Maßstab unter Einsatz von Streptomyceten durchgeführt werden, anwendbar.

— Aus dem Verfahren ergeben sich keine umweltbelastenden Folgeerscheingungen.

— Reinnukleasen, die aus den verfahrensgemäß hergestellten Enzymkonzentraten gewinnbar sind, erweitern schließlich das Spektrum der zum Nukleinsäure-Abbau einsetzbaren Enzyme.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

In 20 Liter einer separierteni20stündigen Fermentation des Stammes StreptomyceshygroscopicusJAeöSS, dem Bildner des AntibiotikumsTurimycin (vgl. Patentschrift DD 84450 sowie DD 84896), in einem Medium, das aus Sojamehl, Glukose, Stärke und Salzen besteht, werden zunächst 60g NaCI eingerührt, und der pH-Wert wird mit Natronlauge konstant auf pH7,2 gehalten. Dieser Lösung, die 3000 bis 5000 viskosimetrische Desoxyribonuklease-Einheiten enthält, werden 1 600g Kaolin zugesetzt; anschließend wird 20 Minuten gerührt. Das gebildete Nuklease-Kaolin-Adsorbat wird sodann abzentrifugiert und mit 2 bis 4 Litern Phosphatpuffer (Konzentration 1,2g/l; ph7,2), der3,0g/l NaCI enthält, gewaschen.

Zur Elution der Nukleasen wird das Adsorbat anschließend mit 2 Litern phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Konzentration 120,0g/l; pH7,2) gewaschen. Man erhält 70% bis 90% der nukleolytischen Gesamtaktivität. Diese 2 Liter Rohenzymlösung werden am Ende durch.Zusatz von 1 kg Ammoniumsulfat gefällt. .

Die Bestimmung der viskosimetrischen Desoxyribonuklease-Einheiten erfolgte nach der Vorschrift aus J. H. Mowat et al., Anal.Biochem.,11 (1965)327; die Ribonuklease-Aktivität würde durch Radialdiffüsion nach W.-B. Schill et al., Anal. Biochem., 46 (1972) 502-533 bestimmt. . .

Beispiel 2

Eine Kulturlösung, die nach 140 Stunden Fermentation des bekannten Nourseothricin-Bildners Streptomyces noursei Stamm JA3890 erhalten worden ist, wird wie in Beispiel 1 aufgearbeitet.

Im nukleasehaltigen Enzymkonzentrat werden dabei 80% bis 90% der nukleolytischen Gesamtaktivität erhalten.

Claims (6)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von Nuklease-haltigen Enzymkonzentraten aus technischen Sekundärmetabolitfermentationen mit Streptomyceten unter Anwendung der allgemeinen Adsorptionsmethode, gekennzeichnet dadurch, daß das Kulturfiltrat einer solchen Fermentation unter neutralen pH-Bedingungen mit Kaolin als Adsorbens versetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

   — bei einer Neutralsalzkonzentration von wenigstens 1,0 g/l das Kulturfiltrat im pH-Bereich.von pH 6,5 bis pH 7,5 bei Temperaturen bis zu 37⁰C in Konzentrationen von 60g/l bis 100g/l mit Kaolin versetzt wird,

   — hierbei entstandene Nuklease-Kaolin-Adsorbate nach mechanischr Abtrennung von Filtrat mit phosphatgepufferter Neutralsalzlösung (pH 6,5 bis pH 7,5) mehrfach gewaschen und

   — abschließend durch Elution mit neutralen Puffern hoher lonenstärke und durch Fällung mit Neutralsalz die nukleasehaltigen Enzymkonzentrate gewonnen

   werden. ' . .
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Kulturfiltrat bei pH 7,2 mit Kaolin in einer Konzentration von 80 g/l versetzt wird. ,
4. 4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Waschung der Adsorbate phosphatgepufferte Neutralsalzlösung mit einem Salzgehalt von 1,0g/l bis 6,0g/l eingesetzt werden.
5. 5. Verfahren nach Punkt 2 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Neutralsalz in der Waschstufe Kochsalz eingesetzt wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Neutralsalz in der Fällungsstufe Ammoniumsulfat eingesetzt wird.