DE3640382A1 - Neues restriktionsenzym und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Restriktionsenzym sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben. Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit einem neuen Restriktionsenzym, das durch ein Bakterium erzeugt wird, das zu dem Genus Acinetobacter gehört, sowie mit einem Verfahren zur Herstellung desselben.

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die dazu in der Lage sind, spezifische Grundsequenzen an einem Desoxyribronukleinsäure (DNA)-Molekül zu erkennen und die doppelstrangige DNA-Kette an spezifischen Stellen zu spalten. Als Ergebnis der neueren Fortschritte in der Molekulargenetik, der Biochemie sowie verwandter Wissenschaften ist es nunmehr klar, daß DNA der Träger für genetische Informationen ist, wobei Restriktionsendonukleasen in breitem Umfange für verschiedene Zwecke verwendet wurden, beispielsweise für die Klärung von genetischen Krankheiten, für die Massenproduktion von genetischen Materialien auf der Grundlage von genetischem Engineering etc. Umgefähr 100 Arten von Endonukleasen wurden bisher aus vielen Mikroorganismen isoliert, wobei jede durch das Erkennungsvermögen einer spezifischen Grundsequenz und durch das Spaltungsmuster identifiziert worden ist. Eine große Anzahl von Restriktionsenzymen mit verschiedenen enzymatischen Eigenschaften ist jedoch noch für eine erfolgreiche Genmanipulation erforderlich.

Sowie bekannt, wurde bisher noch kein Restriktionsenzym festgestellt, welches dazu in der Lage ist, die Grundsequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nachstehend gezeigt, zu erkennen und an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin bzw. Cyctidin stehen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Restriktionsenzyms, das dazu in der Lage ist, die Grundsequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie vorstehend gezeigt, zu erkennen und sie an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten.

Diese Aufgabe wird durch das neue Restriktionsenzym des Anspruchs 1 gelöst.

Demgemäß besteht ein Merkmal der Erfindung in einem neuen Restriktionsenzym aus folgenden Eigenschaften:
(a) Wirkung und Substratspezifität.
Erkennt die Grundsequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nachstehend gezeigt, und spaltet es an den mit Pfeil markierten Stellen worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin bzw. Cytidin stehen.
(b) Optimaler pH: ungefähr 8,5
(c) stabiler pH-Bereich: 6,0 bis 9,5
(d) optimale Arbeitstemperatur: 60 bis 65°C.

Das neue Restriktionsenzym gemäß vorliegender Erfindung spaltet doppelstrangige λ-DNA an 24 Stellen, pBR322-DNA an einer Stelle und Adenovirus-Typ 2-DNA an 8 Stellen, zeigt jedoch keine Spaltwirkung auf ⌀X174 RF-DNA und SV40-DNA.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des neuen Restriktionsenzyms, welches darin besteht, einen Mikroorganismus, der zu dem Genus Acinetobacter gehört und dazu in der Lage ist, dieses Restriktionsenzym in einem Kulturmedium zu erzeugen, zu züchten und das dabei gebildete Enzym aus der Kulturflüssigkeit zu sammeln.

Alle Stämme von Acinetobacter, die dazu in der Lage sind, das neue Restriktionsenzym zu erzeugen, können für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden. Ein typisches Beispiel ist Acinetobacter calcoaceticus, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-935 hinterlegt worden ist. Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Stammes werden auf Seite 437 von "Bergey′s Mannual of Determinative Bacteriology" (8. Auflage), beschrieben.

Alle Nährmittel, die durch die Stämme assimiliert werden können, welche dazu in der Lage sind, das neue Restriktionsenzym zu erzeugen, können dem Kulturmedium zugesetzt werden. Glucose und andere Substanzen können als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, während Hefeextrakt, Pepton, Brainheart-Infusion sowie andere Materialien als Stickstoffquelle geeignet sind.

Die Ausbeute an dem Restriktionsenzym schwankt in erheblichem Ausmaße von den Züchtungsbedingungen. Gute Ergebnisse werden im allgemeinen bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 40°C und bei einem pH im Bereich von 4 bis 8 erhalten. Der höchste Ausstoß wird nach einem 1- oder 2-tätigen Züchten unter Lüften und Rühren erzielt. Es ist überflüssig darauf hinzuweisen, daß optimale Züchtungsbedingungen von Fall zu Fall in Abhängigkeit von dem verwendeten Stamm und der Zusammensetzung des Kuturmediums ausgewählt werden sollen. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Restriktionsenzym wird hauptsächlich innerhalb der Mikrobenzellen angereichert.

Die Mikrobenzellen, welche das Restriktionsenzym enthalten, können von der Kulturflüssigkeit beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt werden.

Dieses Enzym kann unter Anwendung bekannter Methoden, wie sie in herkömmlicher Weise für die Reinigung von Restriktionsendonukleasen eingesetzt werden, extrahiert und gereinigt werden. Beispielsweise werden die gesammelten Mikrobenzellen in einem geeigneten Puffer verteilt und dann durch Ultraschallbehandlung zerbrochen, um eine Extraktion des Enzyms durch die Pufferlösung zu ermöglichen. Nach einer Entfernung der Zellreste durch Ultrazentrifugieren wird Ammoniumsulfat der überstehenden Flüssigkeit zum Aussalzen zugesetzt und der Niederschlag, der sich abscheidet wird in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und gegen einen Puffer der gleichen Zusammensetzung dialysiert. Das Dialysat wird durch Ionenaustauscherchromatographie, Molekularsiebchromatographie sowie Affinitätschromatographie gereinigt, wobei das erfindungsgemäße Restriktionsenzym erhalten wird. Gemäß einer Ausführungsform wird das Dialysat an Phosphorzellulose P11 (Whatman) eingepackt in eine Säule, adsorbiert und der adsorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösungen eluiert. Die aktiven Fraktionen werden wiederum an einer DEAE-Zellulose DE52 Säulen (Whatman) adsorbiert, worauf sich eine Eluierung mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösungen anschließt. Die gesammelten aktiven Fraktionen werden dann an Heparin/Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals) adsorbiert, worauf sich ein Auswaschen mit 0,7 M Kaliumchloridlösung und eine Eluierung mit 1,0 M Kaliumchloridlösung anschließt. Die aktive Fraktion wird weiter durch Adsorption an einer Aminohexylagarose-Säule (Bethesda Research Laboratories) und Eluierung mit 0 bis 1,5 M Kaliumchloridlösung gereinigt, wobei eine Standardprobe des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms erhalten wird.

Die Aktivität dieses Enzyms wird nach der nachfolgend beschriebenen Methode bestimmt.

Eine Substratlösung mit der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt:
10 mMTris-HCl, pH: 7.5  7 mMMgCl₂  7 mM2-Mercaptoethanol 60 mMNaCl  0.01%Rinderserumalbumin  1.0 µgλ-DNA

Die Substratlösung (50 µl) wird auf 37°C vorerhitzt. Eine Probe des zu testenden Restriktionsenzym wird zugesetzt, damit die enzymatische Reaktion bei dieser Temperatur abläuft, und die Reaktion wird 10 Minuten später durch Zugabe von 5 µl einer Abstopplösung (1% SDS, 50% Glycerin, 0,02% Bromphenolblau) abgestoppt. Die Reaktionsmischung wird dann auf ein 1% Agaroseplattengel aufgebracht und eine Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 10 V/cm während 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die Pufferlösung, die für die Elektrophorese verwendet wird, ist ein 90 mM Trisboratpuffer, der 2,5 mM EDTA (pH: 8,3) enthält.

DNA-Banden können durch UV-Bestrahlung festgestellt werden, wenn 0,5 µg/ml Ethidiumbromid zuvor dem Gel zugesetzt werden. Die Elektrophorese wird als beendet angesehen, wenn die Anzahl und die Intensität der Banden für die DNA-Fragmente sich nicht mehr verändern.

Die Enzymaktivität, die eine vollständige Zersetzung von 1 µg/λ-DNA nach einstündiger Reaktion nach 37°C gewährleisten, wird als 1 Einheit bezeichnet.

Das neue Restriktionsenzym, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, besitzt die nachfolgend beschriebenen Eigenschaften:

(1) Wirkung und Substratspezifität:
Dieses Enzym ist dazu in der Lage, die Grundsequenz an einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nachstehend gezeigt, zu erkennen und es an den mit Pfeil markierten Stellen aufzuspalten worin A, T, C und G die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen.

Die Erkennungsgrundsequenz dieses Enzyms wurde wie nachfolgend beschrieben ermittelt.

Das Enzym spaltete Adenovirus-Typ 2 DNA an 8 Stellen, verochte jedoch nicht ⌀X174 RF-DNA und SV40-DNA zu spalten. Ferner spaltet es Dam⁺ λ-DNA und Dam^-λ-DNA an mehr als 20 Stellen, wobei die Anzahl der erhaltenen Fragmente im ersteren um 3 geringer war als im letzteren.

Ferner spaltet das Enzym Dam^-pBR322-DNA an einer Stelle, zeigt jedoch keine Wirkung an Dam⁺pBR322-DNA. Diese Tatsachen legen die Vermutung nahe, daß dieses Enzym dazu in der Lage ist, ein Teil von 5′-GATC-3′- zu erkennen, eine Sequenz, die von E. coli dam Gen erkannt werden kann, und eine Methylierung bei A erfährt. Doppelte Diggerierungstests von Dam^-pBR322 unter Verwendung des Restriktionsenzyms gemäß vorliegender Erfindung zusammen mit Hind III, Sal I, Hinc II und Pst I ergaben jeweils, daß das erfindungsgemäße Enzym eine Stelle nach 1700 bp an dem pBR322-DNA-Molekül erkennt. Die Sequenz GATC in der Nähe von 1700 bp wurde untersucht, wobei die Sequenz TCCGGATC in der Gegend von 1664 bis 1671 bp gefunden wurde. Dies zeigt, daß das erfingungsgemäße Enzym die Sequenz TCCGGA erkennt. Die Anzahl der Sequenzen TCCGGA in Adenovirus-Typ 2 DNA, ≃X174 RF-DNA, SV40- DNA und λ-DNA wurde zu 8, 0, 0 bzw. 24 ermittelt. Dies steht in guter Übereinstimmung mit den vorstehend erhaltenen experimentellen Daten.

Die Spaltungsstellen durch das erfindungsgemäße Restriktionsenzym wurden wie nachstehend beschrieben, ermittelt.

Rückfall-Oligonukleotid d (GTTCCGGAAC), das die Erkennungsstelle durch das erfindungsgemäße Enzym in der Mitte aufweist, wurde nach dem Festphasenverfahren synthetisiert und einem 5′-endständigen Ende mit Polynukleotidkinase und [γ-³²p]-Adenosintriphosphat phosphoryliert. Das auf diese Weise erhaltene ³²P-markierte Molekül wurde dann zur Gewinnung einer doppelstrangigen DNA verschmolzen, die dann mit dem erfindungsgemäßen Enzym deggeriert wurde. Die Reaktionsmischung wurde an einer DEAE-Zellulosedünnschichtplatte (Mashery & Nagel Co.) analysiert, wobei ein markierter Flecken des Trinukleotids (5′-pGTT) festgestellt wurde. Es wurde daher geschlossen, daß dieses Enzym dazu in der Lage ist, die nachfolgend gezeigte Grundsequenz zu erkennen und sie an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten

(2) Optimale Bedingungen für die enzymatische Aktivität:
(a) Optimale Arbeitstemperatur:
Die optimale Arbeitstemperatur dieses Restriktionsenzyms beträgt 60 bis 65°C.
(b) Optimaler pH:
Der optimale pH dieses Restriktionsenzyms beträgt ungefähr 8,5.
(c) KCl- und NaCl-Konzentration:
Die optimale Salzkonzentration für dieses Restriktionsenzym beträgt 150 mM für sowohl KCl als auch NaCl.
(d) Stabilder pH-Bereich:
Der stabile pH-Bereich für dieses Restriktionsenzym beträgt 6,0 bis 9,5.

(3) Molekulargewicht:
300 000 ± 150 000 (durch die Gelfiltrationsmethode mit Sephadex G-200).

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Acinetobacter calcoaceticus (FERM BP-935) wird in 160 l eines Mediums mit der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung bei 32°C während 10 Stunden unter Belüftung und Rühren gezüchtet und die gewachsenen Bakterienzellen (ungefähr 1280 g Feuchtbasis) werden aus der Kulturbrühe (160 l) mit einer gekühlten Zentrifuge gesammelt.
Polypepton10 g Hefeextrakt 5 g Glukose 1 g NaCl 5 g entionisiertes Wasser 1 l pH 7,2

350 g der in der vorstehenden Weise erhaltenen Bakterienzellen werden in 700 ml einer extraktiven Pufferlösung (10 mM Kaliumphosphatpuffer, 10 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7,5) suspendiert, die Suspension wird in einem Ultraschallzerstörungstank zum Aufbrechen der Zellwände behandelt und die erhaltene Mischung wird zentrifugiert (100 000 × g, 1 Stunde) um den Rückstand zu entfernen.

Dem auf diese Weise erhaltenen Extrakt wird Ammoniumsulfat bis zu einer 70%igen Sättigung zugesetzt, der sich abscheidende Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und in einer Pufferlösung A (10 mM Kaliumphosphatpuffer, enthaltend 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin, pH 7,5) aufgelöst, worauf die Lösung über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert wird.

Das Dialysat wird an Phosphorzellulose P11 (Whatman) eingepackt in eine 300 ml-Säule und zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht, adsorbiert. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A wird der absorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösung (lineare Konzentrationsgradientmethode) eluiert. Die Restriktionsenzymaktivität wird in Fraktionen ermittelt, die 0,65 bis 0,70 KCl- Konzentrationen entsprechen.

Diese aktiven Fraktionen werden gesammelt und über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert, das Dialysat wird an DEAE-Zellulose DE52 (Whatman), eingepackt in eine 10 ml-Säule und zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht, absorbiert und der absorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösung (lineare Konzentrationsgradientmethode) eluiert. Die Restriktionsenzymaktivität wird in Fraktionen ermittelt, die 0,20 bis 0,25 KCl- Konzentrationen entsprechen.

Diese aktiven Fraktionen werden gesammelt und gegen die Pufferlösung A dialysiert und das Dialysat wird an Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals), eingepackt in eine 4 ml-Säule und zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht, absorbiert. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A, die 0,7 M Kaliumchlorid enthält, wird der absorbierte Teil mit der Pufferlösung A eluiert, die 1,0 M Kaliumchloridlösung enthält.

Die auf diese Weise erhaltene aktive Fraktion wird wiederum an Aminohexyl-Agarose (Bethesda Research Laboratories), eingefüllt in eine 4 ml-Säule und zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht, absorbiert. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A wird der absorbierte Teil mit 0 bis 1,5 M Kaliumchloridlösungen (lineare Konzentrationsgradientmethode) eluiert. Die Restriktionsenzymaktivität wird in Fraktionen ermittelt, die 0,32 bis 0,65 M Kaliumchloridlösungen entspricht.

Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und durch die Zugabe von Polyethylenglykol konzentriert, worauf eine gleiche Menge Glycerin dem Konzentrat zugesetzt wird, um die fertige Standardprobe des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms zu erhalten.

Diese Standardprobe ist frei von jeder nichtspezifischen DNase oder Phosphatase.

Die vorstehend beschriebene Reinigungsmethode ergibt 3000 Einheiten des Enzyms aus 350 g feuchter Mikrobenzellen.

Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich ist, schafft die Erfindung ein neues Restriktionsenzym mit einer einzigartigen Substratspezifität, die bisher noch nicht bekannt war sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms auf industrielle Weise.

Claims (3)

1. Neues Restriktionsenzym mit folgenden Eigenschaften:
(a) Wirkung und Substratspezifität.
Erkennt die Grundsequenz in einem doppelstrangigen Deoxyribonukleinsäuremolekül, wie nachfolgend gezeigt und spaltet es an den mit Pfeil markierten Stellen (worin A, G, T und C Adenosin, Guanosin, Thymidin bzw. Cytidin bedeuten).
(b) Optimaler pH: ungefähr 8,5
(c) stabiler pH-Bereich: 6,0 bis 9,5
(d) optimale Arbeitstemperatur: 60 bis 65°C.

2. Verfahren zur Herstellung des Restriktionsenzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, der zu dem Genus Acinetobacter gehört und in der Lage ist, das neue Restriktionsenzym in einem Kulturmedium zu erzeugen, gezüchtet und das dabei gebildete Enzym aus der Kulturbrühe gesammelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus, der zu dem Genus Acinetobacter gehört, Acinetobacter calcoaceticus ist.