DE4112563C2

DE4112563C2 -

Info

Publication number: DE4112563C2
Application number: DE4112563A
Authority: DE
Inventors: Katsuhiko Yamamoto; Hiroaki Otsu Shiga Jp Sagawa; Hirokazu Muko Kyoto Jp Kotani; Nobutsugu Matsudo Chiba Jp Hiraoka; Teruya Kusatsu Shiga Jp Nakamura
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-17
Publication date: 1992-08-20
Also published as: DE4112563A1; GB9107589D0; GB2243153B; US5470732A; GB2243153A; JPH044875A; JPH066056B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzymes durch Kultivierung des Stammes Brevibakterium linens FERM BP-2870 (vgl. den Patentanspruch).

Restriktionsenzyme sind Endonucleasen, die in der Lage sind, spezifische Nucleotidsequenzen eines Desoxyribonucleinsäure-Moleküls (DNS) zu erkennen und die doppelsträngige DNS an spezifischen Stellen zu schneiden.

Als ein Ergebnis des Fortschritts der Molekulargene tik, Biochemie und verwandten Wissenschaften ergab sich, daß die DNS den Schlüssel zur Erbsubstanz von Lebewesen darstellt, und seitdem sind Restriktions enzyme ausgiebig als nützliche Enzyme für verschiedene Zwecke eingesetzt worden, wie zur Aufklärung genetisch bedingter Krankheiten und zur Massenproduktion nütz licher Substanzen durch genetische Manipulation. Re striktionsenzyme sind aus einer Vielzahl von Mikro organismen isoliert worden, so sind zur Zeit etwa 150 Enzyme bekannt, die jeweils durch ihr spezifi sches Erkennen einer Nucleotidsequenz und ihr Schnitt muster identifiziert sind. Als ein Restriktionsenzym, das in der Lage ist, folgende Nucleotidsequenz zu erkennen und sie an den durch Pfeile markierten Stel len zu schneiden

(wobei C, T, A und G Cytidin, Thymidin, Adenosin und Guanosin bedeuten), ist das A_VR II bekannt, das von Anabaena variabilis UW (Gene, Vol. 7, 1979, S. 217-270) gebildet wird.

Dieser A_VR II-bildende Mikroorganismus ist eine Alge, die schwer zu kultivieren ist und die A_VR II mit einer sehr geringen Ausbeute produziert; daher ist dieser Mikroorganismus nicht für die industrielle Produktion geeignet.

Demgemäß liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein für die industrielle Produktion geeignetes Ver fahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms be reitzustellen, das in der Lage ist, die gleiche Basen sequenz wie das A_VR II zu erkennen und zu schneiden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem Verfahren des Patentanspruchs gelöst.

Die Erfinder haben einen bestimmten Stamm gefunden, der ein Restriktionsenzym bildet, das in der Lage ist, dieselbe spezifische Nucleotidsequenz wie das A_VRII zu erkennen und zu schneiden und in großen Mengen durch seine Kultivierung hergestellt werden kann, wobei dieser Mikroorganismus kein anderes Restrik tionsenzym als das A_VRII produziert und daher das gebildete Enzym leicht gereinigt werden kann.

Für das erfidnungsgemäße Verfahren wird Brevibakterium linens IAM 1902, aufbewahrt im "Applied Microorganism Laboratory" der Universität zu Tokyo und hinterlegt unter FERM BP-2870 am "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology" verwendet.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kultur medium enthält eine zweckmäßige Kombination von Koh lenstoff- und Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und anderen Nährstoffen, die der verwendete Mikroorga nismus zur Bildung des Restriktionsenzyms assimilieren kann. Sein pH-Wert sollte vorzugsweise im Bereich von 5,0-9,0 liegen. Es können Schüttel-, Rühr- und Be lüftungskulturen eingesetzt werden, aber zur Massen produktion ist die Kultivierung mit Belüftung und Rüh ren bevorzugt. Die Kulturtemperatur sollte in dem Bereich liegen, der die Bildung des Restriktionsenzyms gewähr leistet, ein Bereich von 20-33°C ist jedoch bevor zugt. Die optimale Kultivierungszeit variiert in Abhängigkeit von den angewandten Kulturbedingungen, wobei die Kultivierung solange fortgesetzt werden sollte, bis die Ausbeute des Restriktionsenzyms sein Maximum erreicht.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Restriktionsenzym wird hauptsächlich innerhalb der mikrobiellen Zellen akkumuliert, und die gezüchteten Zellen können beispielsweise durch Zentrifugation von der Kulturlösung abgetrennt werden.

Das gebildete Enzym kann durch Anwendung von für Restrik tionsenzyme bekannte und üblicherweise eingesetzte Ver fahren isoliert und gereinigt werden. Die gewonnenen mikrobiellen Zellen werden in einer Pufferlösung dis pergiert, die Zellwände durch Ultraschallbehandlung auf gebrochen und die akkumulierten Enzyme extrahiert. Nach Entfernung des Rückstandes durch Ultrazentrifugation wird der Extrakt zur Entfernung der Nucleinsäuren mit 1% Streptomycin behandelt und anschließend Ammonium sulfat zur Aussalzung zugesetzt.

Der abgetrennte Niederschlag wird gesammelt, in einem Tris-HCl-Puffer (pH-Wert = 7,5) gelöst und die Lösung gegen dieselbe Pufferlösung dialysiert. Das Dialysat wird dann über Ionenaustauschchromatographie mittels Phosphocellulose und Hydroxylapatit oder über Affini tätschromatographie mittels Heparin-Sepharose gerei nigt, wodurch das Restriktionsenzym erhalten wird.

Die Enzymaktivität wurde durch nachstehende Methode bestimmt.

Es wurde eine Substratlösung der Zusammensetzung ent sprechend folgender Tabelle 1 vorbereitet.

10 mM
Tris - HCl, pH 7,5
7 mM	MgCl₂
7 mM	2-Mercaptoethanol
100 mM	NaCl
1,0 µm	λ-DNA

Diese Lösung (50 µl) wurde auf 37°C vorgewärmt, eine zu testende Probe des Enzyms wurde hinzugegeben. Die Reaktion wurde nach 60 min durch Zugabe von 5 µl einer Stopplösung (enthielt 1% SDS, 50% Glycerin und 0,02% Bromphenolblau) beendet. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein 1%iges Agarose-Flachgel aufgebracht und die Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 10 V/cm über etwa 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die für die Elektrophorese benutzte Pufferlösung war ein 90 mM Tris-Borat Puffer, der 2,5 mM EDTA (pH 8,3) enthielt. Die DNS-Banden können durch UV-Strahlung nachgewiesen werden, wenn vorher dem Gel 0,5 µm/ml Ethidiumbromid zugesetzt wurde. Die Elektrophorese wurde als beendet betrachtet, wenn die Anzahl und In tensität der Banden der DNS-Fragmente sich nicht länger veränderten.

Die Enzymaktivität, die einen vollständigen Abbau von 1 µm λ-DNS nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 37°C bewirkt, wurde als eine Einheit definiert.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Restriktionsenzym hat die nachstehend beschriebenen physikochemischen Eigenschaften.

1) Wirkungsweise und Substratspezifität

Dieses Enzym ist in der Lage, eine Nucleotidsequenz in einem doppelsträngigen DNS-Molekül, wie unten ge zeigt, zu erkennen und sie an den durch Pfeile mar kierten Stellen zu schneiden, es ist daher ein Iso schizomer zu dem bekannten Restriktionsenzym A_VRII.

Die Basensequenz, die von dem Restriktionsenzym die ser Erfindung erkannt wird, wurde durch den Einsatz der Substrate λ-DNS, pBR 322 DNS und ΦX 174 RFI DNS sowie von Adenovirus-2 DNS bestimmt. Das Ergebnis war, daß das Restriktionsenzym die λ-DNS und die Adeno virus-2 DNS an zwei Stellen schnitt, dagegen wurde die pBR 322 DNS und ΦX 174 RFI DNS nicht geschnitten. Zusätzlich wurde dem bekannten Restriktionsenzym A_VRII erlaubt, mit diesen Substraten zu reagieren, wobei das erhaltene Schnittmuster, verglichen mit dem erfindungs gemäß erhaltenen Restriktionsenzym, das gleiche Muster für beide Enzymtypen zeigte. Diese Daten ließen die Schlußfolgerung zu, daß das erfindungsgemäß erhaltene Restriktionsenzym die Nucleotidsequenz 5′-CCTAGG-3′ in DNS-Molekülen erkennt.

Die durch das erfindungsgemäß erhaltene Restriktions enzym geschnittenen Stellen wurden bestimmt durch Gewinnung einer einsträngigen DNS, aus einem Vektor, der durch Einfügung von 5-GCCTAGGC-3′ (eine Nukleotid sequenz, die 5′-CCTAGG-3′ enthält, welche die vom erfindungsgemäß erhaltenen Restriktionsenzym erkannte Sequenz ist) in M13 mp 18 RFI DNS hergestellt ist; ihre Hybridisierung mit 5′GTTTTCCCAGTCACGAC, einem mit ³²P am 5′-Ende markierten Primer; Synthese einer doppelsträngigen Kette eines E. coli DNS Polymerase I Klenow Fragments; Schneiden der so erhaltenen doppel strängigen DNS durch das erfindungsgemäße Restriktions enzym und Messen der Kettenlänge der so gebildeten Fragmente durch Elektrophorese auf einem modifizierten Polyacrylamidgel. Das erhaltene Produkt wurde als Fleck nachgewiesen, der durch das Schneiden an der durch den Pfeil markierten Stelle von

entstanden ist, was zu der Schlußfolgerung führt, daß das erfindungsgemäß erhaltene Enzym die folgende Nucleotidsequenz erkennt und sie an den mit Pfeilen markierten Stellen schneidet.

2) Optimale Bedingungen für die Enzymaktivität a) Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur betrug etwa 37°C.

b) Optimaler pH-Wert

Der optimale pH-Wert lag im Bereich von 7,0 bis 8,5.

c) Salzkonzentration

Die optimale Salzkonzentration lag im Bereich von 50 bis 150 mM NaCl.

d) MgCl₂-Konzentration

Die enzymatische Reaktion des Restriktionsenzyms wurde bei einer MgCl₂-Konzentration im Bereich von 5 mM bis 20 mM aktiviert.

e) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Restriktionsenzyms betrug 159,377 ×10^-21±6,641×10^-21 g (96 000±4000 Daltons), nach Messung mit der Gelfiltration- Methode mit Sephadex G-100, und 69,727×10^-21± 3,320×10^-21 g (42 000±2000 Daltons) nach Elek trophorese mit einem SDS-Polyacrylamidgel. Das zeigt, daß dieses Enzym ein Dimeres ist, das aus zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von jeweils etwa 74,708×10^-21 g (45 000 Daltons) besteht.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung näher.

Beispiel 1

Zwanzig Liter eines Kulturmediums mit der in Tabelle 2 aufgeführten Zusammensetzung wurde in einen 30-Liter Glasfermenter gefüllt und durch das übliche Verfahren sterilisiert.

Glucose\|1 g
Hefeextrakt	5 g
Polypepton	10 g
Natriumchlorid	5 g
Deionisiertes Wasser	1 l
pH-Wert	7,2

500 ml eines Inokulums von Brevibakterium linens IAM 1902 = FERM BP-2870, das aus einer Schüttelkul tur in einem Medium derselben obigen Zusammensetzung bei 30°C über 24 h erhalten wurde, wurde in den Glasfermenter überführt und die Kultivierung bei 30°C über 18 Stunden unter Belüftung (1 vvm) und Rühren (250 U/min) durchgeführt. Die gezüchteten Zellen wurden aus der Nährlösung durch Einsatz einer Tief kühlzentrifuge gewonnen (etwa 114 g Naßgewicht ge züchteter Zellen von 20 l Nährlösung).

72 g der so erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden in 360 ml Pufferlösung A (enthielt 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glyce rin) suspendiert, die Suspension wurde mit einem Ultraschallzerkleinerer zum Brechen der Zellwände behandelt und die erhaltene Mischung zentrifugiert (100 000× g, 1 h), um den Rückstand zu entfernen.

Zu dem so erhaltenen Extrakt (400 ml) wurde 4 g Streptomycin gegeben, die Mischung bei 4°C für eine Stunde stehengelassen und anschließend zentrifugiert (10 000×g, 10 min). Zu dem so erhaltenen Überstand wurde bis zu einer 80%igen Sätti gung Ammoniumsulfat zugegeben, der abgetrennte Nieder schlag durch Zentrifugation gewonnen, in Pufferlösung A, die zusätzlich 0,2 M KCl enthielt, gelöst und die Lö sung über Nacht gegen den gleichen Puffer wie oben dialysiert.

Danach wurde das Dialysat an 100 ml Phosphocellulose adsorbiert, die in einer Säule gepackt war und zuvor mit der Pufferlösung A (0,2 M KCl enthaltend) äquili briert wurde. Nach Waschung mit demselben obigen Puffer wurde der adsorbierte Anteil mit Pufferlösung A, der 0,2-1,0 M KCl enthielt, eluiert (lineare Konzentrationsgradiententechnik). Die so erhaltenen aktiven Fraktionen wurden zusammengemischt, die vereinigte Lösung wurde anschließend an 30 ml Hy droxylapatit adsorbiert, das in einer Säule gepackt war und zuvor mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer äquili briert wurde, und der adsorbierte Anteil mit 10 mM- 500 mM Kaliumphosphatpuffer eluiert (lineare Konzen trationsgradiententechnik). Die so erhaltenen aktiven Fraktionen wurden zusammengemischt, die vereinigte Lösung gegen Pufferlösung A über vier Stunden dialy siert und das Dialysat nochmals an Heparin-Sepharose adsorbiert, das zuvor mit Pufferlösung A äquilibriert wurde. Nach sorgfältiger Waschung mit demselben obigen Puffer wurde der adsorbierte Anteil mit Pufferlösung A, die 0,8 mM KCl enthielt, eluiert und somit die Standardprobe des Restriktionsenzyms hergestellt.

Diese Standardprobe war frei von sämtlichen unspezi fischen DNasen oder Phosphatasen.

Das oben beschriebene Reinigungsverfahren ergab 800 000 Aktivitätseinheiten von 72 g Naßgewicht mikrobieller Zellen.

Aus dieser Beschreibung geht hervor, daß die Erfin dung ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms, das in der Lage ist, dieselbe Basensequenz wie das A_VR II zu erkennen und zu schneiden, bereitstellt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms, das folgende Nucleotidsequenz spezifisch an den durch Pfeile markierten Stellen schneidet, wobei C, T, A und G Cytidin, Thymidin, Adenosin und Guanosin bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium linens BP-2870 züchtet, die Zellen abtrennt und das hauptsächlich inner halb der mikrobiellen Zellen akkumulierte Restrik tionsenzym durch Anwendung von für Restriktionsen zyme bekannte und üblicherweise eingesetzte Ver fahren isoliert und reinigt.