DE4112563A1

DE4112563A1 - Neues restriktionsenzym

Info

Publication number: DE4112563A1
Application number: DE4112563A
Authority: DE
Inventors: Katsuhiko Yamamoto; Hiroaki Sagawa; Hirokazu Kotani; Nobutsugu Hiraoka; Teruya Nakamura
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-17
Publication date: 1991-10-24
Also published as: GB2243153B; US5470732A; JPH044875A; GB2243153A; GB9107589D0; JPH066056B2; DE4112563C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Restriktionsenzym. Insbe sondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzymes durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Art Brevibakterium.

Restriktionsenzyme sind Endonucleasen, die in der Lage sind, spezifische Nucleotidsequenzen eines Desoxyribonucleinsäure-Moleküls (DNS) zu erkennen und die doppelsträngige DNS an spezifischen Stellen zu schneiden.

Als ein Ergebnis des Fortschritts der Molekulargene tik, Biochemie und verwandten Wissenschaften ergab sich, daß die DNS den Schlüssel zur Erbsubstanz von Lebewesen darstellt, und seitdem sind Restriktions enzyme ausgiebig als nützliche Enzyme für verschiedene Zwecke eingesetzt worden, wie zur Aufklärung genetisch bedingter Krankheiten und zur Massenproduktion nütz licher Substanzen durch genetische Manipulation. Re striktionsenzyme sind aus einer Vielzahl von Mikro organismen isoliert worden, so sind zur Zeit etwa 150 Enzyme bekannt, die jeweils durch ihr spezifi sches Erkennen einer Nucleotidsequenz und ihr Schnitt muster identifiziert sind. Als ein Restriktionsenzym, das in der Lage ist, folgende Nucleotidsequenz zu erkennen und sie an den durch Pfeile markierten Stel len zu schneiden

(wobei C, T, A und G Cytidin Thymidin, Adenosin und Guanosin bedeuten), ist das A_VR II bekannt, das von Anabaena variabilis UW (Gene, Vol. 7, 1979, S. 217-270) gebildet wird.

Dieser A_VR II-bildende Mikroorganismus ist eine Alge, die schwer zu kultivieren ist und die A_VR II mit einer sehr geringen Ausbeute produziert; daher ist dieser Mikroorganismus nicht für die industrielle Produktion geeignet.

Demgemäß liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein für die industrielle Produktion geeignetes Ver fahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms be reitzustellen, das in der Lage ist, die gleiche Basen sequenz wie das A_VR II zu erkennen und zu schneiden.

Zusammengefaßt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms, das die Kultivierung eines Mikroorganismus der Art Brevibak terium, der in der Lage ist ein Restriktionsenzym zu bilden, das folgende Nucleotidsequenz an den durch Pfeile markierten Stellen schneidet,

wobei C, T, A und G Cytidin, Thymidin, Adenosin und Guanosin bedeuten, und die Gewinnung dieses Restrik tionsenzyms aus der Kulturlösung, umfaßt.

Die Erfinder haben ein Restriktionsenzym gefunden, das in der Lage ist, dieselbe spezifische Nucleotid sequenz wie das A_VR II zu erkennen und zu schneiden und in großen Mengen durch die Kultivierung eines Mikroorganismus der Art Brevibakterium hergestellt werden kann, wobei dieser Mikroorganismus kein anderes Restriktionsenzym als das A_VR II produziert und da her das gebildete Enzym leicht gereinigt werden kann. Auf der Basis dieser Erkenntnisse wurde diese Erfin dung ausgearbeitet.

Die Erfindung wird nachfolgend eingehender beschrie ben.

Jeder zur Art Brevibakterium gehörende Mikroorganis mus, der in der Lage ist, das Restriktionsenzym zu bil den, kann für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Als Beispiel ist Brevibakterium linens IAM 1902, aufbewahrt im "Applied Microorganism Laboratory" der Universität zu Tokyo und hinterlegt unter FERM BP-2870 am "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology" zu nennen.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kultur medium enthält eine zweckmäßige Kombination von Koh lenstoff- und Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und anderen Nährstoffen, die der verwendete Mikroorga nismus zur Bildung des Restriktionsenzyms assimilieren kann. Sein pH-Wert sollte vorzugsweise im Bereich von 5,0-9,0 liegen. Es können Schüttel-, Rühr- und Be lüftungskulturen eingesetzt werden, aber zur Massen- Produktion ist die Kultivierung mit Belüftung und Rüh ren bevorzugt. Die Kulturtemperatur sollte in dem Be reich liegen, der die Bildung des Restriktionsenzyms gewährleistet, ein Bereich von 20-33°C ist jedoch bevorzugt. Die optimale Kultivierungszeit variiert in Abhängigkeit von den angewandten Kulturbedingungen, wobei die Kultivierung solange fortgesetzt werden sollte, bis die Ausbeute des Restriktionsenzyms sein Maximum erreicht.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Restriktionsenzym wird hauptsächlich innerhalb der mikrobiellen Zellen akkumuliert, und die gezüchteten Zellen können beispielsweise durch Zentrifugation von der Kulturlösung abgetrennt werden.

Das gebildete Enzym kann durch Anwendung von für Restrik tionsenzyme bekannte und üblicherweise eingesetzte Ver fahren isoliert und gereinigt werden. Die gewonnenen mikrobiellen Zellen werden in einer Pufferlösung dis pergiert, die Zellwände durch Ultraschallbehandlung auf gebrochen und die akkumulierten Enzyme extrahiert. Nach Entfernung des Rückstandes durch Ultrazentrifugation wird der Extrakt zur Entfernung der Nucleinsäuren mit 1% Streptomycin behandelt und anschließend Ammonium sulfat zur Aussalzung zugesetzt.

Der abgetrennte Niederschlag wird gesammelt, in einem Tris-HCl-Puffer (pH-Wert = 7,5) gelöst und die Lösung gegen dieselbe Pufferlösung dialysiert. Das Dialysat wird dann über Ionenaustauschchromatographie mittels Phosphocellulose und Hydroxylapatit oder über Affini tätschromatographie mittels Heparin-Sepharose gerei nigt, wodurch das erfindungsgemäße Restriktionsenzym erhalten wird.

Die Enzymaktivität wurde durch nachstehende Methode bestimmt.

Es wurde eine Substratlösung der Zusammensetzung ent sprechend folgender Tabelle 1 vorbereitet.

Tabelle 1

10 mM Tris - HCl, pH 7,5
  7 mM MgCl₂
  7 mM 2-Mercaptoethanol
100 mM NaCl
  1,0 µm λ-DNA (Ein Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.)

Diese Lösung (50 µl) wurde auf 37°C vorgewärmt, eine zu testende Probe des erfindungsgemäßen Enzyms wurde hinzugegeben, um der enzymatischen Reaktion zu erlau ben bei dieser Temperatur abzulaufen. Die Reaktion wurde nach 60 min durch Zugabe von 5 µl einer Stopp lösung (enthielt 1% SDS, 50% Glycerin und 0,02% Bromphenolblau) beendet. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein 1%iges Agarose-Flachgel aufgebracht und die Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 10 V/cm über etwa 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die für die Elektrophorese benutzte Pufferlösung war ein 90 mM Tris-Borat Puffer, der 2,5 mM EDTA (pH 8,3) enthielt. Die DNS-Banden können durch UV-Strahlung nachgewiesen werden, wenn vorher dem Gel 0,5 µm/ml Ethidiumbromid zugesetzt wurde. Die Elektrophorese wurde als beendet betrachtet, wenn die Anzahl und In tensität der Banden der DNS-Fragmente sich nicht länger veränderten.

Die Enzymaktivität, die einen vollständigen Abbau von 1 µm λ-DNS nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 37°C bewirkt, wurde als eine Einheit definiert.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Restriktionsenzym hat die nachstehend beschriebenen physikochemischen Eigenschaften.

1) Wirkungsweise und Substratspezifität

Dieses Enzym ist in der Lage, eine Nucleotidsequenz in einem doppelsträngigen DNS-Molekül, wie unten ge zeigt, zu erkennen und sie an den durch Pfeile mar kierten Stellen zu schneiden, es ist daher ein Iso schizomer zu dem bekannten Restriktionsenzym A_VRII.

Die Basensequenz, die von dem Restriktionsenzym die ser Erfindung erkannt wird, wurde durch den Einsatz der Substrate λ-DNS, pBR 322 DNS und ⌀X 174 RFI DNS (Produkte von Takara Shuzo Co., Ltd.) sowie von Adenovirus-2 DNS (Produkt der "Bethesda Research Laboratories") bestimmt. Das Ergebnis war, daß das erfindungsgemäße Restriktionsenzym die λ-DNS und die Adenovirus-2 DNS an zwei Stellen schnitt, dagegen wurde die pBR 322 DNS und ⌀X 174 RFI DNS nicht ge schnitten. Zusätzlich wurde dem bekannten Restrik tionsenzym A_VRII erlaubt, mit diesen Substraten zu reagieren, wobei das erhaltene Schnittmuster, ver glichen mit dem erfindungsgemäßen Restriktionsenzym, das gleiche Muster für beide Enzymtypen zeigte. Diese Daten ließen die Schlußfolgerung zu, daß das erfin dungsgemäße Restriktionsenzym die Nucleotidsequenz 5′-CCTAGG-3′ in DNS-Molekülen erkennt.

Die durch das erfindungsgemäße Restriktionsenzym ge schnittenen Stellen wurden bestimmt durch Gewinnung einer einsträngigen DNS aus einem Vektor, der durch Einfügung von 5-GCCTAGGC-3′ (eine Nukleotidsequenz, die 5′-CCTAGG-3′ enthält, welche die vom erfindungs gemäßen Restriktionsenzym erkannte Sequenz ist) in M13 mp 18 RFI DNS (ein Produkt der "Takara Shuzo Co., Ltd." hergestellt ist; ihre Hybridisierung mit 5′GTTTTCCCAGTCACGAC, einem mit ³²P am 5′-Ende mar kierten Primer; Synthese einer doppelsträngigen Kette eines E. coli DNS Polymerase I Klenow Frag ments; Schneiden der so erhaltenen doppelsträngigen DNS durch das erfindungsgemäße Restriktionsenzym und Messen der Kettenlänge der so gebildeten Frag mente durch Elektrophorese auf einem modifizierten Polyacrylamidgel. Das erhaltene Produkt wurde als Fleck nachgewiesen, der durch das Schneiden an der durch den Pfeil markierten Stelle von

entstanden ist, was zu der Schlußfolgerung führt, daß das erfindungsgemäße Enzym die folgende Nucleo tidsequenz erkennt und sie an den mit Pfeilen mar kierten Stellen schneidet.

2) Optimale Bedingungen für die Enzymaktivität

a) Optimale Temperatur.
Die optimale Temperatur betrug etwa 37°C,
b) optimaler pH-Wert.
Der optimale pH-Wert lag im Bereich von 7,0 bis 8,5
c) Salzkonzentration.
Die optimale Salzkonzentration lag im Bereich von 50 bis 150 mM NaCl,
d) MgCl₂-Konzentration.
Die enzymatische Reaktion des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms wurde bei einer MgCl₂-Konzen tration im Bereich von 5 mM bis 20 mM aktiviert.
e) Molekulargewicht.
Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Restrik tionsenzyms betrug 159,377 ×10^-21±6,641×10^-21 g (96 000±4000 Daltons), nach Messung mit der Gelfiltration-Methode mit Sephadex G-100, und 69,727×10^-21±3,320×10^-21 g (42 000±2000 Daltons) nach Elektrophorese mit einem SDS-Poly acrylamidgel. Das zeigt, daß dieses Enzym ein Di meres ist, das aus zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von jeweils etwa 74,708×10^-21 g (45 000 Daltons) besteht.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung näher.

Beispiel 1

Zwanzig Liter eines Kulturmediums mit der in Tabelle 2 aufgeführten Zusammensetzung wurde in einen 30-Liter Glasfermenter gefüllt und durch das übliche Verfahren sterilisiert.

Glucose
1 g
Hefeextrakt	5 g
Polypepton	10 g
Natriumchlorid	5 g
Deionisiertes Wasser	1 l
pH-Wert	7,2

500 ml eines Inokulums von Brevibakterium linens IAM 1902 (FERM BP-2870), das aus einer Schüttelkul tur in einem Medium derselben obigen Zusammensetzung bei 30°C über 24 h erhalten wurde, wurde in den Glasfermenter überführt und die Kultivierung bei 30°C über 18 Stunden unter Belüftung (1 vvm) und Rühren (250 U/min) durchgeführt. Die gezüchteten Zellen wurden aus der Nährlösung durch Einsatz einer Tief kühlzentrifuge gewonnen (etwa 114 g Naßgewicht ge züchteter Zellen von 20 l Nährlösung).

72 g der so erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden in 360 ml Pufferlösung A (enthielt 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glyce rin) suspendiert, die Suspension wurde mit einem Ultraschallzerkleinerer zum Brechen der Zellwände behandelt und die erhaltene Mischung zentrifugiert (100 000× g, 1 h),um den Rückstand zu entfernen.

Zu dem so erhaltenen Extrakt (400 ml) wurde 4 g Streptomycin gegeben, die Mischung bei 4°C für eine Stunde stehengelassen und anschließend zentrifugiert (10 000×g, 10 min). Zu dem so erhaltenen Überstand wurde bis zu einer 80%igen Sätti gung Ammoniumsulfat zugegeben, der abgetrennte Nieder schlag durch Zentrifugation gewonnen, in Pufferlösung A, der zusätzlich 0,2 M KCl enthielt, gelöst und die Lö sung über Nacht gegen den gleichen Puffer wie oben dialysiert.

Danach wurde das Dialysat an 100 ml Phosphocellulose (ein Produkt von Whatman Co.) adsorbiert, die in einer Säule gepackt war und zuvor mit der Pufferlösung A (0,2 M KCl enthaltend) äquilibriert wurde. Nach Waschung mit demselben obigen Puffer wurde der adsorbierte An teil mit Pufferlösung A, der 0,2-1,0 M KCl enthielt, eluiert (lineare Konzentrationsgradiententechnik). Die so erhaltenen aktiven Fraktionen wurden zusammenge mischt, die vereinigte Lösung wurde anschließend an 30 ml Hydroxyalpatit ("Bio-rad Laboratories Ltd.") ad sorbiert, das in einer Säule gepackt war und zuvor mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer äquilibriert wurde, und der adsorbierte Anteil mit 10 mM-500 mM Kaliumphosphat puffer eluiert (lineare Konzentrationsgradiententechnik). Die so erhaltenen aktiven Fraktionen wurden zusammenge mischt, die vereinigte Lösung gegen Pufferlösung A über vier Stunden dialysiert und das Dialysat nochmals an Heparin-Sepharose (ein Produkt der "Pharmacia Fine Chemicals Inc.") adsorbiert, das zuvor mit Pufferlö sung A äquilibriert wurde. Nach sorgfältiger Waschung mit demselben obigen Puffer wurde der adsorbierte An teil mit Pufferlösung A, die 0,8 mM KCl enthielt, elu iert und somit die Standardprobe des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms hergestellt.

Diese Standardprobe war frei von sämtlichen unspezi fischen DNasen oder Phosphatasen.

Das oben beschriebene Reinigungsverfahren ergab 800 000 Aktivitätseinheiten von 72 g Naßgewicht mikrobieller Zellen.

Aus dieser Beschreibung geht hervor, daß die Erfin dung ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms, das in der Lage ist, dieselbe Basensequenz wie das A_VR II zu erkennen und zu schneiden, bereitstellt.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines Restriktions enzyms, das die Kultivierung eines Mikroorganis mus der Art Brevibakterium, der in der Lage ist, ein Restriktionsenzym zu bilden, das folgende Nucleotidsequenz spezifisch an den durch Pfeile markierten Stellen schneidet, wobei C, T, A und G Cytidin, Thymidin, Adenosin und Guanosin bedeuten, und die Gewinnung des Restriktionsenzyms, das diese Nucleotidsequenz spezifisch an den durch Pfeile markierten Stellen schneidet, aus der Nährlösung, umfaßt.