DE3631152C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Restriktionsenzym und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Grundsequenz an einem Deoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekül zu erkennen und die doppelstrangige DNA-Ketten an spezifischen Stellen zu spalten. Als Ergebnis neuerer Fortschritte der Molekulargenetik, der Biochemie sowie verwandter Wissenschaften ist es nunmehr erwiesen, daß DNA der Träger für genetische Informationen ist, und Restriktionsendonukleasen wurden in breitem Umfange für verschiedene Zwecke untersucht, beispielsweise zur Klärung von genetischen Krankheiten, bezüglich der Massenerzeugung von genetischen Materialien, die auf einem genetischen Engineering basieren, etc. Ungefähr 100 Arten von Endonukleasen wurden bisher aus vielen Mikroorganismen isoliert und jede durch die spezifische Grundsequenz sowie durch das Spaltungsmuster identifiziert. Eine große Anzahl von Restriktionsenzymen mit verschiedenen enzymatischen Eigenschaften sind für eine erfolgreiche Genmanipulation erforderlich. Es ist jedoch nach bisherigem Wissenstand kein Restriktionsenzym bekannt, das in der Lage ist, die Grundsequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nachfolgend gezeigt, zu erkennen und sie an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten

(worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin beziehungsweise Cytidin stehen).

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Restriktionsenzyms, welches dazu in der Lage ist, die Grundsequenz in der vorstehend erwähnten doppelstrangigen Deoxyribonukleinsäure zu erkennen und sie an den mit Pfeilen markierten Stellen zu spalten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Restriktionsenzym ApaLI gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Dieses Enzym hat folgende Eigenschaften:

• (a) Wirkung und Substratspezifität:
  Erkennt die Grundsequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nachfolgend gezeigt, und spaltet sie an den mit Pfeilen markierten Stellen (worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin beziehungsweise Cytidin stehen).
• (b) Optimaler pH-Bereich: 7,5 bis 8,5
• (c) Stabiler pH-Bereich: 7,0 bis 9,0
• (d) Optimale Temperatur: ungefähr 37°C
• (e) Molekulargewicht: 26 000±8 000 (Gelfiltrationsmethode)

Das erfindungsgemäße Restriktionsenzym ApaLI spaltet doppelstrangige λ-DNA an vier Stellen, und zwar ΦX174 RF an einer Stelle und pBR322 an drei Stellen.

Das erfindungsgemäße Restriktionsenzym ApaLI wird in der Weise hergestellt, daß man Acetobacter pasteurianus FERM BP-877 züchtet und das gebildete Enzym aus der Kulturbrühe isoliert. Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus ist bei dem Fermentation Research Institute (unter der Agency of Industrial Science and Technology) unter der angegebenen Hinterlegungsnummer hinterlegt worden.

Alle Nährmittel, die durch den ApaLI-erzeugenden Stamm assimiliert werden können, können dem Kulturmedium zugesetzt werden. Glukose, Rohrzucker, Maltose, Laktose, Glyzerin, Ethanol, Lactate und verschiedene Fette und Öle oder dergleichen können als Kohlenstoffquelle verwendet werden, während Hefeextrakt, Pepton, entfettete Sojabohnen, Maisquellwasser, Bouillon und andere Materialien als Stickstoffquelle geeignet sind. Minerale und Metallsalze, beispielsweise Phosphate, Kaliumsalze und Magnesiumsalze sowie Vitamine und das Wachstum begünstigende Substanzen können ebenfalls erforderlichenfalls zugesetzt werden.

Die Ausbeute an ApaLI schwankt in erheblichem Ausmaße von den Kulturbedingungen. Die besten Ergebnisse werden im allgemeinen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C sowie bei einem pH im Bereich von 3 bis 8 erhalten. Der höchste Ausstoß wird in 1 bis 3 Tagen bei einem Züchten unter Belüften und Rühren erzielt. Natürlich sollten die optimalen Züchtungsbedingungen von Fall zu Fall ausgewählt werden. ApaLI, das nach erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt wird, reichert sich im Inneren der Mikrobenzellen an.

Die Mikrobenzellen, welche ApaLI enthalten, können von der Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt werden.

Dieses Enzym kann unter Anwendung von Methoden, wie sie im allgemeinen für Restriktionsendonukleasen angewendet werden, extrahiert und gereinigt werden. Die gesammelten Mikrobenzellen werden in einem geeigneten Puffer verteilt und dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, um eine Extraktion des Enzyms durch die Pufferlösung zu ermöglichen. Nach der Entfernung des Rückstands durch Ultrazentrifugieren wird Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit zum Aussalzen zugesetzt und der Niederschlag, der sich abscheidet, wird in einem Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,5) aufgelöst und gegen einen Puffer mit der gleichen Zusammensetzung dialysiert. Das Dialysat wird durch Ionenaustauscherchromatographie, Molekularsiebchromatographie sowie Affinitätschromatographie gereinigt, wobei das erfindungsgemäße Restriktionsenzym erhalten wird. In einem Beispiel wird das Dialysat an DEAE-Zellulose DE52, eingepackt in eine Säule, adsorbiert, worauf sich einen Eluierung mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösungen anschließt. Die gesammelten aktiven Fraktionen werden dann an Affigel blue-Agarose adsorbiert, worauf sich eine Eluierung mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösungen anschließt. Die aktiven Fraktionen werden weiter durch Adsorption an Heparin-Sepharose CL-6B gereinigt und mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösungen eluiert, wobei eine Standardprobe von ApaLI anfällt.

Die Aktivität dieses Enzyms wird nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt.

Eine Substratlösung der in der Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt.

10 mM
Tris-HCL, pH: 7,5
7 mM	MgCL₂
7 mM	2-Merkaptoethanol
50 mM	NaCl
0,01%	Rinderserumalbumin
1,0 µl	λ-DNA

Die Substratlösung (50 µl) wird auf 37°C vorerhitzt, die zu testende ApaLI-Probe wird zugesetzt und die Enzymreaktion bei dieser Temperatur fortschreitengelassen. Die Reaktion wird 10 Minuten später durch Zugabe von 5 µl einer Terminatorlösung (1% SDS, 50% Glyzerin, 0,02% Bromophenol Blau) abgestoppt. Die Reaktionsmischung wird auf ein 1% Agaroseplattengel aufgebracht und eine Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 10 V/cm während 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die verwendete Pufferlösung ist ein 90 mM Trisboratpuffer, der 2,5 mM EDTA (pH 8,3) für die Elektrophorese enthält.

DNA-Bänder können durch UV-Strahlung festgestellt werden, wenn 0,5 µg/ml Ethidiumbromid vor dem Gel zugesetzt wird.

Die Elektrophorese wird als beendet angesehen, wenn die Anzahl und die Intensität der Bänder für die DNA-Fragmente sich nicht mehr verändern.

Die Enzymaktivität, die eine vollständige Zersetzung von 1 µg λ-DNA nach einer einstündigen Reaktion bei 37°C gewährleistet, wurde als eine Einheit definiert.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Restriktionsenzym ApaLI besitzt die nachfolgend beschriebenen Eigenschaften:

(1) Wirkung und Substratspezifität:

Dieses Enzym ist dazu in der Lage, die Grundsequenz eines doppelstrangigen DNA-Moleküls, wie nachfolgend gezeigt, zu erkennen und sie an den mit Pfeilen angegebenen Stellen zu spalten:

Die Erkennungsgrundsequenz an dieses Enzyms ApaLI wurde wie nachfolgend bestimmt:

ApaLI spaltete ΦX174 RF-DNA an einer Stelle und PBR 322-DNA an drei Stellen, ist jedoch nicht in der Lage, SV40-DNA zu spalten. Dies zeigt, daß ApaLI entweder 5′-GTGCAC-3′ oder 5′-TPyCGPuA-3′ an einem DNA-Molekül erkennt und spaltet (worin Py für Thymidin oder Cytidin steht und Pu Adenosin oder Guanosin bedeutet). In einem doppelten Digerierungstest von ΦX174 RF-DNA unter Einsatz von ApaLI und BbeI spaltet das erstere nahezu in der Mitte des längeren Fragments (3429 bp) von BeI-Verdauungsprodukten (Digests). Die erhaltenen zwei Fragmente waren beide kleiner als das kleinere Fragment (1957 bp) von BbeI-Digests von ΦX174 RF-DNA. Aus diesen experimentellen Werten geht hervor, daß ApaLI Φ174 RF-DNA an einer Stelle zwischen den Koordinaten 4483 und 4933 spaltet. Die Sequenz

5′-GTGCAC-3′

existiert tatsächlich in ΦC174 RF-DNA an einer Stelle zwischen den Koordinaten 4779 und 4784 und diese Tatsache steht in Übereinstimmung mit dem vorstehend genannten experimentellen Werten.

An pBR322-DNA wurde die gleiche Palindromsequenz wie vorstehend erwähnt an drei Stellen (Koordinaten 2291, 2789 und 4035) gefunden. ApaLI spaltet diese DNA an diesen drei Stellen und liefert drei Fragmente (487 bp, 1246 bp beziehungsweise 2619 bp). Bei der Behandlung dieser drei Fragmente mit HindIII wird nur das größte Fragment (2619 bp) gespalten, wobei zwei kleinere Fragmente erhalten werden, und zwar 357 bp und 2262 bp, wobei die anderen zwei kleinen Fragmente (498 bp, 1246 bp) ungespalten zurückbleiben. Dies zeigt auch, daß ApaLI in der Lage ist, diese Sequenz

5′-GTGCAC-3′

in pBR 322 DNA, wie im Falle mit ΦX174 RF-DNA zu erkennen und zu spalten. Aus den vorstehenden Ergebnissen geht außerdem hervor, daß die andere mögliche Sequenz 5′-TPyCGPuA-3′ nicht durch ApaLi erkannt wird.

Die Stellen der Spaltung durch das erfindungsgemäße Restriktionsenzym ApaLI wurden in der folgenden Weise bestimmt:

ΦX174 RF-DNA wurde mit ApaLI digeriert (verdaut) und an dem 3′-Ende mit 2′,3′-Dideoxyadenosin-(α-³²P)triphosphat und Terminal-Transferase phosphoryliert. Das auf diese Weise erhaltene ³²P-markierte Molekül wird dann mit XmnI digeriert, wobei zwei markierte DNA-Fragmente, und zwar 338 bp und 636 bp, erhalten wurden, die nach der Methode von Maxam und Gilbert sequenziert wurden. Daraus wurde klar, daß das Fragment von 338 bp eine Sequenz 3′-GAAA-TACGC an dem 3′-Ende besitzt und das Fragment von 636 bp eine Sequenz von 3′-GGCGTACCT an dem 3′-Ende aufweist. Dies Ergebnis kann bezüglich der Grundfrequenz von ΦX174 RF-DNA, wie nachfolgend gezeigt, interpretiert werden, woraus hervorgeht, daß ΦX174 RF-DNA an den mit Pfeil markierten Stellen gespalten worden ist

Daraus geht hervor, daß dieses Enzym dazu in der Lage ist, die Grundsequenz, wie nachfolgend gezeigt, zu erkennen und sie an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten

(2) Optimale Bedingungen für die Enzymaktivität

• a) Optimale Temperatur
  Die optimale Temperatur für ApaLI ist ungefähr 37°C.
• b) Optimaler pH
  Der optimale pH von ApaLI ist im Bereich von 7,5 bis 8,5.
• c) Salzkonzentration
  Die optimale Salzkonzentration von ApaLI liegt im Bereich von 40 bis 50 mM, die relative Aktivität ist 75% für 0 mM und 50% für 100 mM NaCl.
• d) Stabiler pH-Bereich
  Der stabile pH-Bereich von ApaLI beträgt 7,0 bis 9,0.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Acetobactor pasteurianus FERM BP-877 wird in 160 Litern eines Mediums mit der in der Tabelle 2 bezeichneten Zusammensetzung bei 26°C während 19 Stunden unter Belüften und Rühren gezüchtet und die gewachsenen Zellen (ungefähr 280 g, Naßbasis) werden aus der Kulturbrühe in einer Menge von 160 Litern mittels einer gekühlten Zentrifuge gesammelt.

Polypepton|5 g
Hefeextrakt	5 g
Glucose	5 g
Glyzerin	15 g
Entionisiertes Wasser	1 l
pH	6,8

100 Gramm der vorstehend erhaltenen Bakterienzellen werden in 200 ml einer extraktiven Pufferlösung (50 mM Tris-HCL, 10 mM 2-Merkaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,5) suspendiert, die Suspension wird in einer Ultraschallzerstoßvorrichtung zum Zerbrechen der Zellwände behandelt und die erhaltene Mischung wird zur Entfernung des Rückstands zentrifugiert (100 000 × g, 1 Stunde).

Der dabei erhaltene Extrakt wird mit einer 20%igen wäßrigen Lösung von Streptomycinsulfat bis zu einer Endkonzentration von 2% zersetzt. Die Mischung wird bei 30 Minuten gerührt und zentrifugiert, wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird, die frei von Nukleinsäure ist. Ammoniumsulfat wird dieser überstehenden Flüssigkeit bis zu einer 70%igen Sättigung zugesetzt. Der Niederschlag, der sich abscheidet, wird durch Zentrifugieren gesammelt und in einer Pufferlösung A (10 mM Kaliumphosphatpuffer, der 10 mM 2-Merkaptoethanol, 1 mM EDTA und 5% Glyzerin enthält, pH 7,5) aufgelöst, und die Lösung wird über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert.

Das Dialysat wird dann an DEAE-Zellulose DE52, eingepackt in eine 35 × 100 mm-Säule adsorbiert, wobei die Säure zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A wird der adsorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösungen (Methode des linearen Konzentrationsgradienten) eluiert. Die ApaLI-Aktivität wird in Fraktionen entdeckt, die einer 0,18 bis 0,38 M KC1-Konzentration entsprechen.

Dann werden diese Fraktionen gesammelt und über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert und das Dialysat wird an einer Affigel blue-Agarosesäure, gebracht worden ist, adsorbiert. Die Säule wird dann mit der Pufferlösung A gewaschen und den Pufferlösungen A mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 1,0 M Kaliumchlorid eluiert. Die ApaLI-Aktivität wird in den Fraktionen ermittelt, die 0,14 bis 0,32 M KCal entsprechen.

Diese aktiven Fraktionen werden gesammelt und über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert, das Dialysat wird an Heparin-Sepharose Cl-6B, eingepackt in eine 15 × 60 mm-Säule, die zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht worden ist, adsorbiert und der adsorbierte Teil wird mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösung (Methode des linearen Konzentrationsgradienten) eluiert. Die ApaLI-Aktivität wird in Fraktionen ermittelt, die einer 0,13 bis 0,34 KCl-Konzentration entsprechen. Die Aktivfraktionen werden gesammelt und gegen die Pufferlösung A dialysiert, die 50% Glyzerin enthält, bis das Volumen halbiert worden ist, wobei die fertige Standardprobe von ApaLI erhalten wird. Diese Standardprobe ist frei von jeder nichtspezifischen DN-ase oder Phosphatase.

Die vorstehend beschriebene Reinigungsmethode ergibt 39 000 Einheiten ApaLI aus 100 g feuchten Mikrobenzellen. Die relative Aktivität ist um einen Faktor 50 mit einer Ausbeute von 2% erhöht.

Wie aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht, schafft die Erfindung ein neues Restriktionssystem ApaLI mit einer einzigartigen Substratspezifität, das bisher noch nicht bekannt war, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben in industriellem Maßstab.

Claims (2)

1. Restriktionsenzym ApaLI mit folgenden Eigenschaften:

• (a) Wirkung und Substratspezifität:
  Erkennt die Grundsequenz in einem doppelstrangigen Desoxyribonukleinsäuremolekül, wie nachfolgend gezeigt, und spaltet sie an den mit Pfeilen markierten Stellen (worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin beziehungsweise Cytidin stehen).
• (b) Optimaler pH-Bereich: 7,5 bis 8,5
• (c) Stabiler pH-Bereich: 7,0 bis 9,0
• (d) Optimale Temperatur: ungefähr 37°C
• (e) Molekulargewicht: 26 000 ± 8 000 Gelfiltrationsmethode

2. Verfahren zur Herstellung des Restriktionsenzyms ApaLI des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Acetobacter pasteurianus FERM BP-877 züchtet und das gebildete Enzym aus der Kulturbrühe isoliert.