DE3887656T2

DE3887656T2 - Lipasegen.

Info

Publication number: DE3887656T2
Application number: DE19883887656
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Aoyama; Satoshi Inouye; Naoyuki Yoshida
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1987-12-03
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2008-11-19
Also published as: EP0318775A2; DE3887656D1; EP0318775A3; EP0318775B1

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Anordnung, die eine Lipase mit Ursprung aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas codiert, eine rekombinante DNA, die die DNA-Anordnung enthält, und sie enthaltende Escherichia coli und weiterhin ein Verfahren zur Produktion der Lipase.
Lipasen wurden als Lipid-hydrolysierende Enzyme, für die Öl- und Fettverarbeitung, in der Medizin zur klinischen Diagnose, als Detergentien, Verdauungshilfsmittel, etc. verwendet. Ferner sind sie seit den vergangenen Jahren wichtige Enzyme, die die Esterhydrolyse, Estersynthese oder Esterkonversion bei der Produktion chemischer Produkte, insbesondere optisch aktiver Verbindungen, zu katalysieren.
Ferner ist bekannt, daß Bakterien der Gattung Pseudomonas Lipasen produzieren, die als Katalysator für die Esterhydrolyse, Estersynthese oder Esterkonversion nützlich sind (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. Sho 62- 166,898/1987).
Die spezifische Besonderheit der Lipasen, die von den Bakterien der Gattung Pseudomonas produziert werden, ist hinsichtlich der kommerziellen Verwertung nützlich, aber um diese Aufgabe zu lösen ist eine stärkere Substratspezifität (einschließlich sterischer Spezifität) wünschenswert.
Da die Primärstruktur und die Strukturen höherer Ordnung davon unbekannt sind, war es jedoch unmöglich, Lipasen mit einer bevorzugten Aktivität zu erhalten, außer die Verbesserung beruhte auf einem Verfahren von niedriger Effizienz, wie der Durchführung eines großen Screenings, der Durchführung einer Vielzahl von Mutationsbehandlungen, etc.
Da Lipasen durch Expression üblicherweise eines Strukturgens, das in der chromosomalen DNA des produzierenden Bakteriums enthalten ist, produziert werden, war es ferner schwierig, die Produktion von Lipasen in einem Arbeitsschritt zu verbessern.
In den vergangenen Jahren wurde es infolge der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technik möglich, Gene in solche mit einer höheren Aktivität durch deren Isolierung umzuwandeln oder die Nucleotidanordnung umzuwandeln. So wurden Forschungen und Entwicklungen durchgeführt, um kommerziell interessante Proteine zu erzeugen.
Die genannten Erfinder haben ausgedehnte Forschungen durchgeführt, um die vorstehend erwähnten herkömmlichen Verfahren zur Modifikation von Lipasen, die wenig effizient waren, zu verbessern.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Strukturgen einer Lipase, das in dem Chromosom eines Bakteriums der Gattung Pseudomonas vorhanden ist, zu clonieren und dadurch die DNA-Anordnung, die die Lipase codiert, zu bestimmen und eine rekombinante DNA, die eine solche DNA-Anordnung enthält, zu erhalten und ferner unter Verwendung von Escherichia coli, das eine solche rekombinante DNA enthält, eine Lipase mit Ursprung aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas zu erhalten, welche im wesentlichen die gleichen spezifischen Besonderheiten wie die der vorstehend erwähnten Lipase besitzen, wobei die Lipasen für handelsübliche Anwendungen nützlich sind.
Als Ergebnis gelang es den genannten Erfindern, das Strukturgen einer Lipase, das in dem Chromosom des Pseudomonas fragi IFO 12049 Stammes vorhanden ist, zu clonieren, eine DNA-Anordnung, die die Lipase codiert, zu bestimmen und die Lipase mittels Escherichia coli zu produzieren. Dadurch gelangten sie zu der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung besitzt die folgenden Bestandteile (1) bis (8):
(1) eine DNA-Anordnung, codierend eine Lipase mit Ursprung aus dem Bakterium der Gattung Pseudomonas, wobei die Nucleotidsequenz der Lipase die vorliegende Anordnung besitzt:
(2) eine DNA-Anordnung nach Punkt (1), worin das Bakterium der Gattung Pseudoinonas der Pseudomonas fragi IFO 12049 Stamm ist;
(3) eine rekombinante DNA, die in Escherichia coli replizierbar ist, bei der eine DNA-Anordnung, die die Lipase mit Ursprung aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas codiert, oder eine DNA-Anordnung, die ein funktionelles Äquivalent zu dieser Nucleotidanordnung, jeweils nach Punkt (1), codiert, in einen Vektor für Escherichia coli eingebaut ist;
(4) eine rekombinante DNA nach Punkt (3), worin das Bakterium der Gattung Pseudomonas der Pseudomonas fragi IFO 12049 Stamm ist;
(5) eine rekombinante DNA nach Punkt (3), worin der Vektor für Escherichia coli pUC9 ist;
(6) eine rekombinante DNA nach Punkt (3), worin das Bakterium der Gattung Pseudomonas der Pseudomonas fragi IFO 12049 Stamm ist und der Vektor für Escherichia coli pUC9 ist;
(7) ein Escherichia coli, transformiert durch eine rekombinante DNA gemäß Punkt (3);
(8) ein Escherichia coli, transforiniert durch eine rekombinante DNA gemäß Punkt (3), worin das Bakterium der Gattung Pseudomonas Pseudomonas fragi IFO 12049 ist;
(9) ein Escherichia coli, transformiert durch eine rekombinante DNA gemäß Punkt (3), worin der Vektor für Escherichia coli pUC9 ist;
(10) ein Verfahren zur Produktion einer Lipase, bei dem man eine rekombinante DNA gemäß Punkt (3) verwendet;
(11) ein Verfahren zur Produktion einer Lipase, bei dem man einen Escherichia coli gemäß Punkt (7) züchtet;
(12) ein Verfahren zur Produktion einer Lipase, bei dem man einen Escherichia coli gemäß Punkt (7) züchtet, worin das Bakterium der Gattung Pseudomonas Pseudomonas fragi IFO 12049 ist; und
(13) ein Verfahren zur Produktion einer Lipase, bei dem man einen Escherichia coli gemäß Punkt (7) züchtet, wobei der Vektor für Escherichia coli pUC9 ist.
Die Figuren l1bis 5 zeigen jeweils eine erklärende Darstellung zur Erläuterung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung.
Die Figur 1 zeigt die DNA-Anordnung eines Strukturgens der Lipase mit Ursprung aus dem Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049.
Die Figur 2 zeigt die Restriktionsenzymkarte des Plasmids pFL-1. Der Teil-bedeutet ein DNA-Fragment mit Ursprung aus der chromosomalen DNA des Pseudomonas fragi-Stammes IFO 12049.
Die Figur 3 zeigt die jeweiligen insertierten Fragmente der Plasmide pFL-2, pFL-2SC, pFL-2ND, pFL-2AB und pFL-2SM in ein Plasmid pUC9 und vorhandene oder fehlende Bildung von klaren Zonen in einem Tributyrin-Agar-Medium.
Klare Zone "+" zeigt die Bildung einer klaren Zone an.
Die Figur 4 zeigt eine chromosomale DNA-Anordnung (ein Linker ist teilweise in dem Plasmid pUC9 enthalten), die ein Lipasestrukturgen des Pseudomonas fragi-Stammes IFO 12049 eines Plasmids pFL-2 und eine Aminosäureanordnung entsprechend der Lipase-DNA-Anordnung enthält.
Die Figur 5 zeigt den Escherichia coli-Stamm JM 83 (pUC9) (Bahn a) und Stamm JM 83 (pFL-2) (Bahn b), analysiert mit einem Polypeptid in einer 15%igen SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese.
Die Ziffern auf der linken Seite zeigen jeweils das Molekulargewicht (x1000) des Proteinmarkers, der gleichzeitig der Elektrophorese unterworfen wurde.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA wird durch Fragmentieren der chromosomalen DNA eines Bakteriums der Gattung Pseudomonas, das eine Lipase produziert, Einbau des so erhaltenen Fragments in einen Plasmidvektor vom Multicopy- Typ, der das Fragment in Escherichia coli repliziert, und Auswahl derjenigen rekombinanten DNA, die ein Lipasestrukturgen enthält, unter den so erhaltenen rekombinanten DNAs, erhalten.
Die chromosomale DNA des Bakteriums der Gattung Pseudomonas wird hergestellt, indem man den bakteriellen Körper des Bakteriums der Gattung Pseudomonas, der mit Lysozym behandelt worden war, einer lytischen Reaktion mit einein proteolytischen Enzym in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) unterwirft, anschließend die so erhaltene lysierte Substanz mit Phenol extrahiert, um das Protein zu entfernen, und die DNA mit Ethanol fällt.
Die Fragmentierung der chromosomalen DNA wird mit einer Endonuclease ohne Basenspezifität durchgeführt.
Unter Verwendung von Sau 3A1 zur Fragmentierung der chromosomalen Pseudomonas DNA und unter Verwendung von pUC9 (J. Viera und J. Messing, Gene. 19, 259 (1982)) als Escherichia coli-Plasmidvektor ist es möglich, das chromosomale DNA-Fragment in die Bam H1-Spaltstelle als Clonierungsstelle einzuschleusen.
Hier wird pUC9 als DNA-einschleusender Vektor für Escherichia coli verwendet, aber bei der vorliegenden Erfindung kann jede Art von Vektor verwendet werden, sofern er in Escherichia coli repliziert werden kann und einen geeigneten selektiven Marker besitzt und die Expression eines fremden Gens in seiner Art davon erwartet werden kann. Beispielsweise können pUC8, pUC18, pUC19, etc. verwendet werden.
Das chromosomale DNA-Fragment des Bakteriums der Gattung Pseudomonas, das mit einem Restriktionsenzym gespalten wurde, wird elektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt und durch Anf ärben mit Ethidiumbromid unter UV- Strahlen sichtbar gemacht, und das so erhaltene DNA-Fragment mit der gewünschten Größe wird auf ein DEAE-Cellulosepapier adsorbiert. Die adsorbierte Substanz wird mit einer 1 M NaCl-Lösung abgelöst und durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen.
Die Einschleusung der chromosomalen DNA des Bakteriums der Gattung Pseudomonas in den Plasmidvektor wird durch Spalten der chromosomalen DNA und des Plasmidvektors mittels eines Restriktionsenzyms und Verknüpfung der beiden so erhaltenen Fragmente miteinander erreicht.
Vor der Verknüpfung wird der gespaltene Vektor durch eine bakterielle alkalische Phosphatase dephosphoryliert, um die Selbstverknüpfung zu verhindern. Das chromosomale DNA- Fragment und der Plasmidvektor können mit einer Ligase verknüpft werden.
Escherichia coli wird mit der durch die vorstehenden Stufen erhaltenen rekombinanten DNA transformiert, und Escherichia coli mit einer Lipaseproduktivität wird auf der Basis des Markers des Plasmidvektors und einer Lipaseproduktivität ausgewählt.
Was Escherichia coli betrifft, kann als diejenigen, die einen adäquaten Marker, der durch lnsertion eines spezifischen Clonierungsvektors, wie eines ausgewählten Ampicillin-resistenten Bakteriums, erhalten wurde, besitzen, der JM 83-Stamm (M. Messing, R. Crea und P.H. Seeburg, Nucl. Acid. Res., 2309 (1981)) verwendet werden. Ferner ist es auch möglich, Escherichia colis, wie HB101, LE392, etc., zu verwenden.
Die Transformation wird nach einem gut bekannten kompetenten Zellverfahren durchgeführt, und die Selektion mittels des Plasmidmarkers wird durch Zugabe von Ampicillin (etwa 50 ug/ml) zu einem Medium durchgeführt.
Ferner kann die Wahl bezüglich der Lipaseproduktivität durch Zugabe von Tributyrin (etwa 1%) zu einem Medium durchgeführt werden. D.h. ein solches Phänomen wird verwendet, nämlich, wenn Lipase auf dem Medium gebildet wird, ein Lipid in Fettsäuren zersetzt wird und der emulgierte Zustand des Lipids sich unter Bildung einer kreisförmigen klaren Zone in der Peripherie der so erhaltenen Kolonie bildet (W. Kugiyama, Y. Otani, Y. Hashimoto und Y. Takagi, Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 185 (1986)).
Die rekombinante DNA, die das Strukturgen der Lipase enthält und die nach den vorstehenden Stufen erhalten worden ist, wird durch verschiedene Restriktionsenzyme zersetzt. Die Karte der Restriktionsenzyme wird, basierend auf der Messung gemäß dem Elektrophoreseverfahren, unter Verwendung eines Agarosegels hergestellt. Die Subclonierung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA wird durchgeführt.
D.h., wenn die so erhaltene rekombinante DNA mit einem Restriktionsenzym gespalten wird, werden DNA-Fragmente mit einer geeigneten Größe (größer als die des Strukturgens der erwarteten Lipase, aber nicht sehr viel größer als diese) gewonnen. Diese Fragmente werden erneut in den Plasmidvektor für Escherichia coli eingeschleust, oder die rekombinante DNA wird mit einem Restriktionsenzym gespalten, und ein unnötiger DNA-Teil wird entfernt. Das so erhaltene Material wird wie es ist vereinigt, dann ist es möglich, das Molekulargewicht der rekombinanten DNA zu reduzieren.
Die Figur 2 zeigt ein Beispiel der Restriktionsenzymkarte des Plasmids pFL-1, das das Strukturgen der Lipase des Pseudomonas fragi-Stammes IFO 12049 enthält.
Die Figur 3 zeigt ein Beispiel für vorhandene oder fehlende Bildung einer klaren Zone in einem Tributyrin-Agar- Medium von Escherichia colis mit den jeweiligen Plasmiden pFL-2, pFL-2SC, pFL-2ND, pFL-2AB und pFL-2SM, wobei DNA- Fragmente des Plasmids pFL-1, die mittels verschiedener Restriktionsenzyme Eco RI, Sca I, Nde I, Apa I und Sma I gespalten wurden, darin insertiert sind.
Die Bestimmung der DNA-Region, worin die DNA-Anordnung, die die Lipase mit Ursprung aus dein Bakterium der Gattung Pseudomonas codiert, vorhanden ist, kann nach einem bekannten Verfahren, wie nach dem Didesoxy-Verfahren von Sanger et al. (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463, 1977), hergestellt werden.
Was die Tatsache betrifft, ob die DNA-Anordnung gemäß Figur 1, bezogen auf den vorstehenden Punkt (1), die mit einem Startcodon ATG beginnt und mit einem Stoppcodon TAG endet, tatsächlich der Anordnung der Lipase, die mittels Escherichia coli produziert wurde, die in das Plasmid pFL- 2 transformiert worden war, entspricht oder nicht, wurde die Entsprechung von der Tatsache hergeleitet, daß die Expression eines Polypeptids mit einem Molekulargewicht von ca. 33000, bestimmt gemäß dem vorstehend erwähnten Defektversuch und gemäß SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, bestätigt wurde.
D.h. die DNA-Anordnung des Strukturgens der Lipase des Pseudomonas-Stammes IFO 12049, die in dem Plasmid pFL-2 enthalten ist, wurde von der Tatsache beurteilt, daß die vorstehende Anordnung eine Anordnung enthält, die von dem Restriktionsenzym Nde I erkannt wird, aber keine Anordnung enthält, die von Sca I erkannt wird, und ein offenes Leseraster besitzt, wobei das Molekulargewicht ca. 33000 beträgt.
Die Figur 4 zeigt eine Darstellung einer chromosomalen DNA-Anordnung (die teilweise den Linker des Plasmids pUC9 enthält), einschließlich einer Region, bei der die Lipase des Pseudomonas fragi-Stammes IFO 12049 des Plasmids pFL-2 codiert wird, und eine Aminosäureanordnung, entsprechend der DNA-Anordnung des Lipasegens.
Wenn Escherichia coli mit einer rekombinanten DNA, die ein Strukturgen der Lipase mit Ursprung aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas enthält, transformiert wird, wobei das Molekulargewicht der rekombinanten DNA gemäß dem vorstehend erwähnten Subclonierungsschritt verringert wurde, dann ist es möglich, erneut Escherichia colis zu erhalten, die Lipase produzieren können. Der Bestandteil der Escherichia coli, der die Lipase produzieren kann, wird auf Polypeptidebene mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese abgetrennt. Das so abgetrennte Polypeptid wird mit Coomassie Brillant Blau gefärbt und sichtbar gemacht.
Die Expression des Strukturgens der Lipase mit Ursprung aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas, das in einen Vektor zur Einschleusung von DNA für Escherichia coli eingebaut wurde, in Escherichia coli wird durch Züchten des vorstehenden Escherichia colis und eines Escherichia colis ohne eingebautes heterogenes Strukturgen, das nur den vorstehend erwähnten Vektor zur Einschleusung von DNA für Escherichia coli enthält, Auftrennen der so hergestellten Proben in Polypeptide, ihre Sichtbarmachung und den anschließenden Vergleich der so erhaltenen Materialien bestätigt.
Beispielsweise zeigt Figur 5 eine Ansicht von in der SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennten und sichtbar gemachten Polypeptiden in dem Escherichia coli-Stamm JM 83 (pUC9) ("a" in Figur 5) und Escherichia coli-Stamm JM 83 (pFL-2) ("b" in Figur 5).
Durch Vergleich der vorstehenden zwei Proben wird die Expression des Strukturgens der Lipase aus dem Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049 aus dem Plasmid pFL-2 in Escherichia coli bestätigt.
Um eine möglichst hohe Expressionshöhe des in Escherichia coli eingebauten heterogenen Strukturgens zu gewährleisten, ist es ferner notwendig, das vorstehend erwähnte Gen an ein möglichst effektives Promotor-Operatorsystem zu knüpfen.
Im Falle von Escherichia coli sind verschiedene effektive Promotor-Operatorsysteme bekannt, wie das Lactoseoperon (lac), das Tryptophanoperon (trp), der Promotor des äußeren Membranproteingens (lpp), der ß-Lactamasepromotor, etc.
Diese verschiedenen Verfahren können zur Expression in Escherichia coli in einer Region, worin die erfindungsgemäße Lipase codiert wird, verwendet werden. Um ähnliche Ergebnisse zu erhalten, können ferner verschiedene Replikations-Initiationsstellen, Markergene, effektive Promotoren und andere Strukturelemente kombiniert werden.
Transformierte Escherichia colis, die in den vorstehend erwähnten Fällen erhalten wurden, fallen ebenfalls unter den Bereich der vorliegenden Erfindung.
Ferner können die Reproduktionsbedingungen in Abhängigkeit von den spezifischen Besonderheiten der Escherichia coli- Stämme bestimmt werden, so daß die Lipase mit größter Effizienz reproduziert werden kann.
Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu werden.
Alle in den Beispielen verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältliche Produkte von NIPPON GENE CO., LTD.

Beispiel 1

(Herstellung von chromosomaler DNA des Pseudomonas fragi- Stammes IFO 12049)

Der Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049 wurde in einem L-Medium (enthaltend Bactotrypton (1%), ein Hefepulver (0,5%) und NaCl (0,5%) und eingestellt auf pH 7,2) (200 ml) bei 30ºC über Nacht gezüchtet. Anschließend wurden die so erhaltenen bakteriellen Körper gewonnen. Sie wurden einmal mit 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) und 30 mM NaCl- Lösung (10 ml) gewaschen und in 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) und 1 mM EDTA-2Na-Lösung (12 ml), bezogen auf 100 ml Kulturlösung, suspendiert.
Die so erhaltene Suspension wurde mit Tris-HCl-Pufferlö-Sung, Tris-HCl, EDTA-2Na-Pufferlösung (pH 8,0) und Lysozym (hergestellt von Seikagaku Kogyo Co.) versetzt, so daß ihre Endkonzentrationen 50 mM, 50 mM, 50 mM bzw. 1 mg/ml waren. Danach wurde die so erhaltene Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (25º C) stehengelassen.
Die Lösung wurde mit Proteinase K (Warenzeichen eines Produkts von Merck Co.) in Gegenwart von 0,5% SDS versetzt, so daß eine Konzentration von 100 ug/ml erhalten wurde. Anschließend wurde das Gemisch bei 50ºC 3 Stunden langsam geschüttelt, um die bakteriellen Körper aufzulösen.
Die so erhaltene Probe wurde zweimal mit einer gleichen Menge an Tris-gesättigtem Phenol extrahiert, anschließend wurde der Extrakt mit Ethanol gefällt, und die Präzipitate wurden in 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung(pH 8,0)-1 mM EDTA- Lösung (nachstehend als TE-Lösung abgekürzt) aufgelöst, und die Lösung wurde 2 Tage lang bei 4ºC dialysiert, um eine chromosomale DNA herzustellen.

Beispiel 2

(Clonierung des Lipasegens)

Chromosomale DNA des Pseudomonas fragi-Stammes IFO 12049 (etwa 7 ug) hergestellt gemäß Beispiel 1 wurde mit 1 E Sau 3AI bei 37ºC nach Reaktionen im Verlauf von Zeiten von 5, 15, 25, 35 und 50 Minuten teilweise gespalten. Dann wurden die Reaktionen mit EDTA-2Na-Lösungen gestoppt, wodurch eine Endkonzentration von 20 mM erhalten wurde, und die jeweiligen Reaktionslösungen wurden vermischt.
Die so erhaltene Probe, die durch Vermischen erhalten wurde, wurde einer Elektrophorese mit 40 mA 16 Stunden lang in einem 0,7%igen Agarosegel in 40 mM Tris, 2 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA 2Na bei pH 7-9 unterworfen.
DNA-Fragmente von 2-6 Kb in dem Agarosegel wurden auf einem Whatman-DE81-DEAE-Cellulosepapier (Warenzeichen eines Produkts von Whatman Co.) adsorbiert, und anschließend wurde die adsorbierte Substanz mit 300 ul 1 M NaCl-TE-Lösung herausgelöst. Die so erhaltene herausgelöste Substanz wurde zweimal mit einer gleichen Menge 300 ul l M NaCl-TE- Lösung extrahiert und mit Ethanol im 2,5fachen der Menge des Extrakts versetzt, um es zu fällen und zu gewinnen.
Die Menge der zu dieser Zeit gewonnenen Substanz betrug 0,7 ug. Diese Probe und pUC9 (1,5 ug), erhalten durch Spalten mit Bam HI und anschließende Dephosphorylierung der so erhaltenen Substanz mit 0,6 E alkalischer Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo Co.) bei 50ºC für 3 Stunden wurden mittels T4 DNA-Ligase von 1 ul (147 E/ul) in Gegenwart einer Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) (66 mM), MgCl&sub2; (6,6 mM), ATP (0,066 mM) und Dithiothreit (10 mM) bei 4ºC 16 Stunden lang verknüpft.
Unter Verwendung der so verknüpften DNA-Probe wurde der JM 83-Stamm von ungefähr 2x10&sup9; Bakterienkörpern nach dem kompetenten Zellverfahren transformiert. Anschließend wurde die so erhaltene Substanz 16 Stunden lang auf einem L- Agarmedium, das Ampicillin (Warenzeichen eines Produkts von Meiji Seika Co.) (50 ug/ml), Tributyrin (1%) und X-Gal (0,0002%) enthielt, gezüchtet.
Unter den etwa 1500 transformierten Stämmen, die durch einen Marker des pUC9 Plasmidvektors ausgewählt wurden, befand sich ein Stamm, der eine klare Zone in dem Medium bildete. So wurde dieser Stamm abgetrennt und als Escherichia coli JM 83 (pFL-1) bezeichnet.

Beispiel 3

(Analyse der rekombinanten DNA)

Das Plasmid pFL-1 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und danach wurde eine Restriktionsenzymkarte, basierend auf einer Messung gemäß der Agarosegelelektrophorese, hergestellt. Die Restriktionsenzymkarte von pFL-1 ist in Figur 2 gezeigt.
Basierend auf der Restriktiosenzymkarte des Plasmids pFL-1 wurden die jeweiligen DNA-Fragmente, die durch Spalten mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, in pUC9 subcloniert, um den Escherichia coli-Stamm JM 83 zu transformieren. Anschließend wurde vorhandene oder fehlende Bildung einer klaren Zone in einem 1%-Tributerinhaltigen Medium wie im Falle von Beispiel 2 beobachtet.
Die Figur 3 zeigt vorhandene oder fehlende Bildung einer klaren Zone von Escherichia colis mit den Plasmiden, d.h. pFL-2, pFL-2SC, pFL-2ND, pFL-2AB und pFL-2SM, wobei DNA- Fragmente, erhalten durch Spalten des Plasmids pFL-1 mit verschiedenen Restriktionsenzymen, d.h. Eco RI, Sca I, Nde I, Apa I oder Sma I, in die jeweiligen Plasmide insertiert sind.

Beispiel 4

(Bestimmung der DNA-Anordnung)

Hinsichtlich des Teils mit Ursprung aus der chromosomalen DNA des Pseudomonas fragi-Stamms IFO 12049 vom Plasmid pFL-2 wurde die DNA-Anordnung mit dem M13 Sequencing Kit (Warenzeichen eines Produkts von Takara Shuzo Co.) und dem Deaza Sequencing Kit (Warenzeichen eines Produkts von NIPPON GENE CO., LTD.) bestimmt. Als Ergebnis wurde ein offenes Leseraster, wie in Figur 4 gezeigt, bestätigt.

Beispiel 5

(Expression der rekombinanten DNA in Escherichia coli)

Escherichia coli-Stämme JM 83 (pUC9) und JM 83 (pFL-2) wurden in einer Schüttel-Kulturmaschine bei 37ºC 16 Stunden lang in einem flüssigen L-Medium, das 50 ug/ml Ampicillin (Warenzeichen eines Produkts von Meiji Seika Co.) enthielt, gezüchtet. Die so erhaltenen bakteriellen Körper wurden gewonnen, anschließend wurden die Körper erneut in 0,1 M Phosphorsäurepufferlösung (pH 0,7) suspendiert, und die bakteriellen Körper wurden entsprechend der Kulturlösung (30 ul) mit einer gleichen Menge an 2x Probenpufferlösung (10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 2,3% SDS und 0,0625 M Tris-HCl (pH 6,8)) vermischt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang zum Sieden erhitzt und mit Polypeptiden in der 15%igen SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert.
Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Laeinmli et al. (Laemmli, U.K. Nature 227 680 (1970)) durchgeführt, und die Elektrophorese wurde mit 20 mA durchgeführt, bis das Bromphenol Blau das untere Ende des Gels erreichte.
Die Figur 5 zeigt die Polypeptide des Escherichia coli- Stammes JM 83 (pUC9) (Bahn a) und des Stammes JM 83 (pFL- 2) (Bahn b) gefärbt mit einer Coomassie-Brilliant-Blau-Lösung in einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel. Die Expression (das Polypeptid ist durch einen Pfeil (E) gekennzeichnet) des Lipasestrukturgens aus dem Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049, das in dem Plasmid pFL-2 enthalten ist, in dem Escherichia coli-Stamm JM 83 wurde bestätigt.

Claims

1. DNA-Anordnung, codierend eine Lipase aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas, wobei die Nucleotidseguenz dieser Lipase die folgende Anordnung besitzt:

2. DNA-Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium der Gattung Pseudomonas der Pseudomonas fragi IFO 12049 Stamm ist.

3. Rekombinante DNA die in Escherichia coli replizierbar ist, bei der eine DNA-Anordnung, die die Lipase mit Ursprung aus einem Bakterium der Gattung Pseudomonas codiert, oder eine DNA-Anordnung, die ein funktionelles Äquivalent zu dieser Nucleotidanordnung jeweils nach Anspruch 1 codiert, in einem Vektor für Escherichia coli eingebaut ist.

4. Rekombinante DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium der Gattung Pseudomonas der Pseudomonas fragi IFO 12049 Stamm ist.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor für Escherichia coli der bekannte Vektor pUC9 ist.

6. Rekombinante DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium der Gattung Pseudomonas der Pseudomonas fragi IFO 12049 Stamm ist, und der Vektor für Escherichia coli der genannte pUC9 ist.

7. Escherichia coli, transformiert durch eine rekombinante DNA nach Anspruch 3.

8. Escherichia coli, transformiert durch eine rekombinante DNA nach Anspruch 3, worin das Bakterium der Gattung Pseudomonas Pseudomonas fragi IFO 12049 ist.

9. Escherichia coli, transformiert durch eine rekombinante DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor für Escherichia coli der genannte pUC9 ist.

10. Verfahren zur Produktion einer Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rekombinante DNA nach Anspruch 3 verwendet.

11. Verfahren zur Erzeugung einer Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß man Escherichia ooli nach Anspruch 7 züchtet.

12. Verfahren zur Produktion einer Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß man Escherichia coli nach Anspruch 7, worin das Bakterium der Gattung Pseudomonas Pseudomonas fragi IFO 12049 ist, züchtet.

13. Verfahren zur Produktion einer Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß man Escherichia coli nach Anspruch 7 züchtet, wobei der Vektor für Escherichia coli pUC9 ist.