JPH01148188A

JPH01148188A - リパーゼ構造遺伝子を含む組換え体ｄｎａ，それを含む大腸菌、及びリパーゼの製造法

Info

Publication number: JPH01148188A
Application number: JP30663887A
Authority: JP
Inventors: Shigeyuki Aoyama; 茂之青山; Naoyuki Yoshida; 尚之吉田; Satoshi Inoue; 敏井上
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1987-12-03
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1989-06-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、シュウドモナス属細菌由来のリパーゼの構造
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、それを含む大腸菌、及び
リパーゼの製造法に関する。

［従来の技術とその問題点］リパーゼは脂質を加水分解する酵素として、油脂加工、
臨床診断薬、洗剤、消化薬などに使用されているほか、
近年は化成品、特に光学活性化合物の製造法となるエス
テルの加水分解、エステル合成、或はエステル交換を触
媒する重要な酵素である。

従来、リパーゼは既存の菌を用いるか、或は突然変異処
理によってリパーゼ生産能力を高めた細菌を用いた発酵
法により製造されている。しかし、リパーゼは生産菌の
染色体ＤＮＡ中に含まれる通常１個の構造遺伝子の発現
によって生産されるために、リパーゼの生産を飛躍的に
向上させることは困難であった。

また、シュウドモナス属細菌由来のリパーゼのようにエ
ステルの加水分解、エステル合成、或はエステル交換の
触媒に有用なもの（特開昭８２−ｔｅａ、ａｓｓ）は、
より気質特異性（含立体特異性）が望まれているが、そ
の１次構造及び高次構造が不明なため、膨大なスクリー
ニングを行うか、突然変異処理を多数行う等、効率の悪
い方法に頼って望ましい活性を持つリパーゼを得ていた
。

近年１組換え体ＤＮＡ技術の発達により、遺伝子が単離
され、高度の活性をもつものへの誘導。

或はヌクレオチド配列を変換することが可能になり、商
業上関心のあるタンパク質の創製が検討、或は実施され
ている。

本発明は、上記のような従来の効率の悪いリパーゼの改
質法を改善する手段となる組換え体ＤＮＡ、それに用い
られる大腸菌、および、リパーゼの製造法を提供するも
のである。

［問題点を解決するための手段］本発明（＝発明）は、下記の構成を有する。

（１）シュウドモナス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子
を大腸菌用ベクターに組み込んでなる大腸菌内で複製可
能な組換え体ＤＮＡ。

（２）前記遺伝子は、リパーゼを産生しているシュウド
モナスフラジＩＦＯ１２０４９の染色体中に存在する遺
伝子である前記第（１）項記載の組換え体ＤＮＡ。

（３）組込まれてなる大腸菌用ベクターがＰＦＬ−１若
しくはＰＦＬ−２である前記第（１）項記載の組換え体
’ＤＮＡ。

（０大腸菌用ベクターがｐｕｃ　ｓである前記第（１）
項記載の組換え体ＤＮＡ。

（５）シュウドモナス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子
を大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んでなる大腸菌
内で複製可能な組換え体ＤＮＡを含む大腸菌。

（８）シュウドモナス細菌が、シュウドモナス　フラジ
ＩＦ０１２０４１１１である前記第（５）項記載の大腸
菌。

（７）シュウドモナス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子
を大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ大腸菌内で
複製可能な組換え体ＤＮＡを含む大腸菌を用いることを
特徴とするリパーゼの製造法。

以下１本発明の構成と効果につき説明する。

本発明の組替え体ＤＮＡは、リパーゼを産生じているシ
ュウドモナス属細菌の染色体ＤＮＡを断片化し、該断片
を大腸菌内で複製するマルチコピー型のプラスミドベク
ターに組み込んで得られた組換え体ＤＮＡのうち、リパ
ーゼ構造遺伝子を含むものを選択することによって得ら
れる。

シュウドモナス菌の染色体ＤＮＡは、リゾチーム処理し
たシュウドモナスの菌体をナトリウムドデシルサルフェ
ー）　（ＳＤＳ）存在下で、タンパク質分解酵素によっ
て溶解し、溶解物をフェノール、エーテルで抽出するこ
とによって脱蛋白を行い、エタノール沈殿するこのによ
り調製される。

染色体ＤＮＡの断片化は、塩基配列特異性のないエンド
ヌクレアーゼを用いることによって行われる。シュウド
モナス　フラジ染色体ＤＮＡの断片化には５ａｕａＡＩ
を用い、プラスミドベクターとしてｐＵｃＩを用い、ク
ローニング部位のＢａｍ旧部位に染色体ＤＮＡ断片を導
入することが出来る。

ここで大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターとしてｐＵ（＋１（
Ｊ、Ｖｉｅｒａ　ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎ
ｅ、、１９，２５９（１９８２））を使用しているが、
本発明では大腸菌内で複製することができ、適当な選択
マーカーを持ち、ラクトースオペロンのプロモーター、
オペレーターの支配下に外来ＤＮＡ挿入でき、外来遺伝
子の形質発現を期待できるものであれば種類を問わない
、具体的にはｐｕｃ系はプラスミド等がある。

制限酵素で分解されたシュウドモナス菌の染色体ＤＮＡ
断片は、アガロースゲル電気泳動によって分離（臭化エ
チジウム染色によって紫外縁下視覚化される）され、所
望のサイズのＤＮＡ断片がＤＥＡＥセルロースペーパー
に吸着される。吸着物は、ＩＭｏ＋の塩化ナトリウム水
溶液、１０層Ｎｏｌ　−トリス−ＨＣｌ緩衝液（ＰＨ８
，０）　、　１鵬Ｍ−ＥＤＴＡ溶液で溶出され、フェノ
ール、エーテルで抽出し、エタノール沈殿により回収さ
れる。

プラスミドベクターへのシュウドモナス菌の染色体ＤＮ
Ａの導入は、制限酵素により染色体ＤＮＡおよびプラス
ミドベクターを開裂し、両断片を結合することにより達
成される。

該結合前に開裂されたベクターは、細菌性アルカリフォ
スファターゼ処理により、脱リン酸化され、自己結合を
防ぐ、染色体ＤＮＡ断片とプラスミドベクターとは、リ
ガーゼを用いて結合することができる。

上記工程により得られた組換え体ＤＮＡで大腸菌を形質
転換し、プラスミドベクターのマーカー及びリパーゼの
生産能に基づいて、リパーゼ生産能を有する大腸菌を選
択する。ここで、大腸菌は特定のクローニングベクター
の挿入により与えられる適切なマーカー、例えばアンピ
シリン抵抗菌を選択させるものとしてＪＮ８３株（Ｊ、
Ｎｅａｇｉｎｇ、Ｒ。

Ｃｒｅａ、ａｎｄ　Ｐ、Ｈ，例えばＳｅｅｂｕｒｇ、Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　。

２．３０１１（１１１１８１）　）を用いることが出来
る。更に、ＨＢＩＯＩ、ＬＥ３９２等の大腸菌も使用可
能である。

形質転換は、周知のコンピテントセル法によって行い、
プラスミドベクターのマーカーによる選択は、上記具体
例に従えば、培地に５０１Ｌｇ／ｍｌ程度のアンピシリ
ンを加えることによって行う・まだ、リパーゼの生産能
による選択は、１％程度のトリブチリンを培地に加える
ことにより行うことができる。即ち、培地上にリパーゼ
が生成されると、脂質が分解されて脂肪酸ができ、脂質
の乳化状態が変化してコロニー周辺に円形のクリアゾー
ンが形成されることを利用する（Ｗ、Ｋｕｇｉｙａ■ａ
。

Ｙ、　　０ｔａｎｉ、Ｙ、Ｈａａｂｉｍｏｔｏ、ａｎｄ
　　Ｙ、？ａｋａｇｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈ７ａ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　、１４１，
１８５（１１３８Ｂ））。

前記の工程で得られたリパーゼの構造遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡに対する制限酵素地図を作成し、木組換え体
ＤＮＡのサブクローニングを行う。

即ち、得られた組換え体ＤＮＡを制限酵素で切断し適当
な大きさ（予想されるリパーゼ構造遺伝子より大きいが
、過度に大きくない）のＤＮＡ断片を集め、これを再び
大腸菌用プラスミドベクターに組み込むか１組換え体Ｄ
ＮＡを制限酵素で切断し、不要なりＮＡ部分を除去しそ
のまま再結合することにより、組換え体ＤＮＡの分子量
を小さくすることが出来る。

この組換えＤＮＡを再び前記工程のように大腸菌に挿入
すれば、リパーゼ生産能をもった大腸菌を得ることが出
来る。

以上のようにして、シュウドモナス属細菌のリパーゼ構
造遺伝子を大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ大
腸菌内で複製可能な組換え体ＤＮＡ、およびそれを含有
する大腸菌を得ることが出来る。更に、この大腸菌を培
養することにより、リパーゼを得ることが出来る。

［実施例］更に本発明の説明を実施例により詳細に行うが、本発明
は実施例によって制限を受けるものではない。

実施例において、使用された制限酵素は、すべて日本ジ
ーン輛により市販されているものを用いた。

実施例１（シュウドモナス　フラジＩＦ０１２０４９株染色体０
ＮＡの調製）２００ｍｌ　Ｌ−培地（１％バクトドリプトン０．５％
酵母粉末０．５％塩化ナトリウムｐｎ　７．２に調製）
３０℃で一晩培養し集菌したシュウドモナス　フラジＩ
Ｆ０１２０４１１株を、培養液１００ｍ１に対し、１０
ｍＭ−）リス−）ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）、３０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム溶液１０ｍ１で１回洗浄し、１２１の
１０層に一トリスーＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０）、　ｌ
　ｍＷ−ＩＥＤＴＡ　２Ｎａ溶液に懸濁した。

この懸濁液に終濃度が５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ８，０）、　５０ｍＭ−）リス２Ｎａ　５０ｍＭ
　ＥＤＴＡ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）　１騰ｇ／ｍ
ｌ　リゾチウム（生化学工業社）となるように、それぞ
れ加え、１時間室温（２５℃）に放置した。

この溶液に０．５％ＳＯ９存在下１１００ｕ＃＋１の濃
度となるようプロチンエースＫ（メルク社）を加え、３
時間５０℃でゆるやかに振とうさせ菌体を溶解させた。

この試料を等量のトリス飽和フェノールで２回１等量の
ジエチルエーテルで１回抽出した後、エタノール沈殿さ
せ、沈殿物を１０膳にトリスＨＣＩ緩衝液（ｐＨｓ、ｏ
）−１１Ｎ−ＩＥＤＴＡ溶液（以下ＴＥ）に溶かし、同
溶液中で４℃、２日間透析し、染色体ＤＮＡを調製した
。

実施例２（リパーゼ遺伝子のクローニング）実施例１で調製したシュウドモナス　フ　ラ　ジＩＰ０
１２０４９株の染色体ＤＮＡ約７終ｇを３７℃でそれソ
ｎ　Ｉ　Ｕ　（Ｆ）　５ａｕａＡ　ｌ　テ５分％１５分
、２５分、３５分。

５０分と経時的反応で部分消化し、終濃度２０ｍＭとな
るようＥＩＩＴＡ　２Ｎａ溶液で反応を止めた後、各反
応液を混合した。

この混合した試料を、　ｐＨ７−９で４０■圓トリス２
ｍＭ酢酸ナトリウム、１　ｓＮ　ＨＤＴ轟２Ｎａ中の０
．７％アガロースゲル中で４０腸Ａ　１１１時間電気泳
動した。

アガロースゲル中より２〜６ＫｂのＤＮＡ断片をワット
マンＤＥ８１　ＤＩＥＡ！セルロースペーパー（ワット
マン社）に吸着させ、被吸着物を３００１のｌトＭａｉ
ｌ−ＴＩＥ溶液で溶出させ、被溶出物を等量のトリス飽
和フェノールで２回、等量のジエチルエーテルで１回抽
出し、２．５倍量のエタノールを加え沈殿させ回収した
。

この時回収物は約０．？　終ｇであった。

この試料と、　Ｂａｓ＋旧消化後ｓＯ，１３Ｕのアルカ
リホスファターゼ（宝酒造■）で５０℃、３時間の反応
により脱リン酸したｐａｃｅ　１．５ｐｇとを８８ｍＭ
　）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨｅ、ｏ）　ｅ、ｅ脂阿−
１ｇＣ１２０，０８８鳳トＡＴＰ及び１０■にジチオス
レイトール存在下で、４℃ＩＢ時間１ｕｌ　（１４７Ｕ
／ｕｌ）のＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結した。

この連結したＤＮＡ試料を用い、コンピテントセル法に
より〜２　Ｘ　１０９菌体数のＪＭ８３株を形質転換し
、　５０ｇｇ／ｍｌのビクシリン（明治製某社）、１％
トリブチリン、及び０．０００２％Ｘ−ｇａｌを含むり
。

寒天培地上で１８時間培養させた。

およそ１５００のｐａｃｅプラスミドベクターのマーカ
ーにより選択された形質転換株のうち、１株培地中にク
リアーゾーンを形成する株があったのでこれを分離した
。この菌株を大腸菌ＪＮ８３（ｐＦＬ−１）と名付けた
。

この大腸菌ＪＭ８３（ｐＦＬ−１）を第２図に示す。

実施例３（組換え体ＤＮＡの解析）プラスミドｐＦＬ−１を各種制限酵素により、消化しア
ガロースゲル電気泳動法を用いた測定に基づいて制限酵
素地図を作成した。　ｐＦＬ−１の制限酵素地図を第１
図に示す。

プラスミドｐＦＬ−１の制限酵素地図に基づいて。

各種制限酵素により切断して得た各ＤＮＡ断片をｐｕｃ
ｓにザブクローニングし、大腸菌ＪＮ８３株を形質転換
させ、実施例２と同様にして１％トリブチリンを含む培
地におけるクリアゾーン形成の有無を調べた。

プラスミドｐＦＬ−１をＥｃｏＲＩ消化し分離された約
３．８ＫｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し
たプラスミド１）ＮＡで形質転換させた大腸菌ＪＮ８３
株はクリアゾーンを形成した。この菌株を大腸菌ＪＭ８
３（ＰＦＬ−２）と名付けた。

この大腸菌ＪＮ８３（ｐＦＬ−２）を第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

（第１．２図は、本発明の詳細な説明図である。）第１［ｉ！ＪＡおよびＢは、　ＰＦＬ−１、ｐＦＬ−２
の制限酵素地図を示す図である。Ａ図中の黒塗りの部分がシュードモナスフラジＩＦ０１
２０４９株由来のリパーゼ構造遺伝子を含む染色体ＤＮ
Ａ断片であり、白抜きの部分がベクタープラスミドｐＵ
ｃ９由来の部分である。また、Ｂ図は、　ｐＦＬ−１およびｐＦＬ−２のシュー
ドモナスフラジＩＦ０１２０４９株のリパーゼＰＦＬ−
１およびｐｐＬ−２ｆ）　シュードモナスＩＦ０１２０
４１１株のリパーゼ構造遺伝子を含む或いはその一部を
含む染色体ＤＮＡ挿入部分の詳細制限酵素地図と、ｐＦ
Ｌ−１゜ｐＦＬ−２、ｐＦＬ−２５０、ｐＦＬ−２ＮＤ
　、　ｐＦＬ−２ＡＢ　、　ｐＦＬ−２ＳＮ　、ｐＦＬ
−２ＨＦ、ｐＦＬ−２ＩＣ，ｐＦＬ−２ＳＦ、ｐＦＬ−
２ＡＰの各挿入断片とトリブチリン培地におけるクリア
ゾーン形成の有無を示す。クリアゾーン＋はクリアゾーン形成を示す。第２図は、大腸菌ＪＮｌ１３（ｐＦＬ−１）　、大腸菌
ＪＮ８３（ｐＦＬ−２）及び、対照物トシ大腸菌ＪＭ８
３（ｐＵｃ９）シュードモナスフラジＩＦ０１２０４９
株におけるクリアゾーン形成（リパーゼ活性）の有無を
示す。以　　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュウドモナス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子
を大腸菌用ベクターに組み込んでなる大腸菌内で複製可
能な組換え体ＤＮＡ。
（２）前記遺伝子は、リパーゼを産生しているシュウド
モナスフラジＩＦＯ１２０４９の染色体中に存在する遺
伝子である特許請求範囲第（１）項記載の組換え体ＤＮ
Ａ。
（３）組込まれてなる大腸菌用ベクターがＰＦＬ−１若
しくはＰＦＬ−２である特許請求範囲第（１）項記載の
組換え体ＤＮＡ。
（４）大腸菌用ベクターがｐＵＣ９である特許請求の範
囲第（１）項記載の組換え体ＤＮＡ。
（５）シュウドモナス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子
を大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んでなる大腸菌
内で複製可能な組換え体ＤＮＡを含む大腸菌。
（６）シュウドモナス細菌が、シュウドモナスフラジＩ
ＦＯ１２０４３である特許請求範囲第（５）項記載の大
腸菌。
（７）シュウドモナス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子
を大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ大腸菌内で
複製可能な組換え体ＤＮＡを含む大腸菌を用いることを
特徴とするリパーゼの製造法。