SU1701745A1 - Способ получени биомассы SтRертомYсеS, обогащенной эндонуклеазой рестрикции SFI I. - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области микробиологии и касаетс  способов получени  биомассы бактерий Streptomyces fimbnatus с высоким содержанием рестриктазы Sfi I, и увеличение выхода целевого фермента. Способ заключаетс  в следующем. Колонии микроорганизма Streptomyces fimbriatus (ВКПМ S 750), выросшие на твердой питательной среде, гомогенизируют и перенос т в жидкую питательную среду, состо щую из 3.5-3,7% гидролизата кильки. Выход биома- сы составл ет 18-20 г/л культуральной жидкости , выход рестриктазы Sfi I 1000 ед/г 5 табл . 1 ил. (Л С

Description

Изобретение относитс  к микробиологии и касаетс  способов получени  биомассы бактерий Streptomyces fimbriatus с высоким содержанием рестриктазы Sfi I.

Эндонуклеазы рестрикции  вл ютс  важными инструментами генетической инженерии . Рестриктаза Sfi I, выделенна  из Streptomyces fimbriatus S-750,  вл етс  уникальным ферментом, способным узнавать и расщепл ть октануклеотидную палиндром- ную последовательность j варьируемым участком вставки 5 -GGCCN4N GGCC-3 .

Способы получени  рестриктаз различаютс  между собой используемыми штаммами , услови ми культивировани , стади ми очистки Оптимизаци  каждой

стадии позвол ет увеличить выход целевого продукта, однако решающего значени  можно достигнуть, целенаправленно вли   на биосинтез рестриктазы, измен   услови  культивировани .

В литературе сведений о получении биомассы Streptomyces fimbriatus. обогащенной эндонуклеазой рестрикции Sfi I, не обнаружено.

Известен способ получени  биомассы микроорганизмов вида Streptomyces achromogenes ATCC12767, включающий в себ  культивирование в колбах на среде следующего состава, г/л: глюкоза 10,0 пептон 4,0; дрожжевой экстракт 4,0, MgSO 7НгО 0,5; К2НР04 4,0. КН2Р04 2 0 (среда S)

х| О

S

ел

на круговых качалках(200об/мин) при 30°С, рН среды 7,0-7,1; культивирование продолжали 24 ч. Выход биомассы 6,65 г/л.

Недостатком способа  вл етс  сложный состав питательной среды, низкий выход биомассы и невозможность, использу  штамм, получить эндонуклеазу рестрикции Sfi I.

Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ получени  биомассы из Streptomyces grisens, включающий культивирование продуцента на питательной среде S при температуре 30° С в колбах в течение 15 ч при перемешивании. Клетки центрифугировали и хранили при 20°С, Выход биомассы составл ет 8,2 г/л культураль- ной жидкости. Выход рестриктазы Sgr I 20 ед/г мицели .

Основными недостатками прототипа  вл ютс : невысокий выход биомассы; низкий выход целевого фермента; многокомпонентна  сложна  питательна  среда; невозможность данным способом получить фермент, узнающий и расщепл ющий последовательность нуклеотидов 5 -GGCCN5- GGCC-3 .

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода биомассы и увеличение выхода целевого продукта.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что инокул т продуцента фермента, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, подвергают гомогенизации перед культивированием, а культивирование биомассы Streptomyces fimbriatus ведут на питательной среде, содержащей гидролизат кильки в количестве 3,5-3,7%, в течение 48- 53 ч при перемешивании, которое в течение первых двух суток осуществл ют со скоростью 200-220 об/мин, а начина  со вторых суток - 150 об/мин.

Способ заключаетс  в следующем.

Колонии микроорганизма Streptomyces fimbriatus (ВКПМ S-750), выросшие на твердой питательной среде, перенос т (из расчета 8-10 колоний на 1 л жидкой питательной среды) в стекл нный гомогенизатор . Колонии тщательно ресуспендируют до образовани  гомогенной массы, после чего перенос т в жидкую питательную среду, состо щую из 3,5-,7% гидролизата кильки.

Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30°С в течение 48-53 ч при перемешивании, при этом в течение первых суток (24 ч) перемешивание осуществл ют со скоростью 200-220 об/мин, а начина  со вторых суток (с 25 ч) - со скоростью 150 об/мин.

После 53 ч купьтивировани  клетки центрифугируют и выдел ют из биомассы рестриктазу Sfi I известным способом (табл 1) Выход биомассы составл ет 18-20 г/л культуральнойг жидкости. Выход рестриктазы Sfi I составл ет 1000 ед. акт./г. Удельна 

активность рестриктазы Sfi I составл ет 3000 ед/мл.

Получаема  рестриктаза Sfi I узнает и расщепл ет последовательность нуклеотидов 5 -GGCCN4 -GGCC-31, свободна от неспе0 цифического нуклеазного загр знени  и пригодна дл  использовани  в генноинже- нерных работах.

Определ ющими отличительными признаками способа  вл ютс  следующие.

51. Инокул т продуцента фермента, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л питательной среды, подвергают гомогенизации , что позвол ет повысить выход биомассы.

0Особенностью Streptomyces fimbriatus

 вл етс  то, что колонии этого микроорганизма представл ют собой сферические образовани  в форме шариков. Поэтому небходимо перед высевом в жидкую питэ5 тельную среду провести тщательную их гомогенизацию , что дает возможность получать гомогенную биомассу, состо щую из колоний размером 1.5 20мм с высоким выходом.

0В случае отсутстви  предварительной

гомогенизации биомасса представл ет собой крупные клеточные конгломераты диаметром 5-8 мм и единичные мелкие колонии диаметром до 1,0 мм, что затрудн ет выде5 ление фермента.

Зависимость выхода и качества биомассы от дозы посевного материала и режима обработки представлена в табл.2.

Из табл.2 видно, что оптимальным режи0 мом дл  получени  биомассы Streptomyces fimbriatus  вл етс  использование посевной дозы колоний субстратного мицели  на 1 л свежей питательной среды и последующа  гомогенизаци  инокул та

5При использовании посевной дозы менее 8 колоний на 1 л выход биомассы падает а при использовании более 10 колоний на 1 л дальнейшее повышение выхода не происходит , однако наблюдаетс  неравномерное

0 разрушение биомассы.

2. Культивирование продуцента ведут на питательной среде, содержащей 3,5- 3,7% гидролизата кильки в качестве органического источника аминного азота и

5 незаменимых аминокислот, что позвол ет повысить выход биомассы и целевого фермента .

В табл.3 представлена зависимость выхода биомассы и фермента от состава питательной среды.

Из табл.3 видно,что использование гид- ролизата кильки в экспериментально подобранной оптимальной концентрации (3,5-3,7%) способствует максимальному накоплению рестриктазной активности, за счет чего повышаетс  выход целевого фермента .

- При использовании питательной среды с запредельными значени ми концентраций гидролизата кильки (меньше 3,5 и боль- ше 3,7%) выход биомассы и фермента снижаетс .

3. Культивирование продуцента ведут в течение 48-53 ч при перемешивании, при этом в течение первых суток (24 ч) переме- шивание осуществл ют со скоростью 200- 220 об/мин, а начина  со вторых суток (с 25 ч) - со скоростью 50 об/мин, что позвол ет повысить выход биомасы и целевого фермента .

В табл.4-5 приведены зависимости выхода биомассы и фермента от времени культивировани  и скорости перемешивани  гомогенной биомассы.

Из табл.4 и 5 видно, что увеличениеуро- жа  клеток в первой фазе культивирова- ни (24 ч) происходит при перемешивании со скоростью 200-220 об/мин, что св зано с эффективным разрушением клеточных ассоциаций , а уменьшение скорости переме- шивани  до 150 об/мин во второй фазе роста(после 24 ч)способствует увеличению гомогенной биомассы, обогащенной ре- стриктазой.

На чертеже представлены электрофо- реграммы продуктов гидролиза линеаризованной по Vsp I - сайту плазмиды pDKR 85 ферментом Sfi I, где:

1дорожка -ДНКрОКР85

2дорожка - обработка ферментом 15 мин

3дорожка - 30 мин

4дорожка - - - 45 мин

5дорожка - - - 1ч

Как видномз чертежа при культивирова- нии бактерии Streptomyces fimbriatus предлагаемым , способом получают рестриктазу Sfi I, специфически гидролизу- ющую субстрат, не имеющую побочных интерферирующих активностей.

П р и м е р 1. Клетки выращивают на твердой питательной среде (СПА). 9 колоний стерильно помещают в стекл нный гомогенизатор и тщательно ресуспендируют, однородную суспензию добавл ют в 1 л питательной среды, состо щей из 3,6% гидролизата кильки. Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30СС с перемешиванием 210 об/мин в течение 24 ч, далее 150 об/мин. После 50 ч культивировани  клетки центрифугируют. Выход биомассы 20 г/л. Биомассу хран т при -70°С.

20 г клеток суспендируют в 80 мл буфера А (0.01М калий-фосфатный буфер, pHG 7,5 М / -меркаптоэтанол, ЭДТА, 10 М фенилметилосульфонилфторид) и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе . Обломки клеток удал ют центрифугированием (18000 об/мин. 30 мин при 4°С) и надосадочную жидкость нанос т на 250 мл ДЕАК-сефарозы 6В (Pharmacia), уравновешенной буфером А, затем колонку промывают буфером А до ичезновени  УФ-поглощающего материалал в элюате.

Несв завшийс  с колонкой белок высаливали добавлением сульфата аммони  до 70% насыщени  и собирали центрифугированием (10000 об/мин. 20 мин при4°С). Осадок раствор ли в 20 мл буфера А, содержащего 0,15М NaCI,диализовали против буфера А, содержащего 0.15М NaCI в течение 16 ч и наносили на 50 мл гепарин- сефарозы (Pharmacia). Колонку промывали буфером А, содержащим 0.15М NaCI до исчезновени  УФ-поглощающего материала в элюате, затем буфером А, содержащим 0.14 М NaCI vi 0,01 % tween 20 (Serva). до исчезновени  УФ-поглощающего материала в элюате. затем фермент элюировали буфером А, содержащим 1 М NaCI. Белок в смыве высаливали добавлением сульфата аммони  л 70% насыщени  и собирали центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин при 4°С) Осадок белка раствор ли в 5 мл буфера А. содержащего 0.15М NaCI, диализовали против буфера А. содержащего 0.15М NaCI, в течение 16 ч. наносили на 15 мл гепарин-сефарозы. уравновешенной буфером А, содержащим 0.15М NaCI, и элюировали 150 мл градиентом 0,5-1.5 М NaCI в буфере А. Обьем каждой фракции 5 мл. Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) инкубировали 1 ч при 50° С с 1 мкг ДНК фага Т7 и анализировали в геле агарозы. Реакции, расщепл ющие ДНК фага Т7 (21-29), объедин ли, диализировали 3 ч против 2 л буфера А, содержащего 0.15М Nad, наносили на 20 мл НТР - biogel (BioRad) и элюировали 400 мл градиентом (буфер А, содержащий 0.15М NaCI. буфер А. содержащий 0,5М калий-фосфат и 0,15М NaCI). Объем фракций 10 мл. Фракции, содержащие Sfi I, определ ли так же, как при хроматографии на гепарин-сефарозе.Фракции 29-32 объедин ли и диализовали против буфера, содержащего 0,01М трис-HCI, рН 7,5, 0,2М KCI, 0,1мМ ЭДТА, 1мМ дитиот- рептол, 50% глицерин.

За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое дл  полного расщеплени  1 мкг ДНК плазмиды pDKR85 в течение 1 ч при БО°С.

Ферментный препарат хран т при -20°С. ,

Из 1 г биомассы получают 1000 ед. рестрикта- Зы Sfi I с удельной активностью 3000 ед/мл.

П р и м е р 2. Подготовку инокул та и Культивирование ведут аналогично примеру 1, кроме того, что берут 10 колоний на 1 л реды, состо щей из 3,7% гидролизата киль- л. Перемешивание осуществл ют при 220 | б/мин в течение первых 24 ч, далее 150 об/мин. Клетки собирают после 53 ч. Выход биомассы 20 г/л. Выход фермента составл ет 1000 ед/г, удельна  активность 3000 ед/мл.

П р и м е р 3, Подготовку инокул та и культивирование ведут так же, как в примере 1, кроме того, что берут 8 колоний на 1 л свежей питательной среды на основе 3,5% гидролизата кильки. Перемешивание в пер- ной фазе осуществл ют со скоростью 200 об/мин. Клетки собирают после 48 ч Выход биомассы 18 г/л. Выход фермента 1000 д/г, активность 3000 ед/мл.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  биомассы Streptomyces, обогащенной эндонуклеа- зой рестрикции Sfi I, включающий подготовку инокул та, культивирование продуцента фермента на жидкой питательной среде, содержащей органический источник азота, углерода, минеральные соли и воду при 30°С с перемешиванием и последующим отделением биомассы от культу- ральной жидкости, отличающийс  тем что, с целью повышени  выхода биомассы и увеличени  выхода целевого фермента, в качестве микроорганизмов берут штамм

   Streptomyces fimbriatus ВКПМ , используют инокул т, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, который перед культивированием подвергают гомогенизации , культивирование продуцента ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника азота, углерода и минеральных солей гидролизат кильки в количестве 3,5-3,7%. в течение 48-53 ч при перемешивании, осуществл емом в течение

   первых суток со скоростью 200-220 об/мин а начина  с вторых суток - 150 об/мин

   Примечание, Активность объединенной фракции до диализа против

   50% глицерина. Удельна  активность целевого продукта составл ет 3°000 ед/мл или 60 „000 ед/мг

   Т а б л и ц а 1

   Сердечно-мозгова  выт жка12

   (Difco)

   L-среда (триптон (Difco) 10 г

   Дрожжевой экстракт (Difco) 5 г 15 Nad10 г

   0,1% KN03, 0,05% К2НР04.,

   0,05% Nad, 0,OOU FeS04-7H20

   0,002% СаСрз, 0,05% MgSO, ,

   2% глюкоза, 0,01% аланин,

   10 мг/мл n-аминобензойна  кислота,

   0,02% дрожжевой экстракт,

   0,05% гидролизат

   кильки,

   %

   s-среда

   Таблица2

   Не тестируетс 

   Не тестируетс 

   10

   Не тестируетс 

   утстг крупи мелколо

   800 1000 900 200

   Фонова  активность

   Таблица

   100 150 ЙО 150 150 150

   200

   160

   220

   220

   Таблица5

   Не тестируетс  8

   1680 18 90 20 100 12 60

   Некондиционна  биомасса

   1751

   . Много мелких клоний нар ду с 2,0 мм

   18АО Некондиционна  биомасса