SU1532584A1

SU1532584A1 - Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм IммотUм - продуцент эндонуклеазы рестрикции В @ 1

Info

Publication number: SU1532584A1
Application number: SU884392192A
Authority: SU
Inventors: Сергей Харитонович Дегтярев; Надежда Ивановна Речкунова; Мария Ивановна Новожилова; Галина Васильевна Семенченко; Рамиля Шариповна Галимбаева
Original assignee: Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ; Институт Микробиологии И Вирусологии Ан Казсср
Priority date: 1988-03-15
Filing date: 1988-03-15
Publication date: 1989-12-30

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии. Целью изобретени вл етс вы вление штамма - продуцента BREVIBACTERIUM IMMOTUM ВКПМ В - 4151, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции BIM 1, вл ющейс изошизомером MLA 1. Штамм выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, практически не патогенен дл человека, растет на дешевой доступной питательной среде. Из 1 г сырой биомассы выдел ют 2500 ед.фермента с удельной активностью 10000 ед/мл. Штамм B. IMMOTUM В - 4151 продуцирует эндонуклеазу рестрикции BIM 1 и имеет сайт узнавани TTCGAA, идентичный сайту узнавани MLA 1.

Description

ливают нитраты. Аэробы. Хороший рост в присутствии А-6%-ного Nad. Не образуют кислоту из углеводов.

На рыбопептонном агаре после 48 ч инкубации при 28-30 С образуют круглые с ровными кра ми колонии, гладки блест щие, плоские, консистенци пастообразна .

Цвет колоний желтый. Клетки обра- зуют пигмент типа каратиноидов.

В м сопептонном бульоне образует

.

На синтетической среде с минеральным азотом рост скудный, колонии то- вечные, серовато-белые.

Полученна рестриктаза Bim I харатеризуетс следующими свойствами: уз ьает и специфически расщепл ет после ,oвaтeльнocть нуклеотидов TTCGAA; оп тимальное значение рН дл действи рестриктазы 7,5-9,0; оптимальна тем г:ература действи дл активно- с;ти рестриктазы требуютс ионы Mg , оптимальна концентраци 5-15 мМ.

Рестриктаза из Brevibacterium im- niotum 19 названа Bim I согласно обще 1ФИНЯТОЙ номенклатуре Натана и Смита

Штамм также содержит рестриктазу Mm II, котора вл етс изошизоме- ром Bsp R I.

Ферменты Bim I и Bim II хорошо отдел ютс друг от друга при хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11, ITO позвол ет получить препараты обоих ферментов без взаимных примесей .

Сравнение злектрофоретической 1ОДВИЖНОСТИ фрагментов, получаемых три гидролизе ДНК фага А растриктазо Bim I с электрофоретической подвижно тью фрагментов известной длины |(Nru I гидролизат ДНК фага Д) поз- ол ет определить длину фрагментов iBira 1 гидролизата. Получаемый набор Й рагментов совпадает с набором фрагментов , соответствующим гидролизу ЦНК фага Д по последовательности

ITTCGAA.

Так1ш образом, фермент Bim I . узнает и гидролизует последователь- JHocTb нуклеотидов TTCGAA и вл етс |изошизомером М1а I.

Дл подтверждени последовательности узнавани рестриктазы Bim I проводили совместный гидролиз ДНК фага А рестриктазами Bim I +Nar I, :а также Bim I + Xbu I. Получающиес 1при совместном гидролизе дополнительные фрагменты ДНК соответствуют расчетным .

П р и м .е р . Клетки Br.evibacte- ritrni immotum, хран пщес в 30%-ном глицерине в L-бульоне при -20°С высевают на чашку с LA.

После инкубировани при 30°С клетки собирают петлей и внос т в 100 мл В и выращивают до плотности 1,5 при 30°С. Затем культуру внос т в два литра LB и выращивают до плотности 2,5 при 30°С в течение 12-18 ч. После охлаждени клетки собирают центрифугированием . Выход биомассы 2 г сьфого веса с 1 л среды. 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трис- НС1, рН 7,5, содержащего 10 М fi - меркаптоэтанол и 0,1% тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе . Обломки клеток удал ют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4°С); и надосадочную жидкость нанос т на 30 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Vfhatman) , уравновешенной буфером А (0,02 М калийфосфат, рН 7,5; 0,001 М р-меркаптоэтанол, ЭДТА),, зате колонку промьюают буфером А до исчезновени УФ-поглощающего материала в злюате. Адсорбированный материал элю- ируют раствором 1 М NaCl в буфере А. 50 мл полученного смыва белков с колонки диализуют ночь против 2 л буфера А и затем нанос т на 10 мл ДЕАЕ-целлюлозы (ДЕ-52, Whatman, Англи ) , уравновешенной буфером А и элю- ируют 100 мл градиента 0-1,0 М NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 37°С с 1 мкг ДНК фага А и анализируют в геле агарозы. Фракции (10-16), расщепл ющие ,ДНК фага А, объединили, диализовалиЗ чпро- тив 2 л буфера А и наносили на 4 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman, Англи ) и элюировали 40 мл градиентом 0-1,0 Н NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 2 мл. Фракции, содержащие рестрикТаз- ную активность, определ ли также как при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции (8,9), содержащие рестриктазу Bim I, объединили и диализовали против буфера А, содержащего 0,1 М NaCl и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имел удельную активность 10000 ад/мл.

За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое дл полного расщеплени

5 15325846

1 мк ДНК фага Л в течение 1 ч прикультивировани биомассы составл ет

37 С.всего IZ- IS ч вместо 3 недель по

Ферментный препарат хран т припрототипу, устойчив при хранении в

-20°С. Из 1 г биомассы получают ,.различных услови х. 2500 ед. рестриктазы Bim I.

Claims

Полученный штамм обеспечиваетФормула изобретени

в 5 раз больший выход эндонуклеазыШтамм бактерий Brevibacterium imрестрикции Bim I, нетребователен кmottjm ВКПМ В-4151 - продуцент эндопнтательным средам, длительностью нуклеазы рестрикции Bim I.