DE69627856T2

DE69627856T2 - PHENYLACETYL-CoA-LIGASE AUS PENICILLIUM CHRYSOGENUM

Info

Publication number: DE69627856T2
Application number: DE69627856T
Authority: DE
Inventors: Linden-Smithkline Beecham Pharmaceut Gledhill; Andrew-SmithKline Beecham Pharm. Philip GREAVES; Patrick-SmithKline Beecham Pharm. John GRIFFIN
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: PL324225A1; GB9513403D0; KR19990028533A; DK0835316T3; HK1010213A1; DE69627856D1; SI0835316T1; CN1194002A; PL188190B1; WO1997002349A1; ATE239081T1; AU6417396A; EP0835316B1; US6245524B1; JP3819429B2; ES2198493T3; JPH11508450A; KR100455054B1; PT835316E; EP0835316A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, das in der Synthese von Penicillinen aus Zwischenverbindungen, die an der Penicillinbiosynthese beteiligt sind, nützlich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung des Enzyms und der das Enzym codierenden DNA.
Der biochemische Weg für Penicillin G wird in der Literatur offenbart (Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34(6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol 9 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics 48(11), 1195-1212). Der Weg war Gegenstand beträchtlicher Untersuchung mit einer Aussicht, die Ausbeute (Titer) in Fermentationsverfahren zu erhöhen.
Phenylacetat (PAA) und Phenoxyacetat (POA) werden zu den entsprechenden CoA-Thioestern in Penicillium chrysogenum durch ein Ligaseenzym (z.B. PAA-CoA-Ligase) aktiviert. Diese Thioester werden dann zur Biosynthese von Penicillin G im Fall von PAA und Penicillin V im Fall von POA verwendet. PAA-CoA-Ligase wird daher als essentiell in der Biosynthese dieser kommerziell wichtigen therapeutischen Antibiotika angesehen.
Ein Enzym von Pseudomonas putida mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität wurde in einem Reinigungsverfahren isoliert (J. Biol. Chem. 267(12), 7084-7090 (1990)), das Ammoniumsulfatpräzipitation und Kaliumchloridelution von einer DEAE-Sephacelsäule einschließt. Das Enzym besitzt ein Molekulargewicht von 48 kDa+/– 1 kD, einen Optimums- pH-Wert von 8.2 und ist am PAA-Katabolismus beteiligt.
Versuche, ein Enzym mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität aus P. chrysogenum durch das Hydroxymatverfahren (ein kolorimetrischer Test, der Phenylacetylhydroxamat oder Phenoxyacetylhydroxymat bei 540 nm nachweist) zu untersuchen, sind in der von Kogekar&Deshpande (1982) Ind. J. Biochem. Biophys. 19, 257-261 und von Brenner&Rohr (1975) Methods Enzymol 43, 476-481 berichteten Arbeit eingeschlossen worden; andere Arbeiten jedoch (Martinez-Blanco et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(8), 5474-5481) vertreten die Ansicht, dass das Protein nicht gereinigt oder die Aktivität im Detail charakterisiert wurde. Darüber hinaus gelang es den letzteren Autoren nicht, das Enzym mittels des berichteten Verfahrens zu finden.
WO 96/10085 (Gist Brocades, veröffentlicht 4. April 1996) überprüft diese und andere Versuche, eine PAA-CoA-Ligase, die im Penicillin-Weg wirkt, zu isolieren. In WO 96/10085 wird eine Acyl-CoA-Enzymsynthetase als aus einem Stamm von Penicillium chrysogenum B10, der von PanLabs (USA) gehalten wird, erhalten beschrieben. Unter den dem Enzym zugeschriebenen spezifischen Eigenschaften sind die folgenden: Molekulargewicht von etwa 50 kDa (wie durch Gelfiltration bestimmt); pH-Optimum pH 8 bis 8.5 (niedrige Aktivität bei pH 7 oder darunter), Temperaturoptimum bei 40°C, pI höher als 7.25. Es ist von Bedeutung, dass das Enzym durch Ammoniumsulfatpräzipitation gereinigt werden kann. Es besitzt eine ziemlich weite Spezifität (d.h. kann die Bildung von Phenoxyacetyl-Coenzym A, Phenylacetyl-Coenzym A, Adipyl-Coenzym A und Hexanoyl-Coenzym A aus Mg²⁺, ATP, CoASH und Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure, Adipinsäure beziehungsweise Hexansäure katalysieren, besitzt aber keine bedeutende Aktivität gegenüber Essigsäure). Auch wird gesagt, dass das Enzym durch reduzierende Agenzien stabilisiert wird. Eine hohe Konzentration von Ammoniumsulfat oder Glycerol stabilisiert das Enzym auch. Keine Angaben der Reinheit werden für die Enzymaktivität, die durch die offenbarten Verfahren erhalten wird, gegeben, und keine Sequenz oder N-terminale Sequenz wird für das Enzym gegeben, und die entsprechende DNA wird nicht charakterisiert oder ihre Sequenz gegeben.
Trotz all dieser Bemühungen ist wenig über das authentische PAA-CoA-Ligaseenzym bekannt, das in Penicillium sp. in vivo arbeitet. Es ist spekuliert worden, dass das verantwortliche Enzym am Primärmetabolismus beteiligt sein könnte (Smith et al. (1990) Biotechnology 8, 39-41). Martinez-Blanco et al. (1992), siehe dort, wählten ein mögliches Kandidatenenzym, Acetyl-CoA-Synthetase, und reinigten es aus P. chrysogenum auf der Grundlage der Acetyl-CoA-Synthetase-Aktivität. Sie konnten zeigen, dass zusätzlich zur Bildung von CoA-Derivat von Acetat, Acetyl-CoA-Synthetase mehrere Fettsäuren (C2-C8) und einige aromatische Moleküle (einschließlich PAA) in vitro aktivieren konnte.
Das Acetyl-CoA-Synthetasegen wurde sequenziert (International Patent WO 92/07079, Gouka et al. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519, Martinez-Blanco et al. (1993) Gene 130, 265-270), und es wurde gezeigt, dass es eine Homologie zu anderen Acetyl-CoA-Synthetasen aus Pilzen besitzt. Jedoch scheinen Mutationen in diesem Gen, selektiert durch Fluoressigsäure, die Penicillinproduktionsmengen nicht zu verändern (International Patent WO 92/07079), was nahelegt, dass in vivo ein anderes Enzym tatsächlich für die Aktivierung von PAA verantwortlich ist.
In der vorliegenden Erfindung wurde ein direkter Test für PAA-CoA-Ligase-Aktivität zusammen mit einem spezifischen Reinigungsprotokoll entwickelt, und das hat die Reinigung und anschließende Clonierung der für die authentische gehaltenen PAA-CoA-Ligase ermöglicht. Das mittels der vorliegenden Erfindung isolierte Enzym besitzt eine zu der vorstehend erwähnten Acetyl-CoA-Synthetase unterschiedliche N-terminale Aminosäuresequenz und besitzt eine Reihe unterschiedlicher Eigenschaften (z.B. Molekulargewicht), die anzeigen, dass ein zu allen Enzymen, denen diese Rolle bis heute zugeschrieben wurde, unterschiedliches Enzym isoliert wurde. Die für das in der vorliegenden Erfindung isolierte Enzym charakteristischen Eigenschaften schließen eine absolute Abhängigkeit von CoASH als Substrat ein, während das von Kogekar&Deshpande (1983), siehe dort, isolierte Enzym unter Bedingungen getestet wurde, in denen CoASH weggelassen wurde. Dieser und andere Unterschiede zwischen den isolierten Proteinen (z.B. pH-Optima und andere in den nachstehenden Beispielen gegebene Charakteristika) zeigen, dass sich das Enzym in der vorliegenden Erfindung von jedem der im Fachgebiet zuvor beschriebenen unterscheidet. Es wird geglaubt, dass die vorliegende Arbeit die erste Isolierung einer reinen Form des Enzyms PAA-CoA-Ligase aus Penicillium sp. darstellt. Insbesondere die Anwesenheit eines C-terminalen SKI-Peptids ist mit diesem Enzym, das eine Rolle in der Penicillin-Biosynthese besitzt, vereinbar. Das Enzym der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem in WO 96/10085 vorstehend erwähnten darin, dass es ein anderes Molekulargewicht besitzt, und das Enzym der vorliegenden Erfindung ist, anders als das von WO 96/10085, sensitiv gegenüber Ammoniumsulfatpräzipitation und Chloridsalzen.
In einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung DNA, die ein Enzym mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität codiert, erhältlich aus Penicillium chrysogenum durch Züchtung, Ernten und Beschallen des Mycels, Entfernen von Zellbruchstücken und Fraktionieren des durch Beschallen aufgeschlossenen Materials durch Anionen-Austauschchromatographie, gefolgt von hydrophober Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie mit Substratelution und Gelfiltrationschromatographie, wobei die aktiven chromatographischen Fraktionen mittels eines PAA- und Coenzym A-abhängigen Tests nachgewiesen werden.
Das das Protein codierende Gen ist in dem in 2 gezeigten DNA-Fragment lokalisiert. Insbesondere umfasst die DNA im wesentlichen die DNA-Sequenz in Figur 3/SEQ ID 2.
In 2 ist die ungefähre Länge in Kilobasen (kb) der DNA, wie durch Größenbestimmungsexperimente, durchgeführt mittels Agarosegelelektrophorese, bestimmt, angezeigt. Es sollte verstanden werden, dass die Figur nicht beabsichtigt, alle auf der DNA. vorhandenen Restriktionsstellen zu zeigen.
Es wird verstanden werden, dass sich die DNA dieser Erfindung nicht in ihrem natürlichen Zustand befindet, wie sie in der Natur vorkommt, sondern in isolierter oder im wesentlichen reiner Form. Es wird verstanden werden, dass die Erfindung DNA umfaßt, die nicht die genaue dargestellte Anordnung von Restriktionsstellen besitzen kann, wenn die DNA mittels Standardverfahren, einschließlich Nucleotiddeletion, -substitution, -addition oder -inversion der DNA gemäß jedes vorstehend beschriebenen Aspekts der Erfindung gewonnen wurde.
Bevorzugt wird die DNA der vorliegenden Erfindung aus P. chrysogenum gewonnen. Die Erfindung umfaßt jedoch auch DNA-Sequenzen, die von anderen geeigneten Organismen stammen, vor allem anderen produzierenden Organismen als P. chrysogenum, deren Sequenzen nicht die gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen besitzen, aber die mit der in 2 gezeigten DNA oder einem Subfragment davon, bevorzugt unter Bedingungen hoher Stringenz, hybridisieren und die PAA-CoA-Ligase oder ein Enzym mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität codieren (Bedingungen hoher Stringenz sind zum Beispiel solche wie die in Beispiel 18).
Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, der solche DNA umfasst, bevorzugt einen Expressionsvektor zur Expression von PAA-CoA-Ligase in einem geeigneten Wirtsorganismus. Ein spezifisches Beispiel eines solchen Expressionsvektors ist pBK-CMV (erhältlich von Stratagene), und er wird in dieser Erfindung zur Expression in E. coli verwendet. In dieser Erfindung ist das cDNA-Insert von PAA-CoA-Ligase (=pPEN09, 2) ein bevorzugter Vektor zur Expression in E. coli.
Die DNA der Erfindung und sie enthaltende Vektoren können in vielen Bereichen industrieller Aktivität verwendet werden. Das trifft auch auf Wirtsmikroorganismen, transformiert mit den Vektoren, und die Enzyme, die sie exprimieren, zu. Zum Beispiel kann die DNA als eine Hybridisierungssonde verwendet werden, um verwandte oder überlappende Gene zu identifizieren und isolieren, die auf der gesamten zellulären DNA von P. chrysogenum (NRRL 1951) und anderer Mikroorganismen, die Enzyme ähnlicher Struktur und Spezifität produzieren, vorhanden sind.
Die DNA enthaltende rekombinante Vektoren können für die Produktion von genetisch modifizierten Mikroorganismen, die erhöhte Mengen Penicillin synthetisieren, wertvoll sein, wenn sie in geeignete Wirte transformiert werden.
Es wäre sehr vorteilhaft, die Menge der Aktivität der PAA-CoA-Ligase in einem geeigneten Organismus zu erhöhen. Rekombinante Vektoren könnten auch zur Erzeugung neuer oder von Hybridantibiotika über das Verfahren des Gentransfers verwendet werden (siehe zum Beispiel D.A. Hopwood et al., Nature (1985) 314, 642-644). Von der DNA der Erfindung codierte Enzyme können zum Beispiel in zellfreien Systemen verwendet werden, besonders wenn sie auf geeigneten festen Trägern immobilisiert werden, um das bekannte Antibiotikum aus natürlichen Vorläufern oder ein neues Antibiotikum aus ,unnatürlichen' Vorläufern, die zum Beispiel durch chemische Synthese erhalten werden, herzustellen.
Die DNA der Erfindung oder ein Fragment davon (das nicht notwendigerweise ein intaktes Gen trägt) kann entweder mittels rekombinanter DNA-Techniken oder mittels natürlicher Rekombinationsverfahren mit einem Fragment eines an der Biosynthese beteiligten Gens verbunden werden, um ein Hybridgen herzustellen, das die Synthese eines Hybridenzyms steuern kann. Solche Enzyme können zur Herstellung neuer Antibiotika mittels zu solchen hier vorstehend beschriebenen analoger Verfahren verwendet werden.
Die DNA der Erfindung kann auch mittels bekannter Techniken der gerichteten Mutagenese verändert werden (auf eine zu der beschriebenen analoge Art, zum Beispiel von G. Winter et al., Nature (1982) 299, 756-758; oder von Zoller und Smith, Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500), um DNA zu ergeben, in der spezifische Mutationen und/oder Deletionen erfolgt sind. Die mutierte DNA kann auch verwendet werden, um eine erhöhte Ausbeute oder Titer) an Penicillin aus einem geeigneten Wirtsmikroorganismus zu erhalten.
Die mutierte DNA kann auch verwendet werden, um neue oder Hybridantibiotika durch Gentransfer zu erhalten, oder sie kann in der Herstellung mutanter Enzyme (Muteine) verwendet werden, die zur Herstellung neuer Antibiotika durch zu denen hier vorstehend beschriebenen analogen Verfahren verwendet werden können. Die mutierte DNA kann auch verwendet werden, um andere Fermentationseigenschaften geeigneter Organismen zu verändern, z.B. PAA-Toleranz, veränderte Substrate.
Die vorliegende Erfindung liefert auch das Polypeptid mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität, codiert von der DNA gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Das Enzym liegt bevorzugt in gereinigter Form vor, vorteilhafterweise in im wesentlichen reiner Form. Das Enzym dieser Erfindung besitzt ein scheinbares Molekulargewicht von 63 kD (nach SDS-PAGE).
Bevorzugt schließt das Enzym die Sequenz N-terminaler Aminosäuren ein:
VFLPPKESGQLDP
Insbesondere umfaßt das Enzym die Sequenz von Aminosäuren in Figur 1/SEQ ID 1.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität durch Züchtung von Penicillium sp., gefolgt von Extraktion und Reinigung, wobei die aktiven Fraktionen mittels eines PAA- und Co-Enzym A-abhängigen Tests nachgewiesen werden, geliefert. Insbesondere ist Penicillium sp. das P. chrysogenum, und das Mycel wird durch Beschallung behandelt, gefolgt von Fraktionierung durch Anionen-Austausch-, hydrophobe Interaktions-, Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie, um eine ungefähre 1000fache Erhöhung der Reinheit zu liefern.
Das Enzym kann in in vitro-Biotransformationen verwendet werden: Zum Beispiel für die CoA-Ester-Synthese oder für die Penicillinsynthese, wenn es mit Acyl-CoA:6-APA-Acyltransferase gemischt wird. Die in vitro-Biotransformationen können mit ganzen Zellen, zellfreien Extrakten, permeabilisierten Zellen oder dem isolierten Enzym aus den Mikroorganismen oder jedem von diesen in immobilisierter Form durchgeführt werden.
In den Fällen, in denen die Biotransformation mit ganzen Zellen durchgeführt wird, liegen die Mikroorganismen in Form einer wachsenden Kultur, ruhenden Kultur, gewaschenen Mycels, immobilisierter Zellen oder von Protoplasten vor.
Wenn zellfreie Extrakte verwendet werden, werden diese geeigneterweise mittels Scherung und/oder chemischer oder enzymatischer Lyse oder anderer Verfahren des Aufbrechens, bevorzugt Beschallung, und gegebenenfalls anschließender Entfernung der Zelltrümmer, wobei die Enzymaktivität in Lösung bleibt, hergestellt.
Das Enzym wird geeigneterweise gemäß den nachstehenden Beispielen unter Verwendung von im Handel erhältlicher Stämme von P. chrysogenum, einschließlich des Wildtyps NRRL1951, hergestellt. Andere geeignete Stämme von P. chrysogenum schließen hoch Penicillin produzierende Stämme ein, z.B. Stamm BW1901 (D.J. Smith et al. (1990), EMBO J. 9(3), 741-747).
Das Enzym kann durch Züchtung des Mikroorganismus auf herkömmliche Weise, vor allem unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten Flüssigkeit oder halbfestem Medium hergestellt werden. Die Kulturbedingungen können eine Temperatur im Bereich von 5-50°C, bevorzugt 25-30°C, und einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 9, bevorzugt 6-8, stärker bevorzugt 7.2, sein.
Das Enzym kann isoliert und in reiner Form, teilweise gereinigter Form, als in einem unreinen Zustand erhalten, als ein Filtrat aus einer aufgeschlossenen Zellpräparation, als ein Rohzellhomogenat oder anderes verwendet werden. Am geeignetsten ist das Enzym zum Beispiel zumindest gereinigt, um andere Enzyme zu entfernen, die auch die Zerstörung des Startmaterials oder des Enzyms katalysieren können.
Am geeignetsten ist das Enzym immobilisiert, zum Beispiel an ein unlösliches Trägermaterial, wie durch die Verfahren, die von Powell (1990) in Microbial Enzymes and Biotechnology Hrsg. Fogarty&Kelly S. 369-394 diskutiert werden. Das liefert den Vorteil erhöhter Ausbeute und Durchsatz.
Wenn die Biotransformation mit ganzen Zellen durchgeführt wird, umfaßt ein geeignetes Inkubationsmedium das Medium: KH₂PO₄ 2 g, KH₂PO₄ 1.5 g, KCl 0.2 g, MgCl₂·6H₂O 0.2 g, Na₂SO₄·10H₂O 0.22 g, Glucose 1.0 g in einem Liter deionisiertem Wasser pH 6.5 oder einem Wassersystem mit pH-Einstellung.
Wenn die Biotransformation mit zellfreien Extrakten durchgeführt wird, umfaßt das Inkubationsmedium einen geeigneten Puffer. Zusätzlich zu Substraten kann die Enzymreaktion ein oder mehrere andere Cofaktoren, z.B. Metallionen oder Stabilisatoren, zum Beispiel Thiole, enthalten.
Die Biotransformation kann geeigneterweise in wässrigen Medien durchgeführt werden, wobei das Reaktionsgemisch geeigneterweise im Bereich von pH 4-10 gehalten wird, geeigneter von 6 bis 10, bevorzugt um 9.0. Der pH-Wert wird geeigneterweise durch Verwendung von Puffern oder bevorzugt durch die Zugabe von Säure- oder Basetitrant kontrolliert. Die Temperatur der Reaktion sollte allgemein im Bereich von 5-50°C, bevorzugt 22-45°C, stärker bevorzugt von 30-37°C, liegen. In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktion in organischen Lösungsmitteln oder in Gegenwart organischer Lösungsmittel, z.B. Aceton, Methylisobutylketon (MIBK), durchgeführt werden.
Die Reaktionszeit hängt von solchen Faktoren wie Konzentrationen von Reaktanten und Cofaktoren, Temperatur, pH-Wert ab. Nachdem die Reaktion vollständig ist, kann das Produkt mittels herkömmlicher Verfahren isoliert werden. Die anfängliche Reinigung schließt praktischerweise einen Chromatographieschritt ein.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1 - P. chrysogenum-Fermentation.
Sporen von Penicillium chrysogenum (SmithKline Beecham Stamm BW1901) wurden in 15 ml PVS-Medien (35 g/l Maisquellwasser, 15 g/l Glucose, 5 g/l CaCO₃, 8 ml/l Rapssamenöl, pH-Wert auf 5.9 mit NaOH) in 100 ml Schüttelkolben angeimpft. Die Kultur wurde für 48 h bei 26°C auf dem Rundschüttler (230 rpm) wachsen gelassen, bevor 1 ml der ganzen Nährlösung genommen wurden und in 10 ml CS-Medium (35 g/l Maisquellwasser, 85 g/l Lactose, 10 g/l CaCO₃, 10 g/l NaH₂PO₄, 8 g/l (NH₄)₂SO₄, 4 g/l MgSO₄·7H₂O, 4 g/l Na₂SO₄, 6 ml/l Rapssamenöl, 6 g/l Phenoxyessigsäure, pH-Wert auf 6.0 mit NaOH) in 100 ml Schüttelkolben überführt wurden. Diese Kultur wurde dann für 55 h bei 26°C auf dem Rundschüttler (230 rpm) vor der Ernte des Mycels wachsen gelassen.
Beispiel 2 - Herstellung von Proteinextrakten aus P. chrysogenum zum Test, zur Reinigung und zum Western Blotten von PAA-CoA-Ligase.
Mycel eines 55 h C5-Schüttelgefäß, kultiviert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durch Filtrieren durch Glas-Mikrofaser-Filter (Whatman GF/A) geerntet. Die Mycelmasse wurde mit 300 ml 0.9% (Gew./Vol.) Natriumchlorid (4°C) gewaschen und dann aus dem Filter gekratzt und in 10 ml Ligasetestpuffer (30 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM Dithiothreitol, 100 μg/ml Pefabloc^TM in 50% Glycerol) gegeben. Das Mycel wurde dann auf Eis beschallt (3 × 15 s Schall mit dem Ultrasonics Modell W-385 Ultraschallgerät, Schaltknopf 5, Zyklusrate 5 s, 50% Duty Cycle), und die Myceltrümmer wurden durch Zentrifugation (18000 × g, 4°C, 30 min) pelletiert. Der Überstand wurde bei –70°C zur Lagerung eingefroren oder sofort für PAA-CoA-Ligase-Test, Reinigung oder Western Blotting verwendet (Beispiel 7).
Beispiel 3 - in vitro-Test für PAA-CoA-Ligase.
Um die Anwesenheit von PAA-CoA-Ligase-Aktivität in Extrakten oder Säulenfraktionen zu zeigen, wurden 20 μl mit 0.1 M Phenylessigsäure in 50 mM Tris-HCl pH 7.5 (20 μl), 0.1 M NatriumATP (10 μl), 0.2 M Magnesiumchlorid (10 μl), 0.02 M Natrium-Coenzym A (10 μl) und 0.015 M Dithiothreitol (10 μl) in Plastik-Eppendorf-Röhrchen gemischt. Die Röhrchen wurden mit Vortex gemischt (5 s) und dann in ein Wasserbad bei 30°C für 15 min gestellt. Methanol (100 μl) wurde dann zu den Gemischen zugegeben, und die Röhrchen wurden zentrifugiert (14 K, 1 min), um die Proteine zu präzipitieren. Die Überstandsfraktionen wurden auf die Anwesenheit von PAA-CoA durch HPLC (Beispiel 4) analysiert. In jedem Satz von Tests wurde ein Proteinextrakt, hergestellt durch P. chrysogenum-Schüttelkultürferrnentation (Beispiel 1), als eine positive Kontrolle mit dem PAA-CoA-Standard getestet.
Beispiel 4 - HPLC-Analyse von Testüberstanden.
Überstandproben aus PAA-CoA-Ligasetests (Beispiel 3) wurden auf die Anwesenheit von PAA-CoA mit Waters LCM1-HPLC-System getestet. Die Proben (100 μl) wurden auf eine Radial Pak C18-Kompressionsäule bei Raumtemperatur mit einer Flußrate von 2.5 ml/min unter Verwendung einer mobilen Phase von 0.2 M Natriumphosphat pH 5.4 (Puffer A) isokratisch von 0-4 min injiziert. Anschließend folgte ein linearer Gradient auf 100% Puffer B, enthaltend 0.16 M Natriumphosphat pH 5.4 in 40% Acetonitril (4-10 min). Puffer B wurde bei 100% für weitere 2 min gehalten, und dann wurde das System reäquilibriert, fertig für die nächste Injektion unter Verwendung eines linearen Gradienten zurück zu 100% A (12-13 min). Spitzen wurden bei 260 nm nachgewiesen, und PAA-CoA hatte eine Zurückhaltezeit von 12 Min. Positive Proben waren solche, die co-eluierende Spitzen mit dem PAA-CoA-Standard hatten und dieselben UV-Absorptionsspektren wie der Standard zeigten, bestimmt durch ein Photodiodereihenspektrometer.
Beispiel 5 - Reinigung von PAA-CoA-Ligase.
Vorsicht war erforderlich, da die Enzymaktivität als extrem labil festgestellt wurde. Versuche der Präzipitation des Enzyms mit Ammoniumsulfat waren nicht erfolgreich, da keine Aktivität im erhaltenen Material gefunden werden konnte. Das in sich unterscheidet das vorliegende Enzym von dem in WO 96/10085 (Gilt-Brocades) beschriebenen.
Wenn nicht anders angemerkt wurde das folgende Verfahren bei 4°C unter Verwendung von Puffer C, enthaltend 30 mM Tris-HCl, 4 mM DTT, 4 mM EDTA, 5 mM MgCl₂ und 20% Glycerol (Vol./Vol.) bei pH-Wert 9.0 durchgeführt. Trennungen wurden mit einem PharmaCla Hi-Load^TM-System erreicht.
Zellfreier Extrakt (500 ml), hergestellt wie in Beispiel 1 gegeben, wurde langsam bei 4°C aufgetaut.
Der Extrakt wurde dann auf pH-Wert 9.0 mit 5 M NaOH unter Rühren auf Eis eingestellt. Zu diesem Rührextrakt wurden 275 g Q-Sepharose Fast Flow (PharmaCla) Ionenaustauschmedien zugegeben, die zuvor mit 31 Wasser, gefolgt von 11 Puffer C gewaschen worden waren.
Dieses Gemisch wurde für 1.5 h auf Eis gerührt. Der Schlamm wurde dann durch weitere 50 g gewaschenen Q-Sepharose-Harzes auf einem Sinterglas unter reduziertem Druck filtriert. Das Harz wurde dann mit weiteren 100 ml Puffer C gewaschen und dann trockentaufen gelassen, was 600 ml klaren Extrakt, enthaltend PAA-CoA-Ligase, ergibt. Ammoniumsulfat (92.4 g, d.h. Subpräzipitationsmengen) wurden dann zugegeben, und die Lösung wurde auf Eis für 1 h, gefolgt von Filtration (0.45 μm Filter, Millipore, Typ HA) gerührt.
Der PAA-CoA-Ligase-Extrakt (700 ml) wurde dann bei 1 ml/min auf eine Phenylsepharose 6 Fast Flow geladen, niedrige Substitutionssäule (PharmaCla, 12 cm × 2.6 cm Durchmesser), zuvor konditioniert mit 11 Puffer D (wie für Puffer C mit 140 g/l Ammoniumsulfat). Die geladene Säule wurde dann mit 230 ml Puffer D bei 0.8 ml/min gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 100% Puffer D auf 100% Puffer C über 238 ml bei 0.8 ml/min eluiert. 5.5 ml Fraktionen wurden gesammelt und auf PAA-CoA-Ligase-Aktivität wie in Beispiel 3 gegeben getestet. Aktive Fraktionen, 41 bis 49, wurden vereinigt, was 50 ml ergibt, die bei 0.5 ml/min auf eine 5 ml HiTrap^TM Blue Affinitätssäule (Pharinacia) geladen wurden, die zuvor mit 50 ml Puffer C gewaschen wurde. Die geladene Säule wurde mit 15 ml Puffer C gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 100% Puffer C bis 100% Puffer E über 25 ml bei 0.5 ml/min eluiert. Puffer E wurde wie Puffer C Phenylessigsäure zugegeben, um eine Endkonzentration von 0.5 M zu ergeben, die wieder auf pH-Wert 9.0 mit festem NaOH eingestellt wurde. Die Elution von der Affinitätssäule unter Verwendung des natürlichen Substrats wurde verwendet, um die Reinigungsselektivität zu erhöhen und um zu ermöglichen, dass die Enzymaktivität in den resultierenden Fraktionen gemessen werden kann. NaCl-Elution erwies sich als unerfolgreich, da dieses Salz die Enzymaktivität hemmte. Im Gegensatz dazu scheint das in WO 96/10085 beschriebene Enzym stabil zu sein, wenn es in KCl eluiert wird.
Aktive Fraktionen 21, 22 und 23 wurden vereinigt, um 6 ml zu ergeben, die dann bei 0.25 ml/min auf einer Sephacryl S-200 Hochleistungs-Größenausschluß-Säule (PharmaCla, 64 cm × 2.6 cm Durchmesser), getrennt wurden, die zuvor in Puffer F äquilibriert wurde (wie für Puffer C mit Einstellung auf pH-Wert 7.5 mit 5 M HCl). Aktive Fraktionen 54 bis 65 wurden vereinigt, um 11 ml zu ergeben, die auf 60 μl durch zentrifugale Ultrafiltration (Centricon 10,000 MW Ausschluß, Amicon Inc.) konzentriert wurden. Analyse der Fraktionen der Größen-Ausschluß-Säule durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Beispiel 6) zeigten ein Protein von 63 kD, dessen Intensität mit der PAA-CoA-Ligase-Aktivität korrelierte. Western Blotting (Beispiel 6) wurde verwendet, um die Reinigung zu vervollständigen und N-terminales Aminosäuresequenzieren der PAA-CoA-Ligase zu ermöglichen.
Beispiel 6 - Western Blotting des PAA-CoA-Ligase-Proteins.
Um Material zur N-terminalen Aminosäuresequenzierung zu liefern, wurde das gereinigte Protein (60 μl, Beispiel 5) mit einem äquivalenten Volumen SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 (10 ml), Natriumdodecylsulfat (2 g, Ultrapure), 2-Mercaptoethanol (1 ml), Glycerol (10 ml), destilliertes deionisiertes Wasser (7 ml) und 0.1% Bromchlorphenolblau (2 ml) gemischt. Dieses Gemisch wurde für 10 min gekocht und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Aliquots (5, 15 und 20 μl) wurden auf ein 10% Polyacrylamidgel (4% Sammelgel) geladen, gegossen in einer Bio-Rad Mini Protean II Elektrophoresekammer, hergestellt nach dem Herstellerprotokoll. Die Elektrophorese wurde in Elektrodenpuffer durchgeführt, enthaltend 0.025 M Tris, 0.192 M Glycin und 0.1% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (Utrapure) bei 200 V für 45 min, wonach das Polyacrylamidgel in Elektroblotting-Puffer (10 mM 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure, pH 11 in 10% Methanol) für 5 min gegeben wurde. Die Proteine im Polyacrylamidgel wurden auf eine Applied Biosystems ProBlott^TM Immobilisierungsmembran mit einer Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektrophoresetransferkammer nach dem Applied Biosystems-Protokoll transferiert. Nach Vollendung des Blotting wurde die Membran mit Coomassie Blue R-250 mit der Färbemethode im Applied Biosystems-Protokoll gefärbt. Die Proteinbande bei 63 kDa wurde aus der Membran ausgeschnitten, und dieses Material wurde zur N-terminalen Aminosäuresequenzierung (Beispiel 7) verwendet.
Beispiel 7 - N-terminale Aminosäuresequenzierung.
N-terminale Aminosäuresequenzierung wurde von dem geblotteten Protein (Beispiel 6) mit einem Applied Biosystems (ABI)477A gepulsten Flüssigsequenzierer erhalten. Die Sequenz wurde mittels Standard-Edman-Chemie erhalten, wobei freigesetzte PTH-markierte Aminosäuren mit ABI 120 Å Engbohrungschromatographie identifiziert wurden. Die Analyse des gereinigten PAA-CoA-Ligase-Proteins resultierte in der folgenden Sequenzbestimmung:
V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P
Beispiel 8 - Synthese des N-terminalen Peptids der PAA-CoA-Ligase.
Die vom 63 kDa PAA-CoA-Ligase-Protein (Beispiel 7) bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz wurde verwendet, um ein Peptid zu synthetisieren. Das wurde von Peptide and Protein Research Consultants (Washington Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter, Devon EX4 4OG, UK) als 50 mg freie Peptide synthetisiert. 12 mg wurden an Maleimid-aktiviertes BSA (Rinderserumalbumin) unter Verwendung von SMCC (Succinimidyl 4-(N-maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat) gebunden, und 2.5 mg wurden an Maleimid-aktiviertes OVA (Ovalbumin) unter Verwendung von MBS (m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) gebunden.
Beispiel 9 - Herstellung polyclonaler Antikörper gegen vom N-Terminus des 63 kDa PAA-CoA-Ligase-Proteins abgeleitetes Peptid.
An BSA gebundenes Peptid (Beispiel 8) wurde zur Herstellung von polyclonalen Kaninchen-Antikörpern, spezifisch für das 63 kDa-PAA-CoA-Ligase-Protein, verwendet. Das Peptid-BSA-Konjugat (375 μg/ml) wurde filtersterilisiert (0.2 μm Filter), und 1 ml der sterilen Lösung wurde gut mit 2 ml nicht-ulcerativem Komplettem Freundschem Adjuvans (Brian Morris International, Guildford U.K.) durchmischt. Eine Menge von 0.8 ml dieses Gemisches (100 μg des Peptid-BSA-Konjugats) wurden subkutan weißen Neuseelandkaninchen (etwa 10 Wochen alt) an vier verschiedenen Injektionsstellen verabreicht. Weitere Immunisierungen wurden 28 und 58 Tage nach der anfänglichen Immunisierung wie vorstehend beschrieben verabreicht, mit der Ausnahme, dass nicht-ulceratives Inkomplettes Freundsches Adjuvans verwendet wurde. Testblutungsproben wurden von der Vene am Ohrrand 42 und 72 Tage nach der anfänglichen Immunisierung genommen, um den Antikörpertiter und die Spezifität mittels Enzym-gebundenem Iminunosorbent-Test (Beispiel 10) zu bestimmen.
Beispiel 10 – Enzym-gebundener Immunosorbent-Test (ELISA) zur Bestimmung des Antikörpertiters und der Spezifität der 63 kDa-PAA-CoA-Ligase.
Bestimmung des Antikörpertiters
Eine Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (Nunc MaxiSorp^TM) wurde mit PAA-CoA-Ligase-Peptid-OVA-Konjugat (200 μl/Vertiefung, 0-10 μg/ml) in Phosphatgepufferter Salzlösung pH 7.2 (8 g/l Natriumchlorid, 0.2 g/l Kaliumchlorid, 1.44 g/l Natriumdihydrogenortliophosphat, 0.24 g/l Kaliumdihydrogenortliophosphat, pH 7.2) beschichtet. Die beschichtete Mikrotiterplatte wurde bei 4°C für etwa 18 h inkubiert, wonach die Platte viermal mit Waschpuffer (10 mM Tris, 0.15 M Natriumchlorid, 0.02% Natriumazid, 0.05% Tween 20 pH 7.2) unter Verwendung eines Dynatech MRW Plattenwaschgeräts gewaschen wurde. Dieses Waschverfahren wurde über den Rest des Verfahrens verwendet, außer wenn anders angegeben. Blockingpuffer (1.56 g/l Natriumdihydrogenorthophosphat, 8.8 g/l Natriumchlorid, 0.2 g/l Ficoll 400, 0.2 g/l Polyvinylpyrrolidon, 0.5% Rindergammaglobuline von Sigma, pH 7.4, 200 μl/Vertiefung) wurde zu der Platte zugegeben und bei 37°C in einem Dynatech Varishaker Inkubator für 1 h inkubiert. Alle folgenden Inkubationen bei 37°C wurden mit diesem Verfahren durchgeführt. Die Platte wurde viermal gewaschen, und dann wurde polyclonaler Kaninchen-Antikörper (100 μl/Vertiefung, 0-1 : 500000 Verdünnung), verdünnt in Testpuffer (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid, 0.5% BSA, 0.25% Rindergammaglobuline, 0.02% Natriumazid, pH 7.4}, zu der Platte. zugegeben und bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Platte wurde ein Anti-Kaninchen-IgG-biotinylierter Antikörper von Amersham (100 μl/Vertiefung, 1 : 5000 Verdünnung in Testpuffer) zu der Platte zugegeben und bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde gewaschen, und ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat von Amersham (100 μl/Vertiefung, 1 : 2000 Verdünnung in Testpuffer) wurde zu der Platte zugegeben und bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Platte wurde p-Nitrophenylphosphat (Sigma, 1 mg/ml), gelöst in 0.1 M Glycinpuffer (7.51 g/l Glycin, 203 mg/l Magnesiumchlorid, 136 mg/l Zinkchlorid, pH 10.4) zu der Platte zugegeben (100 μl/Vertiefung) und bei 37°C für 30 min inkubiert. Natriumhydroxid (2 M, 50 μl/Vertiefung) wurde zu der Platte zugegeben, und die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 405 nm mit einem Anthos Labtec Plattenleser gemessen. Antikörperfiter zwischen 1 : 500000 und 1 : 1000000 wurden erhalten.
Bestimmung der Antikörperspezifität
Um zu zeigen, dass die polyclonalen Kaninchen-Antikörper mit dem nicht-konjugierten PAA-CoA-Ligase-Peptid reagieren würden, wurde ein ELISA wie vorstehend beschrieben mit einer Modifikation im Inkubationsstadium, das die polyclonalen Kaninchen-Antikörper verwendete, durchgeführt. Die Antikörper wurden 1 : 100000-1 : 400000 in Testpuffer verdünnt, und 50 μl verdünnter Antikörper wurde zu den Vertiefungen zugegeben, enthaltend 50 μl nicht-konjugiertes Peptid (0-20 μg/ml), hergestellt in Testpuffer, enthaltend 2-Mercaptoethanol (0.01% Vol./Vol.). 50% Hemmung der Antikörperreaktivität mit dem OVA-Peptidkonjugat wurden mit einer Konzentration des nicht-konjugierten Peptids von etwa 2 μg/ml erreicht.
Beispiel 11 - Bestimmung der Antikörperspezifität auf Western Blots gegen PAA-CoA-Ligase in Extrakten von Penicillium chrysogenum, E. coli und auf gereinigten Proteinproben.
Aus Penicillium chrysogenum Schüttelkulturen (BW1901 und BW1900A - ein Stamm aus einem zufälligen Mutationsprogramm) und aus E. coli JM109 hergestellte Extrakte und Proben gereinigten PAA-CoA-Ligase-Proteins wurden wie in Beispiel 6 beschrieben Western geblottet, mit der Ausnahme, dass die Membran nicht mit Coomassie-Blau gefärbt wurde. Geblottete Membranen wurden in Blockingpuffer (1.56 g/l Natriumdihydrogenorthophosphat, 8.8 g/l Natriumchlorid, 0.2 g/l Ficoll 400, 0.2 g/l Polyvinylpyrrolidon, 0.5% Rindergammaglobuline, pH 7.4) gegeben und für etwa 18 h bei 4°C inkubiert. Die Membran wurde dann viermal mit Waschpuffer (10 mM Tris, 0.15 M Natriumchlorid, 0.05% Tween 20, pH 7.2) vor der Inkubation (Raumtemperatur, 60 min) mit den polyclonalen Kaninchen-Antikörpern, hergestellt wie in Beispiel 9 gegeben und zuvor 1 : 100 in Testpuffer (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid, 0.5% BSA, 0.25% Rindergammaglobuline, pH 7.4) verdünnt, gewaschen. Nach weiteren viermal Waschen in Waschpuffer wurde die Membran mit einem Esel-anti-Kaninchen-IgG-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Bio-Rad, 1 : 2000 in Testpuffer, 60 min, Raumtemperatur) inkubiert, gefolgt von weiteren viermal Waschen in Waschpuffer. Die Membran wurde dann mit einem Peroxidase-Substrat (Bio-Rad Meerrettichperoxidase-Konjugat-Substrat-Kit) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Waschen des Blots durch fünfmaliges Wechseln von destilliertem deionisiertem Wasser gestoppt wurde. Positive PAA-CoA-Ligase-Proteinproben waren solche mit einer Bande bei etwa 63 kDa, die mit der gereinigten PAA-CoA-Ligase-Bande comigrierten. Keine positive Bande bei 63 kDa wurde in dem E. coli JM109-Proteinextrakt nachgewiesen.
Beispiel 12 - Herstellung einer Penicillium chrysogenum-cDNA-Bank.
Eine cDNA-Bank von Penicillium chrysogenum (SmithKline Beecham Stamm BW1901) wurde nach dem Anleitungsheft von Stratagene ZAP Express^TM cDNA-Synthesekit hergestellt. RNA wurde aus dem Stamm BW1901 wie folgt isoliert. Stamm BW1901, gewachsen für 40 h, wie in Beispiel 1 gegeben, bevor das Mycel durch Filtration über zwei Whatman GF/A 9.0 cm Glasmikrofaser-Filter geerntet wurde. Das Mycel wurde dann in flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines DEPC-behandelten Mörsers und Pistills gemahlen. Das gefrorene, gepulverte Mycel wurde in ein 50 ml Zentrifugationsröhrchen, enthaltend 10 ml Lösung G (4 M Guanidiniumthiocyanat, 50 mM Tris.HCl pH 7.5, 25 mM EDTA), überführt. Das Pulver wurde in Lösung G resuspendiert und auf Eis für 15 min gelassen. Die Myceltrümmer wurden bei 17500 × g bei 4°C für 20 min pelletiert. Der Überstand wurde in einem anderen 50 ml Zentrifugationsröhrchen gesammelt, und die RNA wurde wie in Chomczynski und Sacchi (1987) Analytical Biochemistry 162, 156-159, extrahiert. Von der gesamten RNA wurde PolyA⁺RNA mit dem CP Laboratories Mini-Oligo(dT) Cellulose- Zentrifugationssäulen-Kit nach den Anleitungen des Herstellers isoliert. Die PolyA⁺RNA wurde durch Gelelektrophorese wie in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (zweite Ausgabe) analysiert. Aliquots (5 μg) von PolyA⁺RNA wurden genommen und verwendet, um doppelsträngige cDNA, flankiert von EcoRI-Restriktionsschnittstellen am 5'-Ende und einer XhoI-Restriktionsschnittstelle am 3'-Ende der cDNA, nach dem Stratagene ZAP ExpressTM cDNA-Synthese-Protokoll zu synthetisieren. Die so synthetisierte cDNA wurde dann durch Passage über Stratagene Sephacryl S-400 Zentrifugationssäulen, die mit dem cDNA-Synthesekit geliefert werden, nach den Anleitungen des Herstellers nach der Größe fraktioniert. Die nach der Größe fraktionierte cDNA wurde in die XhoI- und EcoRI-Arme von λZAP Express wie im Stratagene Anleitungsheft ligiert. Die ligierte λDNA wurde dann mit dem Stratagene Gigapack II Gold Verpackungskit nach dem Anleitungsprotokoll verpackt. Der resultierende cDNA-Phage wurde dann durch Ausplattieren und Inkubieren für 8 Stunden amplifiziert. Über 250,000 unabhängige Clone wurden erhalten, und der Phage wurde in 20 ml SM-Medium (0.1 M NaCl, 0.01 M MgSO₄, 0.05 M Tris-HCl pH 7.5, 0.01% Gelatine) pro Nunc-Platte eluiert, aliquotiert und wie in Sambrook et al. (1989) siehe dort gelagert.
Beispiel 13 - Immunoscreening der cDNA-Bank
Die λZAP Express cDNA-Bank aus Beispiel 12 wurde mit wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellten Antikörpern auf Clone durchsucht, die das 63 kDa-PAA-CoA-Ligase-Protein exprimierten. Die cDNA-Bank wurde wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort, abgesucht. Die λZAP Express-Bank wurde in geeigneten Verdünnungen in E. coli Stamm XL1 Blue MRF' infiziert. Die infizierten Bakterien wurden für 4 h auf Luria Agarose, enthaltend 10 mM MgSO₄, 0.2% Maltose und 5 mM IPTG (um die Expression des cDNA-Inserts zu induzieren) bei 37°C wachsen gelassen, bevor sie mit Nitrocellulose (Hybond-C super, Amersham) überschichtet und über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Die Filter wurden dann mit primären Kaninchen-Antikörpern (Beispiel 9) in 1/1000 Verdünnungen immundurchsucht, wobei der sekundäre Antikörper, Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Alkalische Phosphatase-Konjugat-Antikörper (Sigma Produkt A-8025) in 1/2000 Verdünnungen verwendet wurde. Die Lokalisierung positiver Clone wurde mit BCIP/NBT-Tabletten (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/nitroblautetrazolium), erhalten von Sigma (Produkt B-5655) und nach den Anleitungen des Herstellers verwendet, durchgeführt. Vierundzwanzig positive Clone wurden identifiziert und ausgestochen, resuspendiert in SM-Puffer (5.8 g/l NaCl, 2 g/l MgSO₄·7H₂O, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01% Gelatine) und bei einer niedrigeren Dichte von Plaques wieder durchsucht, bis ein positives Signal in einem einzelnen Plaque identifiziert werden konnte.
Beispiel 14 - Subclonierung positiver Clone.
Die positiven λZAP Express cDNA-Clone, die im Immunscreen identifiziert wurden (Beispiel 13), wurden dann als Plasmid pBKCMV-Derivate mit ExAssist-Helferphage und nach dem Auschneideprotokoll von Stratagene ausgeschnitten. Die Plasmidclone wurden dann wachsen gelassen (Kanamycin-Selektion) und Minipreps nach Sambrook et al. (1989), siehe dort, durchgeführt. Die erhaltenen Plasmide wurden dann durch XbaI/Sst1-Doppelverdaus analysiert, um die cDNA-Insertgröße der Clone zu charakterisieren. Die cDNA-Insertgröße lag zwischen 700 bp und 2.8 kb, wobei die größte Gruppe (12 Clone) eine Insertgröße von 2.0 kb besaß. Die Plasmide wurden auch mit Sau3A (4 Basenpaarspalter) gespalten, um die Gruppierung von Cloven auf der Grundlage ähnlicher Restriktionsmuster zu bestätigen. Auf diese Weise wurden die Clone in 6 Gruppen auf der Grundlage gemeinsamer Restriktionsverdaumuster geteilt.
Repräsentative Clone jeder Gruppe wurden dann auf die Herstellung des 63 kDa PAA-CoA-Ligase-Proteins durch Western-Analyse und auch auf Enzymaktivität getestet.
Beispiel 15 - Identifizierung positiver cDNA-Clone mit Western Blotting.
Proteinextrakte repräsentativer, ausgeschnittener, im Immunscreen positiver Clone wurden hergestellt durch Verwenden einer Übernachtkultur von E. coli-Clonen, gewachsen in Luria-Nährlösung mit Kanamycin (50 μg/ml), IPTG (5 mM) bei 25°C und Zugabe eines gleichen Volumens SDS-PAGE-Probenpuffers, gefolgt von Kochen und Elektrophorese wie in Beispiel 6. Die Proteine wurden dann Western geblottet, um die Anwesenheit des 63 kDa PAA-CoA-Ligase-Proteins (Beispiel 11) zu bestimmen. Immunfärbung der Membran wurde wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt, mit der Änderung, dass ein Anti-Kaninchen-IgG-Alkalische Phosphatase-Konjugat verwendet wurde (1 : 2000 Verdünnung in Testpuffer) und das Phosphatasesubstrat BCIP/NBT in Tablettenform (Sigma) geliefert und nach den Anleitungen des Herstellers verwendet wurde. Eine Gruppe von Cloven (cDNA-Insertgröße von 2.0 kb) wurde als ein 63 kDa Protein enthaltend identiziert (comigriert mit. BW1901-Kontrolle).
Beispiel 16 - Test von E. coli-Clonen auf Ligase-Aktivität.
Nährlösung, enthaltend E. coli-Zellen (gewachsen wie in Beispiel 15), wurde in einer gekühlten Denley-Zentrifuge bei 4000 × g, 4°C für 7 min zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen in Ligase-Testpuffer (Beispiel 2) in dem halben des 0riginalvolumens der Nährlösung resuspendiert. Die Zellen wurden dann vor der Beschallung, um die Zellen aufzubrechen, auf Eis gekühlt. Bedingungen zur Beschallung waren Output 5, 50% Duty Cycle auf einem Apollo Electronics-Ultraschallgerät für 30 s Beschallungen über 7 min auf Eis. Extrakte wurden entweder sofort verwendet oder bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. PAA-CoA-Ligase-Aktivität wurde mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Testverfahren nachgewiesen, mit der Ausnahme, dass 40 μl Extrakt verwendet wurden und das Reaktionsgemisch für 60 min bei 30°C inkubiert wurde. Die Anwesenheit von PAA-CoA in den Testüberständen wurde mittels HPLC wie in Beispiel 4 beschrieben zusätzlich mit einem Waters 996 Photodiodenreihen-Detektor für Spektralanalyse nachgewiesen. PAA-CoA-Ligase-Aktivität wurde in Clon 6.6 (repräsentativ für die Gruppe mit einer cDNA-Insertgröße von 2.0 kb) nachgewiesen, und die produzierte PAA-CoA wurde durch Diodenreihenanalyse gegen PAA-CoA-Standard bestätigt.
Beispiel 17 - Sequenz der 5'DNA von PAA-CoA-Ligase-Clonen.
Von Clon 6.6 (=pPEN09) wurde eine Maxiprep gemacht, und die DNA wurde durch CsCl-Gradienten wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort, gereinigt. Eine Restriktionskarte von pPEN09 wurde mittels Einzel- und Doppelspaltung (2) hergestellt. Dieser Clon wurde dann mit dem Primer (5'-ACAGGAAACAGCTATGACCTTG - 3') , erhalten von Cruachem und unter Verwendung des PharmaCla T7 Sequenzierungskits nach den Anleitungen des Herstellers sequenziert. Die nachstehend gezeigte Sequenz des 5'-Endes des cDNA-Inserts bestätigte, dass die translatierte Aminosäuresequenz am N-Terminus der cDNA mit der zuvor erhaltenen (Beispiel 6) Peptidsequenz übereinstimmte, mit der Ausnahme des Start-Methionins (nicht in der Peptidsequenz vorhanden).
Der Rest von pPEN09 wurde mittels Standard-Didesoxynucleotid-Abbruchreaktionen, enthaltend 7-Deaza-dGTP, sequenziert. [³⁵S]ATP wurde als eine Markierung verwendet. Die Sequenzreaktionen wurden auf 6% Polyacrylamidkeilgelen, enthaltend 8 M Harnstoff [Sauger et al. (1977) PNAS 74 5463-5467; Chen und Seeburg (1985) DNA 4 165-170], analysiert. Ineinanderpassende Deletionen wurden von sowohl den T7- als auch den T3-Enden mit ExoIII- und S1-Nuclease [Henikoff (1984) Gene 24 351-359] erzeugt. Die Deletionsclone wurden nach der Größe für die DNA-Sequenzierung durch Elektrophorese auf Agarosegelen nach der Größe ausgewählt. Die ausgewählten Clone wurden wie pPEN09 sequenziert. Interne Sequenzierungprimer wurden wie benötigt synthetisiert. Die vollständige Sequenz des cDNA-Inserts ist in 3 gezeigt. Die translatierte Proteinsequenz ist in 1 gezeigt.
Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des PAA-CoA-Ligase-Proteins mit der National Biomedical Research Foundation Proteinsequenzdatenbank (NBRF-PIR) und SWISS-PROT Proteinsequenzdatenbank (SWISS-PROT) auf DNASTAR-Software ergab die beste Übereinstimmung mit 4-Coumarat-CoA-Ligase der Kartoffel. Mit Hilfe des DNASTAR-Megaliga-Programms (Clustal-Verfahren) wurden das PAA-CoA-Ligase-Protein und die 4-Coumarat-CoA-Ligase der Kartoffel miteinander ausgerichtet. Die Analyse der Sequenzunterschiede ergab eine 25% Ähnlichkeit der Aminosäuren zwischen den zwei Proteinen. Ein ähnlicher Vergleich mit Acetyl-CoA-Synthetasen aus Pilzen (Penicillium, Aspergillus, Neurospora und Hefe) zeigte nur 15% Ähnlichkeit.
Die letzten drei Aminosäuren des PAA-CoA-Ligase-Proteins sind Serin-Lysin-Isoleucin. Diese Aminosäuresequenz stimmt mit dem Consensus für das C-terminale Mikrokörper-Richtungssignal (CMTS) überein, und dieselben Aminosäuren wurden als wichtig zur Anheftung des Hanseaula polymoipha-Katalaseproteins an die Mikrokörperchen betrachtet (Didion&Roggenkamp (1992) FEBS Lett. 303(2-3), 113-116). Das SKI C-terminale Tripeptid kann auch Proteine zum Mikrokörperchen in Neurospora crassa richten (de Zoysa&Connerton (1994) Curr. Genet. 26, 430-437). Der letzte Schritt der Penicillinbiosynthese, durchgeführt vom ACTF-Protein (unter Verwendung von PAA-CoA - das Produkt von PAA-CoA-Ligase), ist in Mikrokörperchen in P. chrysogenum lokalisiert worden (Muller et al. (1991) EMBO J. 10(2), 489-495). Das ACTF-Protein besitzt auch ein CMTS, das zur Anheftung an Mikrokörperchen erforderlich ist ( EP 0488 180 A2 ). Dass das PAA-CoA-Ligase-Protein ein CMTS besitzt, stimmt mit seiner Rolle in der Penicillin-Biosynthese überein.
Beispiel 18 - Hybridisierung genomischer DNA mit PAA-CoA-Ligase-cDNA-Sonde.
Genomische DNA einer Reihe von Stämmen, einschließlich Penicillium chrysogenum Wildtyp NRRL1951, BW1900A, BW1901, wurde wie folgt isoliert. Die Stämme wurden wie in Beispiel 1 wachsen gelassen und nach 40 h durch Filtration durch Whatman GF/A Glasmikrofaser-Filter geerntet. Das Mycel wurde in 0.9 M NaCl vor dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff gespült. Das Mycel wurde zu feinem Pulver in flüssigem Stickstoff gemahlen, und das Pulver wurde in Lösung G (Beispiel 12) resuspendiert, wobei es für 15 min auf Eis gelassen wurde. Die Mycelbruchstücke wurden bei 17500 × g bei 4°C für 20 min pelletiert. Der Überstand wurde in einem anderen 50 ml Zentrifugationsröhrchen gesammelt, und die DNA wurde mit Phenol/Chloroform pH 8.0 extrahiert, mit Chloroform extrahiert und Ethanol-präzipitiert wie in Sambrook et al (1989), siehe dort. Die Nucleinsäure wurde in 10 mM Tris.HCl pH 8.0, 1 mM EDTA resuspendiert, und die RNA wurde durch RNase-Behandlung wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort, entfernt. Die genomischen DNAs wurden mit BamHI gespalten, und die Spaltungen wurden der Elektrophorese unterzogen und auf eine Hybond N-Membran (Amersham) wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort, geblottet. Die Membran wurde mit dem cDNA-Insert von pPEN09 wie folgt hybridisiert : Die Membran wurde in 6 × SSC, 1% SDS, 6% PEG6000, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierter Heringssperma-DNA bei 60°C für 6 h prähybridisiert. Nach dieser Zeit wurde markiertes, denaturiertes cDNA-Fragment (unter Verwendung des Amersham Megaprime-Kits und ³²P-dCTP nach den Anleitungen des Herstellers) zu der Hybridisierungslösung gegeben, und die Hybridisierung bei 60°C über Nacht fortgesetzt. Die Membranen wurden dann bei 65°C in 2 × SSC, 0.1% SDS für 30 min (zweimal) gewaschen. Die Membranen wurden wie in Sambrook et al (1989), siehe dort, der Autoradiographie unterzogen. Die Ergebnisse zeigten ein einzelnes gemeinsames 8 kb BamHI-Fragment in allen Penicillium-Stämmen (einschließlich Wildtyp NRRL1951), das mit der cDNA-Sonde hybridisierte.
Beispiel 19 - Herstellung einer λEMBL3-Bank
Eine Schüttelkultur von P. chrysogenum SmithKline Beecham Stamm BW1900A wurde durch Animpfen mit einem Impfring voll Sporen in 50 ml ACM-Medien (20 g/l Malzextrakt, 1 g/l Bactopepton, 20 g/l Glucose) und Inkubieren unter Schütteln bei 25°C hergestellt. Nach. 40 h Wachstum wurde das Mycel durch Filtration durch Whatman GF/A Glasmikrofaser-Filter geerntet und in 0.9 M NaCl gespült. Das Mycel wurde dann in 0.9 M NaCl, enthaltend 10 mg/ml Novozym (Novo Biolabs, Novo Industri. Dänemark), resusendiert und bei 25°C für 2 h inkubiert. Die Protoplasten wurden von den Mycelbruchstücken durch Passage durch einen Baumwollfilter vor der Zentrifugation bei 4000 × g für 10 min gereinigt, um die Protoplasten zu pelletieren. Die Protoplasten wurden zweimal in 0.9 M NaCl vor der Zugabe von 4 M Guanidiniumthiocyanat, 50 mM Tris.HCl pH 7.5, 25 mM EDTA gespült, um die Protoplasten zu lysieren. Die Bruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand, enthaltend chromosomale DNA, wurde zu einem gleichen Volumen 8 M LiCl gegeben, sanft gemischt und bei –20°C für 30 min gelagert. Das Protein und einige RNA wurden dann durch Zentrifugation (10000 × g, 4°C, 10 min) pelletiert, und der Überstand, enthaltend chromosomale DNA, wurde Ethanol-präzipitiert. Die chromosomale DNA wurde teilweise mit Sau3A gespalten, und die fragmentierte chromosomale DNA wurde nach der Größe auf einem Saccharose-Dichtegradienten wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort, fraktioniert. Sau3A-Fragmente größer als 10 kb enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und zur Herstellung einer λEMBL3-Barik verwendet. Die genomischen Sau3A-Fragmente wurden mit den λEMBL3-BamHI-Armen, erhalten von Promega, ligiert. Die ligierte λDNA wurde dann mittels des Promega Packagene-Kits verpackt. Die verpackte λDNA wurde dann durch Infektion von E. coli Stamm LE392-Zellen amplifiziert, und die Plaques wurden auf einem Bakterienrasen ausplattiert und für 8 h bei 37°C wie in Sambrook et al (1989), siehe dort, inkubiert. Etwa 18000 unabhängige Clone wurden erhalten. Der Phage wurde in SM-Puffer eluiert und geeignet gelagert (wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort).
Beispiel 20 - Clonierung der genomischen DNA von PAA-CoA-Ligase.
Von dem cDNA-Clon 6.6 wurde ein Sstl-XbaI-Fragment, enthaltend das cDNA-Insert ( 2), verwendet als Sonde für eine λEMBL3-Bank (hergestellt in Beispiel 19) für Plaquehybridisierung wie in Sambrook et al. (1989), siehe dort (gleiche Bedingungen wie in Beispiel 18). Aus dem primären Screen wurden eine Reihe primärer Positiver identifiziert und diese wurden gepickt und für einen zweiten Screen bei niedrigeren Verdünnungen verwendet. Die Plaquehybridisierung wurde wiederholt, und einzelne Plaques wurden als hybridisierend mit der PAA-CoA-Ligase-cDNA-Sonde identifiziert. Diese λEMBL-Clone wurden gepickt und amplifiziert. Die λEMBL-Clone wurden mit jeweils BamHI, EcoRI oder SalI und allen paarweisen Kombinationen, neben Einzelspaltungen genomischer DNA von Stamm BW1900A gespalten. Die Spaltungen wurden der Elektrophorese unterzogen, geblottet und durch Southern-Hybridisierung charakterisiert, und Restriktionsfragmente, enthaltend das ganze PAA-CoA-Ligase-Gen, wurden identifiziert. Ein 6.5 kb-EcoRI-Fragment wurde von einigen der λEMBL-Clone genommen (dieselben Größenfragmente werden in chromosomalen DNA-Spaltungen gesehen) und in pIJ2925 subcloniert (G.R. Janssen und M.J. Bibb (1993) Gene 124(1), 133-134). Eine Restriktionskarte der genomischen DNA ist in 4 dargestellt.
Beispiel 21 – Transformation von P. chrysogenum Stamm BW1901 mit PAA-CoA-Ligase.
Der 6.5 kb-EcoRI-Subclou in pIJ2925 (Beispiel 20, =pAMX131) wurde mit einem linearen amdS-Fragment aus p3SR2 (Hynes et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439) verwendet, um Protoplasten von P. chrysogenum Stamm BW1901 zu co-transformieren (Verfahren wie Tilburn et al. (1984) Gene 26, 205-221). Transformanden wurden auf die Fähigkeit, Acetamid verwenden zu können, selektiert. Die Transformanden wurden dann auf PenV-Titer durchsucht. Eine Reihe von Transformanden besaß größere Mengen von PenV, verglichen mit BW1901-Kontrolle (bis 111% bei nochmaligen Tests), was möglicherweise die Integration beider Plasmide nahelegt. Solch ein Ergebnis würde die Rolle dieses Clons in der Penicillinbiosynthese unterstützen.

Claims

Isolierte DNA, umfassend (a) im wesentlichen die DNA-Sequenz in Figur 3/SEQ ID 2, und ein Polypeptid mit Phenylacetyl-Coenzym-A (PAA-CoA)-Ligase-Aktivität und einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 63 kD in SDS-PAGE codierend, erhältlich aus Penicillium chrysogenum durch Züchtung, Ernten, und Beschallen des Mycels, Entfernen von Zellbruchstücken und Fraktionieren des durch Beschallen aufgeschlossenen Materials durch Anionen-Austauschchromatographie, gefolgt von hydrophober Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie mit Substratelution und Gelfiltrationschromatographie, wobei die aktiven, chromatographischen Fraktionen durch einen PAA- und Coenzym A-abhängigen Test nachgewiesen werden; oder (b) eine DNA-Sequenz, die unter hoch-stringenten Bedingungen mit einer DNA nach (a) hybridisiert und die ein Polypeptid mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität und einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 63 kD in SDS-PAGE codiert.
Isoliertes Polypeptid mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität codiert von der DNA nach Anspruch 1.
Polypeptid nach Anspruch 2, das die Sequenz von N-terminalen Aminosäuren V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P einschließt.
Polypeptid nach Anspruch 2 oder 3, das im wesentlichen die Sequenz der Aminosäuren in Figur 1/SEQ ID 1 umfasst.
Vektor, umfassend DNA nach Anspruch 1 zur Expression eines Enzyms mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität in einem geeigneten Wirtsorganismus.
Wirt, der mit DNA nach Anspruch 1 transformiert ist.
Verwendung eines transformierten Wirts nach Anspruch 6 zur Herstellung von Penicillin, oder um den Titer eines Penicillin produzierenden Organismus' zu erhöhen.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit PAA-CoA-Ligase-Aktivität, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert worden ist, gefolgt von Extraktion und Reinigung, wobei die aktiven Fraktionen in einem PAA- und Coenzym A-abhängigen Test nachgewiesen werden.