CN1145699C - 来自产黄青霉的苯乙酰基CoA连接酶 - Google Patents

Abstract

从具有乙酸苯酯-CoA活性的产黄青霉制备酶的方法。还提供了编码该酶的DNA和其在利用修饰菌株进行生产中的用途。

Description

来自产黄青霉的苯乙酰基CoA连接酶

本发明涉及用于从青霉素生物合成有关的中间产物进行青霉素合成的酶。本发明还涉及制备该酶的方法和编码该酶的DNA。

在文献(Queener(1990)Antimicrobial Agents andChemotherapy 34(6)，943-948；Martin(1992)J.IndustrialMicrobiol  9，73-90；Luengo(1995)J.Antibiotics 48(11)，1195-1212)中公开了青霉素G的生物化学途径。从增加发酵过程的产率(效价)的角度看，该途径已进行了相当多的研究。

在产黄青霉中，通过连接酶(如PAA-CoA连接酶)，将乙酸苯酯(PAA)和苯氧基乙酸酯(POA)激活形成相应的CoA硫酯。然后用这些硫酯在PAA的情况下生物合成青霉素G，在POA的情况下生物合成青霉素V。因此认为PAA-CoA对于这些有商业价值的治疗用抗生素的生物合成是非常重要的。

一种来自恶臭假单胞菌、具有PAA-CoA连接酶活性的酶已被分离(J.Biol.chem.267(12)7084-7090(1990)，纯化过程包括硫酸铵沉淀和由DEAE-Sephacel柱以氯化钾洗脱。该酶分子量为48+/-1kD，最适pH为8.2，它参与PAA分解代谢。

已经由Kogekar&Deshpande(1983)(Ind.J.Biochem.Biophys20,208-212)和Brunner&Rohr(1975)(Methods Enzymol43,476-481)报道了曾试图用异羟肟酸酯方法(在540 nm检测苯乙酰-异羟肟酸酯或苯氧乙酰-异羟肟酸酯的比色法)检测产黄青霉中具有PAA-CoA连接酶活性的酶；但其他研究人员(Martinez-Blanco等(1992)J.Biol.Chem. 267(8)，5474-5481)认为该蛋白质不纯或未详细表征其活性。此外，后者不能用报道的方法得到所述酶。

WO 96/10085(Gist Brocades，1996年4月4日公开)对这些和其他分离在青霉素途径中起作用的PAA CoA连接酶的努力作了综述。在WO96/10085中提及，从PanLabs(USA)保存的产黄青霉B10菌株中，得到了酰基CoA合酶。该酶所具有的具体特性如下：分子量约50kDa(由凝胶过滤确定的)，最适pH为8到8.5(在pH7或以下，活性低)，最佳温度为40℃，pI高于7.25。重要的是，通过硫酸铵沉淀可纯化该酶。它具有相当宽的特异性(即，它可以催化从Mg²⁺、ATP、CoASH和苯氧乙酸、苯乙酸、己二酸或己酸形成相应的苯氧乙酰CoA、苯乙酰CoA、己二酰CoA和己酰CoA)，但对乙酸没有任何显著的活性。据说该酶还可通过还原剂来稳定。高浓度的硫酸铵或甘油也可稳定该酶。对于用公开的方法得到的酶活性没有任何纯度说明，尚未给出该酶的序列或N-末端序列，也未给出相应的DNA或其序列。

尽管进行了这些努力，但对在青霉属体内起作用的真正PAA-CoA连接酶仍了解得很少。已经推测，该酶可能与初级代谢有关(Smith等(1990)Biotechnology  8，39-41)。Martinez-Blanco等(1992)(出处同上)筛选了一种可能的候选酶，乙酰CoA合酶，在乙酰CoA合酶活性的基础上，从产黄青霉中纯化该酶。它们除可形成乙酸酯的CoA衍生物外，还可体外激活数种脂肪酸(C2-C8)和一些芳族分子(包括PAA)。

已经测定了乙酰CoA合酶基因(国际专利WO 92/07079，Gouka等(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol. 38，514-519，Martinez-Blanco等(1993)Gene  130,265-270)，并表明与其他真菌的乙酰CoA合酶有同源性。但用氟乙酸筛选的该基因中的突变似乎并未改变青霉素生产水平(国际专利WO 92/07079)，这说明实际上体内的另一种酶激活了PAA。

在本发明中，研究了直接检测PAA-CoA连接酶活性的方法以及具体的纯化方法，这样可以纯化并随后克隆被认为是真正的PAA-CoA连接酶。本发明分离的酶与上述提到的乙酰CoA合酶有不同的N-末端氨基酸序列，并具有许多不同的特性(如分子量)，这表明已分离到一种与迄今发现有这种作用的酶不同的酶。本发明分离的这种酶的特性包括对CoASH底物的绝对依赖性，而Kogekar&Deshpande(1983)(出处同上)分离的酶可在除去了CoASH的条件下检测。分离的蛋白质的这种和其它差异(如最适pH和在下列实施例中的其它特征)表明本发明的酶不同于现有技术中描述的任何酶。因此认为是本发明的工作第一次从青霉属中分离了纯化形式的PAA-CoA连接酶。具体地说，SKIC-末端肽的存在与青霉素生物合成中有实际作用的这种酶一致。本发明的酶不同于上述WO 96/10085中的酶，即分子量不同，本发明的酶(不像WO 96/10085的酶)对硫酸铵沉淀和盐酸盐敏感。

因此，本发明提供了可从产黄青霉中获得的具有PAA-辅酶A连接酶活性的酶，所述酶是通过培养、收集并超声处理菌丝体，除去细胞碎片，用阴离子交换色谱分离超声处理物，然后通过疏水相互作用色谱、以底物洗脱的亲和色谱以及凝胶过滤色谱分离的，其中用PAA和CoA依赖性试验检测有活性的色谱馏份。

酶优选是纯化形式，最好是基本上纯的形式。本发明的酶的表观分子量为63kDa(通过SDS PAGE测量的)。

优选所述酶包含如下的N末端氨基酸序列：

VFLPPKESGQLDP

具体地说，所述酶含有图1/ID SEQ 1的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了制备具有PAA-CoA连接酶活性的酶的方法，所述方法包括培养青霉属菌，然后提取并纯化，其中用PAA和CoA依赖性试验检测有活性的色谱馏份。具体地说，青霉属菌是产黄青霉，通过超声处理菌丝体，然后通过阴离子交换、疏水相互作用亲和色谱和凝胶过滤色谱分离以便使纯度提高近1000倍。

可在体外生物转化中使用所述酶。例如当与酰基-CoA：6-APA酰基转移酶混合时，用于CoA酯合成或青霉素合成。可用全细胞、无细胞提取物、透化处理的细胞或从微生物中分离的酶或上述的固定化形式来完成体外生物转化。

若用全细胞完成生物转化，则微生物可以是正在生长的培养物、静止的培养基、洗涤过的菌丝体、固定化的细胞或原生质体。

使用无细胞提取物时，则可通过剪切和/或化学或酶溶解或其它破碎方法(优选超声处理)适当地得到，在上述破碎过程后，也可除去细胞碎片，将酶活性保留在溶液中。

用市售的产黄青霉株(包括野生型NRRL 1951)，按照下列实施例来适当地制备所述酶。其它适宜的产黄青霉菌株包括高产青霉素菌株如BW1901(EMBO J.9(3)，741-747(1990)D.J.Smith等)。

通过用常规方法，特别是在适宜的液体或半固体培养基中好气条件下，培养微生物来制备所述酶。培养条件的温度为5-50℃，优选25～30℃，pH为3-9，优选6-8，最优选7.2。

可以分离所述酶，并以纯化形式、部分纯化形式(以不纯状态得到的)、来自破碎细胞制品的滤液、粗细胞匀浆物等形式使用。最适宜的例如至少是除去了其它酶的纯化的酶，所述的其它酶可催化原材料或酶的裂解。

最适宜的是例如通过Powell(1990)(Microbial Enzymes andBiotechnology编辑，Fogarty&Kelly，369-394页)讨论的方法固定在不溶支持物上的酶。这样有利于提高产率和产出。

若用全细胞完成生物转化，则适宜的培养基包括：溶解在1升pH6.5的去离子水或可进行pH调整的水系统中的KH₂PO 2g，K₂HPO1.5g，KCl 0.2g，MgCl₂·6H₂O 0.2g，Na₂SO₄·10H₂O 0.22g，葡萄糖1.0g。

若用无细胞提取物完成生物转化，则培养基含有适宜的缓冲液。除底物外，酶反应混合物可含有一种或多种其它辅因子如金属离子或稳定剂如硫醇。

适宜地是在含水培养基中完成生物转化，将反应混合物适宜地保持在pH4-10，更适宜的是6-10，优选在9.0左右。用缓冲液或优选通过加入酸或碱滴定液来适当地控制pH。反应温度通常应在5-50℃，优选22-45℃，最优选30-37℃。另外，可在有机溶剂中或存在有机溶剂如丙酮、甲基异丁基酮(MIBK)的条件下完成反应。

反应时间取决于如下因素：反应剂和辅因子的浓度、温度和pH。反应完成后，可用常规方法分离产物。最初的纯化包括色谱较为便利。

本发明的另一方面还提供了编码本发明PAA-CoA连接酶的DNA。编码所述蛋白质的基因在图2所示的DNA片段内。具体地说，所述DNA基本上包括图3/ID SEQ 2的DNA序列。

在图2中，标明通过琼脂糖凝胶电泳，用大小测定试验确定DNA的近似长度(以kb计)。应理解该图并未标明所述DNA上的所有限制位点。

应理解本发明的DNA并不是其天然产生的天然状态，而是分离的或基本上纯的形式。还应理解本发明包括限制位点的精确构型未予标明的DNA，只要所述DNA是以标准技术衍生于根据本发明上述任何方面的DNA，所述标准技术包括核苷酸缺失、置换、插入或倒位。

优选，本发明的DNA来自产黄青霉。但本发明还包括来自其它适宜生物体，特别是除产黄青霉以外的其它生产菌株的DNA序列，所述序列并没有所表明的限制位点的构型，但其(优选在高严紧度条件下)与图2所示的DNA或其亚片段杂交，并编码PAA-CoA连接酶或具有PAA-CoA连接酶活性的酶(高严紧度条件例如是实施例18所给的条件)。

本发明还提供了含所述DNA的载体，优选用于在适宜宿主生物中表达PAA-CoA连接酶的表达载体。所述表达载体的具体实例是pBK-CMV(购自Stratagene)，在本发明中用于在大肠杆菌中表达。在本发明中，PAA-CoA连接酶的cDNA插入片段(＝pPEN09，图2)是用于大肠杆菌中表达的优选载体。

本发明的DNA和含所述DNA的载体可用于许多工业领域。用所述载体转化的宿主微生物和它们表达的酶也有同样的用途。例如可用所述DNA作为杂交探针以便在产黄青霉(NRRL1951)和产生相似结构和特异性酶的其它微生物的总细胞DNA中鉴定并分离相关或重叠的基因。

含所述DNA的重组载体是很有价值的，当转化到适宜的宿主中时，可以产生合成的青霉素量增加的遗传工程修饰的微生物。

还很有利的是提高适宜生物体中PAA-CoA连接酶活性的量。还可将重组载体经基因转移过程用于生产新或杂合抗生素(参见例如D.A.Hopwood等，Nature，1985，314，642-644)。本发明DNA编码的酶可用于例如，无细胞系统，尤其是固定在适宜的固相支持物上时，以便从天然前体制备已知抗生素或从例如用化学合成得到的“非天然”前体来制备新抗生素。

通过重组DNA技术或天然重组方法，可将本发明的DNA或其片段(不必携带完整基因)与生物合成中的基因片段连接，以产生指导杂合酶合成的杂合基因。可用所述酶通过与前述类似的方法生产新抗生素。

还可通过已知的定点诱变(以与例如由G.Winter等，Nature，1982，299，756-758；或Zoller and Smith，Nucleic AcidsResearch，1982，10，6487-6500所述类似的方式)修饰本发明的DNA以得到其中已产生了特定突变和/或缺失的DNA。可用突变的DNA从适宜的宿主微生物中得到产率(或效价)增加的青霉素。

通过基因转移，还可将突变的DNA用于生产新的或杂合抗生素，或用于生产突变酶(突变蛋白质)，可将所述突变酶通过与前述类似的方法生产新抗生素。还可将突变的DNA用于改变适宜生物体的其它发酵特性，如PAA耐受性，改变的底物。

用下列实施例来说明本发明。

实施例1  产黄青霉发酵

将产黄青霉(SmithKline Beecham菌株BW1901)的孢子接种到100ml摇瓶内的15ml PVS培养基(35g/l玉米浆，15g/l葡萄糖，5g/lCaCO₃，8ml/l菜籽油，用NaOH将pH调到5.9)中。26℃，使培养物生长48小时，同时旋转振荡(230rpm)，然后取1ml的全培养液并转移到100ml摇瓶内的10ml C5培养基(35g/l玉米浆，85g/l乳糖，10g/l CaCO₃，10g/l NaH₂PO，8g/l(NH₄)₂SO₄，4g/lMgSO₄·7H₂O，4g/l NaSO₄，6ml/l菜籽油，6g/l苯氧乙酸，用NaOH将pH调到6.0)中。收集菌丝体前，在26℃使培养物再生长55小时，同时旋转振荡(230rpm)。

实施例2  从产黄青霉中制备蛋白质提取物用于PAA-CoA连接酶的检测、纯化和Western印迹

通过玻璃微纤维过滤器(Whatman GF/A)过滤收集实施例1所述C5摇瓶培养55小时的菌丝体。用300ml 0.9％(w/v)氯化钠(4℃)洗涤菌丝丛(mat)，然后从过滤器上刮下，放到10ml连接酶检测缓冲液(30mM Tris-HCl pH9.0，1mM二硫苏糖醇，在50％甘油中的100μg/mlPefabloc^TM)中。然后在冰上超声处理菌丝体(用UltrasonicsW-385型超声处理仪进行3×15秒脉冲，功率设置5，循环速率5秒，50％工作循环)，然后离心(18000xg，4℃，30分钟)沉淀菌丝体碎片。将上清液于-70℃冷冻保藏或立即用于PAA-CoA连接酶的检测、纯化或Western印迹(实施例7)。

实施例3 PAA-CoA连接酶的体外检测

为了确定在提取物或柱馏份中是否存在PAA-CoA连接酶活性，在塑料微量离心管中，将20μl与50mM Tris-HCl(pH7.5)(20μl)中的0.1M苯乙酸、0.1M ATP钠(10μl)、0.2M氯化镁(10μl)、0.02M CoA钠(10μl)和0.015M二硫苏糖醇(10μl)混合。将试管涡旋混合(5秒)，然后在30℃水浴中放置15分钟。然后将甲醇(100μl)加到混合物中，并将试管离心(14K，1分钟)以沉淀蛋白质。用HPLC(实施例4)分析上清液馏份中是否存在PAA-CoA。在各组试验中，用PAA-CoA标准作为阳性对照，检测从产黄青霉摇瓶发酵(实施例1)制备的蛋白质提取物。

实施例4  试验上清液的HPLC分析

用Waters LCM1 HPLC系统分析来自PAA-CoA连接酶试验(实施例3)的上清液样品是否存在PAA-CoA。室温将样品(100μl)注射到Radial Pak C18压缩柱上，流速为2.5ml/分钟，在0-4分钟用0.2M磷酸钠pH5.4(缓冲液A)的流动相无梯度洗柱。然后用增加至100％缓冲液B的线性梯度洗柱(4～10分钟)，缓冲液B含有在40％乙腈中的0.16M磷酸钠pH5.4。将100％的缓冲液B再保持2分钟，然后再平衡系统以备用于下一次注射，这次注射试验回到100％A的线性梯度(12-13分钟)。检测到260nm的峰，PAA-CoA的保留时间为12分钟。阳性样品与PAA-CoA标准有共洗脱峰并与用光电二极管矩阵分光光度计测定的标准有相同的UV吸收谱。

实施例5 PAA-CoA连接酶的纯化

由于发现酶活性极不稳定，所以要很仔细。由于在所得到的物质中没有活性，所以用硫酸铵沉淀酶的努力没有成功。这本身就将本发明的酶与WO 96/10085(Gist-Brocades)中所述的酶区别开。除非特别说明，下列过程在4℃完成，使用含30mM Tris-HCl，4mM EDTA，5mMMgCl₂和20％甘油(v/v)pH9.0的缓冲液C。用Pharmacia Hi-Load^TM系统完成分离。在4℃缓慢融解在实施例1中所制备的无细胞提取物(500ml)。然后用5M NaOH将提取物的pH调到9.0，同时在冰上搅拌。向该搅拌中的提取物加入已经用3升水，然后用1升缓冲液C洗涤过的275g Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)离子交换基质。将所述混合物在冰上搅拌1.5小时。用减压，在玻璃烧结物上，通过50g洗涤过的Q-Sepharose树脂过滤浆液。然后再用100ml缓冲液C洗涤树脂并使其干燥，得到600澄清的含PAA-CoA连接酶的提取物。然后加入硫酸铵(92.4g即亚沉淀水平)，将溶液在冰上搅拌1小时，然后过滤(0.45μm过滤器，Millipore，HA型)。

然后将PAA-CoA连接酶提取物(700ml)以1ml/分钟上样到Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow，低取代柱(Pharmacia，直径2.6cm×12cm)上，该柱已先用1升缓冲液D(缓冲液C加140g/l硫酸铵)处理。然后以0.8ml/分钟，用230ml缓冲液D洗涤上样的柱，再以0.8ml/分钟，用238ml 100％缓冲液D到100％缓冲液C的线性梯度洗脱。收集5.5ml的馏份，按照实施例3所述检测PAA-CoA连接酶活性。合并活性馏份41-49共50ml，以0.5ml/分钟上样到预先用50ml缓冲液C洗涤过的5ml HiTrap^TM Blue亲和柱(Pharmacia)上。用15ml缓冲液C洗涤上样后的柱，然后以0.5ml/分钟用25ml 100％缓冲液C到100％缓冲液E的线性梯度洗脱。缓冲液E是缓冲液C加终浓度为0.5M的苯乙酸，再用固体氢氧化钠将pH调到9.0。用天然底物从亲和柱上进行洗脱以提高纯化选择性并在所得的馏份中测量酶活性。氯化钠洗脱未获得成功，因为这种盐抑制了酶活性。相反，当用氯化钾洗脱时，WO 96/10085中所述的酶似乎是稳定的。

合并活性馏份21、22和23共6ml，然后以0.25ml/分钟在Sephacryl S-200高效大小排阻柱(Pharmacia，直径2.6cm×64cm)上分离，该柱已预先用缓冲液F(用5M盐酸将缓冲液C的pH调到7.5)平衡过。合并活性馏份54到65共11ml，然后通过离心超滤(Centricon10,000MW截留，Amicon Inc.)浓缩到60μl。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(实施例6)分析大小排阻柱的馏份表明有63 kDa的蛋白质，其强度与PAA-CoA连接酶活性相关。用Western印迹(实施例6)完成纯化并进行PAA-CoA连接酶的N末端氨基酸测序。

实施例6 PAA-CoA连接酶蛋白质的Western印迹

为了提供用于N末端氨基酸测序的材料，将纯化的蛋白质(60μl，实施例5)与等体积的SDSpPAGE样品缓冲液混合，所述缓冲液含有0.5M Tris-HCl pH6.8(10ml)，十二烷基硫酸钠(2g，超纯的)，2-巯基乙醇(1ml)，甘油(10ml)，蒸馏的去离子水(7ml)和0.1％溴氯酚蓝(2ml)。将该混合物煮沸10分钟，然后冷却到室温。将试样(5，15和20μl)上样到10％聚丙烯酰胺凝胶(4％堆积凝胶)上，所述凝胶是用制造商的方法，通过浇铸到Bio-Rad Protean ll电泳槽中而制备的。以200V，在电极缓冲液中经45分钟完成电泳，所述电极缓冲液含有0.025M Tris，0.192M甘氨酸和0.1％w/v十二烷基硫酸钠(超纯的)，此后将聚丙烯酰胺凝胶在电印迹缓冲液(在10％甲醇中的10mM 3-[环己基氨基]-1-丙磺酸，pH11)中放置5分钟。按照Applied Biosystems的方法，用Bio-Rad Mini Trans-Blot电泳转移槽将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到Applied Biosystems ProBlott^TM固定膜上。印迹完成后，膜按照Applied Biosystems的染色方法用考马斯蓝R-250染色。从膜上切下63kDa的蛋白质带，用该材料进行N末端氨基酸测序(实施例7)。

实施例7  N末端氨基酸测序

用Applied Biosystems(ABI)477A脉冲液体测序仪，从印迹的蛋白质(实施例6)得到N末端氨基酸序列。用ABI 120埃小径色谱，通过检测释放的PTH标记的氨基酸，经标准Edman化学法得到序列。纯化的PAA-CoA连接酶蛋白质的分析得到下列序列：

V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P

实施例8  合成PAA-CoA连接酶N末端肽

用从63 kDaPAA-CoA连接酶蛋白质(实施例7)确定的N末端氨基酸序列来合成肽。这是通过Peptide and Protein Research Consultants(Washington Singer Laboratories，University of Exeter，PerryRoad，Exeter，Devon EX4 4QG，UK)，作为50mg游离肽来合成的。用SMCC(琥珀酰基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物)，将12mg与马来酰亚胺激活的BSA(牛血清白蛋白)结合，用MBS(m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，将2.5mg与马来酰亚胺激活的OVA(卵白蛋白)结合。

实施例9  生产抗衍生于63kDa PAA-CoA连接酶的N末端之肽的多克隆抗体

将与BSA结合的肽(实施例8)用于生产63kDa PAA-CoA连接酶蛋白质特异性的兔多克隆抗体。将肽-BSA结合物(375μg/ml)过滤除菌(0.2μm滤器)，将1ml的无菌溶液与2ml非溃疡性弗氏完全佐剂(Brain Morris International，Guidford U.K.)完全混合。在4个不同的注射位点将共0.8ml的该混合物(100μg的肽-BSA结合物)皮下注射给新西兰白兔(约10周龄)。在上述初次免疫接种后28和58天进行再免疫接种，所不同的是使用非溃疡性弗氏不完全佐剂。在初次免疫接种后42和72天，从耳缘静脉取试验血样以便用酶联免疫吸附试验评估抗体滴度和特异性(实施例10)。

实施例10  用于确定63 kDa PAA-CoA连接酶的抗体滴度和特异性的酶联免疫吸附试验(ELISA)

抗体滴度的确定

用PAA-CoA连接酶肽-OVA结合物(200μl/孔，0-10μg/ml)溶解在磷酸缓冲盐水pH7.2(8g/l氯化钠，0.2g/l氯化钾，1.44g/l正磷酸二氢钠，0.24g/l正磷酸二氢钾，pH7.2)包被96孔平底微滴定板(Nunc MaxiSorp^TM)。4℃将包被的微滴定板保温约18小时，此后通过Dynatech MRW洗板机，用洗涤缓冲液(10mM Tris，0.15M氯化钠，0.02％叠氮化钠，0.05％吐温20pH 7.2)将滴定板洗涤4次。除非特别说明，该洗涤方法贯穿本过程的始终。将封闭缓冲液(1.56g/l正磷酸二氢钠，8.8g/l氯化钠，0.2g/l ficoll400，0.2g/l聚乙烯吡咯烷酮，0.5％来自Sigma的牛γ球蛋白，pH7.4，200μl/孔)加到滴定板中，然后在Dynatech Varishaker培养箱中37℃保温1小时。所有随后在37℃的保温均用该方法完成。将滴定板洗涤4次，然后将用试验缓冲液(50mM Tris，150mM氯化钠，1mM氯化镁，0.5％BSA，0.25％牛γ球蛋白，0.02％叠氮化钠，pH7.4)稀释的兔多克隆抗体(100μl/孔，0-1∶500 000稀释度)加到滴定板中并在37℃保温。洗涤滴定板后，将来自Amersham的抗兔IgG生物素化抗体(100μl/孔，用试验缓冲液以1∶5000稀释)加到滴定板中，并在37℃保温。洗涤滴定板并将来自Amersham的链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶结合物(100μl/孔，用试验缓冲液以1∶2000稀释)加到滴定板中，然后在37℃保温。洗涤滴定板后，将溶解在0.1M甘氨酸缓冲液(7.51g/l甘氨酸，203mg/l氯化镁，136mg/l氯化锌，pH10.4)中的磷酸对硝基苯基酯(Sigma，1mg/ml)加到滴定板(100μl/孔)中，然后在37℃保温30分钟。然后将氢氧化钠(2M，50μl/孔)加到滴定板中，用Anthos Labtec读板仪测量各孔在405nm的吸收值。抗体滴度在1∶500 000-1∶1000 000之间。

抗体特异性的确定

为了说明兔多克隆抗体与未结合的PAA-CoA连接酶肽反应，按上述完成ELISA，不同之处是在保温阶段试验兔多克隆抗体。用试验缓冲液将抗体以1∶100000-1∶400000稀释，将50μl稀释的抗体加到含50μl未结合肽(0-20μg/ml)的孔中，所述肽是用含2-巯基乙醇(0.01％，v/v)的试验缓冲液制备的。在未结合肽浓度为约2μg/ml时，达到抗体与OVA-肽结合物的50％抑制。

实施例11  在来自产黄青霉、大肠杆菌提取物中的PAA-CoA连接酶的Western印迹和纯化蛋白质样品上确定抗体的特异性

按照实施例6所述，对从产黄青霉摇瓶培养物(BW1901和BW1900A-衍生于随机突变过程的菌株)、大肠杆菌JM109制备提取物，纯化的PAA-CoA连接酶样品进行Western印迹，所不同的是不用考马斯蓝将膜染色。将印迹的膜放在封闭缓冲液(1.56g/l正磷酸二氢钠，8.8g/l氯化钠，0.2g/l ficoll 400，0.2g/l聚乙烯吡咯烷酮，0.5％牛γ球蛋白，pH7.4)中，然后在4℃保温约18小时。然后用洗涤缓冲液(10mM Tris，0.15M氯化钠，0.05％吐温20，pH7.2)将膜洗涤4次，此后与按照实施例9产生并预先用试验缓冲液(50mM Tris，150mM氯化钠，1mM氯化镁，0.5％BSA，0.25％牛γ球蛋白，pH7.4)以1∶100稀释的兔多克隆抗体一起保温(室温，60分钟)。再用洗涤缓冲液洗涤4次后，将膜与驴抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物一起保温(Bio-Rad，用试验缓冲液以1∶2000稀释，室温60分钟)，然后再用洗涤缓冲液洗涤4次。然后将膜与过氧化物酶底物(Bio-Rad辣根过氧化物酶底物试剂盒)在室温保温10分钟，然后用蒸馏的去离子水将印迹洗涤5次从而停止反应。阳性PAA-CoA连接酶蛋白质样品是有一约63kDa带的蛋白质，该带与纯化的PAA-CoA连接酶带共迁移。在大肠杆菌JM109蛋白质提取物中未检测到63kDa的带。

实施例12构建产黄青霉cDNA文库

按照来自Stratagene’s ZAP Express^TM cDNA合成试剂盒的说明构建产黄青霉(SmithKline Beecham菌株BW1901)的cDNA文库。按下述方法从BW1901菌株中分离RNA。按照实施例1所述，使BW1901菌株生长40小时，然后通过两个Whatman GF/A 9.0cm玻璃微纤维过滤器过滤收集菌丝体。用100ml DEPC(焦碳酸二乙酯，diethylpyrocarbanate)处理的蒸馏水洗涤菌丝体。用DEPC处理的研钵和杵在液氮中研磨菌丝体。将冷冻的粉末状菌丝体转移到含10ml溶液G(4M硫氰酸胍，50mM Tris-HCl pH7.5，25mM EDTA)的50ml离心管中。将粉末重悬在溶液G中，并在冰上放置15分钟。4℃以17500xg离心20分钟来沉淀菌丝体碎片。将上清液收集到另一50ml离心管中，然后按照Chomczynski和Sacchi(1987)(AnalyticalBiochemistry  162，156-159)所述抽提RNA。从总RNA中，用CPLaboratories Mini-Oligo(dT)纤维素旋转柱试剂盒，按照制造商的说明分离polyA⁺RNA。按照Sambrook等(1989)(分子克隆手册，第二版)通过凝胶电泳分析polyA⁺RNA。取polyA⁺RNA的小样(5μg)并按照Stratagene’s ZAP Express^TM cDNA合成方法，用于合成双链cDNA，在该cDNA的5’末端为EcoRI限制位点，在其3’末端为XhoI限制位点。按照制造商的说明，将由此合成的cDNA过cDNA合成试剂盒提供的Stragene’s Sephacryl S-400旋转柱进行大小分离。按照Stratagene的说明手册，将大小分离的cDNA连接到λZAP Express的Xhol和EcoRI臂中。然后用Stratagene’s Gigapack II Gold包装试剂盒按照说明的方法，包装连接的λDNA。然后通过铺开，保温8小时来扩增所得的cDNA噬菌体。得到250000多个独立的克隆，用每Nunc平板20ml SM培养基(0.1M NaCl，0.01M MgSO₄，0.05M Tris-HCl pH7.5，0.01％明胶)稀释，分成等份并按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)贮存。

实施例13  cDNA文库的免疫筛选

用实施例9中制备的抗体，从实施例12的λZAP Express cDNA文库筛选表达63kDa PAA-CoA连接酶蛋白质的克隆。按照Sambrook等(1989)所述筛选cDNA文库(出处同上)。以适宜的稀释度，将λZAPExpress cDNA文库感染到大肠杆菌菌株XL1 Blue MRF’中。使感染的细菌在含10mM MgSO₄，0.2％麦芽糖和5mM IPTG(以诱导cDNA的表达)的Luria琼脂糖上37℃生长4小时，然后用硝酸纤维素(Hybond-C super，Amersham)覆盖并在37℃保温过夜。然后用以1/1000稀释的初次免疫兔抗体(实施例9)免疫筛选滤膜，而使用稀释度为1/2000的第二抗体，山羊抗兔IgG碱性磷酸酶结合物抗体(Sigma产品，A8025)。用从Sigma(产品B-5655)购买的BCIP/NBT片(5溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮兰四唑)完成阳性克隆的定位，并按照制造商的说明使用。鉴定了24个阳性克隆，它们集中在一起，重悬在SM缓冲液(5.8g/l氯化钠，2g/l MgSO₄·7H₂O，50mM Tris-HCl pH7.50.01％明胶)中并以更低的噬菌斑密度再筛选直到可以鉴定单个噬菌斑的阳性信号。

实施例14  阳性克隆的亚克隆

用ExAssit辅助噬菌体和Stratagene提供的切割方法，将从免疫筛选鉴定的阳性λZAP Express cDNA克隆切下作为质粒pBKCMV衍生物。使质粒克隆生长(卡那霉素选择)，然后用Sambrook等(1989)的方法(出处同上)小量制备。通过Xbal/Sstl双酶切分析所得的质粒以鉴定克隆的cDNA插入片段的大小。cDNA插入片段的大小在700bp-2.8kb之间，最大的组(12个克隆)有2.0kb的插入片段。还用Sau3A(4个碱基对的切割)消化质粒以便以相似的限制图谱为基础确定克隆组。在共同的限制消化图谱基础上，用该方法将克隆分成6个组。然后用Western分析检测来自各组的代表性克隆是否生产了63kDa的PAA-CoA连接酶并检测酶活性。

实施例15  用Western印迹说明阳性cDNA克隆

取大肠克隆过夜培养物由代表性切割的免疫筛选阳性克隆制备蛋白质提取物，所述大肠杆菌克隆是在25℃于加卡那霉素(50μg/ml)、IPTG(5mM)的Luria肉汤中生长的，然后按实施例6所述加入等体积SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸，电泳。然后Western印迹蛋白质以确定是否存在63kDa的PAA-CoA连接酶蛋白质(实施例11)。按照实施例11所述完成膜的免疫染色，但使用抗兔IgG碱性磷酸酶结合物(用试验缓冲液以1∶2000稀释)，磷酸酶底物是以片形式供应的BCIP/NBT(Sigma)，并按照制造商的说明使用。鉴定出一组克隆(eDNA插入片段的大小为2.0kb)有63kDa蛋白质(与BW1901对照共迁移)。

实施例16检测大肠杆菌克隆的连接酶活性

用Denley冷冻离心机，以4000xg于4℃将含大肠杆菌细胞(按实施例15培养)的肉汤离心7分钟以沉淀细胞。弃去上清液，以原肉汤体积的一半将细胞重悬在连接酶试验缓冲液(实施例2)中。然后将细胞在冰上冷却，此后进行超声处理以破碎细胞。超声处理的条件是输出为5，在Apollo Electronics Sonicator上30秒的脉冲以50％的工作循环在冰上处理7分钟。提取物要立即使用或于-80℃贮存直到使用。按照实施例3中所述的试验方法确定PAA-CoA连接酶活性，不同之处是试验40μl的提取物并将反应混合物在30℃保温60分钟。按照实施例4所述，用HPLC同时加上用于光谱分析的Waters 996光电二极管矩阵检测仪分析试验上清液中是否存在PAA-CoA连接酶。在克隆6.6(cDNA插入片段为2.0kb组的代表性克隆)中检测到PAA-CoA连接酶活性，用二极管矩阵分析对PAA-CoA标准进行分析来确证生产的PAA-CoA。

实施例17 PAA-CoA连接酶克隆的5’DNA序列

大量制备克隆6.6(＝pPEN09)并按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)通过CsCl梯度纯化DNA。通过单和双酶消化(图2)来制备pPEN09的限制图谱。用从Cruachem购买的引物(5’-ACAGGAAACAGCTATGACCTTG-3’)和Pharmacia的T7测序试剂盒并按照制造商的说明确定该克隆的序列。下面所列的cDNA插入片段的5’末端序列表明翻译的cDNA N-末端的氨基酸序列与以前得到的肽序列(实施例6)一致，只有起始的甲硫氨酸(肽序列中没有)不同。TCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTTTCCTGCACTTTGGAGACCTGCCC-26CTATATTACCCCGAGGATTTGGGAAA ATG GTT TTT TTA CCT 15

                       M   V   F   L   P   5CCA AAG GAG TCC GGT CAA TTG GAC CCA ATT CCC 48P   K   E   S   G   Q   L   D   P   I   P   16GAC AAT ATT CCA ATC AGC GAG TIT ATG CTC AAT 81D   N   I   P   I   S   E   F   M   L   N   27

用含7-脱氮dGTP的标准双脱氧核苷酸终止反应确定pPEN09剩余部分的序列。用[³⁵S]dATP作为标记。在含8M脲的6％聚丙烯酰胺楔形凝胶上分析测序反应[Sanger等(1977)PNAS  74，5463-5467；Chenand Seeburg(1985)DNA  4，165-170]。用ExoIII和S1核酸酶从T7和T3末端产生嵌套缺失[Henikoff(1984)Gene  24，351-359]。通过琼脂糖凝胶上的电泳，对缺失克隆进行大小筛选以用于DNA测序。筛选的克隆是待测序的pPEN09。按需要合成内测序引物。在图3中列出了cDNA插入片段的完整序列。图1中列出了翻译的蛋白质序列。

在DNASTAR软件上将推测的PAA-CoA连接酶蛋白质的氨基酸序列与国家生物医学研究基金蛋白质序列数据库(NBRF-PIR)和SWISS-PROT蛋白质序列数据库(SWISS-PROT)进行比较后，表明其与来自马铃薯的4-香豆酸酯-CoA连接酶匹配得最好。用DNASTAR兆排列(megalign)程序(成簇方法)排列PAA-CoA连接酶蛋白质和马铃著的4-香豆酸酯-CoA连接酶。序列距离分析表明两种蛋白之间氨基酸相似性为25％。与来自真菌(青霉、曲霉、链孢霉和酵母)的乙酰CoA合酶进行相似的比较表明只有15％的相似性。

PAA-CoA连接酶蛋白质的最后3个氨基酸是丝氨酸-赖氨酸-异亮氨酸。该氨基酸序列与C末端微体靶向信号(CMTS)的共有序列一致，因此认为相同的氨基酸对将多形汉逊酵母过氧化氢酶蛋白质导向微体是必不可少的(Didion&Roggenkamp(1992)FEBS Lett.， 303(2-3)，113-116)。SKI C-末端的三肽还可将蛋白质导向粗糙链孢霉中的微体(de Zoysa&Connerton(1994)Curr.Genet. 26，430-437)。青霉素生物合成的最后一步是由已经定位于产黄青霉微体(Muller等(1991)EMBOJ. 10(2)489-495)中的ACTF蛋白质(利用PAA-CoA：PAA-CoA连接酶的产物)完成的。ACTF还有一导向微体所需的CMTS(EP 0488180 A2)。PAA-CoA连接酶蛋白质有一与其在青霉素生物合成中的作用相一致的CMTS。

实施例18  基因组DNA与PAA-CoA连接酶cDNA探针杂交

按照如下方法从多种菌株(包括产黄青霉野生型NRRL 1951，BW1900A，BW1901)中分离基因组DNA。按照实施例1所述使这些菌株生长，40小时后通过Whatman GF/A玻璃微纤维过滤器过滤收集。在冷冻在液氮中前，用0.9M NaCl漂洗菌丝体。在液氮中将菌丝体研磨成细粉，然后将粉末重悬在溶液G(实施例12)中并在冰上放置15分钟。4℃以17500xg离心20分钟来沉淀菌丝体碎片。将上清液收集到另一50ml离心管中，按照Sambrook等(1987)所述(出处同上)用酚/氯仿pH8.0提取DNA，用氯仿提取，然后以乙醇沉淀。将核酸重悬在10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA中，按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)，通过RNase处理去除RNA。用BamHI消化基因组DNA，电泳消化产物，按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)印迹到Hybond N膜(Amersham)上。按照下述将膜与来自pPEN09的cDNA插入片段杂交：在6xSSC，1％SDS，6％PEG6000，100μg/ml变性的成片段的鲱精DNA中于60℃预杂交6小时。此后，将标记的变性cDNA片段(按制造商的说明使用Amersham’sMegaprime试剂盒和³²P-dCTP)加到杂交溶液中，然后在60℃继续过夜杂交。65℃用2xSSC，0.1％SDS将膜洗涤30分钟(两次)。按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)，使膜放射自显影。结果表明来自所有青霉菌株(包括野生型NRRL 1951)的一个共有的8kbBamHI片段与cDNA探针杂交。

实施例19构建λEMBL3文库

通过将一环的孢子接种到50ml ACM培养基(20g/l麦芽提取物，1g/l Bacto胨，20g/l葡萄糖)中并在25℃振荡培养来制备产黄青霉SmithKline Beecham菌株BW1900A的摇瓶培养物。生长40小时后，通过Whatman GF/A玻璃微纤维过滤器过滤收集菌丝体并用0.9MNaCl漂洗。然后将菌丝体重悬在含10mg/ml Novozym(NovoBiolabs，Novo Industri.Denmark)的0.9M NaCl中并在25℃培养2小时。通过棉毛过滤器从菌丝体中纯化原生质体，然后以4000xg离心10分钟以沉淀原生质体。用0.9M NaCl将原生质体漂洗两次，然后加入4M硫氰酸胍、50mM Tris-HClpH7.5、25mM EDTA以破碎原生质体。离心除去碎片，然后将含染色体DNA的上清液加到等体积的8MLiCl中缓慢混合并在-20℃保存30分钟。然后通过离心(10000xg，4℃，10分钟)沉淀蛋白质和一些RNA，乙醇沉淀含染色体DNA的上清液。用Sau3A部分消化染色体DNA，按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)，在蔗糖密度梯度上对染色体DNA片段进行大小分离。合并含有大于10kb Sau3A片段的部分，并用于构建λEMBL3文库。将Sau3A基因组片段连接到从Promega获得的λEMBL3 BamHI臂中。然后用Promega的包装试剂盒包装连接的λDNA。通过感染大肠杆菌菌株LE392细胞来扩增包装的λDNA，将噬菌斑铺在细菌菌苔上并按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)在37℃培养8小时。得到近18000个独立的克隆。将噬菌体洗脱到SM缓冲液中并适宜地贮存(按照Sambrook等(1989)所述(出处同上))。

实施例20  克隆PAA-CoA连接酶的基因组DNA

用来自cDNA克隆6.6含cDNA插入片段(图2)的SstI-XbaI片段，按照Sambrook等(1989)所述(出处同上)(与实施例18中的条件相同)通过噬菌斑杂交来探测λEMBL3文库(在实施例19中制备的)。从初次筛选中，鉴定了大量的初次阳性克隆并将其挑出，然后以更低的稀释度用于二次筛选。重复噬菌斑杂交并根据与PAA-CoA连接酶cDNA探针杂交而鉴定单个噬菌斑。挑出并扩增这些λEMBL克隆。用BamHI、EcoRI或SalI之一以及所有的配对组合来消化λEMBL克隆，以及来自BW1900A基因组DNA的单个消化产物。电泳、印迹消化产物并通过Southern杂交来鉴定，鉴定出含完整PAA-CoA连接酶基因的限制片段。从一些λEMBL克隆中取出6.5kb EcoRI片段(在染色体DNA消化产物中有相同大小的片段)并亚克隆到pIJ1925(G.R.Janssen and M.J.Bibb(1993)Gene 124(1)133-134)。图4中列出了基因组DNA的限制图谱。

实施例21用PAA-CoA连接酶转化产黄青霉BW1901

用pIJ1925(实施例20，＝pAMX131)中的6.5kb EcoRI亚克隆与来自p3SR2(Hynes等(1983)Mol.Cell.Biol. 3，1430-1439)的线性amdS片段共转化产黄青霉BW1901菌株的原生质体(按照Tilburn等(1984)Gene  26，205-221)。根据其利用乙酰胺的能力来筛选转化体。然后筛选转化体PenV滴度。与BW1901对照相比，许多转化体都有更高的PenV水平(重复测试高达111％)，可能表明整合了所有这两个质粒。所述结果可以支持该克隆在青霉素生物合成中的作用。

序列表

(1)一般资料：

  (I)申请人：

    (A)姓名：SmithKling Beecham plc

    (B)街道：New Horizons Court

    (C)城市：Brentford

    (D)州：Middlesex

    (E)国家：英国

    (F)邮政编码(ZIP)：TW 89EP

    (G)电话：0181 975 3314

    (H)电传：0181 975 3688

  (ii)发明题目：新产物

  (iii)序列数：2

  (iv)计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的序列资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：578个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：未知

    (D)拓扑结构：未知

  (ii)分子类型：蛋白质

  (iii)假设：有

  (iv)反义：无

  (vi)来源：

    (A)生物：产黄青霉

    (B)菌株：BW1901

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Val Phe Leu Pro Pro Lys Glu Ser Gly Gln Leu Asp Pro Ile Prol               5                   10                  15Asp Asn Ile Pro Ile Ser Glu Phe Met Leu Asn Glu Arg Tyr Gly Arg

        20                  25                  30Val Arg His Ala Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Thr Cys Gly Ile Thr Gly

    35                  40                  45Lys Ser Tyr Ser Ser Lys Glu Val Ala Asn Arg Val Asp Ser Lau Ala

50                  55                  60Arg Ser Leu Ser Lys Glu Phe Gly Trp Ala Pro Asn Glu Gly Ser Glu65                  70                  75                  80Trp Asp Lys Thr Leu Ala Val Phe Ala Leu Asn Thr Ile Asp Ser Leu

            85                  90                  95Pro Leu Phe Trp Ala Val His Arg Leu Gly Gly Val Leu Thr Pro Ala

        100                 105                 110Asn Ala Ser Tyr Ser Ala Ala Glu Leu Thr His Gln Leu Leu Asp Ser

    115                 120                 125Lys Ala Lys Ala Leu Val Thr Cys Val Pro Leu Leu Ser Ile Ser Leu

130                 135                 140Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Leu Pro Lys Asn Arg Ile Tyr Leu Leu145                 150                 155                 160Asp Val Pro Glu Gln Leu Leu Gly Gly Val Lys Pro Pro Ala Gly Tyr

            165                 170                 175Lys Ser Val Ser Glu Leu Thr Gln Ala Gly Lys Ser Leu Pro Pro Val

        180                 185                 190Asp Glu Leu Arg Trp Ser Ala Gly Glu Gly Ala Arg Arg Thr Ala Phe

    195                 200                 205Val Cys Tyr Ser Ser Gly Thr Ser Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Ile

210                 215                 220Ser His Arg Asn Val Ile Ala Asn Thr Leu Gln Ile Lys Ala Phe Glu225                 230                 235                 240Gln Asn Tyr Arg Asp Gly Gly Gly Thr Lys Pro Ala Ser Thr Glu Val

            245                 250                 255Ala Leu Gly Leu Leu Pro Gln Ser His Ile Tyr Ala Leu Val Val Ile

        260                 265                 270Gly His Ala Gly Ala Tyr Arg Gly Asp Gln Thr Ile Val Leu Pro Lys

    275                 280                 285Phe Glu Leu Lys Ser Tyr Leu Asn Ala Ile Gln Gln Tyr Lys Ile Ser

290                 295                 300Ala Leu Phe Leu Val Pro Pro Ile Ile Ile His Met Leu Gly Thr Gln305                 310                 315                 320Asp Val Cys Ser Lys Tyr Asp Leu Ser Ser Val Thr Ser Leu Phe Thr

            325                 330                 335Gly Ala Ala Pro Leu Gly Met Glu Thr Ala Ala Asp Phe Leu Lys Leu

        340                 345                 350Tyr Pro Asn Ile Leu Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys

    355                 360                 365Thr Val Val Ser Ser Thr His Pro His Asp Ile Trp Leu Gly Ser Ser

370                 375                 380Gly Ala Leu Leu Pro Gly Val Glu Ala Arg Ile Val Thr Pro Glu Asn385                 390                 395                 400Lys Glu Ile Thr Thr Tyr Asp Ser Pro Gly Glu Leu Val Val Arg Ser

            405                 410                 415Pro Ser Val Val Leu Gly Tyr Leu Asn Asn Glu Lys Ala Thr Ala Glu

        420                 425                 430Thr Phe Val Asp Gly Trp Met Arg Thr Gly Asp Glu Ala Val Ile Arg

    435                 440                 445Arg Ser Pro Lys Gly Ile Glu His Val Phe Ile Val Asp Arg Ile Lys

450                 455                 460Glu Leu Ile Lys Val Lys Gly Leu Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu465                 470                 475                 480Ala His Ile Leu Ala His Pro Asp Val Ser Asp Cys Ala Val Ile Ala

            485                 490                 495Ile Pro Asp Asp Arg Ala Gly Glu Val Pro Lys Ala Ile Val Val Lys

        500                 505                 5l0Ser Ala Ser Ala Gly Ser Asp Glu Ser Val Ser Gln Ala Leu Val Lys

    5l5                 520                 525Tyr Val Glu Asp His Lys Ala Arg His Lys Trp Leu Lys Gly Gly Ile

530                 535                 540Arg Phe Val Aap Ala Ile Pro Lys Ser Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg545                 550                 555                 560Arg Leu Ile Arg Asp Gln Glu Lys Glu Ala Arg Arg Lys Ala Gly Ser

            565                 570                 575Lys Ile

(2)SEQ ID NO：2的序列资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1976个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：未知

  (ii)分子类型：cDNA

  (iii)假设：无

  (iv)反义：无

  (vi)来源：

    (A)生物：产黄青霉

    (B)菌株：BW1901

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GAATTCGGCA CGAGTCTAAA CCCCGAGATC ACCTCAGTTT CCTGCACTTT GGAGACCTGC     60CCCTATATTA CCCCGAGGAT TTGGGAAAAT GGTTTTTTTA CCTCCAAAGG AGTCCGGTCA    120ATTGGACCCA ATTCCCGACA ATATTCCAAT CAGCGAGTTT ATGCTCAATG AGAGATATGG    180ACGAGTGCGA CACGCCAGCT CCCGGGACCC ATACACCTGT GGTATTACCG GGAAGTCATA    240CTCGTCGAAA GAGGTAGCCA ATCGCGTCGA CTCGCTGGCT CGTAGTCTAT CAAAGGAATT    300TGGTTGGGCG CCGAATGAAG GGTCAGAATG GGATAAGACA TTGGCCGTGT TTGCCCTCAA    360CACTATCGAT TCCTTACCCC TATTCTGGGC CGTTCACAGA CTGGGCGGTG TTCTCACTCC    420CGCCAACGCA TCATACTCCG CCGCCGAGCT GACGCATCAG CTGCTTGATT CCAAGGCCAA     480GGCCCTTGTG ACTTGTGTTC CTCTCCTCTC CATCTCACTG GAAGCTGCAG CCAAAGCTGG     540TCTCCCGAAG AACAGAATCT ACTTACTCGA TGTACCTGAG CAGCTTCTTG GCGGAGTCAA     600GCCTCCAGCA GGATACAAGT CCGTTTCCGA ACTGACCCAG GCTGGGAAGT CTCTCCCGCC     660AGTGGATGAA TTGCGATGGA GCGCGGGTGA AGGTGCCCGG CGAACAGCAT TTGTGTGCTA     720CTCAAGTGGA ACGTCTGGAT TGCCGAAAGG AGTCATGATC TCACACCGCA ACGTGATCGC     780CAATACCCTT CAGATCAAGG CGTTTGAGCA GAACTACCGG GATGGTGGGG GCACAAAGCC     840TGCGAGTACT GAGGTTGCTC TTGGTCTCCT TCCGCAGAGC CATATCTATG CTCTTGTGGT     900CATTGGCCAT GCTGGGGCAT ACCGAGGCGA CCAAACAATC GTTCTCCCCA AATTCGAATT     960GAAATCCTAC CTGAACGCCA TCCAACAGTA CAAGATCAGT GCGCTGTTCC TGGTACCTCC    1020GATCATCATT CACATGCTGG GCACTCAAGA CGTGTGCTCC AAGTATGACC TGAGTTCCGT    1080GACGTCTCTG TTCACGGGAG CGGCACCCCT GGGTATGGAG ACAGCTGCCG ATTTCCTCAA    1140ACTCTACCCG AACATTTTGA TCCGCCAAGG ATACGGTCTG ACAGAGACAT GCACGGTCGT    1200AAGCTCGACC CACCCGCACG ATATCTGGCT AGGTTCATCC GGCGCTTTGC TCCCTGGAGT    1260CGAGGCACGA ATTGTGACGC CTGAAAACAA GGAAATCACA ACGTACGACT CACCGGGCGA    1320ATTGGTGGTC CGAAGCCCAA GCGTCGTCCT GGGCTATTTG AACAACGAAA AAGCCACCGC    1380AGAGACATTT GTGGACGGAT GGATGCGTAC GGGAGACGAG GCTGTCATCC GTAGAAGCCC    1440GAAGGGCATC GAGCACGTGT TTATTGTCGA TCGGATCAAG GAGTTGATCA AGGTCAAGGG    1500TCTGCAAGTC GCGCCTGCCG AACTCGAAGC CCATATCCTC GCCCACCCCG ATGTCTCGGA    1560CTGTGCTGTC ATCGCTATTC CGGATGATCG TGCAGGAGAA GTACCCAAGG CCATTGTTGT    1620GAAGTCCGCC AGCGCAGGAT CGGACGAATC TGTCTCCCAG GCTCTCGTGA AGTATGTTGA    1680GGACCACAAG GCTCGTCACA AGTGGTTGAA GGGAGGTATC AGATTTGTGG ATGCCATTCC    1740CAAGAGCCCG AGTGGTAAGA TTCTTCGTCG GTTGATCCGT GACCAAGAGA AGGAGGCACG    1800GAGAAAGGCT GGTAGCAAGA TCTAAAAATG TCGGGGGTAG CTTTGATTAG AACTTGGTCT    1860GGGAAACTTG GAAACCGATA ACCATTGTTG GCTTGAACTA GAAGTATATA TGTAAATACG    1920TGATAAACAA GGCATCTCAT CTGCTGTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTCGAG        1976

Claims (12)

1.一种可从产黄青霉中得到、具有苯乙酰辅酶A连接酶活性的分离的酶，是通过培养、收集并超声处理菌丝体，除去细胞碎片并通过阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、用底物洗脱的亲和色谱和凝胶过滤色谱分离超声处理物而得到的，其中用PAA和辅酶A依赖性试验检测有活性的色谱馏份。

2.根据权利要求1的酶，其通过SDS-PAGE确定的表观分子量为63kDa。

3.根据权利要求2的酶，包括下列N末端氨基酸序列：

V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P

4.根据前述任一权利要求的酶，含有ID SEQ 1所示的氨基酸序列。

5.编码权利要求1的酶的DNA。

6.根据权利要求5的DNA，具有图2或4所示的限制位点构型。

7.根据权利要求6的DNA，含有ID SEQ 2的DNA序列。

8.在高严紧度条件下与权利要求5的DNA杂交的DNA，其中所述高严紧度条件如下：在6×SSC，1％SDS，6％PEG6000，100μg/ml变性的、成片段的鲱精DNA中，60℃6小时。

9.含有权利要求5或8任一DNA的载体，所述载体用于在适宜的宿主生物中表达具有PAA-CoA连接酶活性的酶。

10.含有权利要求5或8任一DNA的转化宿主。

11.权利要求9的转化宿主用于生产青霉素或提高青霉素产生生物的效价的用途。

12.制备根据权利要求1的酶的方法，包括培养青霉属菌株，然后提取并纯化，其中用PAA和CoA依赖性试验检测有活性的馏份。

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