JPH06261756A - アミノアシルおよびミスアミノアシルｔＲＮＡの製造法 - Google Patents

アミノアシルおよびミスアミノアシルｔＲＮＡの製造法

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JPH06261756A
JPH06261756A JP5058549A JP5854993A JPH06261756A JP H06261756 A JPH06261756 A JP H06261756A JP 5058549 A JP5058549 A JP 5058549A JP 5854993 A JP5854993 A JP 5854993A JP H06261756 A JPH06261756 A JP H06261756A
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trna
aminoacyl
amino acid
arh
reaction
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Nobuhiko Yamashita
信彦 山下
Junichi Toyama
純一 遠山
Chiwa Kataoka
千和 片岡
Kazunobu Miura
一伸 三浦
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Osaka Gas Co Ltd
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Osaka Gas Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 特定のアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼを
利用したアミノアシルおよびミスアミノアシルtＲＮＡ
の製造法が提供される。 【効果】 本方法により、tＲＮＡに対応アミノ酸また
は非対応アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体を結合させて
アミノアシルtＲＮＡまたはミスアミノアシルtＲＮＡを
製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定のアミノアシルt
ＲＮＡヒドロラーゼを利用したアミノアシルおよびミス
アミノアシルtＲＮＡの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、遺伝子工学やタンパク質工学の手
法を用いたタンパク質の生産法は、バイオテクノロジー
分野の最も重要な技術の１つである。この方法によれ
ば、比較的簡便に大量のタンパク質を生産することがで
きるが、宿主細胞から目的タンパク質を精製するのが困
難であること、目的とするタンパク質によっては溶解性
および安定性が低下すること、更に宿主細胞によっては
毒素などが混入する恐れがあることなどの問題点があ
る。また、わずかな例外を除いて、利用されるアミノ酸
は生体タンパク質を構成する２０種のＬ型アミノ酸に限
られ、人工アミノ酸などの新たなアミノ酸を組込むこと
は不可能である。その理由は、生体内で利用されるアミ
ノ酸は、一旦アミノアシルtＲＮＡ合成酵素によってア
ミノアシルtＲＮＡとして活性化された後に生体内タン
パク質合成系で基質として利用されるためであり、アミ
ノアシルtＲＮＡ合成酵素が識別するアミノ酸が２０種
のＬ型アミノ酸に限定されているためである。
【０００３】これに対して、生体外のタンパク質合成系
は、従来の生体内タンパク質合成(いわゆる組換えＤＮ
Ａ技術によるタンパク質合成)において利用される要素
[リボソーム、mＲＮＡ、Ｌ型アミノ酸、各アミノ酸に対
応するtＲＮＡ、アミノアシルtＲＮＡ合成酵素(ＡＲ
Ｓ)、およびその他のタンパク質合成因子など]を試験管
内に取出し、生体外で安定にかつ効率よくタンパク質合
成を行う系である。
【０００４】この方法において、アミノアシルtＲＮＡ
の代わりにミスアミノアシルtＲＮＡを系に添加する
と、特定のアミノ酸が置換された変異タンパク質や非天
然型アミノ酸などが導入された人工タンパク質が合成で
きるようになる。このような非天然型アミノ酸が導入さ
れたペプチドやタンパク質の合成は、単にタンパク質と
してだけでなく機能材料の創製にも重要である。このよ
うな機能材料はエネルギー、光、表面および分離技術や
生体など様々な機能を持つ材料の開発を可能にすると考
えられ、特に、(a)二酸化炭素の固定化技術、(b)バイオ
リアクター、(c)バイオセンサーなどは直ちに応用され
ていくものと予想される。従って、生体外タンパク質合
成系では、ミスアミノアシルtＲＮＡを合成する技術が
非常に重要である。
【０００５】アミノアシルtＲＮＡの合成方法としては
Ｈechtら(文献１；本明細書中で引用した参考文献はま
とめて後記する)の方法が知られている。即ち、初めに
ジヌクレオチド pＣpＡを化学的に合成し、次いでpＣp
Ａの３'末端にアミノ酸を化学的にエステル結合させて
アミノアシルpＣpＡを得る。一方、tＲＮＡを蛇毒ホス
ホジエステラーゼで部分分解して、３'末端のpＣpＡを
除去したtＲＮＡ−Ｃ−ＯＨを得る。次いで、アミノア
シルpＣpＡをtＲＮＡ−Ｃ−ＯＨの３'末端にＲＮＡリガ
ーゼを用いて酵素的に結合してアミノアシルtＲＮＡを
得る。この方法を用いてＳhultzら(文献２)は、大腸菌t
ＲＮＡPhe(フェニルアラニンに対応する特異的tＲＮＡ)
のアンチコドンをＣＵＡに変換してアンバーコドンＵＡ
Ｇを翻訳できるようにした改変型tＲＮＡに種々の非天
然アミノ酸を結合させることにより、ミスアミノアシル
tＲＮＡを調製している。しかし、このような化学的合
成法では、アミノアシルpＣpＡの合成中に多くの保護基
の付加と脱離および精製を繰返す必要があり、合成工程
が複雑であり、また、不安定なアミノアシル結合の分解
による収率低下の問題が生じる。
【０００６】一方、アミノアシルtＲＮＡが酵素的に合
成できるならば、合成効率、安定性および収率の面で優
れた方法となる。細胞内においては、アミノ酸とtＲＮ
Ａの結合はアミノアシルtＲＮＡ合成酵素(ＡＲＳ)によ
って行なわれている。この酵素は、生体内で知られるア
ミノアシルtＲＮＡを合成する唯一の酵素である。この
酵素の基質特異性は非常に高く、２０種のＬ-アミノ酸
に対応する特異的tＲＮＡ(例えば、フェニルアラニン特
異的tＲＮＡ；tＲＮＡPheと記すこともある)と、これに
付加されるアミノ酸(フェニルアラニン)との対応は厳密
に規定されており、誤認識の頻度は数万分の一と言われ
ている。
【０００７】この酵素は、２段階反応によりtＲＮＡを
アミノアシル化することが知られている。まず、アミノ
酸特異的なＡＲＳがＡＴＰを消費してアミノアシルアデ
ニル酸を合成する。中間体であるこのアミノアシルアデ
ニル酸はアミノ酸特異的ＡＲＳと結合した状態で存在し
ており、次いで、アミノ酸に特異的なtＲＮＡの３'末端
であるpＣpＣpＡのアデノシンの−ＯＨ基と活性化アミ
ノ酸(中間体)の−ＣＯＯＨ基がエステル結合してアミノ
アシルtＲＮＡが合成される。
【０００８】１９８０年代よりＡＲＳによるアミノ酸活
性化機構や触媒機構、あるいはＡＲＳの構造と活性の相
関などの研究が行われている。しかし、現時点ではＡＲ
Ｓの修飾などによる基質特異性の改変(活性中心の修飾
による特異性の改変など)についての報告はない。一
方、tＲＮＡのアミノ酸受容能についての研究も行なわ
れつつある。ＡＲＳに認識されるために必要とされるt
ＲＮＡの部位として、アンチコドン部位、アクセプター
ステム部位、あるいはtＲＮＡのループ様構造の各ルー
プに位置する数個の塩基および塩基対が指摘され、tＲ
ＮＡのアミノ酸受容能の変化にはこのうちいくつかの部
位の改変が必要と考えられている。アンチコドン部位の
みの改変によりアミノ酸受容能が変化したという例も報
告されているが、受容し得るアミノ酸が限定されるこ
と、および本来のアミノ酸受容能に比べ相対活性が低い
という結果が示されている。このように、ＡＲＳおよび
tＲＮＡを任意のアミノ酸を認識および受容し得るよう
改変することは現段階では困難である。従って、現時点
ではＡＲＳによってミスチャージアミノアシルtＲＮＡ
(例えば、グリシン−tＲＮＡPhe)を作製することは困難
である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体外のタ
ンパク質合成系で使用するアミノアシルおよびミスアミ
ノアシルtＲＮＡを、酵素法により製造する新規な方法
を提供するものである。更に詳しくは、本発明は、以下
に示す特定のアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼの逆反
応：
【化２】 (反応式中、a.a.はアミノ酸またはアミノ酸誘導体であ
り、特定のアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼとは基質
特異性の広いアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼである)
を利用して、tＲＮＡに対応アミノ酸または非対応アミ
ノ酸もしくはアミノ酸誘導体を結合させることにより、
アミノアシルtＲＮＡまたはミスアミノアシルtＲＮＡを
製造する方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の方法において
は、特定のアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼを利用す
る。即ち、アミノアシルtＲＮＡの加水分解酵素のうち
基質特異性の広い酵素を用い、この酵素の逆反応を利用
する。Ｈerediaらは、アミノアシルtＲＮＡを特異的に
加水分解し、アミノ酸とtＲＮＡを生成する加水分解酵
素をエビ幼生(Artemia lavae)(文献３)および糸状菌(Fu
sarium culmorum)(文献４)より見い出した。これらの加
水分解酵素、即ち、アミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼ
(ＡＲＨ)はいずれも広い基質特異性を有し、フェニルア
ラニン-tＲＮＡ、リジン-tＲＮＡ、およびロイシン-tＲ
ＮＡなどのアミノアシルtＲＮＡに対して同等の加水分
解活性を示すことが報告されている。一方、加水分解酵
素をある条件で作用させると、逆反応が効率よく進行す
ることが知られている。例えば、タンパク質加水分解酵
素であるパパイン、α-キモトリプシン、カルボキシペ
プチダーゼＹ、トリプシン、およびペプシンなどの逆反
応によって、多くの種類のペプチドが合成されている
(文献５)。本発明者らは、特定のＡＲＨの逆反応系を利
用することによりtＲＮＡを任意のアミノ酸を用いてア
ミノアシル化することができるのではないかと考え、鋭
意研究を行った。その結果として本発明を完成するに至
ったものである。
【００１１】本発明の方法において利用する特定のアミ
ノアシルtＲＮＡヒドロラーゼ(ＡＲＨ)は基質特異性の
広いものである。その例としては、特に上記のエビ幼生
(Artemia lavae)あるいは糸状菌(Fusarium culmorum)由
来のＡＲＨを挙げることができる。エビ幼生は、一般の
水産飼料として市販されているArtemia salina耐久卵を
培養することによって得られる。耐久卵は、例えば日清
ファインケミカル株式会社(横浜)またはＵＳＣインター
ナショナルカンパニー(東京)などから入手できる。糸状
菌株は、財団法人発酵研究所またはAmerican Type Cult
ure Collection(ＡＴＣＣ)から入手できる。アミノアシ
ルtＲＮＡヒドロラーゼ（EC 3.1.1.29)は上記２種類の
生物以外にも、大腸菌、酵母、動物組織に見い出されて
いる。これらの酵素は、アミノ酸のＮ末端が修飾された
アミノアシルtＲＮＡのみを加水分解し、未修飾アミノ
アシルtＲＮＡには作用しないことが報告されている(文
献６および７)。逆反応による種々のアミノ酸のtＲＮＡ
への導入のためには、アミノアシルtＲＮＡに対して広
い基質特異性を示すＡＲＨを選択することが望ましい。
このようなＡＲＨとしては、現在のところ上記の２種類
の生物由来ＡＲＨ以外には知られていない。しかし、こ
れらのＡＲＨについてその分布や生理的機能の研究はほ
とんど進んでいないので、今後の研究で他の生物種から
も本方法に適した性質を有するＡＲＨが発見される可能
性がある。将来において発見されるこのような広い基質
特異性を有するＡＲＨを本方法において用いることもで
きる。ＡＲＨの菌体からの分離および精製は当分野で既
知の方法によって行なうことができる。
【００１２】本方法を実施する際の出発原料であるtＲ
ＮＡ、天然アミノ酸および非天然アミノ酸は市販品から
入手可能であるか、または文献記載の方法によって合成
することができる。
【００１３】ＡＲＨの逆反応を利用した反応系は、プロ
テアーゼ、糖加水分解酵素、リパーゼ、ホスファターゼ
などの加水分解酵素の逆反応に関する例を参考にして実
施できる。例えば、プロテアーゼの加水分解反応の逆反
応を利用したペプチドの酵素的合成法では、高効率に生
成物を得るためにいくつかの工夫された縮合反応系が開
発されている。理論的には、反応生成物を系外に除去す
ると平衡反応は逆方向に進みやすくなる。例えば、反応
に関与しないカルボキシル成分のＮ末端アミノ基、アミ
ン成分のＣ末端カルボキシル基に保護基を導入し、副反
応を抑えるとともにペプチド結合形成に伴う溶解度を減
少させ、生成したペプチドを沈澱させて反応系外に除去
したり、水および水と混和しない有機溶媒の二相よりな
る系で合成をミセル中で進行させ、疎水性生成物が有機
相に吸収されることによって、同様に反応系外に生成物
を除去することなどが行なわれている。以下に反応を促
進するための条件を示す。(1)原料の濃度：ある酵素反
応系において、一方の原料の濃度を高めると質量作用の
法則により、逆反応が促進される；(2)酵素濃度：逆反
応を促進するための酵素濃度は、通常、モル濃度で原料
の数百分の一〜数千分の一の条件が用いられる；(3)反
応条件(反応液のpＨ、反応時間および温度)：逆反応の
至適pＨ、時間、温度などを検討する。また、ＡＲＨの
逆反応の結果生じたアミノアシルtＲＮＡと未反応のtＲ
ＮＡは種々のクロマトグラフィーの手法によって互いに
分離することができる。例えば、チロシンやフェニルア
ラニンなどの非水系アミノ酸の結合したtＲＮＡは、未
反応tＲＮＡと比較して疎水性が高いので、ベンゾイル
化セルロースカラムによって未反応tＲＮＡと分離する
ことができる(文献８)。また、タンパク質合成伸長因子
であるＥＦ-ＴuはＧＴＰと複合体を形成し、アミノアシ
ルtＲＮＡと特異的に結合する機能を持っている。この
性質を利用し、タンパク質合成因子を固定化したカラム
を用いて、アミノアシルtＲＮＡを未反応tＲＮＡから分
離することができる(文献９)。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】実施例１ 糸状菌由来ＡＲＨの調製および活性の測定 Ａ．糸状菌(Fusarium Culmorum)の培養 糸状菌株(IFO No.6814)を(財)発酵研究所から入手し、
斜面培地(ジャガイモ-寒天培地：ジャガイモ２００g、
ショ糖２０g、寒天１５gを混合し、pＨ５.６に調整した
後、蒸留水を加えて１０００mlにすることにより調製)
に接種し、湿度６０％および温度２４℃で１０〜１４日
間培養した。次いで、液体培地(１Ｌ中に、ＫＨ2ＰＯ4
０.５g、ＭnＣl2・４Ｈ2Ｏ ０.０２mg、ＭgＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ ０.５g、ＮaＭoＯ4・２Ｈ2Ｏ ０.０２mg、ＦeＳＯ4
・４Ｈ2Ｏ ０.５mg、塩酸チアミン １mg、ＺnＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０.５mg、Ｄ-グルコース ２０g、ＣuＳＯ4・５Ｈ
2Ｏ ０.０２mg、Ｌ-アスパラギン ２g、カザミノ酸 ２g
を含む培地)に１エーゼ接種し、２４℃で６７時間振盪
培養した。培養後、ろ紙(Ｎo.２)を用いて濾過し、菌体
を集め、滅菌水で３回洗浄した。回収した菌体は湿重量
を測定した後、−２０℃で保存した。
【００１６】Ｂ．ＡＲＨの部分精製 糸状菌由来のＡＲＨをＨerediaら(文献４)の方法により
部分精製した。即ち、−２０℃に保存しておいた菌体
に、５倍量の緩衝液Ａ[１０mＭ 酢酸マグネシウムと１
０mＭ メルカプトエタノールを含む５０mＭ トリス−塩
酸緩衝液(pＨ７.０)]を加え、氷冷下に撹拌して融解し
た後、テフロンホモジナイザーで５ストローク、ホモジ
ナイズした。ホモジネートを４℃および１０,０００Ｘg
で１０分間遠心した後、上清を取り、更に４℃および１
０５,０００Ｘgで９０分間遠心した。得られた上清を、
３０℃にて１６時間インキュベートし、ＡＲＨの粗抽出
画分とした。ＡＲＨは、CM-Sephadex C25カラムによる
イオン交換クロマトグラフィーによって分画した。カラ
ム(１６×１００mm)は、予め緩衝液Ｂ(０.１Ｍ 塩化カ
リウムを含む緩衝液Ａ)によって平衡化した。２５mlの
ＡＲＨ粗抽出画分(８.６mgタンパク質／ml)を流速０.５
ml／分でカラムに積層し、緩衝液Ｂで洗浄した後、０.
１Ｍから１Ｍの塩化カリウムを含む緩衝液Ｂの直線濃度
勾配液(１００ml)でＡＲＨを溶離した。溶出液は３mlず
つ分取した。各溶出画分の５０μlを用いて、[14Ｃ]-フ
ェニルアラニルtＲＮＡを基質としてＡＲＨ活性を測定
した。タンパク質濃度は２８０nmの吸光度を測定するこ
とによって決定した。ＡＲＨの活性画分を集め、これを
部分精製ＡＲＨとした。
【００１７】Ｃ．ＡＲＨ活性の測定 ＡＲＨの活性は、Ｈerediaら(文献４)の方法に従って標
識アミノアシルtＲＮＡを基質として加水分解反応を行
い、残存する標識アミノアシルtＲＮＡを測定すること
により評価した。
【００１８】Ｃ-１．標識アミノアシルtＲＮＡの調製 tＲＮＡPhe、tＲＮＡfMet、tＲＮＡTyrおよびアミノア
シルシンテターゼ(大腸菌由来)はSIGMA CHEMICAL COMPA
NYより購入した。tＲＮＡGluはベーリンガー・マンハイ
ムより購入した。[14Ｃ]-フェニルアラニルtＲＮＡ、[
14Ｃ]-ホルミルメチオニルtＲＮＡ、[14Ｃ]-チロシルt
ＲＮＡ、および[14Ｃ]-グルタミックアシジルtＲＮＡは
西村ら(文献10)の方法により調製した。即ち、１Ｍ Ｔr
is−ＨＣl(pＨ７.７) ６０μlに、８０mＭ アデノシン
三リン酸溶液(ＡＴＰ)(pＨ７.０) ３０μl、０.８Ｍ Ｋ
Ｃl３０μl、０.２Ｍ ＭgＣl2 ３０μl、アミノ酸特異
的tＲＮＡ溶液(２００ＤＵ／ml：１.３〜１.４mg／ml)
４０μl、[14Ｃ]の各アミノ酸(５０μＣi／ml) ８０μ
l、およびアミノアシルtＲＮＡシンテターゼ(３５Ｕ／
μl) １０μlを加え、Ｈ2Ｏで全量を３００μlとした。
[14Ｃ]-グルタミックアシジルtＲＮＡアミノアシル化に
は、１Ｍ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.７)の代わりに０.１Ｍ
Ｔris・ＨＣl(pＨ７.７)を使用して同様に反応混合液を
調製した。アミノアシル化反応は、反応混合液を３７℃
で３０分間温置することによって行った。反応終了後、
反応液の１／２０量(１５μl)を取り、氷冷した５％Ｔ
ＣＡを３ml加え、アミノアシルtＲＮＡを沈澱させた。
氷上に１５分間放置した後、ＧＦ／Ｃガラスろ紙(Whatm
an International Ltd.)上に吸引ろ過して沈澱を回収し
た。フィルターをＴＣＡで３回および５０％エタノール
／５０％エチルエーテルで１回洗浄して乾燥した後、ト
ルエン系シンチレーター(５ml)にフィルターを入れ、シ
ンチレーションカウンターで放射活性を測定し、tＲＮ
Ａに結合した標識アミノ酸の量を算出した。残りの反応
液に、１mＭ ＥＤＴＡを含む１０mＭＴris−ＨＣl緩衝
液飽和フェノール(pＨ７.０)を等量(３００μl)加えて
撹拌した後、１０,０００rpmで２分間遠心した。水層
(上層)に５Ｍ ＮaＣlを６０μl加え、終濃度１Ｍとした
後、２倍量(７２０μl)の−２０℃エタノールを加え
た。この混合液を−２０℃で３０分間放置した後、４℃
および１０,０００rpmで１０分間遠心し、tＲＮＡ画分
を沈澱させた。沈澱画分を減圧乾燥した後、滅菌水に溶
解し、標識アミノアシルtＲＮＡ溶液とした。
【００１９】Ｃ-２．ＡＲＨ活性の測定 ５００mＭ イミダゾール塩酸(pＨ７.５) １０μlに、１
０mＭ 酢酸マグネシウム １０μl、３０００〜５０００
cpm／μlの[14Ｃ]-標識アミノアシルtＲＮＡ１０μｌ、
および測定用サンプル ２０〜５０μlを加え、Ｈ2Ｏで
全量を１００μlとした。３０℃で３０分間温置した
後、氷冷した５％ＴＣＡを３ml加えた。この混合液を氷
上で１５分間放置した後、ＧＦ／Ｃガラスろ紙上に吸引
ろ過して沈澱を回収した。フィルターをＴＣＡで３回お
よび５０％エタノール／５０％エチルエーテルで１回洗
浄して乾燥した後、トルエン系シンチレーター(５ml)に
フィルターを入れ、シンチレーションカウンターで沈澱
中の残存する標識アミノアシルtＲＮＡの放射活性を測
定し、単位時間当たりのアミノアシルtＲＮＡの分解量
を算出した。１分間に１μモルのアミノアシルtＲＮＡ
を分解する酵素活性を１Ｕとした。
【００２０】Ｄ．結果 ５０mlの糸状菌(Fusarium Culmorum)培養液から７.４g
の菌体が得られた。Ｈerediaらの報告に従い、この菌体
からCM-Sephadex C-25カラムのイオン交換クロマトグラ
フィーによるＡＲＨの部分精製を試みた結果、約１０μ
gタンパク質のＡＲＨ(ＡＲＨ)粗精製画分が得られた。
ＡＲＨはイオン交換クロマトグラフィーにおいて、０.
３５Ｍ〜０.４Ｍ ＫＣlで溶出された(図１)。この結果
は、Ｈerediaらのイオン交換クロマトグラフィーでの結
果と一致した。また、ＡＲＨの粗精製画分の基質特異性
を検討する目的で、４種の標識アミノアシルtＲＮＡに
対する分解活性を測定した。その結果、４種の標識アミ
ノアシルtＲＮＡに対する分解活性は互いに大差なく、
この酵素が広い基質特異性を持つことが分かった(表
１)。
【表１】 表１ 糸状菌由来アミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼの粗精製画分の 各種アミノアシルtＲＮＡに対するヒドロラーゼ活性 アミノアシルtＲＮＡ 酵素活性(pモル／分／μgタンパク質) 「14Ｃ」 Ｐhe−tＲＮＡPhe １.５ 「14Ｃ」 Ｍet−tＲＮＡfMet １.０ 「14Ｃ」 Ｇlu−tＲＮＡGlu2 ２.３ 「14Ｃ」 Ｔyr−tＲＮＡTyr1 １.５ また、ＡＲＨの粗精製画分には、リボヌクレアーゼ活性
は全く検出できなかった。これらの結果は、今回、糸状
菌より調製した酵素が、Ｈｅｒｅｄｉａらが報告してい
るＡＲＨと同一の酵素であることを示すものである。
【００２１】実施例２ 糸状菌由来ＡＲＨの逆反応によ
るＬ-チロシンおよびチロシン特異的tＲＮＡからのアミ
ノアシルtＲＮＡの合成 Ａ．方法 アミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼによるtＲＮＡのアミ
ノアシル化は、有機溶媒の存在下でtＲＮＡとアミノ酸
を縮合反応させることによって行った。即ち、０.５Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液 １０μlに、１００mＭ 酢酸マグネシ
ウム １０μl、ジメチルホルムアミド ２５μl、２０Ｕ
／ml tＲＮＡTyr １０μl、４０mＭ Ｌ-チロシン １０
μl、１mＣi／ml Ｌ-[２,３,４,５,６-3Ｈ]チロシン １
０μlおよび２.５μＵの部分精製ＡＲＨを加え、Ｈ2Ｏ
で全量を１１０μlとした。反応は３０℃で１５分間温
置して行なった。また、ＡＲＨの非存在下に同様の操作
を行なったものをコントロールとした。反応終了後、反
応液中のアミノアシルtＲＮＡと未反応の遊離アミノ酸
を、Shodex PROTEIN KW-803カラム(８mmｘ３０cm、２本
組)による高速分子篩クロマトグラフィーによって分離
した。カラムは、予め６０mＭ ＮＨ4Ｃlと１０mＭ (Ｃ
Ｈ3ＣＯＯ)2Ｍgを含む１０mＭ Ｔris・Ｃl緩衝液(pＨ
７.５)で平衡化した。５０μlの反応液をカラムに注入
し、１.０ml／分の流速で展開し、溶出液は０.５mlずつ
分取した。０.５mlの各溶出液画分に３mlの液体シンチ
レーションカクテル Ready Safe (BECKMAN Instrument,
Inc.)を添加して溶解し、液体シンチレーションカウン
ター(BECKMAN Model LS5000TD)によって放射活性を測定
した。ＨＰＬＣ用分子量決定用タンパク質マーカーはオ
リエンタル酵母工業(株)より購入した。分子量マーカー
として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Mw 290,000)、
乳酸デヒドロゲナーゼ(Mw 142,000)、エノラーゼ(Mw 6
7,000)、アデニル酸キナーゼ(Mw 32,000)、およびチト
クロムＣ(Mw 12,400)を用いた。
【００２２】Ｂ．結果 ＡＲＨの逆反応を利用したアミノアシルtＲＮＡの合成
の可能性を検討する目的で、反応系に有機溶媒と大過剰
のアミン成分(Ｌ-チロシン)を添加してＡＲＨの加水分
解活性を抑制し、アミノ酸とtＲＮＡの縮合反応を促進
させることを試みた。２３％ジメチルホルムアミドの存
在下でＬ-チロシンとチロシン特異的tＲＮＡを基質とし
て酵素反応を行い、高速分子篩クロマトグラフィーによ
って、tＲＮＡ画分への標識アミノ酸の取込みを測定す
ると、ＡＲＨ未添加の反応液においてはtＲＮＡ画分へ
の標識アミノ酸の取込みは全く認められなかったのに対
し、ＡＲＨ添加反応液においては、アミノアシルtＲＮ
Ａ(Ｔyr−tＲＮＡTyr)と同位置に放射活性ピークの有意
な上昇が認められた(図２)。
【００２３】チロシンの取込みが認められたtＲＮＡ画
分をフェノール抽出し、エタノール沈澱によってtＲＮ
Ａを回収すると、放射活性の大部分はtＲＮＡ画分に見
い出された。また、このtＲＮＡ画分をＡＲＨで処理
し、再びフェノール処理とエタノール沈澱でtＲＮＡを
回収すると、標識アミノ酸はエタノール沈澱の上清画分
に見い出された。以上の結果は、２３％ジメチルホルム
アミドと大過剰のＬ-チロシンの存在下で、ＡＲＨはそ
の本来の加水分解活性が抑制され、逆反応である縮合反
応によって、Ｌ-チロシンとチロシン特異的tＲＮＡから
チロシルtＲＮＡが合成されたことを示している。
【００２４】実施例３ 糸状菌由来ＡＲＨの逆反応によ
るＬ−フェニルアラニンおよびチロシン特異的tＲＮＡ
からのミスアミノアシルtＲＮＡの合成 Ａ．方法 アミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼによるtＲＮＡのアミ
ノアシル化は、有機溶媒の存在下でtＲＮＡとアミノ酸
を縮合反応させることによって行なった。即ち、０.５
Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液 １０μlに、１００mＭ 酢酸マグ
ネシウム １０μl、ジメチルホルムアミド ２５μl、２
０Ｕ／ml tＲＮＡTyr １０μl、４０mＭＬ-フェニルア
ラニン １０μl、１mＣi／ml Ｌ-[２,３,４,５,６−
3Ｈ]フェニルアラニン １０μlおよび２.５μＵの部分
精製ＡＲＨを加え、Ｈ2Ｏで全量を１１５μlとした。反
応は３０℃で１５分間温置して行なった。また、ＡＲＨ
非存在下に同様の操作を行なったものをコントロールと
した。反応終了後、反応液中のアミノアシルtＲＮＡと
未反応の遊離アミノ酸を、Shodex PROTEIN KW-803カラ
ム(８mmｘ３０cm、２本組)による高速分子篩クロマトグ
ラフィーによって分離した。カラムは、予め６０mＭ Ｎ
Ｈ4Ｃlと１０mＭ (ＣＨ3ＣＯＯ)2Ｍgを含む１０mＭＴri
s・Ｃl緩衝液(pＨ７.５)で平衡化した。５０μlの反応
液をカラムに注入し、１.０ml／分の流速で展開し、溶
出液は０.５mlずつ分取した。０.５mlの各溶出液画分に
３mlの液体シンチレーションカクテル Ready Safe (BEC
KMAN Instrument, Inc.)を添加して溶解し、液体シンチ
レーションカウンター(BECKMAN ModelLS5000TD)によっ
て放射活性を測定した。ＨＰＬＣ用分子量決定用タンパ
ク質マーカーはオリエンタル酵母工業(株)より購入し
た。分子量マーカーとして、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ(Mw 290,000)、乳酸デヒドロゲナーゼ(Mw 142,00
0)、エノラーゼ(Mw 67,000)、アデニル酸キナーゼ(Mw 3
2,000)、およびチトクロムＣ(Mw 12,400)を用いた。
【００２５】Ｂ．結果 ＡＲＨの逆反応を利用したミスアミノアシルtＲＮＡの
合成の可能性を検討する目的で、反応系に有機溶媒と大
過剰のアミン成分(Ｌ-フェニルアラニン)を添加してＡ
ＲＨの加水分解活性を抑制し、アミノ酸とtＲＮＡの縮
合反応を促進させることを試みた。２２％ジメチルホル
ムアミドの存在下でＬ-フェニルアラニンとチロシン特
異的tＲＮＡを基質として酵素反応を行い、高速分子篩
クロマトグラフィーによって、tＲＮＡ画分への標識ア
ミノ酸の取込みを測定すると、ＡＲＨ未添加の反応液に
おいてはtＲＮＡ画分への標識アミノ酸の取込みは全く
認められなかったのに対し、ＡＲＨ添加反応液において
は、tＲＮＡ画分に放射活性ピークの有意な上昇が認め
られた(図３)。
【００２６】フェニルアラニンの取込みが認められたt
ＲＮＡ画分をフェノール抽出し、エタノール沈澱によっ
てtＲＮＡを回収すると、放射活性の大部分はtＲＮＡ画
分に見い出された。また、このtＲＮＡ画分をＡＲＨで
処理し、再びフェノール処理とエタノール沈澱でtＲＮ
Ａを回収すると、標識アミノ酸はエタノール沈澱の上清
画分に見い出された。以上の結果は、２２％ジメチルホ
ルムアミドと大過剰のＬ-フェニルアラニンの存在下
で、ＡＲＨはその本来の加水分解活性が抑制され、逆反
応である縮合反応によって、Ｌ-フェニルアラニンがチ
ロシン特異的tＲＮＡに結合したミスアミノアシルtＲＮ
Ａが合成されたことを示している。即ち、本実施例で用
いたＡＲＨの基質特異性が広いことから、この酵素の逆
反応を利用することによって種々のミスアミノアシルt
ＲＮＡを合成できる可能性が示唆された。
【００２７】参考文献 １．T.G.Heckler, L.H.Chang, Y.Zama, T.Naka, M.S.Ch
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化学同人)、第7巻、434頁 (1975) ９．A.Louie, E.Masuda, M.YoderおよびF.Jurnak, Ana
l.Biochem., 141, 402-408 (1984) 10．西村 暹、生化学実験講座、日本生化学会編(東京
化学同人)、第7巻、431頁 (1975)
【図面の簡単な説明】
【図１】 糸状菌由来のアミノアシルtＲＮＡヒドロラ
ーゼをイオン交換クロマトグラフィーで分画したときの
結果を示すグラフである。
【図２】 アミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼの逆反応
によって生成したチロシルtＲＮＡTyrをＨＰＬＣで分画
したときの結果を示すグラフである。
【図３】 アミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼの逆反応
によって生成したフェニルアラニルtＲＮＡTyrをＨＰＬ
Ｃで分画したときの結果を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 三浦 一伸 京都府京都市下京区中堂寺南町17 株式会 社関西新技術研究所内

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下に示す特定のアミノアシルtＲＮＡ
    ヒドロラーゼの逆反応： 【化１】 (反応式中、a.a.はアミノ酸またはアミノ酸誘導体であ
    り、特定のアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼとは基質
    特異性の広いアミノアシルtＲＮＡヒドロラーゼである)
    を利用して、tＲＮＡに対応アミノ酸または非対応アミ
    ノ酸もしくはアミノ酸誘導体を結合させることにより、
    アミノアシルtＲＮＡまたはミスアミノアシルtＲＮＡを
    製造する方法。
  2. 【請求項２】 特定のアミノアシルtＲＮＡヒドロラー
    ゼが糸状菌(Fusariumculmorum)由来またはエビ幼生(Art
    emia lavae)由来である請求項１に記載の方法。
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