ES2198493T3 - Fenilacetil-coa ligasa de penicillium chrysogenum. - Google Patents
Fenilacetil-coa ligasa de penicillium chrysogenum.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCESO PARA PREPARAR UN ENZIMA DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM QUE POSEE ACTIVIDAD FENILACETILATO - COENZIMA A. SE PROPORCIONA EL DNA QUE CODIFICA EL ENZIMA, ASI COMO SU USO PARA LA PRODUCCION DE CEPAS MODIFICADAS.
Description
Fenilacetil-CoA ligasa de
Penicillium chrysogenum.
La presente invención se refiere a una enzima
útil en la síntesis de penicilinas a partir de intermedios
involucrados en la biosíntesis de la penicilina. La presente
invención se refiere, también, a procesos para la preparación de la
enzima y del ADN que codifica la enzima.
El camino bioquímico para la Penicilina G se
describe en la literatura (Queener (1990) Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 34 (6), 943-948; Martin (1992),
J. Industrial Microbiol. 9, 73-90; Luengo
(1995), J. Antibiotics 48 (11), 1195-1212).
El camino ha sido asunto de un estudio considerable con objeto de
incrementar el rendimiento (título) en procesos de fermentación.
Fenilacetato (FAA) y Fenoxiacetato (FOA) son
activados a los correspondientes tioésteres de la CoA en
Penicilium chrysogenum mediante una enzima ligasa (por
ejemplo, FAA-CoA ligasa). Estos tioésteres se usan,
luego, para la biosíntesis de la Penicilina G en el caso de la FAA
y de la penicilina V en el caso de la FOA. Por tanto, se piensa que
la FAA-CoA ligasa es esencial en la biosíntesis de
estos antibióticos terapéuticos comercialmente importantes.
En un procedimiento de purificación que implica
precipitación con sulfato amónico y elución con cloruro potásico
desde una columna DEAE-Sephacel se ha aislado una
enzima de Pseudomonas putida con actividad
FAA-CoA ligasa (J. Biol. Chem. 267 (12),
7084-7090 (1990)). La enzima tiene un peso molecular
de 48 kDa +/- 1 kD, un pH óptimo de 8,2 y está involucrada en el
catabolismo de la FAA.
Los intentos para ensayar una enzima con
actividad FAA-CoA ligasa a partir de P.
chrysogenum por el método del hidroximato (un ensayo
colorimétrico que detecta fenilacetil-hidroxamato o
fenoxiacetil-hidroxamato a 540 nm) se han incluido
en el trabajo informado por Kogekar y Deshpande (1982), Ind. J.
Biochem. Biophys 19, 257-261 y por Brunner y
Rohr (1975), Methods Enzymol 43, 476-481;
sin embargo, otros técnicos (Martínez-Blanco et al.
(1992), J. Biol. Chem. 267 (8), 5474-5481)
son de la opinión de que la proteína no había sido purificada o de
que la actividad no había sido caracterizada con detalle. Además,
los últimos autores fracasaron en encontrar la enzima por el
procedimiento reseñado.
El documento WO 96/10085 (Gist Brocades,
publicado el 4 de abril de 1996) revisa éstos y otros intentos de
aislar una FAA-CoA ligasa que trabaje en el camino
de la penicilina. En el documento WO 96/10085 se describe una enzima
acil-CoA sintetasa que se obtiene de una cepa B10
de Penicilium chrysogenum que es mantenida por PanLabs
(EE.UU.) Entre las propiedades específicas atribuidas a la enzima
están las siguientes: peso molecular de aproximadamente 50 kDa
(determinado por filtración en gel), pH óptimo pH 8 a 8,5 (baja
actividad a pH 7 o menor), temperatura óptima a 40ºC, pI mayor que
7,25. De forma importante, la enzima puede ser purificada mediante
precipitación con sulfato amónico. Tiene una especificidad bastante
amplia (es decir, es capaz de catalizar la formación de
fenoxiacetil-coenzima A,
fenilacetil-coenzima A,
adipil-coenzima A y
hexanoil-coenzima A a partir de Mg^{2+}, ATP,
CoASH, y ácido fenoxiacético, ácido fenilacético, ácido adípico o
ácido hexanoico, respectivamente, pero no muestra ninguna actividad
significativa hacia el ácido acético. También, se dice que la
enzima es estabilizada mediante agentes reductores. Una alta
concentración de sulfato amónico o de glicerol también estabiliza
la enzima. No se dan indicaciones de pureza para la actividad de la
enzima obtenida por los métodos descritos y no se da ninguna
secuencia o secuencia N-terminal para la enzima, y
el ADN correspondiente ni está caracterizado ni se da su
secuencia.
A pesar de todos estos esfuerzos poco se sabe
acerca de la auténtica enzima FAA-CoA ligasa que
trabaja en la especie Penicillium in vivo. Se ha especulado
con que la enzima responsable puede estar involucrada en un
metabolismo primario (Smith et al. (1990) Biotechnology
8, 39-41). Martínez-Blanco
et al. (1992) ibid seleccionaron una posible enzima
candidato, la acetil-CoA sintetasa, y la purificaron
a partir de P. chrysogenum basándose en la actividad de la
acetil-CoA sintetasa. Fueron capaces de demostrar
que además de formar el derivado CoA del acetato, la
acetil-CoA sintetasa era capaz de activar varios
ácidos grasos (C2-C8) y algunas moléculas
aromáticas (incluyendo la FAA) in vitro.
El gen de la acetil CoA sintetasa ha sido
secuenciado (patente internacional WO92/07079, Gouka et al. (1993),
Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519,
Martínez-Blanco et al. (1993) Gene 130,
265-270) y se ha demostrado que tiene homología con
otras acetil-CoA sintetasas de hongos. Sin embargo,
las mutaciones en este gen seleccionado mediante ácido
fluoroacético no parecen alterar los niveles de producción de
penicilina (patente internacional WO92/07079) lo que sugiere que
in vivo otra enzima es realmente responsable de la
activación de la FAA.
En la presente invención, se ha desarrollado un
ensayo directo de la actividad de la FAA-CoA ligasa
conjuntamente con un protocolo específico de purificación y éste ha
permitido la purificación y posterior clonación de lo que se cree
que es la auténtica FAA-CoA ligasa. La enzima
aislada por la presente invención tiene una secuencia de aminoácido
N-terminal diferente a la acetil-CoA
sintetasa mencionada anteriormente y posee diversas propiedades
diferentes (por ejemplo, el peso molecular) lo que indica que se ha
aislado una enzima diferente de todas las enzimas atribuidas con
este papel hasta la fecha. Las características propiedades de la
enzima aislada en la presente invención incluyen una dependencia
absoluta en CoASH como sustrato mientras que la enzima aislada por
Kogekar y Deshpande (1983) ibid se ensayaba en condiciones donde se
omitía la CoASH. Ésta y otras diferencias entre las proteínas
aisladas (por ejemplo, pH óptimo y otras características dadas en
los ejemplos de más adelante) muestran que la enzima en la presente
invención es diferente de cualquiera de las descritas en la técnica
anterior. Se cree que el presente trabajo representa el primer
aislamiento de una forma pura de la enzima FAA-CoA
ligasa a partir de Penicilium sp. En particular, la presencia de un
péptido C-terminal SKI es consistente con esta
enzima con un papel real en la biosíntesis de la penicilina. La
enzima de la presente invención se diferencia de la del documento
WO 96/10085 mencionada anteriormente en que tiene un peso molecular
diferente y la enzima de la presente invención, a diferencia de la
del documento WO 96/10085, es sensible a la precipitación con
sulfato de amonio y sales cloruro.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona ADN que codifica una enzima con actividad
FAA-CoA ligasa obtenible a partir de Penicilium
chrysogenum cultivando, recolectando y sometiendo el micelio a
ultrasonidos, separando desechos celulares y fraccionando lo
sometido a ultrasonidos por cromatografía de intercambio aniónico,
seguido por cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía
de afinidad con elución de sustrato y cromatografía de filtración
en gel, en donde las fracciones cromatográficas activas son
detectadas usando un ensayo dependiente de FAA y coenzima A.
El gen que codifica dicha proteína está
localizado dentro del fragmento de ADN que se muestra en la Figura
2. En particular, el ADN comprende sustancialmente la secuencia de
ADN de la Figura 3/ID SEQ 2.
En la Figura 2, se indica la longitud aproximada
en kilobases (kb) del ADN determinada clasificando experimentos
llevados a cabo por electroforesis en gel de agarosa. Debe
entenderse que la figura no está proyectada para mostrar todos los
puntos de restricción presentes en el ADN.
Se comprenderá que el ADN de esta invención no
está en su estado natural como aparece en la naturaleza pero es una
forma aislada o sustancialmente pura. Se comprenderá que la
invención abarca ADN que puede no tener la configuración precisa de
los puntos de restricción ilustrados si dicho ADN se ha derivado
mediante técnicas estándar que incluyen delección, sustitución,
adición o inversión de nucleótidos del ADN de acuerdo con cualquier
aspecto de la invención descrita anteriormente.
Preferiblemente, el ADN de la presente invención
se deriva de P. chrysogenum. Sin embargo, la invención
abarca también las secuencias de ADN derivadas de otros organismos
adecuados que producen, especialmente, organismos distintos de
P. chrysogenum cuyas secuencias no tienen la configuración de
los puntos de restricción mostrados pero que hibridan,
preferiblemente en condiciones de gran escasez, con el ADN mostrado
en la Fig. 2 o un subfragmento del mismo y que codifican la
FAA-CoA ligasa o una enzima con actividad
FAA-CoA ligasa (condiciones de gran escasez son,
por ejemplo, las que se dan en el Ejemplo 18).
La invención proporciona, también, un vector que
comprende tal ADN, preferiblemente un vector de expresión para
expresar FAA-CoA ligasa en un organismo huésped
adecuado. Un ejemplo específico de un vector de expresión de este
tipo es pBK-CMV (adquirido de Stratagene) y usado en
esta invención para la expresión en E. coli. En esta
invención el inserto cADN de la FAA-CoA ligasa
(=pPEN09, fig. 2) es un vector preferido para expresión en E.
coli.
El ADN de la invención y los vectores que
contienen el mismo pueden encontrar uso en muchas áreas de
actividad industrial. Esto se aplica, también, a microorganismos
huésped transformados con dichos vectores y a las enzimas que
expresan. Por ejemplo, el ADN puede utilizarse como una sonda de
hibridación para identificar y aislar genes relacionados o
solapantes presentes en el ADN celular total de P.
chrysogenum (NRRL 1951) y de otros microorganismos que producen
enzimas de estructura y especificidad similares.
Vectores recombinantes que contienen dicho ADN
pueden ser valiosos, si se transforman en huéspedes adecuados, en
la producción de micro-organismos genéticamente
modificados que sintetizan cantidades incrementadas de
penicilina.
Sería muy ventajoso incrementar la cantidad de
actividad de la FAA-CoA ligasa en un organismo
adecuado. También pueden usarse vectores recombinantes en la
generación de antibióticos nuevos o híbridos mediante el
procedimiento de transferencia de genes (véase, por ejemplo, D.A.
Hopwood et al.,Nature, 1985, 314, 642-644).
Las enzimas codificadas por el ADN de la invención, por ejemplo, en
los sistemas exentos de células, especialmente, cuando están
inmovilizadas sobre soportes sólidos adecuados, pueden usarse para
preparar los antibióticos conocidos a partir de precursores
naturales o un nuevo antibiótico a partir de precursores ``no
naturales'' obtenidos, por ejemplo, por síntesis química.
El ADN de la invención o uno de los fragmentos
del mismo (sin que sea necesario que lleve un gen intacto) puede
combinarse, o por técnicas de ADN recombinante o por procedimientos
de recombinación natural, con un fragmento de un gen involucrado en
biosíntesis para producir un gen híbrido capaz de dirigir la
síntesis de una enzima híbrida. Tales enzimas pueden usarse en la
producción de nuevos antibióticos mediante procesos análogos a los
descritos en lo que antecede.
El ADN de la invención puede ser modificado,
también, por técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio
(de una manera análoga a la descrita, por ejemplo, por G. Winter
et al., Nature, 1982, 299, 756-758; o por
Zoller y Smith, Nucleic Acids Research, 1982, 10,
6487-6500) para dar ADN en el que se han efectuado
mutaciones y/o delecciones específicas. El ADN mutado puede usarse
para obtener un rendimiento (o título) de penicilina incrementado a
partir de un microorganismo huésped adecuado.
El ADN mutado puede usarse, también, para obtener
antibióticos nuevos o híbridos por transferencia de genes, o puede
usarse en la producción de enzimas mutantes (muteínas) que pueden
usarse en la producción de antibióticos nuevos por procesos
análogos a los descritos en lo que antecede. El ADN mutado puede
usarse, también, para alterar otras propiedades de fermentación de
organismos adecuados, por ejemplo, sustratos alterados en la
tolerancia a la FAA.
La presente invención proporciona, también, el
polipéptido con actividad FAA-CoA ligasa
codificado por el ADN de acuerdo con el primer aspecto de la
invención. La enzima, preferiblemente, está en forma purificada,
ventajosamente en forma sustancialmente pura. La enzima de esta
invención tiene una masa molecular aparente de 63 kDa (mediante SDS
PAGE). Preferiblemente, la enzima incluye la secuencia de
aminoácidos N-terminal: V F L P P K E S G Q L D
P.
En particular, la enzima comprende la secuencia
de aminoácidos de la Figura 1/ID SEQ 1.
En un aspecto adicional de la invención, se ha
proporcionado un método de preparar una enzima con actividad
FAA-CoA ligasa cultivando Penicilium sp. seguido
por extracción y purificación, en donde las fracciones activas se
detectan usando un ensayo dependiente de FAA y
Co-enzima A. En particular, la Penicilium sp. es
P. chrysogenum y el micelio es tratado mediante
ultrasonidos, seguido por cromatografía de fraccionamiento por
intercambio aniónico, de interacción hidrófoba, de afinidad y de
filtración en gel para proporcionar un incremento de la pureza de
aproximadamente 1000 veces.
La enzima puede usarse en biotransformaciones
in vitro. Por ejemplo, para la síntesis del éster de la CoA
o para la síntesis de penicilina cuando se mezclan con
acil-CoA:6-APA aciltransferasa. Las
biotransformaciones in vitro pueden llevarse a cabo usando
células enteras, extractos exentos de células, células
permeabilizadas o la enzima aislada a partir de microorganismos o
cualquiera de éstos en forma inmovilizada.
Si la biotransformación se lleva a cabo usando
células enteras, el microorganismo puede estar en la forma de
cultivo en crecimiento, cultivo en reposo, micelio lavado, células
inmovilizadas o protoplastos.
Cuando se usan extractos exentos de células,
éstos se producen, adecuadamente, por cizalla y/o lisis química o
enzimática u otros métodos de disrupción, preferiblemente
sometiendo a ultrasonidos y, opcionalmente, después, separación de
los desechos celulares, dejando la actividad de la enzima en la
solución.
La enzima se prepara, adecuadamente, según los
ejemplos de más adelante usando cepas de P. chrysogenum,
comercialmente disponibles, incluyendo el tipo salvaje NRRL 1951.
Otras cepas adecuadas de P. chrysogenum incluyen cepas que
producen mucha penicilina, por ejemplo, la cepa BW1901 (EMBO J.
9 (3), 741-747 (1990), D.J. Smith et
al.).
La enzima puede ser preparada cultivando el
microorganismo de una manera convencional, especialmente en
condiciones aeróbicas en un medio líquido o semisólido adecuado.
Las condiciones de cultivo pueden ser una temperatura en el
intervalo de 5-50ºC, preferiblemente
25-30ºC, y un pH en el intervalo 3 a 9,
preferiblemente 6-8, lo más preferiblemente 7,2.
La enzima puede aislarse y usarse en forma
purificada, en forma parcialmente purificada, como obtenida en un
estado impuro, como un filtrado de una preparación celular
desorganizada, como un homogeneizado celular en bruto, y así
sucesivamente. Lo más adecuadamente la enzima es, por ejemplo, al
menos purificada para separar otras enzimas que puedan, también,
catalizar la destrucción de las materias primas o de la enzima.
Lo más adecuadamente, la enzima es inmovilizada,
por ejemplo, en un material soporte insoluble como por los
procedimientos discutidos por Powell (1990) en Microbial Enzymes
and Biotechnology, redactores Fogarty y Kelly, p.
369-394. Esto proporciona la ventaja de un
rendimiento y una capacidad de tratamiento incrementados.
Cuando la biotransformación se lleva a cabo
utilizando células enteras, un medio de incubación adecuado
comprende un medio: 2 g de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g de
K_{2}HPO_{4}, 0,2 g de KCl, 0,2 g de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,22 g de Na_{2}SO_{4}\cdot10H_{2}O, 1,0 g de glucosa en un
litro de agua desionizada a pH 6,5 o un sistema acuoso con ajuste
de pH.
Cuando la biotransformación se lleva a cabo
usando extractos exentos de células el medio de incubación
comprende un tampón adecuado. Además de los sustratos, la mezcla de
reacción de la enzima puede contener uno o más cofactores, por
ejemplo, iones metálicos o estabilizadores, por ejemplo tioles.
La biotransformación puede llevarse a cabo,
adecuadamente, en medio acuoso, manteniéndose la mezcla de
reacción, adecuadamente, en el intervalo de pH 4-10,
más adecuadamente de 6 a 10, preferiblemente alrededor de 9,0. El
pH es controlado, adecuadamente, usando tampones o preferiblemente
por la adición de un reactivo de valoración ácido o base. La
temperatura de la reacción debería estar, generalmente, en el
intervalo 5-50ºC, preferiblemente
22-45ºC, lo más preferiblemente
30-37ºC. Alternativamente, la reacción puede
llevarse a cabo en disolventes orgánicos o en presencia de
disolventes orgánicos, por ejemplo, acetona y metil isobutil cetona
(MIBK).
El tiempo de reacción depende de factores tales
como las concentraciones de los reaccionantes y de los cofactores,
la temperatura y el pH. Después de que la reacción ha terminado, el
producto puede ser aislado por métodos convencionales. La
purificación inicial supone, convenientemente, una etapa de
cromatografía.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Se inocularon esporas de Penicilium
chrysogenum (Cepa BW1901 de SmithKline Beecham) en 15 ml de
medio PVS (35 g/l maíz empapado con líquido de tratamiento, 15 g/l
de glucosa, 5 g/l de CaCO_{3}, 8 ml/l de aceite de semilla de
colza, pH a 5,9 con NaOH) en matraz vibrante de 100 ml. El cultivo
se desarrolló durante 48 h a 26ºC con agitación orbital (230 rpm)
antes de tomar 1 ml del caldo total y transferirlo a 10 ml de medio
de cultivo C5 (35 g/l de maíz empapado con líquido de tratamiento,
85 g/l de lactosa, 10 g/l de CaCO_{3}, 10 g/l de
NaH_{2}PO_{4}, 8 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 4 g/l
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 4 g/l de Na_{2}SO_{4}, 6 ml/l de
aceite de semilla de colza, 6 g/l de ácido fenoxiacético, pH a 6,0
con NaOH) en matraz vibrante de 100 ml. Este cultivo se desarrolló
luego durante 55 h a 26ºC con agitación orbital (230 rpm) antes de
recolectar los micelios.
Los micelios del matraz vibrante C5 de 55 h
cultivados como se describe en el ejemplo 1 se recolectaron
filtrando a través de filtros de microfibra de vidrio (Whatman
GF/A). La mata micelial se lavó con 300 ml de cloruro sódico al 0,9%
(peso/volumen) (4ºC) y luego se rascó del filtro y se colocó en 10
ml del tampón de ensayo de ligasa (Tris-HCl 30 mM,
pH 9,0, ditiotreitol 1 mM, 100 \mug/ml de Pefabloc® en glicerol
al 50%). Los micelios se sometieron luego a ultrasonidos en hielo
(3 x 15 explosiones usando un equipo de ultrasonidos Ultrasonics
modelo W-385, reglaje de potencia 5, cadencia de 5
s, ciclo de trabajo del 50%), y luego los desechos miceliales se
granularon por centrifugación (18.000xg, 4ºC, 30 min). El
sobrenadante se congeló a menos 70ºC durante el almacenamiento o se
usó inmediatamente para el ensayo de la FAA-CoA
ligasa, para purificación o para transferencia Western (ejemplo
7).
Para demostrar la presencia de actividad de la
FAA-CoA ligasa en extractos o en fracciones de
columna, se mezclaron 20 \mul con ácido fenilacético 0,1 M en
Tris-HCl 50 mM pH 7,5 (20 \mul), ATP sódico 0,1 M
(10 \mul), cloruro de magnesio 0,2 M (10 \mul), coenzima A
sódica 0,02 M (10 \mul) y ditiotreitol 0,015 M (10 \mul) en
tubos eppendorf de plástico. Los tubos se mezclaron con vórtice (5
s) y luego se colocaron en un baño de agua a 30ºC durante 15 min.
Luego, a las mezclas, se añadió metanol (100 \mul) y los tubos se
centrifugaron (14 K, 1 min) para precipitar las proteínas. En las
fracciones sobrenadantes se analizó la presencia de
FAA-CoA por HPLC (cromatografía de líquidos de alto
rendimiento) (ejemplo 4). En cada conjunto de ensayos, se ensayó un
extracto de proteína preparado a partir de una fermentación de P.
chrysogenum en matraz vibrante (ejemplo 1) como un control
positivo junto con un patrón de FAA-CoA.
Se analizó la presencia de
FAA-CoA en las muestras sobrenadantes de los
ensayos de FAA-CoA ligasa (ejemplo 3) usando un
sistema Waters LCM1 de HPLC. Las muestras (100 \mul) se
inyectaron en una columna de compresión Radial Pak C18 a
temperatura ambiente con un caudal de 2,5 ml/min usando una fase
móvil de fosfato sódico 0,2 M pH 5,4 (Tampón A) isocráticamente de
0-4 min. Esto fue seguido por un gradiente lineal
para tampón B 100% que contenía fosfato sódico 0,16 M pH 5,4 en
acetonitrilo al 40% (4-10 min). El tampón B se
mantuvo 100% durante unos 2 min adicionales y, luego, el sistema se
reequilibró listo para la siguiente inyección usando un gradiente
lineal de vuelta a A 100% (12-13 min). Los picos se
detectaron a 260 nm y la FAA-CoA tenía un tiempo de
retención de 12 min. Las muestras positivas eran las que tenían
picos co-eluyentes con el patrón de
FAA-CoA y mostraron los mismos espectros de
absorbancia UV que el patrón determinado por un espectrómetro de
red fotodiodo.
Fue necesario poner atención, ya que se encontró
que la actividad de la enzima era extremadamente lábil. Los
intentos de precipitar la enzima con sulfato amónico no tuvieron
éxito ya que no pudo encontrarse ninguna actividad en el material
obtenido. Esto por sí solo distingue la presente enzima de la
descrita en el documento WO 96/10085
(Gist-Brocades).
A menos que se indique de otra manera, el
procedimiento siguiente se realizó a 4ºC usando tampón C que
contenía Tris-HCl 30 mM, DTT 4 mM, AEDT 4 mM,
MgCl_{2} 5 mM y glicerol al 20% (vol/vol) a pH 9,0. Las
separaciones se lograron usando un sistema Pharmacia
Hi-Load®. El extracto exento de células (500 ml),
elaborado como se da en el ejemplo 1, se descongeló lentamente a
4ºC. El extracto se ajustó luego a pH 9,0 usando NaOH 5 M con
agitación en hielo. A este extracto en agitación se añadieron 275 g
de un medio de intercambio iónico Q-Sepharose Fast
Flow (Pharmacia) que había sido previamente lavado con 3 l de agua
seguido por 1 l de tampón C. Esta mezcla se agitó durante 1,5 h en
hielo. La suspensión se filtró luego a través de unos 50 g
adicionales de una resina Q-Sepharose lavada en un
sinterizado de vidrio usando presión reducida. La resina se lavó
luego con unos 100 ml adicionales de tampón C y luego se dejó secar
dando 600 ml de un extracto transparente que contenía
FAA-CoA ligasa. Luego, se añadió sulfato amónico
(92,4 g, es decir, niveles de subprecipitación) y la solución se
agitó en hielo durante 1 h seguido por filtración (filtro de 0,45
\mum, Millipore, tipo HA).
El extracto de FAA-CoA Ligasa
(700 ml) se cargó luego a 1ml/min en una columna
Phenyl-sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia, 12 cm x 2,6
cm de diámetro), de baja sustitución, previamente acondicionada con
1 l de tampón D (como para el tampón C con 140 g/l de sulfato
amónico). La columna cargada se lavó después con 230 ml de tampón D
a 0,8 ml/min y después se eluyó con un gradiente lineal desde tampón
D 100% hasta tampón C 100% con 238 ml a 0,8 ml/min. Se recogieron
fracciones de 5,5 ml y se ensayaron en cuanto a la actividad de la
FAA-CoA ligasa como se da en el ejemplo 3. Las
fracciones activas 41 a 49 se agruparon dando 50 ml, que se
cargaron a 0,5 ml/min en una columna de afinidad HiTrap® Blue
(Pharmacia) de 5 ml previamente lavadas con 50 ml de tampón C. La
columna cargada se lavó con 15 ml de tampón C y luego se eluyó
usando un gradiente lineal desde tampón C 100% hasta tampón E 100%
con 25 ml a 0,5 ml/min. El tampón E era como para tampón C con la
adición de ácido fenilacético hasta dada una concentración final de
0,5 M que se reajustó a pH 9,0 usando NaOH sólido. La elución desde
la columna de afinidad usando el sustrato natural se usó para
aumentar la selectividad de la purificación y permitir que la
actividad enzimática fuera medida en las fracciones resultantes. La
elución de NaCl se probó sin éxito porque su sal inhibió la
actividad de la enzima. En contraste, la enzima descrita en el
documento WO 96/10085 parece ser estable cuando se eluye en KCl.
Las fracciones activas 21, 22 y 23 se agruparon
para dar 6 ml, que luego se separaron a 0,25 ml/min en una columna
de exclusión por tamaño Sephacryl S-200 High
Performance (Pharmacia, 64 cm x 2,6 cm de diámetro) que se había
equilibrado previamente en tampón F (como para el tampón C con
ajuste a pH 7,5 con HCl 5 M). Las fracciones activas 54 a 65 se
agruparon dando 11 ml que se concentraron hasta 60 \mul por
ultrafiltración centrífuga (corte Centricon de peso molecular
10.000, de Amicon Inc.). El análisis de las fracciones de la
columna de exclusión por tamaños mediante electroforesis por
SDS-gel de poliacrilamida (ejemplo 6) mostró una
proteína de 63 kDa, cuya intensidad estaba correlacionada con la
actividad de la FAA-CoA ligasa. La transferencia
Western (ejemplo 6) se usó para completar la purificación y
permitir secuenciar el aminoácido N-terminal de la
FAA-CoA ligasa.
Para proporcionar material para secuenciar el
aminoácido N-terminal, la proteína purificada (60
\mul, ejemplo 5) se mezcló con un volumen igual de muestra de
tampón SDS-PAGE que contenía
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 (10 ml),
dodecil-sulfato sódico (2g, ultrapuro),
2-mercaptoetanol (1 ml), glicerol (10 ml), agua
destilada desionizada (7 ml) y azul de bromoclorofenol al 0,1% (2
ml). Esta mezcla se llevó a ebullición durante 10 min y se dejó
enfriar a temperatura ambiente. Se cargaron alícuotas (de 5, 15 y
20 \mul) sobre un gel de poliacrilamida al 10% (gel con 4% de
apilamiento) fundido en una celda de electroforesis
Bio-Rad Mini Protean II preparada usando el
protocolo de los fabricantes. La electroforesis se realizó en un
tampón de electrodo que contenía Tris 0,025 M, glicina 0,192 M y
dodecil-sulfato sódico al 0,1% peso/volumen
(ultrapuro) a 200 V durante 45 min después de cuyo tiempo el gel de
poliacrilamida se colocó en el tampón de electrotransferencia (ácido
3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico
10 mM, pH 11 en metanol al 10%) durante 5 min. Las proteínas en el
gel de poliacrilamida se transfirieron sobre membrana de
inmovilización Applied Biosystems ProBlott® usando una celda de
transferencia electroforética Bio-Rad Mini
Trans-Blot siguiendo el protocolo de Applied
Biosystems. Al terminar la transferencia, la membrana se coloreó con
Coomasie Blue R-250 usando el método de coloreado
en el protocolo de Applied Biosystems. La banda de proteína a 63
kDa se cortó de la membrana y este material se usó para secuenciar
el aminoácido N-terminal (ejemplo 7).
La secuencia de aminoácido
N-terminal se obtuvo a partir de la proteína
transferida (ejemplo 6) usando un Secuenciador de Líquido Impulsado
477A de Applied Biosystems (ABI). La secuencia se obtuvo usando
patrón de Edman Chemistry con identificación de los aminoácidos
liberados marcados con PTH usando cromatografía ABI en tubo de
pequeño diámetro de 120 \ring{A}. El análisis de la proteína
FAA-CoA ligasa purificada dio como resultado la
siguiente asignación de secuencia:
V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P.
Para sintetizar un péptido se usó la secuencia de
aminoácido N-terminal determinada a partir de la
proteína FAA-CoA de 63 kDa (ejemplo 7). Ésta fue
sintetizada por Peptide and Protein Research Consultants (Washington
Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter,
Devon EX4 4QG, Reino Unido) en forma de 50 mg de péptidos libres.
12 mg se conjugaron con maleimida activada con ASB (Albúmina de
suero bovino) usando SMCC
(4-(N-maleimidiometil)ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo) y 2,5 mg se conjugaron con maleimida activada con
OVA (Ovoalbúmina) usando MBS (éster
N-hidroxisuccinimida de
m-maleimidobenzoílo).
El péptido conjugado con ASB (ejemplo 8) se usó
para la producción de anticuerpos policlonales de conejo
específicos para la proteína FAA-CoA ligasa de 63
kDa. El péptido conjugado con ASB (375 \mug/ml) se esterilizó en
filtro (filtro de 0,2 \mum) y 1 ml de la solución estéril se
mezcló enérgicamente con 2 ml de adyuvante completo Freunds no
ulcerativo (Brian Morris International, Guildford, Reino Unido). Un
total de 0,8 ml de esta mezcla (100 \mug del péptido conjugado
con ASB) se administraron de forma subcutánea a conejos blancos de
Nueva Zelanda (de aproximadamente 10 semanas de vida) en cuatro
diferentes lugares de inyección. Después de la inmunización inicial
descrita anteriormente, se administraron inmunizaciones adicionales
a los 28 y 58 días, con la excepción de que se usaron adyuvantes
incompletos Freunds no ulcerativos. Las muestras de sangre para
ensayo se extrajeron de la vena marginal de la oreja a los 42 y 72
días después de la inmunización inicial para valorar el título y
especificidad del anticuerpo usando un Ensayo Inmunoabsorbente
Ligado a la Enzima (ejemplo 10).
Una placa de microtitulación de fondo plano de 96
pocillos (Nunc MaxiSorp®) se revistió con un péptido de
FAA-CoA ligasa conjugado con OVA (200
\mul/pocillo, 0-10 \mug/ml) en solución salina
tamponada con fosfato a pH 7,2 (8 g/l de cloruro sódico, 0,2 g/l de
cloruro potásico, 1,44 g/l de ortofosfato dihidrógeno sódico, 0,24
g/l de ortofosfato dihidrógeno potásico, pH 7,2). La placa de
microtitulación revestida se incubó a 4ºC durante aproximadamente 18
h después de cuyo tiempo la placa se lavó cuatro veces con tampón
de lavado (Tris 10 mM, cloruro de sodio 0,15 M, azida sódica al
0,02%, Tween 20 al 0,05%, pH 7,2) usando un lavador de placas MRW
de Dynatech. Este método de lavado se usa a lo largo del resto del
procedimiento a menos que se indique de otra manera. El tampón de
bloqueo (1,56 g/l de ortofosfato dihidrógeno sódico, 8,8 g/l de
cloruro sódico, 0,2 g/l de ficoll 400, 0,2 g/l de
polivinil-pirrolidona, gammaglobulina bovina al
0,5% de Sigma, pH 7,4, 200 \mul/pocillo) se añadió a la placa y
se incubó a 37ºC en un Incubador Varishaker de Dynatech durante 1 h.
Todas las incubaciones subsiguientes a 37ºC se realizaron usando
este método. La placa se lavó cuatro veces y luego el anticuerpo
policlonal de conejo (100 \mul/pocillo, dilución de
0-1:500.000), se diluyó en tampón del ensayo (Tris
50 mM, cloruro sódico 150 mM, cloruro de magnesio 1 mM, ASB al 0,5%,
gammaglobulina bovina al 0,25%, azida sódica al 0,02%, pH 7,4), se
añadió a la placa y se incubó a 37ºC. Después de lavar la placa, a
la placa se añadió un anticuerpo bioestañado de IgG
anti-conejo de Amersham (100 \mul/pocillo,
dilución 1:5.000 en el tampón de ensayo) y se incubó a 37ºC. La
placa se lavó y un conjugado de estreptavidina alcalina fosfatasa
de Amersham (100 \mul/pocillo, 1:2.000 dilución en tampón de
ensayo) se añadió a la placa y se incubó a 37ºC. Después de lavar
la placa, a la placa (100 \mul/pocillo) se añadió fosfato de
p-nitrofenilo (Sigma, 1 mg/ml) disuelto en tampón de
glicina 0,1 M (7,51 g/l de glicina, 203 mg/l de cloruro de
magnesio, 136 mg/l de cloruro de cinc, pH 10,4) y se incubó a 37ºC
durante 30 min. A la placa se añadió, luego, hidróxido sódico (2 M,
50 \mul/pocillo) y se midió la absorbancia de cada pocillo a 405
nm usando un lector de placa Anthos Labtec. Se obtuvieron títulos
de anticuerpos entre 1:500.000 y 1:1.000.000.
Para demostrar que los anticuerpos policlonales
de conejo reaccionarían con el péptido de FAA-CoA
ligasa no conjugado, se realizó un ensayo ELISA como se ha descrito
anteriormente con una modificación en la etapa de incubación que usó
anticuerpos policlonales de conejo. Los anticuerpos se diluyeron
1:100.000- 1:400.000 en tampón de ensayo y 50 \mul de anticuerpo
diluido se añadieron a pocillos que contenían 50 \mul de péptido
(0-20 \mug/ml) no conjugado preparado en tampón
de ensayo que contenía 2-mercaptoetanol (0,01%,
vol/vol). Se logró un 50% de inhibición de la reactividad del
anticuerpo con el péptido conjugado con OVA a una concentración de
péptido no conjugado de aproximadamente 2 \mug/ml.
Los extractos preparados a partir de cultivos de
Penicilium chrysogenum en matraz vibrante (BW1901 y BW1900A
- una cepa derivada de un programa de mutación al azar), a partir
de JM109 de E. coli y muestras de proteína
FAA-CoA ligasa purificada se sometieron a
transferencia Western como se ha descrito en el ejemplo 6 excepto
que la membrana no se coloreó con Coomassie Blue. Las membranas
transferidas se colocaron en tampón de bloqueo (1,56 g/l de
ortofosfato dihidrógeno sódico, 8,8 g/l de cloruro sódico, 0,2 g/l
ficoll 400, 0,2 g/l de polivinil-pirrolidona,
gammaglobulina bovina al 0,5%, pH 7,4) y se incubaron durante
aproximadamente 18 h a 4ºC. La membrana se lavó luego cuatro veces
con tampón de lavado (Tris 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, Tween 20 al
0,05%, pH 7,2) antes de incubar (temperatura ambiente, 60 min) con
anticuerpos policlonales de conejo generados como se da en el
ejemplo 9 y previamente diluidos 1:100 en tampón de ensayo (Tris 50
mM, cloruro sódico 150 mM, cloruro de magnesio 1 mM, ASB al 0,5%,
gammaglobulina bovina al 0,25%, pH 7,4). Después de unos cuatro
lavados adicionales en tampón de lavado la membrana se incubó con
un conjugado de peroxidasa de rábano picante-IgG
anti-conejo de asno (Bio-Rad,
1:2.000 en tampón de ensayo, 60 min, temperatura ambiente) seguido
por unos cuatro lavados adicionales en tampón de lavado. La
membrana se incubó luego con un sustrato de peroxidasa (un Estuche
de sustrato de conjugado de peroxidasa de rábano picante
Bio-Rad) durante 10 min a temperatura ambiente antes
de parar la reacción lavando la mancha con cinco cambios de agua
destilada desionizada. Las muestras positivas de proteínas
FAA-CoA ligasa eran aquellas con una banda a
aproximadamente 63 kDa que coemigraron con la banda de
FAA-CoA ligasa purificada. No se detectó ninguna
banda positiva a 63 kDa en el extracto de proteína JM109 de
E-coli.
Un banco de cADN de Penicilium chrysogenum
(Cepa BW1901 de SmithKline Beecham) se construyó siguiendo el
manual de instrucciones del Estuche de Síntesis de cADN de ZAP
Express® de Stratagene. El ARN se aisló de la cepa BW1901 como
sigue. La cepa BW1901 desarrollada como se da en el ejemplo 1
durante 40 h antes de recolectar los micelios por filtración a
través de dos filtros Whatman GF/A de microfibra de vidrio de 9,0
cm. Los micelios se lavaron con 100 ml de agua destilada tratada
con DEPC (pirocarbonato de dietilo). Los micelios se trituraron
después en nitrógeno líquido usando un mortero y mano de almirez
tratados con DEPC. Los micelios en polvo congelados se transfirieron
a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 10 ml de solución G
(tiocianato de guanidinio 4M, Tris\cdotHCl 50 mM, pH 7,5, AEDT 25
mM). El polvo se volvió a suspender en Solución G y de dejó en
hielo durante 15 min. El desecho micelial se granuló a 17.500 x g a
4ºC durante 20 min. El sobrenadante se recogió en otro tubo de
centrífuga de 50 ml y se extrajo el ARN como Chomczynski y Sacchi
(1987), Analytical Biochemistry 162, 156-159.
Del ARN total, se aisló ARN poliA^{+} usando un estuche de
columnas de rotación de celulosa de CP Laboratories
Mini-Oligo (dT) según las instrucciones del
fabricante. El ARN poliA^{+} se analizó por electroforesis en gel
como en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (segunda edición). Se tomaron alícuotas (5
\mug) de ARN poliA^{+} y se usaron para sintetizar cADN de
doble hélice flanqueado por un punto de restricción EcoRI en
el extremo 5' y un punto de restricción XhoI en el extremo
3' del cADN siguiendo el protocolo de síntesis de cADN de ZAP
Express® de Stratagene. El cADN así sintetizado se fraccionó luego
por tamaños por paso a través de columnas de rotación Sephacryl
S-400 de Stratagene suministradas con el estuche de
síntesis de cADN siguiendo las instrucciones del fabricante. El
cADN fraccionado por tamaños fue ligado a los brazos XhoI y
EcoRI de \lambdaZAP Express como en el manual de
instrucciones de Stratagene. El \lambdaADN ligado se empaquetó
entonces usando un estuche de empaquetado Gigapack II Gold de
Stratagene según el protocolo de instrucciones. El fago de cADN
resultante se multiplicó después mediante cultivo en placas,
incubando durante 8 horas. Se obtuvieron más de 250.000 clones
independientes y el fago eluido en 20 ml de medio de cultivo SM
(NaCl 0,1 M, MgSO_{4}0,01 M, Tris-HCl 0,05 M, pH
7,5, gelatina al 0,01%) para placa Nunc, en alícuotas y se almacenó
como Sambrook et al. (1989) ibid.
El banco de cADN \lambdaZAP Express del Ejemplo
12 se clasificó para los clones que expresaron la proteína
FAA-CoA ligasa de 63 kDa usando anticuerpos
elaborados como se da en el ejemplo 9. El banco de cADN se clasificó
como en Sambrook et al. (1989) ibid. El banco \lambdaZAP
Express se infectó a diluciones apropiadas en la cepa XL1 Blue MRF'
de E. coli. Las bacterias infectadas se dejaron crecer
durante 4 h en agarosa Luria que contenía MgSO_{4} 10 mM, maltosa
al 0,2% e IPTG 5 mM (para inducir la expresión del inserto de cADN)
a 37ºC antes de revestir con nitrocelulosa (Hybond-C
super, de Amersham) e incubar durante la noche a 37ºC. Los filtros
fueron luego inmunoclasificados usando los anticuerpos primarios de
conejo (ejemplo 9) a diluciones 1/1.000, mientras el anticuerpo
secundario, anticuerpo conjugado fosfatasa
alcalina-IgG anti-conejo de cabra
(producto A-8025 de Sigma) se usó a diluciones
1/2.000. La localización de clones positivos se realizó con
pastillas de BCIP/NBT (fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroblue
tetrazolium) comprado a Sigma (producto B-5655) y
usado según las instrucciones del fabricante. Se identificaron
veinticuatro clones positivos y se sacaron testigos, se volvieron a
suspender en tampón SM (5,8 g/l de NaCl, 2 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5,
gelatina 0,01%) y se volvieron a clasificar a una menor densidad de
placas hasta que pudo identificarse una señal positiva en una sola
placa.
Los clones positivos de cADN \lambdaZAP Express
identificados a partir de la inmunoclasificación (ejemplo 13)
fueron excindidos después como derivados del plásmido pBKCMV usando
el fago ayudante ExAssist y el protocolo de escisión proporcionado
por Stratagene. Los clones del plásmido se desarrollaron luego
(selección de kanamicina) y se ``mini-prepararon''
como se da en Sambrook et al. (1989) ibid. Los plásmidos
obtenidos se analizaron luego mediante digestiones dobles con
Xbai/SstI para caracterizar el tamaño del inserto de cADN de los
clones. El tamaño del inserto de cADN osciló entre 700 bp y 2,8 kb,
con el grupo más grande (12 clones) que posee un tamaño de inserto
de 2,0 kb. Los plásmidos fueron también digeridos con Sau3A
(cortador de 4 pares de bases) para confirmar el agrupamiento de
clones basándose en modelos de restricción similares. De esta
forma, los clones se dividieron en 6 grupos basados en modelos de
digestión de restricción comunes. Clones representativos de cada
grupo fueron luego ensayados para la producción de la proteína
FAA-CoA ligasa de 63 kDa mediante análisis Western
y también para la actividad de la enzima.
Los extractos de proteínas de clones positivos
representativos de inmunoclasificación excindida se prepararon
tomando un cultivo durante la noche de clones de E. coli
desarrollados en caldo de cultivo Luria mas kanamicina (50
\mug/ml), IPTG (5 mM) a 25ºC y añadiendo un volumen igual de
tampón de muestra SDS-PAGE seguido por ebullición y
electroforesis como en el ejemplo 6. Las proteínas se sometieron
entonces a transferencia Western para determinar la presencia de
proteína FAA-CoA ligasa de 63 kDa (ejemplo 11). El
inmunocoloreado de la membrana se realizó como se ha descrito en el
ejemplo 11 excepto que se usó un conjugado de fosfatasa
alcalina-IgG anti-conejo (dilución
1:2.000 en tampón de ensayo) y el sustrato fosfatasa era BCIP/NBT
suministrado en forma de pastilla (Sigma) y usado de acuerdo con
las instrucciones de los fabricantes. Se identificó que un grupo de
clones (tamaño del inserto de cADN de 2,0 kb) tenía una proteína de
63 kDa (co-emigrada con el control de BW1901).
Para granular las células, se centrifugó en una
centrífuga Denley refrigerada, a 4.000xg y a 4ºC durante 7 min, el
caldo de cultivo que contenía células de E. coli
(desarrolladas como en el ejemplo 15). El sobrenadante se desechó y
las células se volvieron a suspender en tampón de ensayo de ligasa
(ejemplo 2) en la mitad del volumen del caldo de cultivo original.
Las células se sometieron luego a enfriamiento en hielo antes de
someterlas a ultrasonidos para deshacer las células. Las
condiciones del sometimiento a ultrasonidos eran potencia 5 y ciclo
de trabajo al 50% en un equipo de ultrasonidos Apollo Electronics
para 30 explosiones durante 7 min en hielo. Los extractos se usaron
inmediatamente o se almacenaron a -80ºC hasta el momento de su uso.
La actividad de la FAA-CoA ligasa se demostró
usando el procedimiento de ensayo descrito en el ejemplo 3, excepto
que se usaron 40 \mul del extracto y la mezcla de reacción se
incubó durante 60 min a 30ºC. La presencia de
FAA-CoA ligasa en los sobrenadantes del ensayo se
demostró usando HPLC como se ha descrito en el ejemplo 4 con la
adición de un detector de red de fotodiodo Waters 996 para el
análisis espectral. La actividad de la FAA-CoA
ligasa se detectó en el clon 6.6 (representativo del grupo con el
tamaño del inserto de cADN de 2,0 kb) y la FAA-CoA
producida se confirmó por análisis de red de diodo frente a patrón
de FAA-CoA ligasa.
El clon 6.6 (=pPEN09) se
``maxi-preparó'' y el ADN purificado por gradientes
CsCl como en Sambrook et al. (1989) ibid. Se preparó un mapa de
restricción de pPEN09 realizando digestiones enzimáticas sencillas
y dobles (figura 2). Este clon se secuenció después usando el
primario
(5'-ACAGGAAACAGCTATGACCTTG-3')
comprado a Cruachem y usando un estuche de secuenciar T7 de
Pharmacia y siguiendo las instrucciones proporcionadas por el
fabricante. La secuencia del extremo 5' del inserto de cADN,
mostrada más adelante, verificó que la secuencia de aminoácido
traducida en el N-terminal del cADN se equiparó a
la de la secuencia peptídica previamente obtenida (ejemplo 6),
excepto por la metionina de partida (ausente de la secuencia
peptídica).
El resto de pPEN09 se secuenció usando reacciones
de terminación didesoxinucleótido patrón que contenían
7-deaza dGTP. Como marcador se usó
[^{35}S]dATP. Las reacciones de la secuencia se analizaron
con geles cuña de poliacrilamida al 6% que contenían urea 8 M
[Sanger et al. (1977), PNAS 74, 5463-5467;
Chen y Seeburg (1985), DNA 4, 165-170]. Se
generaron delecciones encajadas de ambos extremos T7 y T3 usando
ExoIII y nucleasa S1 [Henikoff (1984) Gene 24,
351-359]. Los clones de la delección se
seleccionaron por tamaños para secuenciar ADN por electroforesis en
geles de agarosa. Los clones seleccionados se secuenciaron como
pPEN09. Los primarios de secuenciación interna se sintetizaron
según se necesitaban. La secuencia completa del inserto de cADN se
muestra en la Figura 3. La secuencia de la proteína traducida se
muestra en la Figura 1.
La comparación de la secuencia de aminoácidos
deducida de la proteína FAA-CoA ligasa con la base
de datos de secuencias de la National Biomedical Research
Foundation Protein (NBFR-PIR) y el Banco de Datos de
Secuencias de Proteínas SWISS-PROT
(SWISS-PROT) en el programa DNASTAR dio el mejor
emparejamiento con la
4-cumarato-CoA ligasa de la patata.
Usando el programa DNASTAR de megaalineación (método clustal) se
alinearon la proteína FAA-CoA ligasa y la
4-cumarato-CoA ligasa de la patata.
El análisis de las distancias secuenciales reveló una similaridad
del 25% de aminoácidos entre las dos proteínas. Una comparación
similar con acetil-CoA sintetasas de hongos
(Penicilium, Aspergillus, Neurospora y fermento) mostró sólo una
similaridad del 15%.
Los tres últimos aminoácidos de la proteína
FAA-CoA ligasa son
serina-lisina-isoleucina. Esta
secuencia de aminoácidos se ajusta al consenso para la Señal de
Elección como Diana por Microcuerpo C-terminal (en
inglés, CMTS) y los mismos aminoácidos han sido considerados
esenciales para elegir como diana la proteína Hansenula polimorfa
catalasa por los microcuerpos (Didion y Roggenkamp (1992) FEBS
Lett. 303(2-3), 113-116). El
tripéptido C-terminal SKI puede también elegir como
diana la proteína por el microcuerpo en Neurospora crassa
(de Zoysa y Connerton (1994) Curr. Genet. 26,
430-437). La última etapa de la biosíntesis de la
penicilina llevada a cabo por la proteína ACTF (utilizando
FAA-CoA - el producto de la FAA-CoA
ligasa) se ha localizado para microcuerpos en P. chrysogenum
(Muller et al. (1991) EMBO J. 10 (2),
489-495). La proteína ACTF tiene también una CMTS
que se requiere para elegir como diana por el microcuerpo
(documento EP 0 488 180 A2). Que la proteína
FAA-CoA ligasa tenga una CMTS es consistente con su
papel en la biosíntesis de la penicilina.
El ADN genómico de numerosas cepas, incluyendo
tipo salvaje NRRL1951, BW1900A, BW1901 de Penicilium
chrysogenum, se aisló como sigue. Las cepas se desarrollaron
como en el ejemplo 1, y se recolectaron después de 40 h por
filtración a través de filtros Whatman GF/A de microfibra de vidrio.
Los micelios se enjuagaron en NaCl 0,9 M antes de congelar en
nitrógeno líquido. Los micelios se trituraron hasta un polvo fino
en nitrógeno líquido y el polvo se volvió a suspender en solución G
(ejemplo 12) dejándolo en hielo durante 15 min. El desecho micelial
se granuló a 17500 x g a 4ºC durante 20 min. El sobrenadante se
recogió en otro tubo de centrífuga de 50 ml y el ADN se extrajo con
fenol/cloroformo a pH 8,0, se extrajo con cloroformo y etanol
precipitado como en Sambrook et al (1987) ibid. El ácido nucleico
se volvió a suspender en Tris\cdotHCl 10 mM, pH 8,0, AEDT 1mM y
se separó el ARN por tratamiento con RNasa (ribonucleasa) como en
Sambrook et al. (1989) ibid. Los ADN genómicos se sometieron
a digestión con BamHI y las digestiones se sometieron a
electroforesis, se transfirieron sobre membrana Hybond N (Amersham)
como en Sambrook et al. (1989) ibid. La membrana se hibridó
con el inserto de cADN a partir de pPEN09 como sigue: La membrana
se hibridó previamente en 6 x SSC, SDS al 1%, PEG6000 al 6%, 100
\mug/ml de ADN de esperma de arenque fragmentado y
desnaturalizado a 60ºC durante 6 h. Después de este tiempo, a la
solución de hibridación se añadió el fragmento de cADN
desnaturalizado y marcado (usando un estuche Megaprime de Amersham
y ^{32}P-dCTP como instrucciones del fabricante)
y la hibridación continuó a 60ºC durante la noche. Las membranas se
lavaron después a 65ºC en 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 30 min (dos
veces). Las membranas se autorradiografiaron como Sambrook et al
(1989) ibid. Los resultados mostraron un único fragmento común
BamHI de 8 kb de todas las cepas de Penicilium (incluyendo
el tipo salvaje NRRL 1951) que hibridan con la sonda de cADN.
Se preparó un cultivo de cepa BW1900A de P.
chrysogenum deSmithKline Beecham, en matraz vibrante,
inoculando un bucle cerrado lleno de esporas en 50 ml de medio de
cultivo ACM (20 g/l de extracto de malta, 1 g/l de
bacto-pectona, 20 g/l de glucosa) e incubando con
vibración a 25ºC. Después de 40 h de desarrollo los micelios se
recolectaron por filtración a través de filtros Whatman GF/A de
microfibra de vidrio y se enjuagaron en NaCl 0,9 M. Los micelios se
volvieron a suspender después en NaCl 0,9 M que contenía 10 mg/ml de
Novozym (Novo Biolabs, Novo Industri., Dinamarca) y se incubaron a
25ºC durante 2 h. Los protoplastos se purificaron a partir de los
desechos miceliales por paso a través de un filtro de lana de
algodón antes de centrifugar a 4.000 x g durante 10 min para
granular los protoplastos. Los protoplastos se enjuagaron dos veces
en NaCl 0,9 M antes de añadir tiocianato de guanidino 4 M,
Tris\cdotHCl 50 mM, pH 7,5, AEDT 25 mM para lisar los
protoplastos. El desecho se separó por centrifugación y el
sobrenadante que contenía ADN cromosómico, se añadió a un volumen
igual de LiCl 8 M, se mezcló suavemente y se almacenó a -20ºC
durante 30 min. La proteína y algo de ARN se granularon después por
centrifugación (10.000 x g, 4ºC, 10 min) y el sobrenadante que
contenía ADN cromosómico, se precipitó con etanol. El ADN
cromosómico se sometió a digestión de forma parcial con
Sau3A y el ADN cromosómico fragmentado se fraccionó por
tamaños sobre un gradiente de densidad de sacarosa como en Sambrook
et al. (1989) ibid. Las fracciones que contenían fragmentos
Sau3A mayores que 10 kb se agruparon y se usaron en la
construcción de un banco de \lambdaEMBL3. Los fragmentos
genómicos Sau3A se ligaron a los brazos \lambdaEMBL3 BamHI
obtenidos de Promega. El \lambdaADN ligado se empaquetó después
usando un estuche Packagene de Promega. El \lambdaADN empaquetado
se multiplicó después infectando células de cepa LE392 de E.
coli y las placas se cultivaron en un césped bacteriano y se
incubaron durante 8 h a 37ºC como Sambrook et al (1989) ibid.
Se obtuvieron aproximadamente 18.000 clones independientes. El fago
se eluyó en tampón SM y se almacenó apropiadamente (como en
Sambrook et al., 1989, ibid).
A partir del clon 6.6 del cADN se usó un
fragmento SstI-XbaI que contenía el inserto cADN
(figura 2) para sondear un banco \lambdaEMBL3 (preparado en el
ejemplo 19) mediante hibridación en placa como Sambrook et
al. (1989) ibid (las mismas condiciones que en el ejemplo 18).
De la clasificación primaria se identificaron numerosos positivos
primarios y éstos se escogieron y se usaron para una clasificación
secundaria a diluciones menores. Se repitió la hibridación en placa
y se identificaron las placas individuales como hibridantes para la
sonda de cADN de la FAA-CoA ligasa. Estos clones
\lambdaEMBL3 se recogieron y se multiplicaron. Los clones
\lambdaEMBL3 fueron digeridos con uno de entre BamHI, EcoRI o
SaII y todas las combinaciones en parejas, junto con digestiones
sencillas de ADN genómico de la cepa BW1900A. Las digestiones se
sometieron a electroforesis, se transfirieron y se caracterizaron
por hibridación Southern y se identificaron fragmentos de
restricción que contenían el gen completo de la
FAA-CoA ligasa. Un fragmento EcoRI de 6,5 kb se tomó
de alguno de los clones \lambdaEMBL (fragmentos de igual tamaño
vistos en digestiones cromosómicas de ADN) y se subclonó en pIJ2925
(G.R. Janssen y M.J. Bibb (1993), Gene 124 (1),
133-134). En la Figura 4 se presenta un mapa de
restricción del ADN genómico.
El subclon EcoRI de 6,5 kb en pIJ2925 (ejemplo
20, =pAMX131) se usó con un fragmento lineal amdS de p3SR2 (Hynes
et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3,
1430-1439) para co-transformar
protoplastos de cepa BW1901 de P. chrysogenum (el método
como Tiltburn et al. (1984) Gene 26,
205-221). Los transformantes se seleccionaron por
la capacidad para utilizar acetamida. Los transformantes se
clasificaron luego para titulación de la Pen V. Numerosos
transformantes tenían niveles más elevados de la Pen V comparado con
el control BW1901 (hasta 111% en los reensayos), lo que sugiere
posiblemente la integración de ambos plásmidos. Un resultado de
este tipo apoyaría el papel de este clon en la biosíntesis de la
penicilina.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SmithKline Beecham plc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: New Horizons Court
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Brentford
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Middlesex
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0181 975 3314
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0181 975 3688
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo producto
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Ordenador personal de IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 578 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Penicilium chrysogenum
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: BW1901
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1976 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Penicilium chrysogenum
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: BW1901
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA, SEQ ID Nº 2:
Claims (8)
1. ADN aislado que comprende (a) sustancialmente
la secuencia ADN en la Figura 3/ID SEQ 2 y que codifica un
polipéptido que tiene actividad
fenilacetil-coenzima A (FAA-CoA)
ligasa y un peso molecular aparente de aproximadamente 63 kD
mediante SDS PAGE, obtenible de Penicilium chrysogenum
cultivando, recolectando y sometiendo a ultrasonidos el micelio,
separando desechos celulares y fraccionando lo sometido a
ultrasonidos por cromatografía de intercambio aniónico, seguido por
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad
con elución de sustrato y cromatografía de filtración en gel, en
donde las fracciones cromatográficas activas son detectadas usando
un ensayo dependiente de FAA y coenzima A; o (b) una secuencia de
ADN que hibrida en condiciones de gran escasez a una secuencia de
ADN de (a) y que codifica un polipéptido con actividad
FAA-CoA ligasa, y un peso molecular aparente de
aproximadamente 63 kD mediante SDS PAGE.
2. Un polipéptido aislado con actividad
FAA-CoA ligasa codificado por el ADN según la
reivindicación 1.
3. Un polipéptido según la reivindicación 2 y que
incorpora la secuencia de aminoácidos
N-terminal:
V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P
4. Un polipéptido según las reivindicaciones 2 o
3 que comprende sustancialmente la secuencia de aminoácidos
mostrada en la Fig. 1/ID SEQ 1.
5. Un vector que comprende ADN según la
reivindicación 1 para expresar una enzima que tiene actividad
FAA-CoA ligasa en un organismo huésped adecuado.
6. Un huésped transformado con ADN como se define
en la reivindicación 1.
7. Uso de un huésped transformado según la
reivindicación 6 para producir penicilina o para incrementar el
título de un organismo que produce penicilina.
8. Un proceso para preparar una enzima con
actividad FAA-CoA ligasa, que comprende cultivar
una célula huésped que ha sido transformada con un vector según la
reivindicación 6, seguido por extracción y purificación, en donde
las fracciones activas son detectadas usando un ensayo dependiente
de FAA y Co-enzima A.
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