MXPA98000212A - Fenilacetil-coa ligasa a partir de penicillium chrysogenum - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una enzima a partir de Penicillium chrysogenum que tiene actividad de fenilacetato-Coenzima A;también se provee codificación de ADN para la enzima y su uso en la producción de cepas modificadas.

Description

FENILACETIL-CoA LIGASA ft PARTIR DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a una enzima úitl en la síntesis de penicilina a partir de intermediarios implicados en la biosíntesis de penicilina. La presente invención también se refiere a procedimientos para la preparación de la enzima y ADN que codifica la enzima. La vía bioquímica de penicilina G se describe en la literatura (Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34(6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol 9, 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics 48 (11), 1195-1212). La vía ha sido el tema de estudio considerable con vista a icrementa r el rendimiento (título) en procedimientos de fermentación. El fenilacetato (PAA) y fenoxiacetato (POA) son activados a los tioésteres de CoA correspondientes en Penicillium chrvsogenum por una enzima ligasa (por ejemplo, PAA-CoA ligasa). Estos tioésteres se usan después para la biosíntesis de la penicilina G en el caso de PAA y penicilina V en el caso de POA. La PAA-CoA ligasa por lo tanto se piensa que es esencial en la biosíntesis de los antibióticos terapéuticos comercialmente importantes. Una enzima a partir de Pseudomonas putida que tiene actividad de PAA-CoA ligasa ha sido aislada (J. Biol. Chem. 267(12), 7084-7090 (1990) en un procedimiento de purificación que implica precipitación de sulfato de amonio y elusión de cloruro de potasio a partir de una columna de DEAE-Sephacel . La enzima tiene un peso molecular de 48 kDa +/- 1 kD, un ph óptimo de 8.2 y está implicada en catabolismo de PAA. Intentos para someter a prueba una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa a partir de P. chrvsogenum por el método de hidroximato (una prueba colórimét rica que detecta hidroxamato de fenilacetilo o hidroxiamato de fenoxiacetilo a 540 nm) ha sido reportada por Kogekar & Deshpande (1983) Ind. J. Biochem. Biophys 20, 208-212 y por Brunner & Rohr (1975) Methods Enzymol 43, 476-481; sin embargo, otros investigadores (Martinez-Blanco y otros (1992) J. Biol. Chem. 267(8), 5474-5481) consideran que la proteína no ha sido purificada o la actividad ca rate rizada en detalle. Además, los últimos autores no encuentran la enzima por el procedimiento reportado. W0 96/10085 (Gist Brocades, publicada el 4 de abril de 1996) revisa estos y otros intentos en el aislamiento de PAA-CoA ligasa que opera en la vía de la penicilina. En W0 96/10085 una enzima acil-CoA sintetasa se describe como obteniéndose de una cepa de Penicillium chrysogenum BIO que es mantenida en los laboratorios PanLabs (USA). Entre las propiedades atribuidas a la enzima están las siguientes: peso molecular de aproximadamente 50 kDa (tal como se determina por filtración de gel), pH óptimo de 8 a 8.5 (actividad baja a pH 7 o inferior), temperatura óptima a 40°C, pl mayor que 7.25. De manera importante, la enzima puede ser purificada por precipitación de sulfato de amonio. Tiene una especificidad muy amplia (es decir, es capaz de catalizar la formación de fenoxiacetil-coenzima A, fenilacetil-coenzima A, adipil-coenzima A y hexanoil-coenzima Aa partir de Mg 2+, ATP, CoASH, y ácido fenoxiacético, ácido fenilacético, ácido adípico o ácido hexanóico respectivamente pero no muestra ninguna actividad específica hacia el ácido acético. También se dice que la enzima es estabilizada por agentes reductores. Una alta concentración de sulfato de amonio o glicerol también estabiliza la enzima. No se dan indicaciones de pureza para la actividad de la enzima obtenida por los métodos descritos y no se da secuencia o secuencia N-terminal para la enzima y el ADN correspondiente no se ca rate riza o no se da su secuencia. A pesar de todos esos esfuerzos se sabe poco acerca de la enzima PAA-CoA ligasa auténtica que opera Penicillium sp. in vivo. Se ha especulado que la enzima responsable puede estar implicada en metabolismo primario (Smith y otros (1990) Biotechnology 8, 39-41). Martinez-Blanco y otros (1992) ibid seleccionaron una posible enzima, la acetil CoA sintetasa y la purificaron a partir de P. chrysogenum sobre la base de actividad de acetil CoA sintetasa. Pudieron mostrar que además de formar el derivado de CoA de acetato, la acetil CoA sintetasa fue capaz de activar varios ácidos grasos (C2-C8) y algunas moléculas aromáticas (incluyendo PAA) in vitro. El gen de acetil CoA sintetasa ha sido secuenciado (International Patent W092/07079, Gouka y otros (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519, Martinez-Blanco y otros (1993) gene 130. 265-270) y ha mostrado tener homología con otras acetil CoA sintetasa a partir de hongos. Sin embargo, las mutaciones en este gen seleccionadas por ácido fluoroacético no parecen alterar los niveles de producción de penicilina (Patente Internacional W092/07079) que sugiere que in vivo otra enzima es realmente responsable de activación de PAA. En la presente invención se ha desarrollado una prueba directa para actividad de PAA-CoA ligasa junto con un protocolo de purificación específico y esto ha permitido la purificación de la que se cree que es la PAA-CoA ligasa auténtica, y su clonación subsecuente. La enzima aislada por la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal diferente a la acetil CoA sintetasa anteriormente mencionada y posee un número de propiedades diferentes (por ejemplo, peso molecular) que indican que una enzima diferente ha sido aislada de todas las enzimas atribuidas con esta función hasta la fecha. Las propiedades características de la enzima aislada en la presente invención incluyen una dependencia absoluta de CoASH como substrato mientras que la enzima aislada por Kogekar & Deshpande (1983) ibid se probó en condiciones en donde se omitió CoASH. Estas y otras diferencias entre las proteínas aisladas (por ejemplo, pH óptimo y otras características dadas en los ejemplos siguientes) muestran que la enzima en la presente invención es diferente de cualquiera de aquellas descritas en la técnica anterior. Se cree que el siguiente trabajo representa un primer aislamiento de una forma pura de una enzima PAA-CoA ligasa de Penicillium sp. En particular, la presencia de un péptido SKI C terminal es consistente con la enzima que tiene una función real en la biosíntesis de penicilina. La enzima de la presente invención difiere de la de WO 96/10085 anteriormente mencionada en que tiene un peso molecular diferente y la enzima de la presente invención, a diferencia de la de WO 96/10085 es sensible a precipitación de sulfato de amonio y sales de cloruro. Por consiguiente, la presente invención provee una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa obtenible a partir de Penicillium chrysogenum cultivando, cosechando y tratando con sonido el micelio, removiendo los residuos de células y fraccionando el material tratado con sonido por cromatografía de intercambio de aniones, seguido de cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad con elusión de substrato y cromatografía de filtración de gel en donde las fracciones cromatográficas activas son detectadas usando una prueba dependiente de PAA y coenzima A. La enzima está preferiblemente en forma purificada, ventajosamente en forma substancialmente pura. La enzima de esta invención tiene una masa molecular aparente de 63 kDa (por SDS PAGE) Preferiblemente, la enzima incluye la secuencia de aminoácidos N-terminales: V F L P P K E S G Q L D P En particular, la enzima comprende la secuencia de aminoácidos en la Figura 1 / ID SEQ 1 En un aspecto adicional de la invención se provee un método para preparar una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa cultivando Penicillium sp., seguido de extracción y purificación en donde las fracciones activas son detectadas usando una prueba dependiente de PAA y Coenzima A. En particular, la especie de Penicillium sp. es P. chrysogenum y el micelio se trata con sonido, seguido de fraccionamiento por intercambio de aniones, interacción hidrofóbica, afinidad y cromatografía de filtración de gel para proveer un incremento en pureza de aproximadamente 1000 veces. La enzima se puede usar en biotransformaciones in vitro. Por ejemplo para síntesis de éster de CoA o para síntesis de penicilina cuando se mezcla con acil-CoA : 6-APA aci 1 transferasa. Las biotransformaciones in vitro se pueden llevar á cabo usando células enteras, extractos libres de células, células permeabilizadas o la enzima aislada a partir de los microorganisos o cualquiera de éstos en forma inmovilizada. En donde se lleva a cabo la biotransformación usando células enteras, el microoganismo puede estar en forma de un cultivo en crecimiento, cultivo en reposo, micelio lavado, células inmovilizadas o protoplastos. Cuando se usan extractos libres de células, éstos se producen adecuadamente sometiendo a esfuerzo cortante y/o por lisis química o enzimática u otros métodos de alteración, preferiblemente tratamiento con sonido, y opcionalmente remoción de residuos de células posteriormente, dejando la actividad de la enzima en solución. La enzima se prepara adecuadamente de acuerdo con los ejemplos que se dan más adelante usando cepas comercialmente disponibles de P. chrysogenum incluyendo el tipo silvestre NRRL1951. Otras cepas adecuadas de P. chrysogenum incluyen cepas altamente productoras de penicilina, por ejemplo, la cepa BW1901 (EMBO J. 9(3), 741-747 (1990) D.J. Smith y otros). La enzima se puede preparar cultivando el microrganismo de una manera convencional, especialmente bajo condiciones aeróbicas en un medio líquido o semisólido adecuado. Las condiciones de cultivo pueden ser una temperaura en la escala de 5-50ßC, preferiblemente 25-30°C y un pH en la escala de 3 a 9, preferiblemente 6-8, muy preferiblemente de 7.2. La enzima se puede aislar y usar en forma purificada, forma parcialmente purificada, como se obtiene en un estado impuro, como un filtrado de una preparación de células alteradas, como un homogeneizado de células crudas, etc. Muy adecuadamente, la enzimas, por ejemplo, por lo menos purificada para remover otras enzimas que también podrían catalizar la destrucción de los materiales de partida o la enzima. Muy adecuadamente, la enzima es inmovilizada por ejemplo a un material de soporte insoluble tal como mediante los procedimientos descritos por Powell (1990) en Microbial Enzymes and Biotechnology ed. Fogarty & Kelly p. 369-394. Esto provee la ventaja de incrementar el rendimiento y producción. Cuando la biotransformación se lleva a cabo usando células enteras, un medio de incubación adecuado comprende el medio: KH2PO4 2g, K2HPO4 1.5g, KC1 0.2g, Mg CI2.6H2O 0.2g, Na2S0_; .IOH2O 0.22g, glucosa 1.0 g en agua desionizada, pH 6.5 o un sistema de agua con un ajuste de pH. Cuando se lleva a cabo la biotransformación usando extractos libres de células, el medio de incubación comprende un regulador de pH adecuado. Además de los substratos, la mezcla de reacción enzimática puede contener uno o más de otros cofactores, por ejemplo, iones metálicos o estabilizadores por ejemplo tioles. La biotransformación se puede llevar a cabo adecuadamente en un medio acuoso, la mezcla de reacción siendo adecuadamente mantenida en la escala de pH de 4-10, muy adecuadamente de 6 a 10, preferiblemente de 9.0. El pH es adecuadamente controlado usando reguladores de pH preferiblemente mediante la adición de un titulador ácido o básico. La temperatura de la reacción generalmente estará en la escala de 5 a 50°C, preferiblemente de 22 a 45°C, muy preferiblemente de 30 a 37°C. Alternativamente la reacción se puede llevar a cabo en solventes orgánicos o en presencia de solventes orgánicos, por ejemplo, acetona, metilisobutilcetona (MIBK). El tiempo de reacción depende de factores tales como concentraciones de reactivos y cofactores, temperatura y pH.

Después de que se completa la reacción, el producto se puede aislar por métodos convencionales. La purificación inicial convenientemente implica un paso de cromatografía. En un aspecto adicional, la presente invención también provee ADN que condifica la PAA-CoA ligasa de la presente invención. El gen que codifica dicha proteína está localizado dentro del fragmento de ADN mostrado en la Figura 2.

En particular, el, ADN comprende substancialmente la secuencia de ADN de la Figura 3 /ID SEQ 2. En la Figura 2, la longitud aproximada en kilobases (kb) del ADN tal como se determina por experimentos de dimensionamiento llevados a cabo por elec roforesis de gel de agarosa, está indicado. Se debe entender que la Figura no sólo está diseñada para mostrar todos los sitios de restricción presentes en el ADN. Se entenderá que el ADN de esta invención no está en su estado natural como ocurre en la naturaleza sino en su estado aislado o en forma substancialmente pura. Se entenderá que la invención abarca el ADN que puede no tener la configuración precisa de sitios de restricción ilustrados si el ADN ha sido derivado por técnicas normales incluyendo de lesión de nucléotidos, substitutción, adición o inversión del ADN de conformidad con cualquier aspecto de la invención anteriormente descrito. Preferiblemente, el ADN de la presente invención se deriva de P. chrysogenum. Sin embargo, la invención también abarca secuencias del ADN derivadas de otros organismos adecuados especialmente organismos productores distintos a P. chrvsogenum cuyas secuencias no tienen la configuración de sitios de restricción mostrados pero que hibridizan, preferiblemente bajo condiciones de alta estringencia, con el ADN mostrado en la Figura 2 o un subfragmento del mismo que codifica la PAA-CoA ligasa o una enzima con actividad de PAA-CoA ligasa (las condiciones de alta estringencia son, por ejemplo, como se da en el Ejemplo 18). La invención también provee un vector que comprende dicho ADN, preferiblemente un vector de expresión para expresar PAA-CoA ligasa en un organismo hospedero adecuado. Un ejemplo específico de dicho vector de expresión es pBK-CMV (comprado de Stratagene) y usado en esta invención para expresión en E. coli. En esta invención, el inserto de ADNc de PAA-CoA ligasa (=pPEN09, fig.2) es un vector preferido para la expresión en EL. coli. El ADN de la invención y los vectores que contienen el mismo pueden encontrar uso en muchas áreas de actividad industrial. Eso también se aplica a micro rganis os transformados con dichos vectores y enzimas a las que expresan. por ejemplo, el ADN se puede utilizar como una sonda de hibridación para identificar y aislar genes relacionados o traslapables presentes en el ADN celular total de P. chrysogenum (NRRL 1951) y de otros icrorganismos que producen enzimas de estructura y especificidad similares. Los vectores recombinantes que contienen dicho ADN pueden ser valiosos vuando se transforman en hospederos adecuados, en la producción de microrganismos genéticamente modificados que sintetizan cantidades incrementadas de penicilina. Sería ventajoso incrementar la cantidad de actividad de PAA-CoA ligasa en un organismo adecuado. Los vectores recombinantes también se podrían usar en la generación de antibióticos novedosos o híbridos a través del procedimiento de transferencia de genes (véase por ejemplo D.A. Hopwood y otros, Nature, 1985, 314, 642-644). Enzimas codificadas por el ADN de la invención se pueden usar, por ejemplo, en sistemas libres de células especialmente cuando se inmovilizan sobre soportes sólidos adecuados, para preparar el antibiótico conocido a partir de precursores naturales o un antibiótico novedoso a partir de precursores "no naturales" obtenidos, por ejemplo, por síntesis química. El ADN de la invención o un fragmento del mismo (que no necesariamente lleva un gen intacto) se puede combinar, ya sea mediante técnicas de ADN recombinante o mediante procedimientos de recombinación natural, con un fragmento de un gen implicado en la biosíntesis para producir un gen híbrido capaz de dirigir la síntesis de una enzima híbrida. Dichas enzimas pueden usarse en la producción de antibióticos novedosos por procedimientos análogos a los que se describieron anteriormente. El ADN de la invención también puede ser modificado por técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio (de una manera análoga a la descrita, por ejemplo, por G. Winter y otros, Nature, 1982, 299, 756-758; o por Zoller y Smith, Nucleid Acids Research, 1982, 10, 6487-6500) para dar ADN cuyas mutaciones específicas y/o deleciones han sido efectuadas. El ADN mutado se puede usar para obtener un rendimiento (o título) incrementado de penicilina a partir de un microrganismo hospedero adecuado. El ADN mutado también se puede usar para obtener antibióticos novedosos o híbridos por transferencia de genes, o se puede usar en la producción de enzimas mutantes (muteínas) que se pueden usar en la producción de antibióticos novedosos por procedimientos análogos a los que se describieron anteriormente. El ADN mutado también se puede usar para alterar otras propiedades de fermentación de organismos adecuados, por ejemplo, tolerancia a PAA, substratos alterados. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Fermentación por P. chrysogenum Esporas de Penicillium chrysogenum (SmithKIine Beecham Strain BW1901) se inocularon en 15 ml de medios de PVS (35 g/1) de solución de maíz, 15 g/1 de glucosa, 5 g/1 de CaC03 , 8ml/l de aceite de semilla de colza, pH a 5.9 con NaOH) en un matraz agitado de 100 ml . El cultivo se sometió a crecimiento durante 48 horas a 26°C con agitación orbital (230 rpm) antes de tomar 1 ml de caldo entero y transferirlo a 10 ml de medio de C5 (35 g/1 de solución de maíz, 85 g/1 de lactosa, 10 g/1 de CaC03 , , 10 g/1 de NaH2P04, 8 g/1 de (NH 2SO4, 4 g/1 de MgS?4.7H2?, 4 g/1 de Na2S0.; , 6 ml/1 de aceite de semilla de colsa, 6 g/1 de ácido fenoxiacético, pH a 6.0 con NaOH) en un matraz agitado de 100 ml . Este cultivo se hizo crecer durante 55 horas a 26°C con agitación orbital (230?~pm) antes de cosechar el micelio.

EJEMPLO 2 Preparación de extractos de proteina a partir de Penicillium chrysogenum para prueba, purificación y Western blotting de PAA-CoA ligasa Micelios de un matraz agitado de C5 durante 55 horas cultivados como se describió en el Ejemplo 1 se cosecharon filtrando a través de filtros de microfibra de vidrio (Whatman GF/A). La estera micelial se lavó con 300 ml de cloruro de sodio a 0.9% (p/v) (4°C) y después se raspó y se colocó en 100 ml de regulador de pH para prueba de ligasa (Tris-HCl a 30mM, pH 9.0, ditiotreitol a 1 mM, 100 µg/ml de Pefabloc™ en glicerol al 50%). El micelio después se trató con sonido sobre hielo (Ix 15s usando un sonicador Ultrasonics modelo W-385, fijando la potencia en 5, velocidad de ciclo 5 s, ciclo de trabajo 50%), y después los residuos miceliales se formaron en pellas por configuración (18000xg, 4°C, 30 min). El sobrenadante se congeló a -70°C para almacenamiento o para usarse in ediatramente para prueba de PAA-CoA ligasa, purificación o Western blotting (Ejemplo 7).

EJEMPLO 3 Prueba in vitro para PAA-CoA ligasa Para demostrar la presencia de actividad de PAA-CoA ligasa en extractos o fracciones de columna, 20 µl se mezclaron con ácido fenilacético a 0.1 M en Tris-HCl a 50 mM, pH 7.5 (20 µl), ATP de sodio a 0.1 M (10 µl), cloruro de magnesio 0.2M (lOµl), coenzima A de sodio a 0.02 M (10 µl) y ditiotreitol a 0.015M (10 µl.) en tubos de Eppendorf de plástico. Los tubos se mezclaron en remolino (5 s) y después se colocaron en un baño de agua a 30°C durante 15 minutos. Después se añadió metanol (lOOµl) a las mezclas y los tubos se centrifugaron (14K, lmin) para precipitar las proteínas. Las fracciones de sobrenadante se analizaron para presencia de PAA-CoA por Ciar (ejemplo 4). En cada serie de pruebas, un extracto de proteína preparado a partir de fermentación por P. chrysogenum en un matraz de agitación (ejempli 1) se probó como un control positivo junto con PAA-CoA no rmal .

EJEMPLO 4 Análisis de CLAR de sobrenadantes de prueba Muestras de sobrenadantes de las pruebas PAA-CoA ligasa (ejemplo 3) se analizaron para la presencia de PAA-CoA usando un sistema de CLAR Waters LCM1. Se inyectaron muestras (lOOµl) en una columna de compresión de Radial Pak C18 a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 2.5 ml/min usando una fase móvil de fosfato de sodio a 0.2 M, pH 5.4 (regulador de pH A) isocrácticamente de 0 a 4 minutos. Esto fue seguido de un gradiente lineal a regulador de pH a 100% que contenía fosfato de sodio a 0.16 M, pH 5.4 en acetonitrilo al 40% (4-10 min). El regulador de pH B se mantuvo a 100% durante 2 minutos adicionales y después el sistema se reequilibró listo para la siguiente inyección usando un gradiente lineal de nuevo a A al 100% (12-13 min). Se detectaron picos a 260 nm y PAA-CoA tuvo un tiempo de retención de 12 minutos. Las muestras positivas fueron aquellas que tuvieron picos de coelusión con el PAA-CoA normal y mostraron el mismo espectro de absorbancia de UV como el estándar para ser determinado por el espectó etro de disposición de fotodiodo.

EJEMPLO 5 Purificación de PAA-CoA ligasa Se requirió cuidado ya que se encontró que la actividad de la enzima era extremadamente lábil. Los intentos en la precipitación de la enzima con sulfato de amonio no tuvieron éxito ya que no se pudo encontrar actividad en el material obtenido. Esto, por sí mismo, distingue a la presente enzima de la descrita en WO 96/10085 (Gist-Brocades) . A menos que se indique otra cosa, el siguiente procedimiento se condujo a 4°C usando regulador de pH C que contenía Tris-HCl a 30 mM, DTT a 4 mM, EDTA a 4 mM, MgCl2 a 5 M y glicerol al 20% (v/v) a un pH de 9.0. Se lograron preparaciones usando un sistema de Pharmacia Hi-Load™ . Extractos libres de células (500 ml), hechos como se da en el Ejemplo 1, se descongelaron lentamente a 4°C. El extracto después se ajustó a un pH de 9.0 usando NaOH a 5 M con agitación sobre hielo. A este extracto en agitación se añadieron 275 g del medio de intercambio de iones de Q-Sepharose fast Flow (Pharmacia) que había sido lavado previamente con 3 litros de agua seguido de 1 litro de regulador de pH C. Esta mezcla se agitó durante 1.5 horas sobre hielo. La suspensión se filtró después a través de 50 g adicionales de resina de Q-Sepharose lavada sobre un confeccionador de vidrio usando presión reducida. La resina después se lavó con 100 ml adicionales de regulador de pH C y después se dejó correr secar dando 600 ml de extracto claro que contenía PAA-CoA ligasa. Después se añadió sulfato de amonio (92.4 g, es decir, niveles de subprecipitación) y la solución se agitó sobre hielo durante 1 hora seguida de filtración (fitro de 0.45 µ, Millipore, tipo HA). El extracto de PAA-CoA ligasa (700 ml) se cargó después a 1 ml/min sobre una columna de substitución baja de Phenyl-sepha rose 6 Fast Flow (Pharmacia, diámetro de 12 cm x 2.6 cm) previamente acondicionado con 1 litro de regulador de pH D (igual que para regulador de pH C con 140 g/1 de sulfato de amonio). La columna cargada se lavó después con 230 ml de regulador de pH D a 0.8ml/min y después se eluyó con un gradiente lineal de regulador de pH D al 100% a regulador de pH C al 100% sobre 238 ml a 0.8ml/min. Fracciones de 5.5 ml se rcogieron y se sometieron a prueba para actividad de PAA-CoA ligasa como se da en el ejemplo 3. Las fracciones activas, 41 a 49 se depositaron dando 50 ml , que se cargaron a 0.5 ml/min sobre una columna de afinidad de HiTrap™ Blue de 5 ml (Pharmacia) previamente lavada con 50 ml de regulador de pH C. La columna cargada se lavó con 15 ml de regulador de pH C y después se eluyó usando un gradiente lineal de regulador de pH C al 100% a regulador de pH E al 100% sobre 25 ml a 0.5 ml/min. El regulador de pH E fue como el regulador de pH C con la adición de ácido fenilacético para dar una concentración final de 0.5M que se ajustó de nuevo a pH de 9.0 usando NaOH sólido. La elusión a partir de la columna de afinidad usando el substrato natural se usó para incrementar selectividad por purificación y para permitir la actividad enzimática para medirla en las fracciones resultantes. La elusión con NaCl probó ser exitosa ya que esta sal inhibió la actividad de la enzima. Por el contrario, la enzima descrita en WO 96/10085 pareció ser estable cuando se eluyó con KC1. Fracciones activas 21, 22 y 23 se depositaron para dar 6ml, que después se separaron a 0.25 ml/min sobre una columna de exclusión de tamaño de Sephacryl S-200 High Performance (Pharmacia, diámetro de 64 cm x 2.6 cm) que había sido previamente equilibrada en regulador de pH F (como para regulador de pH C con ajuste a pH de 7.5 con HCl a 5 M). Las fracciones activas 54 a 65 se depositaron para dar 11 ml que se concentraron hasta 60 µl por ultrafiltración centrífuga (Centricon, corte de PM de 10,000 Amicon Inc.). El análisis de las fracciones a partir de la columna de exclusión por tamaño por elect rofé resis de gel de SDS-poliacrila ida (ejemplo 6) mostró una proteína de 63 kDa, cuya intensidad se correlacionó con la actividad de PAA-CoA ligasa. Se usó Western Blotting (ejemplo 6) para completar la purificación y para permitir la secuenciación de aminoácidos N-terminales de PAA-CoA ligasa.

EJEMPLO 6 Western blotting de proteína PAA-CoA ligasa Para proveer material para secuenciación de amino-ácidos N-terminales, la proteína purificada (60 µl, ejemplo 5) se mezcló con un volumen igual de regulador de pH de muestra de SDS-PAGE que contenía Tris-HCl a 0.5 M, pH de 6.8 (10 ml), dodecil sulfato de sodio (2 g, ultrapuro), 2-mercaptoetanol (1 ml), glicerol (10 ml), agua desionizada destilada (7 ml) y azul de bromoclo rofenol al 0.1% (2 ml). La mezcla se hirvió durante 10 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se cargaron alícuotas (5, 15 y 20 µl) a un colado de gel de poliacrilamida al 10% (gel de apilamiento al 4%) en una celda de elect rofé resis de Bio-Rad Mini P rotean II usando el protocolo de fabricantes. La electrofóresis se condujo en un regulador de pH de electrodos que contenía Tris a 0.025M, glicina 0.192M y dodecil sulfato de sodio al 0.1% p/v (ultrapuro) a 200V durante 45 minutos tiempo después del cual el gel de poliacrilamida se colocó en regulador de pH de electroblotting (ácido 3-[ciclohexilamino]-l-propanesulfónico a lOmM, pH 11 en metanol al 10%) durante 5 minutos. Las proteínas en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de inmovilización de Applied Biosystems ProBlott™ usando una celda de transferencia de electroforesis de Bio-Rad Mini Trans-Blot siguiendo el protocolo de Applied Biosystems. Al completarse el blotting, la membrana se tiñó con Azul de Coomassie R-250 usando el método de detinción en el protocolo de Applied Biosystems. La banda de proteína a 63kDa se cortó de la membrana y este material se usó para secuenciación de aminoácidos N-terminales (ejemplo 7).

EJEMPLO 7 Secuenciación de aminoácidos N-terminales La secuenciación de aminoácidos N-terminales se obtuvo a partir de proteína sometida a blotting (ejemplo 6) usando un Secuenciador de Applied Biosystems (ABI) 477A Pulsed Liquid Sequencer. La secuencia se obtuvo usando Edman Chemistry normal con identificación de aminoácidos marcados con PTH liberados usando cromatografía de agujero estrecho de ABI 120 A. El análisis de la proteína PAA-CoA ligasa purificada dio por resultado la siguiente asignación de secuencia: V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P EJEMPLO 8 Síntesis de péptido N-terminal de PAA-CoA ligasa La secuencia de aminoácidos N-terminales determinada a partir de la proteína PAA-CoA ligasa de 63kDa (ejemplo 7) se usó para sintetizar un péptido. Este fue sintetizado por Peptide and Protein Research Consultants (Washington Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter, Devon EX4 4QG, UK) como péptidos libres de 50 mg. Se conjugaron 12 mg a BSA (albúmina de suero de bovino) activada con maleimida usando SMCC (1-carboxilato de Succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano) y se conjugaron 2.5 mg de OVA (ovalbúmina) activada con maleimida usando MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) .

EJEMPLO 9 Producción de anticuerpos policlonales para péptido derivado de N-terminal de la proteina PAA-CoA ligasa de 63kda El péptido conjugado a BSA (ejemplo 8) se usó para la producción de anticuerpos policlonales de conejos específicos para la proteína PAA-CoA ligasa de 63 kDa. El conjugado de péptido BSA (375 µg/ml) se esterilizó por filtro (filtro de 0.2 µ) y 1 ml de la solución estéril se mezcló uniformemente con 2 ml de adyuvante completo de Freunds no ulcerativo (Brian Morris International, Guildford U.K.). Un total de 0.8 ml de esta mezcla (100 µg del conjugado del péptido-BSA) se administró subcutáneamente a conejos blancos de Nueva Zelandia (aprosimadamente de 10 semanas de edad) en cuatro diferentes sitios de inyección. Inmunizaciones adicionales se administraron a los 28 y 58 días después de la inmunización inicial como se describió anteriormente con la excepción de que se usó adyuvante incompleto de Freunds no ulcerativo. Muestras de sangrado de prueba se tomaron de la vena de la oreja marginal a los 42 y 72 días después de la inmunización inicial para evaluar el título de anticuerpo y especificidad de anticue o usando una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ejemplo 10).

EJEMPLO 10 Prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) para la determinación de título de anticuerpo y especificidad de anticuerpo para la PAA-CoA ligasa de 63kda Determinación de título de anticuerpo Una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pozos (Nunc MaxiSof™) se revistió con conjugado de péptido de PAA-CoA ligasa-OVA (200 µl/well, 0-10 µg/ml) en solución salina regulada en su pH con fosfato con un pH de 7.2 (8 g/1 de cloruro de sodio, 0.2 g/1 de cloruro de potasio, 1.44 g/1 de ortofosfato diácido de sodio, 0.24 g/1 de ortofosfato diácido de potasio, pH 7.2). La placa de microtitulación revestida se incubó a 4°C durante aproximadamente 18 horas tiempo después del cual la placa se lavó cuatro veces con regulador de pH de lavado (Tris al lOmM, cloruro de sodio al 0.15 M, azida de sodio al 0.02%, Tween 20 al 0.05%, pH 7.2) usando un lavador de placa de Dynatech MRW. Este método de lavado se usó en todo el resto del procedimiento a menos que se especificara otra cosa. El regulador de pH bloqueador (1.56 g/1 de ortofosfato diácido de sodio, 8.8 g/1 de cloruro de sodio, 0.2 g/1 de ficol 400, 0.2 g/1 de polivinilpirrolidona, gammaglobulina de bovino al 0.5% de Sigma, pH 7.4, 200 µl/pozo) se añadió a la placa y se incubó a 37*C en una incubadora de Dynatech Varishaker durante 1 hora. Todas las incubaciones subsecuentes a 37ßC se realizaron usando este método. La placa se lavó cuatro veces y después el anticuefo policlonal de conejo (100 µl/pozo, dilución de 0-1:500 000), diluido en regulador de pH de prueba (Tris a 50 mM, cloruro de sodio a 150 mM, cloruro de magnesio a 1 mM, BSA al 0.5%, gamma globulina de bovino al 0.25%, azida de sodio al 0.02%, pH 7.4), se añadió a la placa y se incubó a 37°C. Después de lavar la placa se añadió un anticuefo biotinilado de IgG anticonejo de Amersham (lOOµl/pozo, dilución de 1:5000 en regulador de pH de prueba) a la placa y se incubó a 37°C. La placa se lavó y se añadió un conjugado de fosfatasa alcalina de streptavidin de Amersham (lOOµl/pozo, dilución de 1:2000 en regulador de pH de prueba) a la placa y se incubó a 37°C. Después de lavar la placa, se disolvió fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, 1 mg/ml) en regulador de pH de glicina a 0.1 M (7.51 g/1 de glicina, 203 mg/l de cloruro de magnesio, 136 mg/l de cloruro de zinc, pH 10.4) se anadió a la placa (100 µl/pozo) y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Después se añadió hidróxido de sodio (2M, 50 µl/pozo) a la placa y la absorbancia de cada pozo se midió a 405nm usando un lector de placa de Anthos Labtec. Se obtuvieron títulos de anticuefos entre 1:500000 y 1:1000000.

DETERMINACIÓN DE ESPECIFICIDAD DE ANTICUERPOS Para demostrar que los anticuefos policlonales de conejo reaccionarían con el péptido de PAA-CoA ligasa no conjugado se realizó una prueba de ELISA como se describió anteriormente con una modificación en la etapa de incubación que usó los anticuefos policlonales de conejo. Los anticuefos se diluyeron 1:100 000-1:400 000 en regulador de pH y se añadieron 50 µl de anticuefo diluido a pozos que contenían 50 µl del péptido no conjugado (0-20 µg/ml) preparado en regulador de pH de prueba que contenía 2-mercaptortanol (0.01%, v/v). Se logró una inhibición de 50% de reactividad de anticuefo con un conjugado de OVA-péptido a una concentración de péptido no conjugado de aproximadamente 2µg/ml.

EJEMPLO 11 Determinación de especificidad de anticuerpo sobre Western Blots para PAA-CoA ligasa en extractos de Penicillium chrysogenum. E.coli y sobre muestras de protelna purificadas Extractos preparados a partir de cultivos en matraz de agitación de Penicillium chrysogenum (BW1901 y BW1900A-una cepa derivada de un programa de mutación aleatorio) de E.coli JM109 y muestras de proteína PAA-CoA ligasa purificada fueron sometidos a Western blotted como se describe en el ejemplo 6 excepto que la membrana no se tiñó con azul de Coomassie. Las membranas sometidas a Western blotted se colocaron en regulador de pH bloqueador (1.56 g/1 de ortofosfato diácido de sodio, 8.8 g/1 de cloruro de sodio, 0.2 g/1 de ficoll 400, 0.2 g/1 de polivinilpirrolidona, gammaglobulina de bovino al 0.5%, pH 7.4) y se incubaron durante aproximadamente 18 horas a 4ßC. La membrana después se lavó cuatro veces con regulador de pH de lavado (Tris a 10 M, cloruro de sodio a 0.15 M, Tween 20 a 0.05%, pH 7.2) antes de la incubación (temperatura ambiente, 60 minutos) con los anticuefos policlonales de conejo generados como se da en el ejemplo 9 y previamente diluidos 1:100 en regulador de pH de prueba (Tris a 50mM, cloruro de sodio a 150mM, cloruro de magnesio a 1 mM, BSA al 0.5%, gammaglobulina de bovino al 0.25%, pH 7.4). Después de cuatro lavados adicionales el regulador de pH de lavado la membrana se incubó con un conjugado de IgG de anticonejo de burro-peroxidasa de rábano (Bio-Rad, 1:2000 en regulador de pH de prueba, 60 minutos, temperatura ambiente) seguido de cuatro lavados adicionales en regulador de pH. La membrana después se incubó con un substrato de peroxidasa (equipo de substrato de conjugado de peroxidasa de rábano Bio-rad) durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de detener la reacción mediante lavado de la mancha en cinco cambios de agua desionizada destilada. Muestras de proteína PAA-CoA ligasa positivas fueron aquellas con una banda a aproximadamente 63 kDa que comigró con la banda de PAA-CoA ligasa purificada. No se detectó banda positiva a 63 kDa en extracto de proteína de E.coli JM109.

EJEMPLO 12 Construcción de banco de ADNc de Penicillium chrysogenum Un banco de ADNc de Penicillium chrysogenum (SmithKIine Beecham Strain BW1901) se construyó siguiendo el manual de instrucciones de Equipo de síntesis de ADNc ZAP Express™ de Stratagene. Se aisló ARN a partir de BW1901 como sigue. El crecimiento de cepa BW1901 como se da en el ejemplo 1 durante 40 horas antes de la cosecha del micelio por filtración a través de dos filtros de microfibra de vidrio Whatman GF/A 9.0 cm. Los mcielios se lavaron con 100 ml de agua destilada tratada con DEPC (pi rocarbanato de dietilo). Los micelios después se molieron en nitrógeno líquido usando mortero y pistilo tratado con DEPC. Los micelios en polvo congelados se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 10 ml de solución G (tiocianato de guanidinio a 4M, Tris. HCl a 50 mM, pH 7.5, EDTA a 25 mM) . El polvo se volvió a suspender en Solución G y se dejó sobre hielo durante 15 minutos. Los residuos miceliales se formaron en pellas a 17500xg a 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante se recogió en otro tubo de centrífuga de 50 ml y el ARN se extrajo como se indica en Chomczynski y Sacchi (1987) Analytical Biochemistry 162. 156-159. De el ARN total, se aisló ARN poliA+ usando un equipo de columna giratoria de celulosa de CP Laboratories Mini-Oligo (dT) según las instrucciones del fabricante. El ARN poliA+ se analizó por electroforesis de gel como en Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edición). Alícuotas (5 µg) de ARN poliA+ se tomaron y se usaron para sintetizar ADNc de doble cadena blanqueado por sitio de restricción de EcoRI en el extremo 5' y la restricción de Xhol en el extremo 3' del ADNc, siguiendo el protocolo de síntesis de ADNc ZAP Express™ de Strategene. El ADNc así sintetizado después se fraccionó en tamaños pasando a través de columnas giratorias de Sephacryl S-400 de Stratagene suministradas con el equipo de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc fraccionado en cuanto a tamaño se ligó en los brazos de Xhol y EcoRI de lamdaZAP Express como se indica en el manual de instrucciones de Stratagene. El ADN la da ligado se empacó después usando un equipo de empaque Gigapack II Gold Packaging de Stratagene según el protocolo de instrucciones. El fago de ADNc resultante después se amplificó plaqueando, incubando durante 8 horas. Se obtuvieron aproximadamente 250,000 clonas independientes y el fago eluido en 20 ml de medio de SM (NaCl a 0.1M, gSO^ a 0.01M, Tris-HCl a 0.05M, pH 7.5, gelatina al 0.01%) por placa de Nunc, se formó en alícuotas y se almacenó según Sambrook y otros (1989) ibid.

EJEMPLO 13 Inmunoselección de banco de ADNc El banco de ADNc lamdaZAP Express del Ejemplo 12 se tamizó para clonas que expresaban la proteína PAA-CoA ligasa de 63 kDa usando anticuefos hechos como se da en el Ejemplo 9. El banco de ADNc se tamizó como en Sambrook y otros (1989) ibid. El banco de lamdaZAP Express se infectó a diluciones apropiadas en la cepa de XL1 Blue MRF' de E. coli. Las bacterias infectadas se hicieron crecer durante 4 horas sobre agarosa de Luria que contenía MgSO.; a lO M, maltosa al 0.2% e IPTG a 5 mM (para inducir expresión del inserto de ADNc) a 37°C antes de traslape con nitrocelulosa (Hybond-C super, Amersham) e incubando durante la noche a 37°C. Los filtros después se inmunotamizaron usando los anticuefos de conejos primarios (ejemplo 9) a diluciones de 1/1000, mientras que el anticuefo secundario, anticuefo de conjugado de fosfatasa alcalina de IgG anticonejo de cabra (producto de A-8025 de Sigma) se usó a diluciones de 1/2000. La localización de clonas positivas se realizó con tabletas de BCIP/NBT (fosfato de 5 bromo-4-cloro-3-indolilo/tetrazoleo nitroazul) comprado de Sigma (producto B-5655) y se usó de acuerdo con las ins rucciones del fabricante. Veinticuatro clonas positivas se identificaron y se centraron, se volvieron a suspender en regulador de pH de SM (5.8 g/1 de NaCl, 2 g/1 de MgS0*7H20, Tris-HCl a 50 M, pH 7.5, gelatina al 0.01%) y se volvió a tamizar a una densidad más baja de placas hasta que una señal positiva se pudo identificar para una placa individual.

EJEMPLO 14 Subclonación de clonas positivas Las clonas de ADNc de lamdaZAP Express positivas identificadas a partir del inmunotamizado (ejemplo 13) fueron cortadas después como derivados de plásmido pBKCMV usando el fago auxiliar ExAssist y el protocolo de excisión provisto por Stratagene. Las clonas de plásmido después se hicieron crecer (selección de canamicina) y "mini-preparado" como se da en Sambrook y otros (1989) ibid. Los plásmidos obtenidos después se analizaron por dobles digestiones de Xbal/Sstl para caracterizar el tamaño de inserto de ADNc de las clonas. El tamaño del inserto ADNc varió de 700 bp a 2.8 kb, con el grupo más grande (12 clonas) poseyendo un tamaño de inserto de 2.0 kb. Los plásmidos también fueron digeridos con Sau3A (cortador de 4 pares de bases) para confirmar agrupación de clonas sobre la base de patrones de restricción similares. De esta manera, las clonas se dividieron en seis grupos basados en patrones de digestión por restricción común. Clonas representativas de cada grupo se sometieron a prueba después para producción de la proteína PAA-CoA ligasa de 63 kDa por análisis de Western y también para actividad enzimática EJEMPLO 15 Demostración de clonas de ADNc positivas usando Western Blotting Extractos de proteína a partir de clonas positivas por inmunotamizado cortadas representativas se prepararon tomando un cultivo durante la noche de clonas de E. coli que se cultivaron en caldo de Luria además de canamicina (50µg/ml), IPTG (5mM) a 25°C y añadiendo un volumen igual de regulador de pH de muestra de SDS-PAGE seguido de ebullición y electroforesis como en el ejemplo 6. Después las proteínas se sometieron a Western blott para determinar la presencia de proteína de PAA-CoA ligasa de 63 kDa (ejemplo 11). La in unotinsiónde la membrana se realizó como se describió en el ejemplo 11 distinta a la de un conjugado de fosfatasa alcalina de IgG de anticonejo (dilución de 1:2000 en regulador de pH de prueba) y el substrato de fosfatasa fue BCIP/NBT fue suministrado en forma de tabletas (Sigma) y se usó de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Un grupo de clonas (ADNc, tamaño de inserto de 2.0 kb) se identificó como de una proteína de 63 kDa (co-migrada con control de BW1901).

EJEMPLO 16 Prueba de clonas de E. Coli para actividad de ligasa Caldo que contenía células de E. coli (cultivadas como en el ejemplo 15) se centrifugó en una centrífuga de Denley refrigerada 4000xg, 4ßC durante 7 minutos para formar las células en pellas. El sobrenadante se desechó y las célula se volvieron a suspender en regulador de pH de prueba de ligasa (ejemplo 2) a la mitad del volumen de caldo original. Las células después se enfriaron sobre hielo antes de sonicar para alterar las células. Las condiciones para sonicación fueron una salida de 5, ciclo de trabajo de 50% en un sonicador Apollo Electronics Sonicator durante 30 estallidos durante 7 minutos en hielo. Los extractos se usaron inmediatamente o se almacenaron a -80°C hasta usarse. La actividad de PAA-CoA ligasa se demostró usando el procedimiento de prueba dscrito usado en el ejemplo 3 excepto que 40 µl del extractos e usaron y la mezcla de reacción se incubó durante 60 minutos a 30°C. La presencia de PAA-CoA en los sobrenadantes de prueba se demostró usando CLAR como se describe en el ejemplo 4 con la adición de un detector de disposición de 996 fotodiodos de Waters para análisis espectral. La actividad de PAA-CoA ligasa se detectó en la clona 6.6 (representativa del grupo con ADNc, tamaño de inserto de 2.0 kb) y la PAA-CoA producida se confirmó por análisis de disposición de diodos contra un patrón de PAA-CoA.

EJEMPLO 17 Secuencia de ADN de 5* de clonas de PAA-CoA ligasa Clona 6.6 (=pPEN09) se "preparó previamente al máximo" y se purificó ADN mediante gradientes de CsCl como en Sambrook y otros (1989) ibid. Un mapa de restricción de pPEN09 se preparó realizando digestiones de enzimas individuales y dobles (figura 2). esta clona después se secuenció usando el iniciador (5'-ACAGGSSSCAGCTATGACCTTG-3' ) comprado de Cruachem y usando un equipo secuenciador de Pharmacia's T7 y siguiendo las instrucciones del fabricante provistas. La secuencia del extremo 5' del inserto de ADNc, que se muestra más adelante, verificó que la secuencia de aminoácidos traducida en el N-terminal del ADNc igualado al de la secuencia de péptidos previamente obtenido (ejemplo 6), excepto por la metionina de partida (ausente de la secuencia de péptidos). TCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTTTCCTGCACTTTGGAGACCTGCCC -26 CTATATTACCCCGAGGATTTGGGAAA ATG GTT TTT TTA CCT 15 M V F L P 5 CCA AAG GAG TCC GGT CAA TTG GAC CCA ATT CCC 48 P K E S G Q L D P I P 16 GAC AAT ATT CCA ATC AGC GAG TTT ATG CTC AAT 81 D N I P I S E F M L N 27 El resto de pPEN09 se secuenció usando reacciones de terminaciones de didesoxinucleótidos normal que contenía 7-deaza dGTP. [35S]dATP se usó como etiqueta. Las reacciones de etiqueta se analizaron en geles de cuña de poliacrilamida de 6% que contenía urea a 8M Sanger y otros (1977) PNAS 74, 5463-5467; Chen y Seeburg (1985) DNA 4, 165-170]. Se generaron deleciones alojadas a partir de los extremos T7 y T3 usando ExoIII y SI nucelasa [Henikoff (1984) Gene 24, 351-359]. Las clonas de deleción se seleccionaron en cuanto a tamaño para la secuenciación de ADN por electroforesis sobre geles de agarosa. Las clonas seleccionadas se secuenciaron como pPEN09. Los iniciadores de secuenciación internos se sintetizaron según fue necesario. La secuencia completa de inserto completa de ADN se muestra en la figura 3. La secuencia de proteína se muestra en la figura 1. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína PAA-CoA ligasa con la base de datos de secuencia de National Biomedical Research Foundation Protein (NBRF-PIR) y el banco de datos de SWISS-PROT Protein Sequence Data bank (SWISS-PROT) en software de DNASTAR dio la mejor igualación con 4-coumarato-CoA ligasa a partir de la papa. Usando el programa de DNASTAR megalign (método de clustal), se alineó la proteína PAA-CoA ligasa y la 4-coumarato-CoA ligasa de papa. El análisis de las distancias de secuencia reveló una similitud de 25% de aminoácidos entre las dos proteínas. Una coparación similar con acetil CoA sintetasas a partir de hongos (Penicillium. Aspergillus. Neurospora y levaduras) mostró sólo una similitud de 15%. Los últios tres aminoácidos de la proteína PAA-CoA ligasa fueron serina-lisina-isoleucina. La secuencia de aminoácidos se ajusta al consenso para la señal de objetivo de microcuefo C-terminal (CMTS) y los mismos aminoácidos han sido considerados esenciales para dirigir la proteína catalasa polimorfa de Hansenula para microcuefos (Didion & Roggenkamp (1992) FEBS Lett. 303(2-3). 113-116). El tripéptido C-terminal de SKI también puede dirigir la proteína al microcuefo en Neurospora crassa (de Zoysa & Connerton (1994) Curr. Genet. 26, 430-437). El útlimo paso de biosíntesis de penicilina llevado a cabo por la proteína de ACTF (utilizando PAA-CoA-el producto de PAA-CoA ligasa) ha sido localizado para microcuefos en P. chrysogenum (Muller y otros (1991) EMBO J. 10(2) 489-495). La proteína de ACTF también tiene un CMTS que se requiere para dirigir al microcuefo (EP 0488 180 A2) . El de la proteína PAA-CoA ligasa tiene un CMTS que es consistente con su función en la biosíntesis de penicilina.

EJEMPLO 18 Hibridación de ADN genómico con sonda de ADNc para PAA-CoA ligasa El ADN genómico obtenido a partir de un número de cepas, incluyendo NRRL 1951, BW1900A, BW1901 de tipo silvestre de Penicillium chrysogenum se aisló de la siguiente manera. Las cepas se cultivaron como en el ejemplo 1, y se cosecharon después de 40 horas por filtración a través de filtros de microfibras de vidrio GF/A de Whatman. Los micelios se enjuagaron en NaCl a 0.9M antes de congelarse en nitrógeno líquido. Los micelios se molieron a un polvo fino en nitrógeno líquido y el polvo se volvió a suspender en solución G (ejemplo 12) dejando sobre hielo durante 15 minutos. Los residuos miceliales se formaron en pellas a 17500xg a 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante se recogió en otro tub de centrífuga de 50 ml y el ADN se extrajo con fenol/cloroformo pH 8.0, se extrajo con cloroformo y etanol precipitado como en Sambrook y otros (1987) ibid. El ácido nucleico se volvió a suspender en Tris-HCl a lOmM, pH 8.0, EDTA a lmM y ARN se removió por tratamiento de ARNasa como en Sambrook y otros (1989) ibid. Los ADNs genómicos se digirieron con BamHI y los productos digeridos se sometieron a electroforesis, a prueba de blott sobre membrana de Hybond N (Amersham) como en Sambrook y otros (1989) ibid. La membrana se pre-hibridó en 6xSSC, SDS al 1%, PEG6000 al 6%, lOOµg/ml de ADN de esperma de arenque fragmentado y desnaturalizado a 60ßC durante 6 horas. Después de este tiempo el fragmento de ADNc marcado y desnaturalizado (usando un equipo de Megaprime de Amersham) y 32p-<ctp según instrucciones del fabricante) se añadió a la solución de hibridación y la hibridación se continuó a 60°C durante la noche. Las membranas se lavaron después a 65°C en 2xSSC, SDS al 0.1% durante 30 minutos (dos veces). Las membranas se sometieron a autoradiografía según Sambrook y otros (1989) ibid. Los resultados mostraron un solo fragmento común de 8 kb BamHI a partir de las cepas de Penicillium (inlcuyendo NRRL1951 de tipo silvestre) que hibridizaron a la sonda de ADNc.

EJEMPLO 19 Construcción del banco de lamdaEMBL3 Un cultivo en matraz agitado de cepa BW1900A de P. chrysogenum SmiyhKline Beecham se preparó inoculando un hasa de esporas en 50 ml de medio de ACM (20g/l de extracto de malta, lg/1 de bactopeptona, 20g/l de glucosa) e incubando con agitación a 25°C. Después de 40 horas de crecimeinto, el micelio se cosechó por filtración a través de filtros de microfibra de vidrio GF/A de Whatman y se enjuagaron en NaCl a 0.9M. Los micelios después se volvieron a suspender en NaCl a 0.9M que contenía lOmg/ml de Novozy (Novo Biolabs, Novo Industri. Dinamarca) y se incubaron a 25°C durante 2 horas. Los protoplastos se purificaron a partir de los residuos de micelios pasando a través de un filtro de lana de algodón antes de centrifugar 4000xg durante 10 minutos para formar pellas con los protoplastos. Los protoplastos se enjuagaron dos veces en NaCl a 0.9M antes de añadir tiocianato de guanidina a 4M, Tris. HCl a 50mM, pH 7.5, EDTA a 25mM para lisar los protoplastos. Los residuos se removieron por centrifugación y el sobrenadante que contenía ADN cromosómico se añadió a un volumen igual de LiCl a 8M mezclado suavemente y almacenado a -20°C durante 30 minutos. La proteína y algo de ARN se formaron en pellas después por centrifugación (lOOOOxg, 4°C, 10 mminutos) y el sobrenadante que contenía ADN cromosómico se precipitó en etanol. El ADN cromosómico se digirió parcialmente con Sau3A y el ADN cromosómico fragmentado se fraccionó por tamaño sobre un gradiente de densidad de sacarosa como en Sambrook y otros (1989) ibid. Fracciones que contenían fragmentos de Sau3A mayors de lOkb se depositaron en un depósito común y se usaron en la construcción de un banco de lamdaEMBL3. Los fragmentos genómicos de Sau3A se ligaron a los brazos de lamdaEMBL3BamHI a partir de Promega. El ADNlamda ligado después se empacó usando un equipo de Packagene de promega. El ADNlamda empacado después se amplificó infectando células de cepa de LE392 de E. colli y las placas se colocaron sobre un cultivo bacteriano y se incubaron durante 8 horas a 37°C como en Sambrook y otros (1989) ibid. Se obtuvieron aproximadamente 18000 clonas independientes. El fago se eluyó en regulador de pH de SM y se almacenó apropiadamente (como en Sambrook y otros, 1989, ibid).

EJEMPLO 20 Clonación del ADN genómico de PAA-CoA ligasa A partir de la clona 6.6 de ADNc se usó un fragmento de Sstl-Xbal que contenía inserto de ADNc (figura 2) para someter a sonda un banco de lamdaEMBL3 (preparado en el ejemplo 19) por hibridación de placa como en Sambrook y otros (1989) ibid (condiciones iguales que en el ejemplo 18). A partir del tamiz primario, se identificó un número de positivos primarios y estos se recogieron y usaron para un segundo tamiz en diluciones inferiores. La hibridación de placa se repitió y las placas individuales se identificaron como hibridando la sonda de ADNc de PAA-CoA ligasa. estas clonas de lamdaEMBL se recogieron y se amplificaron. Las clonas de lamdaEMBL se digirieron con un BamHI, EcoRI o Salí y todas las combinaciones en pares, junto con productos digeridos individuales de ADN genómico de la cepa BW1900A. Los productos digeridos se sometieron a electroforesis , a blotting y se caraterizaron por hibridación de Southern y fragmentos de restricción que contenían el gen entero de PAA-CoA ligasa se identificaron. Un fragmento de 6.5 kb de EcoRl se tomó de algunas clonas de lamdaEMBL (los mismos fragmentos de tamaño vistos en productos digeridos de ADN cromosómico) y se subclonaron en pIJ2925 (G.R. Janssen y M.J. Bibb (1993) Gene 124(1) 133-134). Un mapa de restricción del ADN genómico se presenta en la figura 4.

EJEMPLO 21 Transformación de cepa de BW19Q1 de Penicillium chrysogenum con PAA-CoA ligasa La subclona de 6.5 kb de EcoRI en pIJ2925 (ejemplo , =pAMX131) se usó con un fragmento de a dS lineal a partir de p3SR2 (Hynes y otros (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439) para co- ransformar protoplastos de la cepa BW1901 de P^. chi-ysogenum (método según Tilburn y otros (1984) Gene 26, 205-221). Los transformantes se seleccionaron para la capacidad para utilizar acetamida. Los transformantes después se tamizaron para título de PenV. Un número de transformantes tuvo niveles mayores de PenV comparados con el control de BW1901 (hasta 111% en segundas pruebas), que sugerían posiblemente la integración de ambos plásmidos. Dicho resultado soportaría la función de esta clona en biosíntesis de penicilina.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: SmithKIine Beecham pie (B) CALLE: New Horizons Court (C) CIUDAD: Brentford (D) ESTADO: Middlesex (E) PAÍS: Inglaterra (F) CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP (G) TELEFONO: 0181 975 3314 (H) TELEFAX: 0181 975 3688 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Producto novedoso (iü) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM COMPATIBLE (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 CEPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 1: (A) LONGITUD: 578 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Penicillium chrysogenum (B) CEPA: BW1901 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Mßt Val Phß Leu Pro Pro Lys Glu Ser Gly Gln Leu Asp Pro lia Pro 1 5 10 15 Asp Asn lia Pro lia Ser Glu Phß Mat Leu Asn Glu Arg Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Arg His Ala Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Thr Cys Gly lie Thr Gly 35 40 45 Lys Sar Tyr Ser Ser Lys Glu Val Ala Asn Arg Val Asp Ser Lau Ala 50 55 60 Arg Sar Lau Ser Lys Glu Phß Gly Trp Ala Pro Asn Glu Gly Sar Glu 65 70 75 80 Trp Asp Lys Thr Leu Ala Val Phe Ala Leu Asn Thr lia Asp Ser Lau 85 90 95 Pro Leu Phe Trp Ala Val His Arg Leu Gly Gly Val Leu Thr Pro Ala 100 105 110 Asn Ala Sar Tyr Sar Ala Ala Glu Lau Thr His G n Leu Leu Asp Sar 115 120 125 Lys Ala Lys Ala Leu Val Thr Cys Val Pro Leu Leu Sar lie Ser Leu 130 135 140 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Leu Pro Lys Asn Arg lia Tyr Lau Leu 145 150 155 160 Asp Val Pro Glu Gln Leu Leu Gly Gly Val Lys Pro Pro Ala Gly Tyr 165 170 175 Lys Ser Val Ser Glu Leu Thr Gln Ala Gly Lys Ser Leu Pro Pro Val 180 185 190 Asp Glu Leu Arg Trp Ser Ala Gly Glu Gly Ala Arg Arg Thr Ala Phe 195 200 205 Val Cys Tyr Ser Ser Gly Thr Ser Gly Leu Pro Lys Gly Val Mat Ha 210 215 220 Ser His Arg Asn Val Ha Ala Asn Thr Lau Gln Ha Lys Ala Phß Glu 225 230 235 240 Gln Asn Tyr Arg Asp Gly Gly Gly Thr Lys Pro Ala Ser Thr Glu Val 245 250 255 Ala Leu Gly Leu Leu Pro Gln Ser His Ha Tyr Ala Leu Val Val Ha 260 265 270 Gly His Ala Gly Ala Tyr Arg Gly Asp Gln Thr Ha Val Lau Pro Lys 275 280 285 Phß Glu Leu Lys Ser Tyr Leu Asn Ala He Gln Gln Tyr Lys He Ser 290 295 300 Ala Lau Phe Leu Val Pro Pro He Ha Ha His Mßt Lau Gly Thr Gln 305 310 315 320 Aap Val Cys Ser Lys Tyr Asp Leu Sar Ser Val Thr Ser Leu Pha Thr 325 330 335 Gly Ala Ala Pro Lau Gly Mat Glu Thr Ala Ala Asp Phe Leu Lys Lau 340 345 350 Tyr Pro Asn He Leu Ha Arg Gln Gly Tyr Gly Lau Thr Glu Thr Cys 355 360 365 Thr Val Val Ser Ser Thr His Pro His Asp He Trp Lau Gly Sar Sar 370 375 380 Gly Ala Leu Leu Pro Gly Val Glu Ala Arg He Val Thr Pro Glu Asn 385 390 395 400 Lys Glu He Thr Thr Tyr Asp Ser Pro Gly Glu Leu Val Val Arg Ser 405 410 415 Pro Ser Val Val Leu Gly Tyr Leu Asn Asn Glu Lys Ala Thr Ala Glu 420 425 430 Thr Phß Val Asp Gly Trp Mßt Arg Thr Gly Asp Glu Ala Val He Arg 435 440 445 Arg Sar Pro Lys Gly Ha Glu His Val Phß He Val Asp Arg He Lys 450 455 460 Glu Leu He Lys Val Lys Gly Leu Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu 465 470 475 480 Ala His He Leu Ala His Pro Asp Val Ser Asp Cys Ala Val He Ala 485 490 495 He Pro Asp Asp Arg Ala Gly Glu Val Pro Lys Ala He Val Val Lys 500 505 510 Sar Ala Ser Ala Gly Ser Asp Glu Ser Val Ser Gln Ala Lau Val Lya 515 520 525 Tyr Val Glu Asp His Lys Ala Arg His Lys Trp Lau Lys Gly Gly Ha 530 535 540 Arg Phß Val Asp Ala Ha Pro Lys Sar Pro Sar Gly Lys Ha Leu Arg 545 550 555 560 Arg Leu Ha Arg Asp Gln Glu Lys Glu Ala Arg Arg Lys Ala Gly Sar 565 570 575 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 2: (A) LONGITUD: 1976 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Penicillium chrysogenum (B) CEPA: BW1901 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: GAATTCGGCA CGAGTCTAAA CCCCGAGATC ACCTCAGTTT CCTGCACTTT GGAGACCTGC 60 CCCTATATTA CCCCGAGGAT TTGGGAAAAT GGTTTTTTTA CCTCCAAAGG AGTCCGGTCA 120 ATTGGACCCA ATTCCCGACA ATATTCCAAT CAGCGAGTTT ATGCTCAATG AGAGATATGG 180 ACGAGTGCGA CACGCCAGCT CCCGGGACCC ATACACCTGT GGTATTACCG GGAAGTCATA 240 CTCGTCGAAA GAGGTAGCCA ATCGCGTCGA CTCGCTGGCT CGTAGTCTAT CAAAGGAATT 300 TGGTTGGGCG CCGAATGAAG GGTCAGAATG GGATAAGACA TTGGCCGTGT TTGCCCTCAA 360 CACTATCGAT TCCTTACCCC TATTCTGGGC CGTTCACAGA CTGGGCGGTG TTCTCACTCC 420 CGCCAACGCA TCAIACTCCG CCGCCGAGCT GACGCATCAG CTGCTTGATT CCAAGGCCAA 480 GGCCCTTGTG ACTTGTGTTC CTCTCCTCTC CATCTCACTG GAAGCTGCAG CCAAAGCTGG 540 TCTCCCGAAG AACAGAATCT ACTTACTCGA TGTACCTGAG CAGCTTCTTG GCGGAGTCAA 600 GCCTCCAGCA GGATACAAGT CCGTTTCCGA ACTGACCCAG GCTGGGAAGT CTCTCCCGCC 660 AGTGGATGAA TTGCGATGGA GCGCGGGTGA AGGTGCCCGG CGAACAGCAT TTGTGTGCTA 720 CTCAAGTGGA ACGTCTGGAT TGCCGAAAGG AGTCATGATC TCACACCGCA ACGTGATCGC 780 CAATACCCTT CAGATCAAGG CGTTTGAGCA GAACTACCGG GATGGTGGGG GCACAAAGCC 840 TGCGAGTACT GAGGTTGCTC TTGGTCTCCT TCCGCAGAGC CATATCTATG CTCTTGTGGT 900 CATTGGCCAT GCTGGGGCAT ACCGAGGCGA CCAAACAATC GTTCTCCCCA AATTCGAATT 960 GAAATCC AC CTGAACGCCA TCCAACAGTA CAAGATCAGT GCGCTGTTCC TGGTACCTCC 1020 GATCATCATT CACATGCTGG GCACTCAAGA CGTGTGCTCC AAGTATGACC TGAGTTCCGT 1080 GACGTCTCTG TTCACGGGAG CGGCACCCCT GGGTATGGAG ACAGCTGCCG ATTTCCTCAA 1140 ACTCTACCCG AACATTTTGA TCCGCCAAGG ATACGGTCTG ACAGAGACAT GCACGGTCGT 1200 AAGCTCGACC CACCCGCACG ATATCTGGCT AGGTTCATCC GGCGCTTTGC TCCCTGGAGT 1260 CGAGGCACGA ATTGTGACGC CTGAAAACAA GGAAATCACA ACGTACGACT CACCGGGCGA 1320 ATTGGTGGTC CGAAGCCCAA GCGTCGTCCT GGGCTATTTG AACAACGAAA AAGCCACCGC 1380 AGAGACATTT GTGGACGGAT GGATGCGTAC GGGAGACGAG GCTGTCATCC GTAGAAGCCC 1440 GAAGGGCATC GAGCACGTGT TTATTGTCGA TCGGATCAAG GAGTTGATCA AGGTCAAGGG 1500 TCTGCAAGTC GCGCCTGCCG AACTCGAAGC CCATATCCTC GCCCACCCCG ATGTCTCGGA 1560 CTGTGCTGTC ATCGCTATTC CGGATGATCG TGCAGGAGAA GTACCCAAGG CCATTGTTGT 1620 GAAGTCCGCC AGCGCAGGAT CGGACGAATC TGTCTCCCAG GCTCTCGTGA AGTATGTTGA 1680 GGACCACAAG GCTCGTCACA AGTGGTTGAA GGGAGGTATC AGATTTGTGG ATGCCATTCC 1740 CAAGAGCCCG AGTGGTAAGA TTCTTCGTCG GTTGATCCGT GACCAAGAGA AGGAGGCACG 1800 GAGAAAGGCT GGTAGCAAGA TCTAAAAATG TCGGGGGTAG CTTTGATTAG AACTTGGTCT 1860 GGGAAACTTG GAAACCGATA ACCATTGTTG GCTTGAACTA GAAGTATATA TGTAAATACG 1920 TGATAAACAA GGCATCTCAT CTGCTGTTA? AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTCGAG 1976

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una enzima que tiene una actividad de fenilacetil-coenzima A (PAA-CoA) ligasa obtenible a partir de Penicillium chrysogenum cultivando, cosechando y tratando con sonido el micelio, removiendo residuos de células y fraccionando el producto tratado con sonido por cromatografía de intercambio de aniones, seguido de cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad con elusión de substrato y cromatografía de filtración de gel en donde las fracciones cromatográficas activas se detectan usando una prueba dependiente de PAA y coenzima A-.

2.- Una enzima de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una masa molecular evidente de 63 kD por SDS page.

3.- Una enzima de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 que incofora la secuencia de aminoácidos N-terminales: V-F_L-P_p_K- -S_G_Q_L_D_p

4.- Una enzima de conformidad con cualquier reivindicación que comprende la secuencia de aminoácidos mostrados en ID SEQ 1.

5.- ADN que codifica una enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4.

6.- ADN que codifica para la reivindicación 5 que tiene la configuración de sitios de restricción como se muestra en la figura 2 ó 4.

7.- ADN de confomridad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende la secuencia de ADN en ID SEQ 2.

8.- ADN que hibridiza bajo condiciones de alta estringencia con ADN de conformidad con las reivindicaciones 5, 6 ó 7 o fragmentos del mismo.

9.- Un vector que comprende ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para expresar una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa en un organismo hospedero adecuado.

10.- Un hospedero transformado que comprende ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

11.- El uso de un hospedero transformado de conformidad co la reivindicación 9 para producir penicilina o para incrementar el título de un organismo productor de penicilina.

12.- Un procedimiento para preparar una enzima de conformidad con la reivindicación 1, que comprende cultivar Penicillium sp.. seguido de la extracción y purificación en donde las fracciones activas se detectan usando una prueba dependiente de PAA y Co-enzima A.