MXPA98000212A - Fenilacetil-coa ligasa a partir de penicillium chrysogenum - Google Patents
Fenilacetil-coa ligasa a partir de penicillium chrysogenumInfo
- Publication number
- MXPA98000212A MXPA98000212A MXPA/A/1998/000212A MX9800212A MXPA98000212A MX PA98000212 A MXPA98000212 A MX PA98000212A MX 9800212 A MX9800212 A MX 9800212A MX PA98000212 A MXPA98000212 A MX PA98000212A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- enzyme
- paa
- dna
- coa
- coa ligase
- Prior art date
Links
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 title description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 49
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 62
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 62
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 16
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 claims description 14
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 241000228168 Penicillium sp. Species 0.000 claims description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent Effects 0.000 claims description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 3
- ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N Phenylacetyl coenzyme A Natural products S(C(=O)Cc1ccccc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N phenylacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC1=CC=CC=C1 ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035980 PAA Effects 0.000 claims 2
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229920001888 polyacrylic acid Polymers 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 abstract description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 46
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 27
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 media Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 239000000727 fraction Substances 0.000 description 10
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-M phenylacetate Chemical compound [O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229940049953 phenylacetate Drugs 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 8
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010049926 Acetate-CoA Ligase Proteins 0.000 description 7
- 102000008146 Acetate-CoA Ligase Human genes 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 6
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 6
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 6
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 6
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 6
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- -1 phenylacetyl Chemical group 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- SJSYJHLLBBSLIH-SDNWHVSQSA-N (E)-3-(2-methoxyphenyl)-2-phenylprop-2-enoic acid Chemical compound COC1=CC=CC=C1\C=C(\C(O)=O)C1=CC=CC=C1 SJSYJHLLBBSLIH-SDNWHVSQSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 229940093530 Coenzyme A Drugs 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108090001095 Immunoglobulin G Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N Phenylacetic acid Natural products OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 3
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 3
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 2-((2,6-Dichlorophenyl)imino)imidazolidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYAMLSCELQQRAE-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-aminoacetyl)-methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=O)CN VYAMLSCELQQRAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXUIDZOMTRMIOE-UHFFFAOYSA-N 3-oxo-3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C1=CC=CC=C1 HXUIDZOMTRMIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016192 4-coumarate-CoA ligase Proteins 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N Adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Histidine Chemical compound NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCNC(N)=N XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Aspartyl-L-proline Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M Caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N Diethylpyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N Ethephon Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N Hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N L-tyrosyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M Lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940092253 Ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 229940056360 Penicillin G Drugs 0.000 description 2
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 2
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229940092597 Prolia Drugs 0.000 description 2
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Cysteine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Threonine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010004620 glycylsarcosine Proteins 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- DOFAQXCYFQKSHT-SRVKXCTJSA-N (2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DOFAQXCYFQKSHT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N (2S)-1-[(2S)-2-azaniumyl-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumyl-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetate Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylazaniumyl)propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGHKSHCBDXNTHX-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(4-amino-1-carboxy-4-oxobutyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O MGHKSHCBDXNTHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKTRDWYCAUTRRL-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-2-(1H-imidazol-5-yl)ethyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino)butyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-APA Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N AEBSF Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000615866 Antho Species 0.000 description 1
- SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N Arg-Asp Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N Arg-Gln Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Asparagine Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPDLYUOYAGBHFB-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Arginine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N NPDLYUOYAGBHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Asparagine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Cysteine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101700077824 CNN1 Proteins 0.000 description 1
- JHLNERQLKQQLRZ-UHFFFAOYSA-N Calcium silicate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] JHLNERQLKQQLRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004671 Cell-Free System Anatomy 0.000 description 1
- 241001431608 Colsa Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 241001057440 Didion Species 0.000 description 1
- JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N Diphenadione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1C(=O)C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016938 EC 1.11.1.6 Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 EC 1.11.1.6 Proteins 0.000 description 1
- 241001025319 Etheostoma collis Species 0.000 description 1
- 101700015998 FADD Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N Fluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)CF QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- OEXFMSFODMQEPE-CGSNXLPNSA-N Hexanoyl-Coenzyme A Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OEXFMSFODMQEPE-CGSNXLPNSA-N 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108010077451 IGG-horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 210000001822 Immobilized Cells Anatomy 0.000 description 1
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine zwitterion Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-ZFWWWQNUSA-N Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 229940045184 Malt extract Drugs 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000146313 Parnassius apollo Species 0.000 description 1
- 229940056367 Penicillin V Drugs 0.000 description 1
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N Phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241001148662 Phragmites australis Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229920000582 Polyisocyanurate Polymers 0.000 description 1
- 241000710179 Potato virus S Species 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 240000007742 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Arginine Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 102100006947 TAGLN Human genes 0.000 description 1
- 101710025884 TAGLN Proteins 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N Thr-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- CUTPSEKWUPZFLV-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Cysteine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Lysine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L Zinc chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000703 anti-shock Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding Effects 0.000 description 1
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035569 catabolism Effects 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 229920002083 cellular DNA Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M chloride anion Chemical class [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated Effects 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 101710009782 fadD11 Proteins 0.000 description 1
- 101710010463 fadD15 Proteins 0.000 description 1
- 101710010457 fadD17 Proteins 0.000 description 1
- 101710010449 fadD19 Proteins 0.000 description 1
- 101710009908 fadD21 Proteins 0.000 description 1
- 101710010378 fadD23 Proteins 0.000 description 1
- 101710009902 fadD25 Proteins 0.000 description 1
- 101700051677 fadK Proteins 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010020584 glycyl-sarcosyl-sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine zwitterion Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- XKUUMWKWUZRRPD-UHFFFAOYSA-N heptan-2-amine;sulfuric acid Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCC(C)[NH3+].CCCCCC(C)[NH3+] XKUUMWKWUZRRPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm DNA Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010077158 leucinyl-arginyl-tryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- SBPBPUFWNOBPMN-CECATXLMSA-N phenoxyacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)COC1=CC=CC=C1 SBPBPUFWNOBPMN-CECATXLMSA-N 0.000 description 1
- 108010064486 phenylalanyl-leucyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N pro glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000001711 protein immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000284 resting Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- RMJPDRUNCDRUQC-MCDZGGTQSA-M sodium;[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O RMJPDRUNCDRUQC-MCDZGGTQSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 101700037037 vraA Proteins 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Serine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una enzima a partir de Penicillium chrysogenum que tiene actividad de fenilacetato-Coenzima A;también se provee codificación de ADN para la enzima y su uso en la producción de cepas modificadas.
Description
FENILACETIL-CoA LIGASA ft PARTIR DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención se refiere a una enzima úitl en la síntesis de penicilina a partir de intermediarios implicados en la biosíntesis de penicilina. La presente invención también se refiere a procedimientos para la preparación de la enzima y ADN que codifica la enzima. La vía bioquímica de penicilina G se describe en la literatura (Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34(6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol 9, 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics 48 (11), 1195-1212). La vía ha sido el tema de estudio considerable con vista a icrementa r el rendimiento (título) en procedimientos de fermentación. El fenilacetato (PAA) y fenoxiacetato (POA) son activados a los tioésteres de CoA correspondientes en Penicillium chrvsogenum por una enzima ligasa (por ejemplo, PAA-CoA ligasa). Estos tioésteres se usan después para la biosíntesis de la penicilina G en el caso de PAA y penicilina V en el caso de POA. La PAA-CoA ligasa por lo tanto se piensa que es esencial en la biosíntesis de los antibióticos terapéuticos comercialmente importantes. Una enzima a partir de Pseudomonas putida que tiene actividad de PAA-CoA ligasa ha sido aislada (J. Biol. Chem.
267(12), 7084-7090 (1990) en un procedimiento de purificación que implica precipitación de sulfato de amonio y elusión de cloruro de potasio a partir de una columna de DEAE-Sephacel . La enzima tiene un peso molecular de 48 kDa +/- 1 kD, un ph óptimo de 8.2 y está implicada en catabolismo de PAA. Intentos para someter a prueba una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa a partir de P. chrvsogenum por el método de hidroximato (una prueba colórimét rica que detecta hidroxamato de fenilacetilo o hidroxiamato de fenoxiacetilo a 540 nm) ha sido reportada por Kogekar & Deshpande (1983) Ind. J. Biochem. Biophys 20, 208-212 y por Brunner & Rohr (1975) Methods Enzymol 43, 476-481; sin embargo, otros investigadores (Martinez-Blanco y otros (1992) J. Biol. Chem. 267(8), 5474-5481) consideran que la proteína no ha sido purificada o la actividad ca rate rizada en detalle. Además, los últimos autores no encuentran la enzima por el procedimiento reportado. W0 96/10085 (Gist Brocades, publicada el 4 de abril de 1996) revisa estos y otros intentos en el aislamiento de PAA-CoA ligasa que opera en la vía de la penicilina. En W0 96/10085 una enzima acil-CoA sintetasa se describe como obteniéndose de una cepa de Penicillium chrysogenum BIO que es mantenida en los laboratorios PanLabs (USA). Entre las propiedades atribuidas a la enzima están las siguientes: peso molecular de aproximadamente 50 kDa (tal como se determina por filtración de gel), pH óptimo de 8 a 8.5 (actividad baja a pH 7 o inferior), temperatura óptima a 40°C, pl mayor que 7.25. De manera importante, la enzima puede ser purificada por precipitación de sulfato de amonio. Tiene una especificidad muy amplia (es decir, es capaz de catalizar la formación de fenoxiacetil-coenzima A, fenilacetil-coenzima A, adipil-coenzima A y hexanoil-coenzima Aa partir de Mg 2+, ATP, CoASH, y ácido fenoxiacético, ácido fenilacético, ácido adípico o ácido hexanóico respectivamente pero no muestra ninguna actividad específica hacia el ácido acético. También se dice que la enzima es estabilizada por agentes reductores. Una alta concentración de sulfato de amonio o glicerol también estabiliza la enzima. No se dan indicaciones de pureza para la actividad de la enzima obtenida por los métodos descritos y no se da secuencia o secuencia N-terminal para la enzima y el ADN correspondiente no se ca rate riza o no se da su secuencia. A pesar de todos esos esfuerzos se sabe poco acerca de la enzima PAA-CoA ligasa auténtica que opera Penicillium sp. in vivo. Se ha especulado que la enzima responsable puede estar implicada en metabolismo primario (Smith y otros (1990) Biotechnology 8, 39-41). Martinez-Blanco y otros (1992) ibid seleccionaron una posible enzima, la acetil CoA sintetasa y la purificaron a partir de P. chrysogenum sobre la base de actividad de acetil CoA sintetasa. Pudieron mostrar que además de formar el derivado de CoA de acetato, la acetil CoA sintetasa fue capaz de activar varios ácidos grasos (C2-C8) y algunas moléculas aromáticas (incluyendo PAA) in vitro. El gen de acetil CoA sintetasa ha sido secuenciado (International Patent W092/07079, Gouka y otros (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519, Martinez-Blanco y otros (1993) gene 130. 265-270) y ha mostrado tener homología con otras acetil CoA sintetasa a partir de hongos. Sin embargo, las mutaciones en este gen seleccionadas por ácido fluoroacético no parecen alterar los niveles de producción de penicilina (Patente Internacional W092/07079) que sugiere que in vivo otra enzima es realmente responsable de activación de PAA. En la presente invención se ha desarrollado una prueba directa para actividad de PAA-CoA ligasa junto con un protocolo de purificación específico y esto ha permitido la purificación de la que se cree que es la PAA-CoA ligasa auténtica, y su clonación subsecuente. La enzima aislada por la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal diferente a la acetil CoA sintetasa anteriormente mencionada y posee un número de propiedades diferentes (por ejemplo, peso molecular) que indican que una enzima diferente ha sido aislada de todas las enzimas atribuidas con esta función hasta la fecha. Las propiedades características de la enzima aislada en la presente invención incluyen una dependencia absoluta de CoASH como substrato mientras que la enzima aislada por Kogekar & Deshpande (1983) ibid se probó en condiciones en donde se omitió CoASH. Estas y otras diferencias entre las proteínas aisladas (por ejemplo, pH óptimo y otras características dadas en los ejemplos siguientes) muestran que la enzima en la presente invención es diferente de cualquiera de aquellas descritas en la técnica anterior. Se cree que el siguiente trabajo representa un primer aislamiento de una forma pura de una enzima PAA-CoA ligasa de Penicillium sp. En particular, la presencia de un péptido SKI C terminal es consistente con la enzima que tiene una función real en la biosíntesis de penicilina. La enzima de la presente invención difiere de la de WO 96/10085 anteriormente mencionada en que tiene un peso molecular diferente y la enzima de la presente invención, a diferencia de la de WO 96/10085 es sensible a precipitación de sulfato de amonio y sales de cloruro. Por consiguiente, la presente invención provee una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa obtenible a partir de Penicillium chrysogenum cultivando, cosechando y tratando con sonido el micelio, removiendo los residuos de células y fraccionando el material tratado con sonido por cromatografía de intercambio de aniones, seguido de cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad con elusión de substrato y cromatografía de filtración de gel en donde las fracciones cromatográficas activas son detectadas usando una prueba dependiente de PAA y coenzima A. La enzima está preferiblemente en forma purificada, ventajosamente en forma substancialmente pura. La enzima de esta invención tiene una masa molecular aparente de 63 kDa (por SDS PAGE) Preferiblemente, la enzima incluye la secuencia de aminoácidos N-terminales:
V F L P P K E S G Q L D P En particular, la enzima comprende la secuencia de aminoácidos en la Figura 1 / ID SEQ 1 En un aspecto adicional de la invención se provee un método para preparar una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa cultivando Penicillium sp., seguido de extracción y purificación en donde las fracciones activas son detectadas usando una prueba dependiente de PAA y Coenzima A. En particular, la especie de Penicillium sp. es P. chrysogenum y el micelio se trata con sonido, seguido de fraccionamiento por intercambio de aniones, interacción hidrofóbica, afinidad y cromatografía de filtración de gel para proveer un incremento en pureza de aproximadamente 1000 veces. La enzima se puede usar en biotransformaciones in vitro. Por ejemplo para síntesis de éster de CoA o para síntesis de penicilina cuando se mezcla con acil-CoA : 6-APA aci 1 transferasa. Las biotransformaciones in vitro se pueden llevar á cabo usando células enteras, extractos libres de células, células permeabilizadas o la enzima aislada a partir de los microorganisos o cualquiera de éstos en forma inmovilizada. En donde se lleva a cabo la biotransformación usando células enteras, el microoganismo puede estar en forma de un cultivo en crecimiento, cultivo en reposo, micelio lavado, células inmovilizadas o protoplastos. Cuando se usan extractos libres de células, éstos se producen adecuadamente sometiendo a esfuerzo cortante y/o por lisis química o enzimática u otros métodos de alteración, preferiblemente tratamiento con sonido, y opcionalmente remoción de residuos de células posteriormente, dejando la actividad de la enzima en solución. La enzima se prepara adecuadamente de acuerdo con los ejemplos que se dan más adelante usando cepas comercialmente disponibles de P. chrysogenum incluyendo el tipo silvestre NRRL1951. Otras cepas adecuadas de P. chrysogenum incluyen cepas altamente productoras de penicilina, por ejemplo, la cepa BW1901 (EMBO J. 9(3), 741-747 (1990) D.J. Smith y otros). La enzima se puede preparar cultivando el microrganismo de una manera convencional, especialmente bajo condiciones aeróbicas en un medio líquido o semisólido adecuado. Las condiciones de cultivo pueden ser una temperaura en la escala de 5-50ßC, preferiblemente 25-30°C y un pH en la escala de 3 a 9, preferiblemente 6-8, muy preferiblemente de 7.2. La enzima se puede aislar y usar en forma purificada, forma parcialmente purificada, como se obtiene en un estado impuro, como un filtrado de una preparación de células alteradas, como un homogeneizado de células crudas, etc. Muy adecuadamente, la enzimas, por ejemplo, por lo menos purificada para remover otras enzimas que también podrían catalizar la destrucción de los materiales de partida o la enzima. Muy adecuadamente, la enzima es inmovilizada por ejemplo a un material de soporte insoluble tal como mediante los procedimientos descritos por Powell (1990) en Microbial Enzymes and Biotechnology ed. Fogarty & Kelly p. 369-394. Esto provee la ventaja de incrementar el rendimiento y producción. Cuando la biotransformación se lleva a cabo usando células enteras, un medio de incubación adecuado comprende el medio: KH2PO4 2g, K2HPO4 1.5g, KC1 0.2g, Mg CI2.6H2O 0.2g, Na2S0_; .IOH2O 0.22g, glucosa 1.0 g en agua desionizada, pH 6.5 o un sistema de agua con un ajuste de pH. Cuando se lleva a cabo la biotransformación usando extractos libres de células, el medio de incubación comprende un regulador de pH adecuado. Además de los substratos, la mezcla de reacción enzimática puede contener uno o más de otros cofactores, por ejemplo, iones metálicos o estabilizadores por ejemplo tioles. La biotransformación se puede llevar a cabo adecuadamente en un medio acuoso, la mezcla de reacción siendo adecuadamente mantenida en la escala de pH de 4-10, muy adecuadamente de 6 a 10, preferiblemente de 9.0. El pH es adecuadamente controlado usando reguladores de pH preferiblemente mediante la adición de un titulador ácido o básico. La temperatura de la reacción generalmente estará en la escala de 5 a 50°C, preferiblemente de 22 a 45°C, muy preferiblemente de 30 a 37°C. Alternativamente la reacción se puede llevar a cabo en solventes orgánicos o en presencia de solventes orgánicos, por ejemplo, acetona, metilisobutilcetona (MIBK). El tiempo de reacción depende de factores tales como concentraciones de reactivos y cofactores, temperatura y pH.
Después de que se completa la reacción, el producto se puede aislar por métodos convencionales. La purificación inicial convenientemente implica un paso de cromatografía. En un aspecto adicional, la presente invención también provee ADN que condifica la PAA-CoA ligasa de la presente invención. El gen que codifica dicha proteína está localizado dentro del fragmento de ADN mostrado en la Figura 2.
En particular, el, ADN comprende substancialmente la secuencia de ADN de la Figura 3 /ID SEQ 2. En la Figura 2, la longitud aproximada en kilobases
(kb) del ADN tal como se determina por experimentos de dimensionamiento llevados a cabo por elec roforesis de gel de agarosa, está indicado. Se debe entender que la Figura no sólo está diseñada para mostrar todos los sitios de restricción presentes en el ADN. Se entenderá que el ADN de esta invención no está en su estado natural como ocurre en la naturaleza sino en su estado aislado o en forma substancialmente pura. Se entenderá que la invención abarca el ADN que puede no tener la configuración precisa de sitios de restricción ilustrados si el
ADN ha sido derivado por técnicas normales incluyendo de lesión de nucléotidos, substitutción, adición o inversión del ADN de conformidad con cualquier aspecto de la invención anteriormente descrito. Preferiblemente, el ADN de la presente invención se deriva de P. chrysogenum. Sin embargo, la invención también abarca secuencias del ADN derivadas de otros organismos adecuados especialmente organismos productores distintos a P. chrvsogenum cuyas secuencias no tienen la configuración de sitios de restricción mostrados pero que hibridizan, preferiblemente bajo condiciones de alta estringencia, con el ADN mostrado en la Figura 2 o un subfragmento del mismo que codifica la PAA-CoA ligasa o una enzima con actividad de PAA-CoA ligasa (las condiciones de alta estringencia son, por ejemplo, como se da en el Ejemplo 18). La invención también provee un vector que comprende dicho ADN, preferiblemente un vector de expresión para expresar PAA-CoA ligasa en un organismo hospedero adecuado. Un ejemplo específico de dicho vector de expresión es pBK-CMV (comprado de Stratagene) y usado en esta invención para expresión en E. coli. En esta invención, el inserto de ADNc de PAA-CoA ligasa (=pPEN09, fig.2) es un vector preferido para la expresión en EL. coli. El ADN de la invención y los vectores que contienen el mismo pueden encontrar uso en muchas áreas de actividad industrial. Eso también se aplica a micro rganis os transformados con dichos vectores y enzimas a las que expresan. por ejemplo, el ADN se puede utilizar como una sonda de hibridación para identificar y aislar genes relacionados o traslapables presentes en el ADN celular total de P. chrysogenum (NRRL 1951) y de otros icrorganismos que producen enzimas de estructura y especificidad similares. Los vectores recombinantes que contienen dicho ADN pueden ser valiosos vuando se transforman en hospederos adecuados, en la producción de microrganismos genéticamente modificados que sintetizan cantidades incrementadas de penicilina. Sería ventajoso incrementar la cantidad de actividad de PAA-CoA ligasa en un organismo adecuado. Los vectores recombinantes también se podrían usar en la generación de antibióticos novedosos o híbridos a través del procedimiento de transferencia de genes (véase por ejemplo D.A. Hopwood y otros, Nature, 1985, 314, 642-644). Enzimas codificadas por el ADN de la invención se pueden usar, por ejemplo, en sistemas libres de células especialmente cuando se inmovilizan sobre soportes sólidos adecuados, para preparar el antibiótico conocido a partir de precursores naturales o un antibiótico novedoso a partir de precursores "no naturales" obtenidos, por ejemplo, por síntesis química. El ADN de la invención o un fragmento del mismo (que no necesariamente lleva un gen intacto) se puede combinar, ya sea mediante técnicas de ADN recombinante o mediante procedimientos de recombinación natural, con un fragmento de un gen implicado en la biosíntesis para producir un gen híbrido capaz de dirigir la síntesis de una enzima híbrida. Dichas enzimas pueden usarse en la producción de antibióticos novedosos por procedimientos análogos a los que se describieron anteriormente. El ADN de la invención también puede ser modificado por técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio (de una manera análoga a la descrita, por ejemplo, por G. Winter y otros, Nature, 1982, 299, 756-758; o por Zoller y Smith, Nucleid Acids Research, 1982, 10, 6487-6500) para dar ADN cuyas mutaciones específicas y/o deleciones han sido efectuadas. El ADN mutado se puede usar para obtener un rendimiento (o título) incrementado de penicilina a partir de un microrganismo hospedero adecuado. El ADN mutado también se puede usar para obtener antibióticos novedosos o híbridos por transferencia de genes, o se puede usar en la producción de enzimas mutantes (muteínas) que se pueden usar en la producción de antibióticos novedosos por procedimientos análogos a los que se describieron anteriormente. El ADN mutado también se puede usar para alterar otras propiedades de fermentación de organismos adecuados, por ejemplo, tolerancia a PAA, substratos alterados. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
EJEMPLO 1 Fermentación por P. chrysogenum
Esporas de Penicillium chrysogenum (SmithKIine Beecham Strain BW1901) se inocularon en 15 ml de medios de PVS (35 g/1) de solución de maíz, 15 g/1 de glucosa, 5 g/1 de CaC03 , 8ml/l de aceite de semilla de colza, pH a 5.9 con NaOH) en un matraz agitado de 100 ml . El cultivo se sometió a crecimiento durante 48 horas a 26°C con agitación orbital (230 rpm) antes de tomar 1 ml de caldo entero y transferirlo a 10 ml de medio de C5 (35 g/1 de solución de maíz, 85 g/1 de lactosa, 10 g/1 de CaC03 , , 10 g/1 de NaH2P04, 8 g/1 de (NH 2SO4, 4 g/1 de MgS?4.7H2?, 4 g/1 de Na2S0.; , 6 ml/1 de aceite de semilla de colsa, 6 g/1 de ácido fenoxiacético, pH a 6.0 con NaOH) en un matraz agitado de 100 ml . Este cultivo se hizo crecer durante 55 horas a 26°C con agitación orbital (230?~pm) antes de cosechar el micelio.
EJEMPLO 2 Preparación de extractos de proteina a partir de Penicillium chrysogenum para prueba, purificación y Western blotting de PAA-CoA ligasa
Micelios de un matraz agitado de C5 durante 55 horas cultivados como se describió en el Ejemplo 1 se cosecharon filtrando a través de filtros de microfibra de vidrio (Whatman GF/A). La estera micelial se lavó con 300 ml de cloruro de sodio a 0.9% (p/v) (4°C) y después se raspó y se colocó en 100 ml de regulador de pH para prueba de ligasa (Tris-HCl a 30mM, pH 9.0, ditiotreitol a 1 mM, 100 µg/ml de Pefabloc™ en glicerol al 50%). El micelio después se trató con sonido sobre hielo (Ix 15s usando un sonicador Ultrasonics modelo W-385, fijando la potencia en 5, velocidad de ciclo 5 s, ciclo de trabajo 50%), y después los residuos miceliales se formaron en pellas por configuración (18000xg, 4°C, 30 min). El sobrenadante se congeló a -70°C para almacenamiento o para usarse in ediatramente para prueba de PAA-CoA ligasa, purificación o Western blotting (Ejemplo 7).
EJEMPLO 3 Prueba in vitro para PAA-CoA ligasa
Para demostrar la presencia de actividad de PAA-CoA ligasa en extractos o fracciones de columna, 20 µl se mezclaron con ácido fenilacético a 0.1 M en Tris-HCl a 50 mM, pH 7.5 (20 µl), ATP de sodio a 0.1 M (10 µl), cloruro de magnesio 0.2M (lOµl), coenzima A de sodio a 0.02 M (10 µl) y ditiotreitol a 0.015M (10 µl.) en tubos de Eppendorf de plástico. Los tubos se mezclaron en remolino (5 s) y después se colocaron en un baño de agua a 30°C durante 15 minutos. Después se añadió metanol (lOOµl) a las mezclas y los tubos se centrifugaron (14K, lmin) para precipitar las proteínas. Las fracciones de sobrenadante se analizaron para presencia de PAA-CoA por Ciar (ejemplo 4). En cada serie de pruebas, un extracto de proteína preparado a partir de fermentación por P. chrysogenum en un matraz de agitación (ejempli 1) se probó como un control positivo junto con PAA-CoA no rmal .
EJEMPLO 4 Análisis de CLAR de sobrenadantes de prueba
Muestras de sobrenadantes de las pruebas PAA-CoA ligasa (ejemplo 3) se analizaron para la presencia de PAA-CoA usando un sistema de CLAR Waters LCM1. Se inyectaron muestras (lOOµl) en una columna de compresión de Radial Pak C18 a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 2.5 ml/min usando una fase móvil de fosfato de sodio a 0.2 M, pH 5.4 (regulador de pH A) isocrácticamente de 0 a 4 minutos. Esto fue seguido de un gradiente lineal a regulador de pH a 100% que contenía fosfato de sodio a 0.16 M, pH 5.4 en acetonitrilo al 40% (4-10 min). El regulador de pH B se mantuvo a 100% durante 2 minutos adicionales y después el sistema se reequilibró listo para la siguiente inyección usando un gradiente lineal de nuevo a A al 100% (12-13 min). Se detectaron picos a 260 nm y PAA-CoA tuvo un tiempo de retención de 12 minutos. Las muestras positivas fueron aquellas que tuvieron picos de coelusión con el PAA-CoA normal y mostraron el mismo espectro de absorbancia de UV como el estándar para ser determinado por el espectó etro de disposición de fotodiodo.
EJEMPLO 5 Purificación de PAA-CoA ligasa
Se requirió cuidado ya que se encontró que la actividad de la enzima era extremadamente lábil. Los intentos en la precipitación de la enzima con sulfato de amonio no tuvieron éxito ya que no se pudo encontrar actividad en el material obtenido. Esto, por sí mismo, distingue a la presente enzima de la descrita en WO 96/10085 (Gist-Brocades) . A menos que se indique otra cosa, el siguiente procedimiento se condujo a 4°C usando regulador de pH C que contenía Tris-HCl a 30 mM, DTT a 4 mM, EDTA a 4 mM, MgCl2 a 5 M y glicerol al 20% (v/v) a un pH de 9.0. Se lograron preparaciones usando un sistema de Pharmacia Hi-Load™ . Extractos libres de células (500 ml), hechos como se da en el Ejemplo 1, se descongelaron lentamente a 4°C. El extracto después se ajustó a un pH de 9.0 usando NaOH a 5 M con agitación sobre hielo. A este extracto en agitación se añadieron 275 g del medio de intercambio de iones de Q-Sepharose fast Flow (Pharmacia) que había sido lavado previamente con 3 litros de agua seguido de 1 litro de regulador de pH C. Esta mezcla se agitó durante 1.5 horas sobre hielo. La suspensión se filtró después a través de 50 g adicionales de resina de Q-Sepharose lavada sobre un confeccionador de vidrio usando presión reducida. La resina después se lavó con 100 ml adicionales de regulador de pH C y después se dejó correr secar dando 600 ml de extracto claro que contenía PAA-CoA ligasa. Después se añadió sulfato de amonio (92.4 g, es decir, niveles de subprecipitación) y la solución se agitó sobre hielo durante 1 hora seguida de filtración (fitro de 0.45 µ, Millipore, tipo HA). El extracto de PAA-CoA ligasa (700 ml) se cargó después a 1 ml/min sobre una columna de substitución baja de Phenyl-sepha rose 6 Fast Flow (Pharmacia, diámetro de 12 cm x 2.6 cm) previamente acondicionado con 1 litro de regulador de pH D (igual que para regulador de pH C con 140 g/1 de sulfato de amonio). La columna cargada se lavó después con 230 ml de regulador de pH D a 0.8ml/min y después se eluyó con un gradiente lineal de regulador de pH D al 100% a regulador de pH C al 100% sobre 238 ml a 0.8ml/min. Fracciones de 5.5 ml se rcogieron y se sometieron a prueba para actividad de PAA-CoA ligasa como se da en el ejemplo 3. Las fracciones activas, 41 a 49 se depositaron dando 50 ml , que se cargaron a 0.5 ml/min sobre una columna de afinidad de HiTrap™ Blue de 5 ml (Pharmacia) previamente lavada con 50 ml de regulador de pH C. La columna cargada se lavó con 15 ml de regulador de pH C y después se eluyó usando un gradiente lineal de regulador de pH C al 100% a regulador de pH E al 100% sobre 25 ml a 0.5 ml/min. El regulador de pH E fue como el regulador de pH C con la adición de ácido fenilacético para dar una concentración final de 0.5M que se ajustó de nuevo a pH de 9.0 usando NaOH sólido. La elusión a partir de la columna de afinidad usando el substrato natural se usó para incrementar selectividad por purificación y para permitir la actividad enzimática para medirla en las fracciones resultantes. La elusión con NaCl probó ser exitosa ya que esta sal inhibió la actividad de la enzima. Por el contrario, la enzima descrita en WO 96/10085 pareció ser estable cuando se eluyó con KC1. Fracciones activas 21, 22 y 23 se depositaron para dar 6ml, que después se separaron a 0.25 ml/min sobre una columna de exclusión de tamaño de Sephacryl S-200 High Performance (Pharmacia, diámetro de 64 cm x 2.6 cm) que había sido previamente equilibrada en regulador de pH F (como para regulador de pH C con ajuste a pH de 7.5 con HCl a 5 M). Las fracciones activas 54 a 65 se depositaron para dar 11 ml que se concentraron hasta 60 µl por ultrafiltración centrífuga (Centricon, corte de PM de 10,000 Amicon Inc.). El análisis de las fracciones a partir de la columna de exclusión por tamaño por elect rofé resis de gel de SDS-poliacrila ida (ejemplo 6) mostró una proteína de 63 kDa, cuya intensidad se correlacionó con la actividad de PAA-CoA ligasa. Se usó Western Blotting (ejemplo 6) para completar la purificación y para permitir la secuenciación de aminoácidos N-terminales de PAA-CoA ligasa.
EJEMPLO 6 Western blotting de proteína PAA-CoA ligasa
Para proveer material para secuenciación de amino-ácidos N-terminales, la proteína purificada (60 µl, ejemplo 5) se mezcló con un volumen igual de regulador de pH de muestra de SDS-PAGE que contenía Tris-HCl a 0.5 M, pH de 6.8 (10 ml), dodecil sulfato de sodio (2 g, ultrapuro), 2-mercaptoetanol (1 ml), glicerol (10 ml), agua desionizada destilada (7 ml) y azul de bromoclo rofenol al 0.1% (2 ml). La mezcla se hirvió durante 10 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se cargaron alícuotas (5, 15 y 20 µl) a un colado de gel de poliacrilamida al 10% (gel de apilamiento al 4%) en una celda de elect rofé resis de Bio-Rad Mini P rotean II usando el protocolo de fabricantes. La electrofóresis se condujo en un regulador de pH de electrodos que contenía Tris a 0.025M, glicina 0.192M y dodecil sulfato de sodio al 0.1% p/v (ultrapuro) a 200V durante 45 minutos tiempo después del cual el gel de poliacrilamida se colocó en regulador de pH de electroblotting (ácido 3-[ciclohexilamino]-l-propanesulfónico a lOmM, pH 11 en metanol al 10%) durante 5 minutos. Las proteínas en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de inmovilización de Applied Biosystems ProBlott™ usando una celda de transferencia de electroforesis de Bio-Rad Mini Trans-Blot siguiendo el protocolo de Applied Biosystems. Al completarse el blotting, la membrana se tiñó con Azul de Coomassie R-250 usando el método de detinción en el protocolo de Applied Biosystems. La banda de proteína a 63kDa se cortó de la membrana y este material se usó para secuenciación de aminoácidos N-terminales (ejemplo 7).
EJEMPLO 7 Secuenciación de aminoácidos N-terminales
La secuenciación de aminoácidos N-terminales se obtuvo a partir de proteína sometida a blotting (ejemplo 6) usando un Secuenciador de Applied Biosystems (ABI) 477A Pulsed Liquid Sequencer. La secuencia se obtuvo usando Edman Chemistry normal con identificación de aminoácidos marcados con PTH liberados usando cromatografía de agujero estrecho de ABI 120 A. El análisis de la proteína PAA-CoA ligasa purificada dio por resultado la siguiente asignación de secuencia: V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P
EJEMPLO 8 Síntesis de péptido N-terminal de PAA-CoA ligasa
La secuencia de aminoácidos N-terminales determinada a partir de la proteína PAA-CoA ligasa de 63kDa (ejemplo 7) se usó para sintetizar un péptido. Este fue sintetizado por Peptide and Protein Research Consultants (Washington Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter, Devon EX4 4QG, UK) como péptidos libres de 50 mg. Se conjugaron 12 mg a BSA (albúmina de suero de bovino) activada con maleimida usando SMCC (1-carboxilato de Succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano) y se conjugaron 2.5 mg de OVA (ovalbúmina) activada con maleimida usando MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) .
EJEMPLO 9 Producción de anticuerpos policlonales para péptido derivado de N-terminal de la proteina PAA-CoA ligasa de 63kda
El péptido conjugado a BSA (ejemplo 8) se usó para la producción de anticuerpos policlonales de conejos específicos para la proteína PAA-CoA ligasa de 63 kDa. El conjugado de péptido BSA (375 µg/ml) se esterilizó por filtro (filtro de 0.2 µ) y 1 ml de la solución estéril se mezcló uniformemente con 2 ml de adyuvante completo de Freunds no ulcerativo (Brian Morris International, Guildford U.K.). Un total de 0.8 ml de esta mezcla (100 µg del conjugado del péptido-BSA) se administró subcutáneamente a conejos blancos de Nueva Zelandia (aprosimadamente de 10 semanas de edad) en cuatro diferentes sitios de inyección. Inmunizaciones adicionales se administraron a los 28 y 58 días después de la inmunización inicial como se describió anteriormente con la excepción de que se usó adyuvante incompleto de Freunds no ulcerativo. Muestras de sangrado de prueba se tomaron de la vena de la oreja marginal a los 42 y 72 días después de la inmunización inicial para evaluar el título de anticuerpo y especificidad de anticue o usando una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ejemplo 10).
EJEMPLO 10 Prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) para la determinación de título de anticuerpo y especificidad de anticuerpo para la PAA-CoA ligasa de 63kda
Determinación de título de anticuerpo
Una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pozos (Nunc MaxiSof™) se revistió con conjugado de péptido de PAA-CoA ligasa-OVA (200 µl/well, 0-10 µg/ml) en solución salina regulada en su pH con fosfato con un pH de 7.2 (8 g/1 de cloruro de sodio, 0.2 g/1 de cloruro de potasio, 1.44 g/1 de ortofosfato diácido de sodio, 0.24 g/1 de ortofosfato diácido de potasio, pH 7.2). La placa de microtitulación revestida se incubó a 4°C durante aproximadamente 18 horas tiempo después del cual la placa se lavó cuatro veces con regulador de pH de lavado (Tris al lOmM, cloruro de sodio al 0.15 M, azida de sodio al 0.02%, Tween 20 al 0.05%, pH 7.2) usando un lavador de placa de Dynatech MRW. Este método de lavado se usó en todo el resto del procedimiento a menos que se especificara otra cosa. El regulador de pH bloqueador (1.56 g/1 de ortofosfato diácido de sodio, 8.8 g/1 de cloruro de sodio, 0.2 g/1 de ficol 400, 0.2 g/1 de polivinilpirrolidona, gammaglobulina de bovino al 0.5% de Sigma, pH 7.4, 200 µl/pozo) se añadió a la placa y se incubó a 37*C en una incubadora de Dynatech Varishaker durante 1 hora. Todas las incubaciones subsecuentes a 37ßC se realizaron usando este método. La placa se lavó cuatro veces y después el anticuefo policlonal de conejo (100 µl/pozo, dilución de 0-1:500 000), diluido en regulador de pH de prueba (Tris a 50 mM, cloruro de sodio a 150 mM, cloruro de magnesio a 1 mM, BSA al 0.5%, gamma globulina de bovino al 0.25%, azida de sodio al 0.02%, pH 7.4), se añadió a la placa y se incubó a 37°C. Después de lavar la placa se añadió un anticuefo biotinilado de IgG anticonejo de Amersham (lOOµl/pozo, dilución de 1:5000 en regulador de pH de prueba) a la placa y se incubó a 37°C. La placa se lavó y se añadió un conjugado de fosfatasa alcalina de streptavidin de Amersham (lOOµl/pozo, dilución de 1:2000 en regulador de pH de prueba) a la placa y se incubó a 37°C. Después de lavar la placa, se disolvió fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, 1 mg/ml) en regulador de pH de glicina a 0.1 M (7.51 g/1 de glicina, 203 mg/l de cloruro de magnesio, 136 mg/l de cloruro de zinc, pH 10.4) se anadió a la placa (100 µl/pozo) y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Después se añadió hidróxido de sodio (2M, 50 µl/pozo) a la placa y la absorbancia de cada pozo se midió a 405nm usando un lector de placa de Anthos Labtec. Se obtuvieron títulos de anticuefos entre 1:500000 y 1:1000000.
DETERMINACIÓN DE ESPECIFICIDAD DE ANTICUERPOS
Para demostrar que los anticuefos policlonales de conejo reaccionarían con el péptido de PAA-CoA ligasa no conjugado se realizó una prueba de ELISA como se describió anteriormente con una modificación en la etapa de incubación que usó los anticuefos policlonales de conejo. Los anticuefos se diluyeron 1:100 000-1:400 000 en regulador de pH y se añadieron 50 µl de anticuefo diluido a pozos que contenían 50 µl del péptido no conjugado (0-20 µg/ml) preparado en regulador de pH de prueba que contenía 2-mercaptortanol (0.01%, v/v). Se logró una inhibición de 50% de reactividad de anticuefo con un conjugado de OVA-péptido a una concentración de péptido no conjugado de aproximadamente 2µg/ml.
EJEMPLO 11 Determinación de especificidad de anticuerpo sobre Western Blots para PAA-CoA ligasa en extractos de Penicillium chrysogenum. E.coli y sobre muestras de protelna purificadas
Extractos preparados a partir de cultivos en matraz de agitación de Penicillium chrysogenum (BW1901 y BW1900A-una cepa derivada de un programa de mutación aleatorio) de E.coli JM109 y muestras de proteína PAA-CoA ligasa purificada fueron sometidos a Western blotted como se describe en el ejemplo 6 excepto que la membrana no se tiñó con azul de Coomassie. Las membranas sometidas a Western blotted se colocaron en regulador de pH bloqueador (1.56 g/1 de ortofosfato diácido de sodio, 8.8 g/1 de cloruro de sodio, 0.2 g/1 de ficoll 400, 0.2 g/1 de polivinilpirrolidona, gammaglobulina de bovino al 0.5%, pH 7.4) y se incubaron durante aproximadamente 18 horas a 4ßC. La membrana después se lavó cuatro veces con regulador de pH de lavado (Tris a 10 M, cloruro de sodio a 0.15 M, Tween 20 a 0.05%, pH 7.2) antes de la incubación (temperatura ambiente, 60 minutos) con los anticuefos policlonales de conejo generados como se da en el ejemplo 9 y previamente diluidos 1:100 en regulador de pH de prueba (Tris a 50mM, cloruro de sodio a 150mM, cloruro de magnesio a 1 mM, BSA al 0.5%, gammaglobulina de bovino al 0.25%, pH 7.4). Después de cuatro lavados adicionales el regulador de pH de lavado la membrana se incubó con un conjugado de IgG de anticonejo de burro-peroxidasa de rábano (Bio-Rad, 1:2000 en regulador de pH de prueba, 60 minutos, temperatura ambiente) seguido de cuatro lavados adicionales en regulador de pH. La membrana después se incubó con un substrato de peroxidasa (equipo de substrato de conjugado de peroxidasa de rábano Bio-rad) durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de detener la reacción mediante lavado de la mancha en cinco cambios de agua desionizada destilada. Muestras de proteína PAA-CoA ligasa positivas fueron aquellas con una banda a aproximadamente 63 kDa que comigró con la banda de PAA-CoA ligasa purificada. No se detectó banda positiva a 63 kDa en extracto de proteína de E.coli JM109.
EJEMPLO 12 Construcción de banco de ADNc de Penicillium chrysogenum
Un banco de ADNc de Penicillium chrysogenum (SmithKIine Beecham Strain BW1901) se construyó siguiendo el manual de instrucciones de Equipo de síntesis de ADNc ZAP Express™ de Stratagene. Se aisló ARN a partir de BW1901 como sigue. El crecimiento de cepa BW1901 como se da en el ejemplo 1 durante 40 horas antes de la cosecha del micelio por filtración a través de dos filtros de microfibra de vidrio Whatman GF/A 9.0 cm. Los mcielios se lavaron con 100 ml de agua destilada tratada con DEPC (pi rocarbanato de dietilo). Los micelios después se molieron en nitrógeno líquido usando mortero y pistilo tratado con DEPC. Los micelios en polvo congelados se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 10 ml de solución G (tiocianato de guanidinio a 4M, Tris. HCl a 50 mM, pH 7.5, EDTA a 25 mM) . El polvo se volvió a suspender en Solución G y se dejó sobre hielo durante 15 minutos. Los residuos miceliales se formaron en pellas a 17500xg a 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante se recogió en otro tubo de centrífuga de 50 ml y el ARN se extrajo como se indica en Chomczynski y Sacchi (1987) Analytical Biochemistry 162. 156-159. De el ARN total, se aisló ARN poliA+ usando un equipo de columna giratoria de celulosa de CP Laboratories Mini-Oligo (dT) según las instrucciones del fabricante. El ARN poliA+ se analizó por electroforesis de gel como en Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edición). Alícuotas (5 µg) de ARN poliA+ se tomaron y se usaron para sintetizar ADNc de doble cadena blanqueado por sitio de restricción de EcoRI en el extremo 5' y la restricción de Xhol en el extremo 3' del ADNc, siguiendo el protocolo de síntesis de ADNc ZAP Express™ de Strategene. El ADNc así sintetizado después se fraccionó en tamaños pasando a través de columnas giratorias de Sephacryl S-400 de Stratagene suministradas con el equipo de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc fraccionado en cuanto a tamaño se ligó en los brazos de Xhol y EcoRI de lamdaZAP Express como se indica en el manual de instrucciones de Stratagene. El ADN la da ligado se empacó después usando un equipo de empaque Gigapack II Gold Packaging de Stratagene según el protocolo de instrucciones. El fago de ADNc resultante después se amplificó plaqueando, incubando durante 8 horas. Se obtuvieron aproximadamente 250,000 clonas independientes y el fago eluido en 20 ml de medio de SM (NaCl a 0.1M, gSO^ a 0.01M, Tris-HCl a 0.05M, pH 7.5, gelatina al 0.01%) por placa de Nunc, se formó en alícuotas y se almacenó según Sambrook y otros (1989) ibid.
EJEMPLO 13 Inmunoselección de banco de ADNc
El banco de ADNc lamdaZAP Express del Ejemplo 12 se tamizó para clonas que expresaban la proteína PAA-CoA ligasa de 63 kDa usando anticuefos hechos como se da en el Ejemplo 9. El banco de ADNc se tamizó como en Sambrook y otros (1989) ibid. El banco de lamdaZAP Express se infectó a diluciones apropiadas en la cepa de XL1 Blue MRF' de E. coli. Las bacterias infectadas se hicieron crecer durante 4 horas sobre agarosa de Luria que contenía MgSO.; a lO M, maltosa al 0.2% e IPTG a 5 mM (para inducir expresión del inserto de ADNc) a 37°C antes de traslape con nitrocelulosa (Hybond-C super, Amersham) e incubando durante la noche a 37°C. Los filtros después se inmunotamizaron usando los anticuefos de conejos primarios (ejemplo 9) a diluciones de 1/1000, mientras que el anticuefo secundario, anticuefo de conjugado de fosfatasa alcalina de IgG anticonejo de cabra (producto de A-8025 de Sigma) se usó a diluciones de 1/2000. La localización de clonas positivas se realizó con tabletas de BCIP/NBT (fosfato de 5 bromo-4-cloro-3-indolilo/tetrazoleo nitroazul) comprado de Sigma (producto B-5655) y se usó de acuerdo con las ins rucciones del fabricante. Veinticuatro clonas positivas se identificaron y se centraron, se volvieron a suspender en regulador de pH de SM (5.8 g/1 de NaCl, 2 g/1 de MgS0*7H20, Tris-HCl a 50 M, pH 7.5, gelatina al 0.01%) y se volvió a tamizar a una densidad más baja de placas hasta que una señal positiva se pudo identificar para una placa individual.
EJEMPLO 14 Subclonación de clonas positivas
Las clonas de ADNc de lamdaZAP Express positivas identificadas a partir del inmunotamizado (ejemplo 13) fueron cortadas después como derivados de plásmido pBKCMV usando el fago auxiliar ExAssist y el protocolo de excisión provisto por Stratagene. Las clonas de plásmido después se hicieron crecer (selección de canamicina) y "mini-preparado" como se da en Sambrook y otros (1989) ibid. Los plásmidos obtenidos después se analizaron por dobles digestiones de Xbal/Sstl para caracterizar el tamaño de inserto de ADNc de las clonas. El tamaño del inserto ADNc varió de 700 bp a 2.8 kb, con el grupo más grande (12 clonas) poseyendo un tamaño de inserto de 2.0 kb. Los plásmidos también fueron digeridos con Sau3A (cortador de 4 pares de bases) para confirmar agrupación de clonas sobre la base de patrones de restricción similares. De esta manera, las clonas se dividieron en seis grupos basados en patrones de digestión por restricción común. Clonas representativas de cada grupo se sometieron a prueba después para producción de la proteína PAA-CoA ligasa de 63 kDa por análisis de Western y también para actividad enzimática EJEMPLO 15 Demostración de clonas de ADNc positivas usando Western Blotting
Extractos de proteína a partir de clonas positivas por inmunotamizado cortadas representativas se prepararon tomando un cultivo durante la noche de clonas de E. coli que se cultivaron en caldo de Luria además de canamicina (50µg/ml), IPTG (5mM) a 25°C y añadiendo un volumen igual de regulador de pH de muestra de SDS-PAGE seguido de ebullición y electroforesis como en el ejemplo 6. Después las proteínas se sometieron a Western blott para determinar la presencia de proteína de PAA-CoA ligasa de 63 kDa (ejemplo 11). La in unotinsiónde la membrana se realizó como se describió en el ejemplo 11 distinta a la de un conjugado de fosfatasa alcalina de IgG de anticonejo (dilución de 1:2000 en regulador de pH de prueba) y el substrato de fosfatasa fue BCIP/NBT fue suministrado en forma de tabletas (Sigma) y se usó de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Un grupo de clonas (ADNc, tamaño de inserto de 2.0 kb) se identificó como de una proteína de 63 kDa (co-migrada con control de BW1901).
EJEMPLO 16 Prueba de clonas de E. Coli para actividad de ligasa
Caldo que contenía células de E. coli (cultivadas como en el ejemplo 15) se centrifugó en una centrífuga de Denley refrigerada 4000xg, 4ßC durante 7 minutos para formar las células en pellas. El sobrenadante se desechó y las célula se volvieron a suspender en regulador de pH de prueba de ligasa (ejemplo 2) a la mitad del volumen de caldo original. Las células después se enfriaron sobre hielo antes de sonicar para alterar las células. Las condiciones para sonicación fueron una salida de 5, ciclo de trabajo de 50% en un sonicador Apollo Electronics Sonicator durante 30 estallidos durante 7 minutos en hielo. Los extractos se usaron inmediatamente o se almacenaron a -80°C hasta usarse. La actividad de PAA-CoA ligasa se demostró usando el procedimiento de prueba dscrito usado en el ejemplo 3 excepto que 40 µl del extractos e usaron y la mezcla de reacción se incubó durante 60 minutos a 30°C. La presencia de PAA-CoA en los sobrenadantes de prueba se demostró usando CLAR como se describe en el ejemplo 4 con la adición de un detector de disposición de 996 fotodiodos de Waters para análisis espectral. La actividad de PAA-CoA ligasa se detectó en la clona 6.6 (representativa del grupo con ADNc, tamaño de inserto de 2.0 kb) y la PAA-CoA producida se confirmó por análisis de disposición de diodos contra un patrón de PAA-CoA.
EJEMPLO 17 Secuencia de ADN de 5* de clonas de PAA-CoA ligasa
Clona 6.6 (=pPEN09) se "preparó previamente al máximo" y se purificó ADN mediante gradientes de CsCl como en Sambrook y otros (1989) ibid. Un mapa de restricción de pPEN09 se preparó realizando digestiones de enzimas individuales y dobles (figura 2). esta clona después se secuenció usando el iniciador (5'-ACAGGSSSCAGCTATGACCTTG-3' ) comprado de Cruachem y usando un equipo secuenciador de Pharmacia's T7 y siguiendo las instrucciones del fabricante provistas. La secuencia del extremo 5' del inserto de ADNc, que se muestra más adelante, verificó que la secuencia de aminoácidos traducida en el N-terminal del ADNc igualado al de la secuencia de péptidos previamente obtenido (ejemplo 6), excepto por la metionina de partida (ausente de la secuencia de péptidos). TCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTTTCCTGCACTTTGGAGACCTGCCC -26 CTATATTACCCCGAGGATTTGGGAAA ATG GTT TTT TTA CCT 15 M V F L P 5
CCA AAG GAG TCC GGT CAA TTG GAC CCA ATT CCC 48 P K E S G Q L D P I P 16
GAC AAT ATT CCA ATC AGC GAG TTT ATG CTC AAT 81 D N I P I S E F M L N 27
El resto de pPEN09 se secuenció usando reacciones de terminaciones de didesoxinucleótidos normal que contenía 7-deaza dGTP. [35S]dATP se usó como etiqueta. Las reacciones de etiqueta se analizaron en geles de cuña de poliacrilamida de 6% que contenía urea a 8M Sanger y otros (1977) PNAS 74, 5463-5467; Chen y Seeburg (1985) DNA 4, 165-170]. Se generaron deleciones alojadas a partir de los extremos T7 y T3 usando ExoIII y SI nucelasa [Henikoff (1984) Gene 24, 351-359]. Las clonas de deleción se seleccionaron en cuanto a tamaño para la secuenciación de ADN por electroforesis sobre geles de agarosa. Las clonas seleccionadas se secuenciaron como pPEN09. Los iniciadores de secuenciación internos se sintetizaron según fue necesario. La secuencia completa de inserto completa de ADN se muestra en la figura 3. La secuencia de proteína se muestra en la figura 1. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína PAA-CoA ligasa con la base de datos de secuencia de National Biomedical Research Foundation Protein (NBRF-PIR) y el banco de datos de SWISS-PROT Protein Sequence Data bank (SWISS-PROT) en software de DNASTAR dio la mejor igualación con 4-coumarato-CoA ligasa a partir de la papa. Usando el programa de DNASTAR megalign (método de clustal), se alineó la proteína PAA-CoA ligasa y la 4-coumarato-CoA ligasa de papa. El análisis de las distancias de secuencia reveló una similitud de 25% de aminoácidos entre las dos proteínas. Una coparación similar con acetil CoA sintetasas a partir de hongos (Penicillium. Aspergillus. Neurospora y levaduras) mostró sólo una similitud de 15%. Los últios tres aminoácidos de la proteína PAA-CoA ligasa fueron serina-lisina-isoleucina. La secuencia de aminoácidos se ajusta al consenso para la señal de objetivo de microcuefo C-terminal (CMTS) y los mismos aminoácidos han sido considerados esenciales para dirigir la proteína catalasa polimorfa de Hansenula para microcuefos (Didion & Roggenkamp (1992) FEBS Lett. 303(2-3). 113-116). El tripéptido C-terminal de SKI también puede dirigir la proteína al microcuefo en Neurospora crassa (de Zoysa & Connerton (1994) Curr. Genet. 26, 430-437). El útlimo paso de biosíntesis de penicilina llevado a cabo por la proteína de ACTF (utilizando PAA-CoA-el producto de PAA-CoA ligasa) ha sido localizado para microcuefos en P. chrysogenum (Muller y otros (1991) EMBO J. 10(2) 489-495). La proteína de ACTF también tiene un CMTS que se requiere para dirigir al microcuefo (EP 0488 180 A2) . El de la proteína PAA-CoA ligasa tiene un CMTS que es consistente con su función en la biosíntesis de penicilina.
EJEMPLO 18 Hibridación de ADN genómico con sonda de ADNc para PAA-CoA ligasa
El ADN genómico obtenido a partir de un número de cepas, incluyendo NRRL 1951, BW1900A, BW1901 de tipo silvestre de Penicillium chrysogenum se aisló de la siguiente manera. Las cepas se cultivaron como en el ejemplo 1, y se cosecharon después de 40 horas por filtración a través de filtros de microfibras de vidrio GF/A de Whatman. Los micelios se enjuagaron en NaCl a 0.9M antes de congelarse en nitrógeno líquido. Los micelios se molieron a un polvo fino en nitrógeno líquido y el polvo se volvió a suspender en solución G (ejemplo 12) dejando sobre hielo durante 15 minutos. Los residuos miceliales se formaron en pellas a 17500xg a 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante se recogió en otro tub de centrífuga de 50 ml y el ADN se extrajo con fenol/cloroformo pH 8.0, se extrajo con cloroformo y etanol precipitado como en Sambrook y otros (1987) ibid. El ácido nucleico se volvió a suspender en Tris-HCl a lOmM, pH 8.0, EDTA a lmM y ARN se removió por tratamiento de ARNasa como en Sambrook y otros (1989) ibid. Los ADNs genómicos se digirieron con BamHI y los productos digeridos se sometieron a electroforesis, a prueba de blott sobre membrana de Hybond N (Amersham) como en Sambrook y otros (1989) ibid. La membrana se pre-hibridó en 6xSSC, SDS al 1%, PEG6000 al 6%, lOOµg/ml de ADN de esperma de arenque fragmentado y desnaturalizado a 60ßC durante 6 horas. Después de este tiempo el fragmento de ADNc marcado y desnaturalizado (usando un equipo de Megaprime de Amersham) y 32p-<ctp según instrucciones del fabricante) se añadió a la solución de hibridación y la hibridación se continuó a 60°C durante la noche. Las membranas se lavaron después a 65°C en 2xSSC, SDS al 0.1% durante 30 minutos (dos veces). Las membranas se sometieron a autoradiografía según Sambrook y otros (1989) ibid. Los resultados mostraron un solo fragmento común de 8 kb BamHI a partir de las cepas de Penicillium (inlcuyendo NRRL1951 de tipo silvestre) que hibridizaron a la sonda de ADNc.
EJEMPLO 19 Construcción del banco de lamdaEMBL3
Un cultivo en matraz agitado de cepa BW1900A de P. chrysogenum SmiyhKline Beecham se preparó inoculando un hasa de esporas en 50 ml de medio de ACM (20g/l de extracto de malta, lg/1 de bactopeptona, 20g/l de glucosa) e incubando con agitación a 25°C. Después de 40 horas de crecimeinto, el micelio se cosechó por filtración a través de filtros de microfibra de vidrio GF/A de Whatman y se enjuagaron en NaCl a 0.9M. Los micelios después se volvieron a suspender en NaCl a 0.9M que contenía lOmg/ml de Novozy (Novo Biolabs, Novo Industri. Dinamarca) y se incubaron a 25°C durante 2 horas. Los protoplastos se purificaron a partir de los residuos de micelios pasando a través de un filtro de lana de algodón antes de centrifugar 4000xg durante 10 minutos para formar pellas con los protoplastos. Los protoplastos se enjuagaron dos veces en NaCl a 0.9M antes de añadir tiocianato de guanidina a 4M, Tris. HCl a 50mM, pH 7.5, EDTA a 25mM para lisar los protoplastos. Los residuos se removieron por centrifugación y el sobrenadante que contenía ADN cromosómico se añadió a un volumen igual de LiCl a 8M mezclado suavemente y almacenado a -20°C durante 30 minutos. La proteína y algo de ARN se formaron en pellas después por centrifugación (lOOOOxg, 4°C, 10 mminutos) y el sobrenadante que contenía ADN cromosómico se precipitó en etanol. El ADN cromosómico se digirió parcialmente con Sau3A y el ADN cromosómico fragmentado se fraccionó por tamaño sobre un gradiente de densidad de sacarosa como en Sambrook y otros (1989) ibid. Fracciones que contenían fragmentos de Sau3A mayors de lOkb se depositaron en un depósito común y se usaron en la construcción de un banco de lamdaEMBL3. Los fragmentos genómicos de Sau3A se ligaron a los brazos de lamdaEMBL3BamHI a partir de Promega. El ADNlamda ligado después se empacó usando un equipo de Packagene de promega. El ADNlamda empacado después se amplificó infectando células de cepa de LE392 de E. colli y las placas se colocaron sobre un cultivo bacteriano y se incubaron durante 8 horas a 37°C como en Sambrook y otros (1989) ibid. Se obtuvieron aproximadamente 18000 clonas independientes. El fago se eluyó en regulador de pH de SM y se almacenó apropiadamente (como en Sambrook y otros, 1989, ibid).
EJEMPLO 20 Clonación del ADN genómico de PAA-CoA ligasa
A partir de la clona 6.6 de ADNc se usó un fragmento de Sstl-Xbal que contenía inserto de ADNc (figura 2) para someter a sonda un banco de lamdaEMBL3 (preparado en el ejemplo 19) por hibridación de placa como en Sambrook y otros (1989) ibid (condiciones iguales que en el ejemplo 18). A partir del tamiz primario, se identificó un número de positivos primarios y estos se recogieron y usaron para un segundo tamiz en diluciones inferiores. La hibridación de placa se repitió y las placas individuales se identificaron como hibridando la sonda de ADNc de PAA-CoA ligasa. estas clonas de lamdaEMBL se recogieron y se amplificaron. Las clonas de lamdaEMBL se digirieron con un BamHI, EcoRI o Salí y todas las combinaciones en pares, junto con productos digeridos individuales de ADN genómico de la cepa BW1900A. Los productos digeridos se sometieron a electroforesis , a blotting y se caraterizaron por hibridación de Southern y fragmentos de restricción que contenían el gen entero de PAA-CoA ligasa se identificaron. Un fragmento de 6.5 kb de EcoRl se tomó de algunas clonas de lamdaEMBL (los mismos fragmentos de tamaño vistos en productos digeridos de ADN cromosómico) y se subclonaron en pIJ2925 (G.R. Janssen y M.J. Bibb (1993) Gene 124(1) 133-134). Un mapa de restricción del ADN genómico se presenta en la figura 4.
EJEMPLO 21 Transformación de cepa de BW19Q1 de Penicillium chrysogenum con PAA-CoA ligasa
La subclona de 6.5 kb de EcoRI en pIJ2925 (ejemplo
, =pAMX131) se usó con un fragmento de a dS lineal a partir de p3SR2 (Hynes y otros (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439) para co- ransformar protoplastos de la cepa BW1901 de P^.
chi-ysogenum (método según Tilburn y otros (1984) Gene 26, 205-221). Los transformantes se seleccionaron para la capacidad para utilizar acetamida. Los transformantes después se tamizaron para título de PenV. Un número de transformantes tuvo niveles mayores de PenV comparados con el control de BW1901 (hasta 111% en segundas pruebas), que sugerían posiblemente la integración de ambos plásmidos. Dicho resultado soportaría la función de esta clona en biosíntesis de penicilina.
LISTADO DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: SmithKIine Beecham pie (B) CALLE: New Horizons Court (C) CIUDAD: Brentford (D) ESTADO: Middlesex (E) PAÍS: Inglaterra (F) CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP (G) TELEFONO: 0181 975 3314 (H) TELEFAX: 0181 975 3688
(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Producto novedoso (iü) NUMERO DE SECUENCIAS: 2
(v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM COMPATIBLE (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 CEPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 1: (A) LONGITUD: 578 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Penicillium chrysogenum (B) CEPA: BW1901 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Mßt Val Phß Leu Pro Pro Lys Glu Ser Gly Gln Leu Asp Pro lia Pro 1 5 10 15
Asp Asn lia Pro lia Ser Glu Phß Mat Leu Asn Glu Arg Tyr Gly Arg 20 25 30 Val Arg His Ala Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Thr Cys Gly lie Thr Gly 35 40 45
Lys Sar Tyr Ser Ser Lys Glu Val Ala Asn Arg Val Asp Ser Lau Ala
50 55 60 Arg Sar Lau Ser Lys Glu Phß Gly Trp Ala Pro Asn Glu Gly Sar Glu 65 70 75 80
Trp Asp Lys Thr Leu Ala Val Phe Ala Leu Asn Thr lia Asp Ser Lau 85 90 95
Pro Leu Phe Trp Ala Val His Arg Leu Gly Gly Val Leu Thr Pro Ala 100 105 110
Asn Ala Sar Tyr Sar Ala Ala Glu Lau Thr His G n Leu Leu Asp Sar
115 120 125
Lys Ala Lys Ala Leu Val Thr Cys Val Pro Leu Leu Sar lie Ser Leu 130 135 140
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Leu Pro Lys Asn Arg lia Tyr Lau Leu 145 150 155 160 Asp Val Pro Glu Gln Leu Leu Gly Gly Val Lys Pro Pro Ala Gly Tyr 165 170 175
Lys Ser Val Ser Glu Leu Thr Gln Ala Gly Lys Ser Leu Pro Pro Val 180 185 190
Asp Glu Leu Arg Trp Ser Ala Gly Glu Gly Ala Arg Arg Thr Ala Phe 195 200 205
Val Cys Tyr Ser Ser Gly Thr Ser Gly Leu Pro Lys Gly Val Mat Ha 210 215 220
Ser His Arg Asn Val Ha Ala Asn Thr Lau Gln Ha Lys Ala Phß Glu 225 230 235 240
Gln Asn Tyr Arg Asp Gly Gly Gly Thr Lys Pro Ala Ser Thr Glu Val 245 250 255
Ala Leu Gly Leu Leu Pro Gln Ser His Ha Tyr Ala Leu Val Val Ha 260 265 270
Gly His Ala Gly Ala Tyr Arg Gly Asp Gln Thr Ha Val Lau Pro Lys 275 280 285
Phß Glu Leu Lys Ser Tyr Leu Asn Ala He Gln Gln Tyr Lys He Ser 290 295 300
Ala Lau Phe Leu Val Pro Pro He Ha Ha His Mßt Lau Gly Thr Gln 305 310 315 320
Aap Val Cys Ser Lys Tyr Asp Leu Sar Ser Val Thr Ser Leu Pha Thr 325 330 335
Gly Ala Ala Pro Lau Gly Mat Glu Thr Ala Ala Asp Phe Leu Lys Lau 340 345 350
Tyr Pro Asn He Leu Ha Arg Gln Gly Tyr Gly Lau Thr Glu Thr Cys 355 360 365 Thr Val Val Ser Ser Thr His Pro His Asp He Trp Lau Gly Sar Sar 370 375 380
Gly Ala Leu Leu Pro Gly Val Glu Ala Arg He Val Thr Pro Glu Asn 385 390 395 400
Lys Glu He Thr Thr Tyr Asp Ser Pro Gly Glu Leu Val Val Arg Ser 405 410 415
Pro Ser Val Val Leu Gly Tyr Leu Asn Asn Glu Lys Ala Thr Ala Glu 420 425 430
Thr Phß Val Asp Gly Trp Mßt Arg Thr Gly Asp Glu Ala Val He Arg 435 440 445
Arg Sar Pro Lys Gly Ha Glu His Val Phß He Val Asp Arg He Lys 450 455 460
Glu Leu He Lys Val Lys Gly Leu Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu 465 470 475 480
Ala His He Leu Ala His Pro Asp Val Ser Asp Cys Ala Val He Ala 485 490 495
He Pro Asp Asp Arg Ala Gly Glu Val Pro Lys Ala He Val Val Lys 500 505 510
Sar Ala Ser Ala Gly Ser Asp Glu Ser Val Ser Gln Ala Lau Val Lya 515 520 525
Tyr Val Glu Asp His Lys Ala Arg His Lys Trp Lau Lys Gly Gly Ha 530 535 540
Arg Phß Val Asp Ala Ha Pro Lys Sar Pro Sar Gly Lys Ha Leu Arg 545 550 555 560
Arg Leu Ha Arg Asp Gln Glu Lys Glu Ala Arg Arg Lys Ala Gly Sar 565 570 575 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 2: (A) LONGITUD: 1976 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Penicillium chrysogenum (B) CEPA: BW1901 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
GAATTCGGCA CGAGTCTAAA CCCCGAGATC ACCTCAGTTT CCTGCACTTT GGAGACCTGC 60
CCCTATATTA CCCCGAGGAT TTGGGAAAAT GGTTTTTTTA CCTCCAAAGG AGTCCGGTCA 120
ATTGGACCCA ATTCCCGACA ATATTCCAAT CAGCGAGTTT ATGCTCAATG AGAGATATGG 180
ACGAGTGCGA CACGCCAGCT CCCGGGACCC ATACACCTGT GGTATTACCG GGAAGTCATA 240
CTCGTCGAAA GAGGTAGCCA ATCGCGTCGA CTCGCTGGCT CGTAGTCTAT CAAAGGAATT 300
TGGTTGGGCG CCGAATGAAG GGTCAGAATG GGATAAGACA TTGGCCGTGT TTGCCCTCAA 360
CACTATCGAT TCCTTACCCC TATTCTGGGC CGTTCACAGA CTGGGCGGTG TTCTCACTCC 420 CGCCAACGCA TCAIACTCCG CCGCCGAGCT GACGCATCAG CTGCTTGATT CCAAGGCCAA 480
GGCCCTTGTG ACTTGTGTTC CTCTCCTCTC CATCTCACTG GAAGCTGCAG CCAAAGCTGG 540
TCTCCCGAAG AACAGAATCT ACTTACTCGA TGTACCTGAG CAGCTTCTTG GCGGAGTCAA 600
GCCTCCAGCA GGATACAAGT CCGTTTCCGA ACTGACCCAG GCTGGGAAGT CTCTCCCGCC 660
AGTGGATGAA TTGCGATGGA GCGCGGGTGA AGGTGCCCGG CGAACAGCAT TTGTGTGCTA 720
CTCAAGTGGA ACGTCTGGAT TGCCGAAAGG AGTCATGATC TCACACCGCA ACGTGATCGC 780
CAATACCCTT CAGATCAAGG CGTTTGAGCA GAACTACCGG GATGGTGGGG GCACAAAGCC 840
TGCGAGTACT GAGGTTGCTC TTGGTCTCCT TCCGCAGAGC CATATCTATG CTCTTGTGGT 900
CATTGGCCAT GCTGGGGCAT ACCGAGGCGA CCAAACAATC GTTCTCCCCA AATTCGAATT 960
GAAATCC AC CTGAACGCCA TCCAACAGTA CAAGATCAGT GCGCTGTTCC TGGTACCTCC 1020
GATCATCATT CACATGCTGG GCACTCAAGA CGTGTGCTCC AAGTATGACC TGAGTTCCGT 1080
GACGTCTCTG TTCACGGGAG CGGCACCCCT GGGTATGGAG ACAGCTGCCG ATTTCCTCAA 1140
ACTCTACCCG AACATTTTGA TCCGCCAAGG ATACGGTCTG ACAGAGACAT GCACGGTCGT 1200
AAGCTCGACC CACCCGCACG ATATCTGGCT AGGTTCATCC GGCGCTTTGC TCCCTGGAGT 1260
CGAGGCACGA ATTGTGACGC CTGAAAACAA GGAAATCACA ACGTACGACT CACCGGGCGA 1320
ATTGGTGGTC CGAAGCCCAA GCGTCGTCCT GGGCTATTTG AACAACGAAA AAGCCACCGC 1380
AGAGACATTT GTGGACGGAT GGATGCGTAC GGGAGACGAG GCTGTCATCC GTAGAAGCCC 1440
GAAGGGCATC GAGCACGTGT TTATTGTCGA TCGGATCAAG GAGTTGATCA AGGTCAAGGG 1500
TCTGCAAGTC GCGCCTGCCG AACTCGAAGC CCATATCCTC GCCCACCCCG ATGTCTCGGA 1560 CTGTGCTGTC ATCGCTATTC CGGATGATCG TGCAGGAGAA GTACCCAAGG CCATTGTTGT 1620
GAAGTCCGCC AGCGCAGGAT CGGACGAATC TGTCTCCCAG GCTCTCGTGA AGTATGTTGA 1680
GGACCACAAG GCTCGTCACA AGTGGTTGAA GGGAGGTATC AGATTTGTGG ATGCCATTCC 1740
CAAGAGCCCG AGTGGTAAGA TTCTTCGTCG GTTGATCCGT GACCAAGAGA AGGAGGCACG 1800
GAGAAAGGCT GGTAGCAAGA TCTAAAAATG TCGGGGGTAG CTTTGATTAG AACTTGGTCT 1860
GGGAAACTTG GAAACCGATA ACCATTGTTG GCTTGAACTA GAAGTATATA TGTAAATACG 1920
TGATAAACAA GGCATCTCAT CTGCTGTTA? AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTCGAG 1976
Claims (12)
1.- Una enzima que tiene una actividad de fenilacetil-coenzima A (PAA-CoA) ligasa obtenible a partir de Penicillium chrysogenum cultivando, cosechando y tratando con sonido el micelio, removiendo residuos de células y fraccionando el producto tratado con sonido por cromatografía de intercambio de aniones, seguido de cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad con elusión de substrato y cromatografía de filtración de gel en donde las fracciones cromatográficas activas se detectan usando una prueba dependiente de PAA y coenzima A-.
2.- Una enzima de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una masa molecular evidente de 63 kD por SDS page.
3.- Una enzima de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 que incofora la secuencia de aminoácidos N-terminales: V-F_L-P_p_K- -S_G_Q_L_D_p
4.- Una enzima de conformidad con cualquier reivindicación que comprende la secuencia de aminoácidos mostrados en ID SEQ 1.
5.- ADN que codifica una enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4.
6.- ADN que codifica para la reivindicación 5 que tiene la configuración de sitios de restricción como se muestra en la figura 2 ó 4.
7.- ADN de confomridad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende la secuencia de ADN en ID SEQ 2.
8.- ADN que hibridiza bajo condiciones de alta estringencia con ADN de conformidad con las reivindicaciones 5, 6 ó 7 o fragmentos del mismo.
9.- Un vector que comprende ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para expresar una enzima que tiene actividad de PAA-CoA ligasa en un organismo hospedero adecuado.
10.- Un hospedero transformado que comprende ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
11.- El uso de un hospedero transformado de conformidad co la reivindicación 9 para producir penicilina o para incrementar el título de un organismo productor de penicilina.
12.- Un procedimiento para preparar una enzima de conformidad con la reivindicación 1, que comprende cultivar Penicillium sp.. seguido de la extracción y purificación en donde las fracciones activas se detectan usando una prueba dependiente de PAA y Co-enzima A.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9513403.7A GB9513403D0 (en) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | Novel product |
GB9513403.7 | 1995-06-30 | ||
PCT/EP1996/002799 WO1997002349A1 (en) | 1995-06-30 | 1996-06-26 | PHENYLACETYL-CoA LIGASE FROM PENICILLIUM CHRYSOGENUM |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
MXPA98000212A true MXPA98000212A (es) | 1998-04-01 |
MX9800212A MX9800212A (es) | 1998-04-30 |
Family
ID=10776961
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
MX9800212A MX9800212A (es) | 1995-06-30 | 1996-06-26 | Fenilacetil-coa ligasa a partir de penicillium chrysogenum. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6245524B1 (es) |
EP (1) | EP0835316B1 (es) |
JP (1) | JP3819429B2 (es) |
KR (1) | KR100455054B1 (es) |
CN (1) | CN1145699C (es) |
AT (1) | ATE239081T1 (es) |
AU (1) | AU6417396A (es) |
DE (1) | DE69627856T2 (es) |
DK (1) | DK0835316T3 (es) |
ES (1) | ES2198493T3 (es) |
GB (1) | GB9513403D0 (es) |
HK (1) | HK1010213A1 (es) |
MX (1) | MX9800212A (es) |
PL (2) | PL186765B1 (es) |
PT (1) | PT835316E (es) |
SI (1) | SI0835316T1 (es) |
WO (1) | WO1997002349A1 (es) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUT77042A (hu) | 1994-09-28 | 1998-03-02 | Gist-Brocades B.V. | Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal |
ES2108651B1 (es) * | 1996-03-18 | 1998-07-16 | Antibioticos Sa | Procedimiento para incrementar la produccion de penicilina g (bencilpenicilina) en penicillium chrysogenum mediante la expresion del gen pcl. |
ES2220176B1 (es) * | 2002-05-27 | 2006-02-16 | Universidad De Extremadura | Nuevo enzima protelotico, procedimiento para su obtencion y aplicaciones. |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUT77042A (hu) | 1994-09-28 | 1998-03-02 | Gist-Brocades B.V. | Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal |
-
1995
- 1995-06-30 GB GBGB9513403.7A patent/GB9513403D0/en active Pending
-
1996
- 1996-06-26 AU AU64173/96A patent/AU6417396A/en not_active Abandoned
- 1996-06-26 CN CNB961964049A patent/CN1145699C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-26 AT AT96923946T patent/ATE239081T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 JP JP50478297A patent/JP3819429B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-26 PT PT96923946T patent/PT835316E/pt unknown
- 1996-06-26 EP EP96923946A patent/EP0835316B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-26 PL PL96324225A patent/PL186765B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 WO PCT/EP1996/002799 patent/WO1997002349A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-06-26 PL PL96360440A patent/PL188190B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 US US08/981,215 patent/US6245524B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-26 DK DK96923946T patent/DK0835316T3/da active
- 1996-06-26 DE DE69627856T patent/DE69627856T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-26 MX MX9800212A patent/MX9800212A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 KR KR1019970709851A patent/KR100455054B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 ES ES96923946T patent/ES2198493T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-26 SI SI9630612T patent/SI0835316T1/xx unknown
-
1998
- 1998-10-09 HK HK98111174A patent/HK1010213A1/xx not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6174706B1 (en) | DNA encoding triol polyketide synthase | |
HU204097B (en) | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species | |
SK28894A3 (en) | Bioprocess for preparing 7-adca | |
JPS6371183A (ja) | ホスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 | |
EP0821064B1 (en) | Recombinant fructosyl amino acid oxidase | |
HU219140B (hu) | Oxalát-dekarboxilázt kódoló izolált DNS fragmens, az azt tartalmazó rekombináns molekula, és a rekombináns molekulát tartalmazó transzformált növényi sejtek | |
KR0171897B1 (ko) | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 | |
US20050003383A1 (en) | Linoleate isomerase | |
AU3798900A (en) | Novel proteins related to gaba metabolism | |
JPH02167078A (ja) | 二次代謝産物生産増加のための生合成遺伝子又は制御遺伝子の単離法及び使用法 | |
MXPA98000212A (es) | Fenilacetil-coa ligasa a partir de penicillium chrysogenum | |
US6245524B1 (en) | Phenylacetyl-CoA ligase from penicillium chrysogenum | |
US5652132A (en) | Oxido reductase enzyme system obtainable from P. chrysogenum, the set of genes encoding the same and the use of oxido reductase enzyme systems or genes encoding the same for increasing antibiotic production | |
EP0448180A2 (en) | A method of modulating the production of secondary metabolites | |
JPH0253488A (ja) | ウリカーゼのdna配列および製法 | |
US6815189B1 (en) | Gene from acremonium chrysogenum encoding a protein with cephalosporin C acetylhydrolase activity and methods of use of such gene | |
US6297032B1 (en) | Recombinant cephalosporin C amidohydrolase in cephalosporin biosynthesis | |
US5882879A (en) | Method for influencing β-lactam antibiotic production and for isolation of large quantities of ACV synthetase | |
JP3658323B2 (ja) | トレハロースシンターゼ蛋白質、遺伝子、プラスミド、微生物、及びトレハロースの製造方法 | |
JP3816593B2 (ja) | キラータンパク質 | |
US5753435A (en) | Oxido reductase enzyme system obtainable from P. chrysogenum, the set of genes encoding the same and the use of oxido reductase enzyme systems or genes encoding the same for increasing antibiotic production | |
NOLTE et al. | Purification and characterization of chloramphenicol acetyltransferase from Flavobacterium CB60 | |
KR19990067302A (ko) | 벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도 | |
JP3330670B2 (ja) | アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法 | |
JP2000515008A (ja) | アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする核酸 |