HU219140B - Oxalát-dekarboxilázt kódoló izolált DNS fragmens, az azt tartalmazó rekombináns molekula, és a rekombináns molekulát tartalmazó transzformált növényi sejtek - Google Patents

Abstract

A találmány oxalát-dekarboxilázt kódoló izolált DNS-fragmensrevonatkozik, amely az 1. számú szekvenciának megfelelőnukleotidszekvenciát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik azizolált DNS-fragmenst és egy vektort tartalmazó rekombináns molekulákis, továbbá az ilyen rekombináns molekulákat tartalmazó transzformáltnövényi sejtek. ŕ

Description

A találmány egy oxálsavat bontó enzimre, közelebbről oxalát-dekarboxilázt kódoló izolált DNS-fragmensre vonatkozik. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti DNS-ffagmenst és egy vektort tartalmazó rekombináns molekulák, valamint az utóbbi rekombináns molekulát tartalmazó transzformált növényi sejtek is.

Az emberi és állati szervezet oxálsavtartalmának legnagyobb része az elfogyasztott növényi táplálékból származik. Néhány zöld levelű zöldségféle (például Amaranthus, spenót, rebarbara) vitaminokban és ásványi anyagokban gazdag, azonban káros hatású oxálsavat is tartalmaz. Az ilyen növények nagy mennyiségben fogyasztva toxikussá válnak az emberi szervezet számára, mert az oxálsavból és kalciumból kelátkötéssel kalcium-oxalát képződik, ami a vesében kicsapódva hiperoxalúriához és a veseszövet károsodásához vezet [Decastro, J.: Pharm. Biomed. Anal 6, 1 (1988); Hodgkinson: Clin. Chem. 16, 547 (1970)].

Legalább két olyan további káros folyamat is megemlíthető, amelyekben az oxálsav közvetett szerepet játszik. Az egyik eset a szántóföldi növényeket (például napraforgót) súlyosan károsító Whetziina sclerotiorium gombával kapcsolatos, amelynek növényeket támadó mechanizmusában fontos szerepet játszik az oxálsavtermelés. Az oxálsav már a patogenezis korai szakaszában felhalmozódik a megfertőzött szövetekben, és koncentrációja egyre fokozódik, miközben a kórokozó elszaporodik a gazdanövény szöveteiben. Az oxálsav felhalmozódása a levélben annak hervadását, végül elhalását okozza. így az oxálsav a növényi nedveket szállító szárak és a levelek bázisától előre haladó mobilis taxinként viselkedik [Maxwell: Physiol. Plánt Pathol. 3, 279 (1973)].

A másik eset a Lathyrus sativus-szal (lednek vagy csicseriborsó) kapcsolatos, amelynek fogyasztása neurolatirizmust okoz. A neurolatirizmus a lábizmok spaszticitásához, alsóvégtag-bénuláshoz, görcsös rángásokhoz, végül halálhoz vezet. A L. sativus egy fehérjékben gazdag, évelő hüvelyes, ami szélsőséges körülmények (például szárazság, vízhiány) között is képes növekedni, nem igényel különösebb kezelést, és a növény különböző részei ODAP néven ismert neurotoxint (azaz β-Νoxalil-L-a,P-diamino-propionsavat) tartalmaznak. Az ODAP szintézise kétlépéses reakcióban megy végbe, amelynek alapvető kiindulási szubsztrátuma az oxálsav. Az ODAP az agyi idegimpulzusok továbbításában fontos szerepet betöltő glutaminsav metabolikus antagonistájaként hat. Erre vezethető vissza, hogy ez a hüvelyes nagy fehérjetartalma ellenére sem használható fel élelmiszerként [Mickelson és munkatársai: Modem Nutrition in Health and Disease 5. kiadás, 412-433. oldal (szerkesztők: Goodhart R. S. és Shils Μ. E., kiadó: Lea and Febiger, Philadelphia, 1973)].

Az oxálsavnak a fentiekben tárgyalt rendszerekben betöltött szerepét tanulmányozva joggal állítható, hogy az oxálsav jelentős stresszfaktor. Belátható tehát, hogy nagy jelentősége van egy olyan izolált génnek, amely oxálsavat bontó enzimet kódol. Ilyen gén a megfelelő növények szervezetébe beépítve eszközül szolgálhat az oxálsav hatékony elbontásához azokban a növényekben, amelyekben oxálsav halmozódik fel, vagy amelyekben az oxálsav neurotoxinszintézisében vesz részt, vagy amelyeket az oxálsav károsít.

Az ismert oxálsavbontó enzimrendszerek közül a bazidiumos gombák közé tartozó Collybia velutipesből származó oxalát-dekarboxiláz különösen figyelemre méltó, mert - miként a részlegesen tisztított enzimmel végzett vizsgálatok eredményei igazolják - ez az enzim kofaktor nélkül egyetlen egyszerű lépésben elbontja az oxálsavat szén-dioxidra és hangyasavra, amely utóbbi vegyület nem toxikus [Shimazono és munkatársai: J. Bioi. Chem. 227, 151 (1957)]. Egy korábbi közleményünkben [J. Bioi. Chem. 266(35), 23 548-23 553 (1991)] a Collybia velutipesből származó oxalát-dekarboxiláz-enzim tisztítását, klónozását és az enzim lehetséges felhasználásait ismertettük. Ez a közlemény a Collybia velutipes oxalát-dekarboxiláz-génjének egy izolált ffagmenséről is említést tesz, a fragmens DNSszekvenciáját azonban nem ismerteti, és szerkezetéről mindössze annyit közöl, hogy 1,2 kilobázis hosszúságú. Vizsgálatainkat folytatva azonban felismertük, hogy az oxalát-dekarboxilázt kódoló DNS-fragmens több mint 300 bázispárral többet tartalmaz a fenti közleményben megemlített ffagmensnél, és az oxalát-dekarboxilázt kódoló DNS-fragmens szekvenciáját is meghatároztuk. A találmány ezen a felismerésen alapul.

A találmány tárgya tehát oxalát-dekarboxilázt kódoló izolált DNS-fragmens, amely a szekvenciajegyzékben 1. számon szereplő nukleotidszekvenciát tartalmazza. Ez a DNS-fragmens előnyösen Collybia velutipesből elkülönített fragmens lehet.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti DNSfragmenst és egy vektort tartalmazó rekombináns molekulák, valamint az ilyen rekombináns molekulákat tartalmazó transzformált növényi sejtek.

A találmány szerinti felismerés lehetővé teszi a növények oxálsav-érzékenységének és/vagy endogén oxálsavtartalmának a csökkentését. A találmány szerinti DNS-ffagmenst oxalát-dekarboxiláz expressziójáért felelős génként növények (például szántóföldi növények, így napraforgó, szójabab, babfélék, repce, lucerna, len, földimogyoró és lóhere; zöldségfélék, így saláta, paradicsom, uborka, burgonya, sárgarépa, torma, zöldborsó, lencse, káposzta, brokkoli és karfiol; virágok, így petúnia és szegfű; továbbá fák, így barackfa) szervezetébe beépítve ezek a növények rezisztensekké válnak olyan betegségekkel (elsősorban gombás betegségekkel, például Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena Leucostoma, Rhizoctonia és Schizophyllum gombafajták által okozott betegségekkel) szemben, amelyek kialakulásában fontos szerepet játszik az oxálsav. Az oxálsavbontó oxalát-dekarboxiláz-enzim növényi szervezetekben való termelődése révén visszaszorítható a növények pusztulása, betegségek okozta károsodása és olyan más káros tünetek kialakulása, amelyek fellépésében az oxálsav döntő oki szerepet játszik. Az oxalátdekarboxiláz termelődése révén a növények oxálsav okozta vagy oxálsavtermelésre visszavezethető betegségei (és az ilyen betegségek okozta pusztulás) is meg2

HU219 ΜΟΒ előzhetők. Ez különösen fontos előnyt jelent a kereskedelmi forgalmazásra termesztett szántóföldi növények szempontjából, amelyek leggyakoribb károsítói éppen a korábbiakban felsorolt gombák.

Noha az oxalát-dekarboxiláz-enzim tisztítása, a tisztított enzim azonosítása és jellemzése, valamint az enzim felhasználása nem képezi a találmány tárgyát, a teljesség érdekében a leírásban és a példákban ezekre is kitérünk.

A találmány szerinti DNS-fragmens által kódolt oxalát-dekarboxiláz-enzim megfelelő mértékben tisztított formája savas pl-vel rendelkezik, széles pH-tartományban stabil, és mérsékelten hőstabil. Az enzim SDS-PAGE segítségével meghatározott molekulatömege glikolizált állapotban 64 kDa, deglikozilált állapotban 55 kDa.

A növényi szervezetben való oxalát-dekarboxiláztermelődés (ami azáltal válik lehetővé, hogy a találmány szerinti DNS-fiagmenst génként növényi szervezetekbe építjük be) mezőgazdasági előnyeit már fentebb tárgyaltuk. Az oxalát-dekarboxiláz azonban hagyományos kártevőirtó készítmények hatóanyagaként is felhasználható; ezek a készítmények a hatóanyag mellett mezőgazdaságilag alkalmazható szokásos hordozóanyagokat és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmazhatnak, és külsőleg vihetők fel a kezelendő növényekre. Az oxalát-dekarboxiláz ilyen módon való felhasználása környezetvédelmi szempontból is nagyon előnyös, mert az enzim nem szennyező, és nem károsítja a növényeket.

Növényvédelmi célokra, külső kezeléshez az enzimet különféle folyékony vagy szilárd hordozóanyagokkal összekeverve oldat, szuszpenzió vagy porozószer formájában vihetjük fel. A felvitel módja az irtandó kórokozóik) és a kezelendő növény(ek) fajtájától függően változhat. Az általános felviteli módszerek egyes konkrét haszonnövényekre és kórokozókra való adaptálásáról a K. D. Hickey (szerkesztő): „Methods fór Evaluating Pesticides fór Control of Plánt Pathogens” (The American Phytopathological Society, 1986) című kézikönyvben található útmutatás. A készítményekhez adható segédanyagok például szolubilizálószerek, nedvesítőszerek, stabilizálószerek, mikrokapszulákat képező szerek és hasonlók lehetnek; ezek a segédanyagok szakember számára közismertek.

Külső kezelés céljára rekombináns mikroorganizmusok is felhasználhatók akár életképes, akár az enzimet nem inaktiváló módszerrel életképtelenné tett formában.

A C. velutipesből származó oxalát-dekarboxilázenzim tisztítását és az izolált enzim jellemzését az 1. példában ismertetjük részletesebben. Miként az 1. példából és az ahhoz tartozó ábrákból megállapítható, a kromatofokuszálásos rezolválás az enzim két formáját szolgáltatja. A két izoenzim mind aminosav-összetétel, mind peptidtérkép, mind immunológiai keresztreaktivitás szempontjából hasonló egymáshoz. Továbbtanulmányozáshoz a 3,3 pH-értéken eluált izoenzimet („A” csúcs) használtuk. Az enzim K_m-értéke 4, 5 mmol, V_max-értéke 166 pmol/perc/mg volt. A glikozilezett enzimalegység molekulatömege 64 kDa, a deglikozilezett fehérjéé pedig 55 kDa volt. Az enzim pl-je savas, az enzim széles pH-tartományban igen stabil, és mérsékelten hőstabil.

A gombaeredetű oxalát-dekarboxilázt kódoló, az

1. számú szekvenciának megfelelő szekvenciájú gén (azaz a találmány szerinti DNS-fragmens) klónozását a példákban ismertetjük részletesebben. Röviden, az enzimet kódoló cDNS-t egy Xgtll expressziós könyvtár immunoscreenelésével kaptuk. A hibridizációval szelektált mRNS in vitro körülmények között végzett transzlációja egy 55 kDa molekulatömegű fehérjét eredményezett. Genomiális Southem-hibridizációval megállapítottuk, hogy az oxalát-dekarboxilázt egyetlen gén kódolja. A cDNS-szonda egyetlen, 1,5 kilobázispár méretű mRNS-sel hibridizált. Az mRNS oxálsavval indukált anyagnak bizonyult. Az enzim aktivitása és az mRNS-szint között ideiglenes összefüggést észleltünk, ami azt jelzi, hogy az oxalát-dekarboxiláz kifejeződése a transzkripció szintjén szabályozott.

Az érett oxalát-dekarboxiláz-enzimet kódoló szekvenciát tartalmazó, az 1. számú szekvencián bemutatott szerkezetű gén a struktúrgén adott gazdasejtben való kifejezéséhez szükséges genetikai szabályozóelemekhez kapcsolható. A szükséges szabályozóelemek első típusa egy génpromotor-régió, amely a növényi sejt biológiai mechanizmusa által felismerhető DNS-szekvenciákat tartalmaz, és a DNS-szekvenciának hírvivő RNS (mRNS) szekvenciává való transzkripcióját indukálja. Az mRNS ezután a struktúrgéntartomány által kódolt fehérjetermékké transzlatálódik. A promotort az oxalát-dekarboxiláz-gén elé vagy annak 5’-végéhez illesztettük szokásos módszerekkel [lásd például Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning” 104-106. oldal (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].

Az oxalát-dekarboxiláz-gén növényi sejtekben való kifejezésére használható promotorrégiók közé olyan promotorok tartoznak, amelyek különböző növényi szövetek széles választékában hatásosak. Erre a célra például a karfíol-mozaikvírusból származó 35S promotor alkalmas. A növényi sejtekben felhasználható promotorok egy másik típusát azok alkotják, amelyekkel a kifejezés csak az előzőnél korlátozottabb körülmények között végezhető el. Idetartoznak például a csak meghatározott növényi szövet(ek)ben hatásos promotorok és/vagy csak meghatározott inger (például sebzés) hatására aktiválódó promotorok. Az ilyen típusú promotorok példájaként a fenil-alanin-ammónia-liáz (PÁL) génjének 5’-szabályozórégióját említjük; ezt a promotortípust Liang és munkatársai ismertetik [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9284-9288 (1989)]. Az oxalát-dekarboxiláz-gén mikrobiális gazdasejtekben való kifejezéséhez mikrobiális forrásokból származó promotorokat használhatunk. Ilyen promotor például a baktériumokban, köztük E. coliban való kifejezésre használható trp promotor [lásd például Amman és munkatársai: Gene 25, 167-178 (1983)], vagy az élesztőben való kifejezésre használható gliceraldehid-foszfát-dehidrogenáz (GAPD)-promotor [lásd például Edens és munkatársai: Cell 37, 629-633 (1984)]. A gén kifejezéséhez használható promotorszekvenciák részben vagy egészben a

HU 219 140 Β gazdasejttől eltérő sejtekben található promotorszekvenciák is lehetnek, feltéve hogy megfelelnek a fent ismertetett transzkripciós és transzlációs követelményeknek.

Egy második genetikai szabályozóelem, amit célszerű, de nem feltétlenül szükséges az oxalát-dekarboxiláz-génhez illeszteni, egy terminátor vagy poliadenilező szekvencia, ami a gén transzkripciójának hatásos leállítását segíti elő, és eukariótákban ezenkívül a poliadenilezést (azaz meghatározatlan számú adenozin nukleotid hozzákapcsolását az mRNS 3’-végéhez) is elősegíti. A terminátorrégió a szakirodalomban ismertetett módszerekkel kapcsolható a gén mögé vagy a gén 3’végéhez (lásd például Maniatis és munkatársai fent idézett szakkönyvének 104-106. oldalát). A növényekben való kifejezéshez felhasználható ilyen terminátor/poliadenilező szekvencia található például az Agrobacter tumefaciens Ti plazmidból származó oktopin-szintázgénben [lásd: DeGreve és munkatársai: J. Mól. Appl. Génét. 1, 499—511 (1982)]. A mikrobiális gazdasejtekben való kifejezéshez felhasználható terminátorszekvenciák közül példaként a Salmonella typhimuriumból származó rhó-fíiggetlen transzkripcióterminátor szekvenciát említjük [lásd például E. Winkler: „Escherichia coli and Salmonella typhimurium”, a Cellular and Molecular Biology című szakkönyvben (főszerkesztő : F. C. Neidhardt; kiadó: American Society fór Microbiology, 1987)]. A terminátorszekvenciák részben vagy egészben a gazdasejttől eltérő sejtekben található terminátorszekvenciák is lehetnek, feltéve hogy megfelelnek a gazdasejtben való transzkripció leállítására és a poliadenilezésre fent ismertetett követelményeknek.

Az oxalát-dekarboxiláz-génhez kapcsolható szabályozóelemek további típusát alkotják a szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciák. A szignálpeptid a fehérje aminoterminális részéhez kapcsolódik, és lehetővé teszi, hogy a fehéije a sejtfalhoz kötődjön vagy kiválasztódjon a gazdasejtből. A sejtfalhoz kötődés során a szignálpeptid lehasad, és az érett fehérjének megfelelő szekvenciájú fehérjetermék képződik. A szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia a promotorrégió és a kódolórégió közé illeszthető. A szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciát szokásos módszerekkel illeszthetjük be a kívánt helyre (lásd például Maniatis és munkatársai fent idézett szakkönyvének 104-106. oldalát). A felhasználható szignálszekvenciák közül példaként a következőket soroljuk fel: növények extenzingénjéból származó szignálpeptid [Chen és Vamer: EMBO J. 4, 2145-2151 (1985)], Erwinia carotovora bakteriális pelB (pektátliáz) génjéből származó szignálpeptid [Lei és munkatársai: J. Bacteriol. 169, 4379 (1987)], élesztő preprofaktorából származó szignálpeptid [Smith és munkatársai: Science 229, 1219-1229 (1985)]. A szignálpeptid-szekvenciák részben vagy egészben a gazdasejttől eltérő sejtekből származóak is lehetnek, feltéve hogy megfelelnek a fehéije átalakulására és gazdasejtben való megkötődésére fent ismertetett követelményeknek.

Az oxalát-dekarboxiláz-gén gazdanövénybe való illesztésére az idegen gének növényekbe való beépítésére alkalmas ismert módszerek bármelyikét felhasználhatjuk. Az adott növény oxalát-dekarboxiláz-génnel való transzformálására alkalmas módszert a gazdanövénynek megfelelően választjuk meg. Példaként közöljük, hogy az Agrobacterium által közvetített transzformálást jó eredménnyel alkalmazhatjuk növények oxalát-dekarboxiláz-génnel való transzformálására.

Az oxalát-dekarboxiláz-génnel való, Agrobacterium által közvetített transzformálás során az Agrobacterium által közvetített transzformálási módszer jól ismert lépéseit követjük. Először egy hatástalanított Agrobacterium tumefaciens-törzsbe mint átmeneti gazdaszervezetbe növényekben való kifejezésre alkalmas génkazettát építünk be. Az oxalát-dekarboxiláz-génkazettát egy szelektálható markergént (például neomicin foszfottranszferáz ΙΙ-t, foszfinothricin-acetil-transzferázt vagy hasonló anyagot kódoló gént) tartalmazó rekombináns plazmid T-DNS régiójába építjük be. Ezt a módszert számos közlemény ismerteti; lásd például Horsch és munkatársai: Science 227, 1229-1231 (1985). Ezután növényi szövetdarabokat (például levél-, sziklevél- vagy sziklevél alatti szövetdarabokat) 2-3 napig inkubálunk a baktériumokkal együtt, majd a baktériumokat antibiotikummal, például karbenicillinnel elpusztítjuk. A növényi szövetkultúra táptalajához a felhasznált szelektálható markergénnek megfelelő antibiotikumot is adunk, így csak a transzformált növényi sejtek növekedhetnek.

A transzformált sejtekből regenerált növényeket az oxalát-dekarboxiláz-gén jelenlétére és kifejeződésére vizsgáljuk. Az egyedi transzformánsok azonosítására immunanalízist és az oxalát-dekarboxiláz aktivitásának kimutatására alkalmas módszereket használhatunk. Az érintetlen szövetek funkcionális vizsgálatára a külső forrásból felvitt oxálsavval szembeni toleranciamérését is használhatjuk.

Miként már közöltük, az Agrobacterium által közvetített transzformáláson kívül a növények transzformálására számos más módszert is használhatunk. A DNS bevitelére alkalmas ilyen más módszer például az elektroporálás (azaz a DNS kémiailag indukált bevitele a protoplasztokba), a mikroinjektálás, a biolisztika és hasonlók. Az Agrobacterium által közvetített transzformálásra kevéssé alkalmas növények közé tartozik például a szójabab és egyes gabonaféleségek, így a kukorica. Ezeknek a növényeknek a transzformálására az Agrobacterium által közvetített transzformálástól eltérő megoldást célszerű használnunk.

A találmány további részleteit a példákban közöljük. Miként már említettük, a példákban a teljesség érdekében az oxalát-dekarboxiláz tisztítását és jellemzését is ismertetjük. A példákban ábrákra hivatkozunk, amelyek rövid leírását az alábbiakban adjuk meg.

Az 1. ábra egy kromatofokuszálóoszlopról leoldott oxalát-dekarboxiláz elúciós profilját szemlélteti. Az „Aceton-IV.” lépésből (lásd az 1. táblázatot) származó fehérjét 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) egyensúlyba hozott, 1x13 cm méretű DEAESepharose CL-6B oszlopra vittük fel. A megkötött fehérjéket gradiens szerint csökkenő pH-jú pufferoldattal

HU219 ΜΟΒ eluáltuk. Az aktivitás a 3,3 pH-értékű pufferoldattal eluált A. csúcsban és a 2,5 pH-értékű pufferoldattal eluált B. csúcsban halmozódott fel. Az ábrán betétként feltüntetett kromatogram a két csúcsnak megfelelő fehérje kromatogramja. Az A. csúcsnak (lásd: A. sáv) és a B. csúcsnak (lásd: B. sáv) megfelelő fehéijét 11%-os SDS-PAGE-n futtattuk, és Coomassie Blue színezékkel festettük. Az S. sáv az SDS-7 (gyártja: Sigma) kromatogramja, amit kalibrációs standardként használtunk a molekulatömeg meghatározásához.

A 2. ábra az oxalát-dekarboxiláz tisztaságát jellemző kromatogramokat mutatja be. A 2A. ábra szerinti esetben 3 pg fehérjéből (1. sáv) indultunk ki, amiből kétszeres sorozathígítást készítettünk (1-7. sáv). A futtatást 7% és 15% között gradiens szerint változó koncentrációjú SDS-PAGE-n végeztük, a megfestéshez Coomassie Blue színezéket használtunk. A 2B. ábrán bemutatott esetben 10 pg, az A. csúcsból származó oxalát-dekarboxilázt az első irányban izoelektromos fokuszálással (pH 2,5-5,0; Pharmacia-gyártmányú amfolitok), a második irányban 12%-os SDS-PAGE-n futtattunk. A megfestéshez itt is Coomassie Blue színezéket használtunk. Az S. sáv a molekulatömeg meghatározásához kalibrációs standardként használt SDS-7 (gyártja : Sigma) kromatogramja.

A 3. ábra aktivitás/sáv korrelációt szemléltet. 500 ng oxalát-dekarboxilázt 6%-os nem denaturáló poli(akril-amid)-gélen két sávban elektroforézisnek vetettünk alá. Az egyik sávot Coomassie Blue színezékkel festettük meg, a másikat pedig 12 darab 4 mm-es szeletre vágtuk szét. A gélszeleteket 200 pl 0,1 mólos kálium-acetát pufferoldatban (pH 4,5) inkubáltuk. Az akril-amidot szétdörzsöltük, és egy éjszakán át 4 °C-on áztattuk. Ezután meghatároztuk az egyes gélszeleteken megkötött enzim aktivitását, és a megfestett sáv megfelelő szakaszához rendeltük. Az enzimaktivitás (0,2 egység) migrációs távolsága (R_f=O,35; 4. gélszelet) megfelelt az 500 ng enzim megfestett kromatogramján észlelt értéknek. A gél más részein sem enzimaktivitást, sem fehérje jelenlétét nem észleltük.

A 4. ábrán az oxalát-dekarboxiláz két formájának Cleveland-emésztés után kapott kromatográfiás képét hasonlítjuk össze. Egy 15%-os futtatógélből készített 4,5%-os halmozógélen peptidtérképeket alakítottunk ki. 11%-os SDS-poli(akril-amid)-gélből 10-10 pg A. csúcsbeli, illetve B. csúcsbeli polipeptidnek megfelelő szeleteket vágtunk ki, és 100 pg/ml V8 proteázzal (S. aureus; Sigma-gyártmány) emésztettük. A peptideket elektroblottolással nitrocellulóz-membránra vittük fel, és 1:5000-szeres hígítású antioxalát-dekarboxiláz antitesttel immundetektálásnak vetettük alá. Az 1. sáv az A. csúcsbeli, a 2. sáv a B. csúcsbeli fehérjére kapott eredményeket mutatja be.

Az 5. ábra az oxalát-dekarboxiláz deglükozilálásakor kapott kromatogramokat szemlélteti. 1 pg A. csúcsbeli enzimet 1 mE (3. sáv), illetve 10 mE (4. sáv) Endo H-val kezeltünk 22 órán át, majd 11%-os SDS-PAGE-n futtattuk. Az 1. és 2. sáv a kezeletlen A. csúcsbeli enzim kromatogramja; ezek kontrollként szolgálnak. A jobb oldali S. sáv a Pharmaciától beszerzett molekulatömeg-jelző standard kromatogramja, míg a bal oldali

S. sáv a BRL előfestett, nagy molekulatömegű molekulatömeg-jelző standard kromatogramja.

A 6. ábra az enzimaktivitás immuntitrálás-meghatározásának eredményeit szemlélteti. 1,5 pg enzimet 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldatban (pH 4,5) változó térfogatú szérummal 2 órán át 25 °C-on inkubáltunk. Az immunkomplexeket 12 000 g gyorsuláson 10 percig végzett centrifügálással elkülönítettük, és standard elemzéssel meghatároztuk a felülúszó maradék aktivitását. Az eredményeket az 1. görbe szemlélteti. A preimmunszérummal végzett kontrollinkubálások után kapott eredményeket a Pl. görbe szemlélteti.

A 7A. ábra az oxalát-dekarboxiláz-P-galaktozidáz fúziós fehéijék immunológiai elemzésének eredményét szemlélteti. IPTG-indukált makroplakkokat 1%-os Laemmli-pufferoldattal lizáltunk, 10%-os SDS-PAGE-n futtattuk, majd nitrocellulóz-membránra vittük át, és antioxalát-dekarboxiláz antitestekkel szondáztuk. Az egyes sávok fölött szereplő számok a kiónok sorszámainak felelnek meg. A C. sáv a nem rekombináns [???] makroplakkjának felhasználásával kapott eredményeket szemlélteti, és kontrollként szolgál. A 7B. ábra az immunpozitív plakkokból származó RNS differenciálhibridizációjának eredményeit szemlélteti. Az egyedi klónokból elkülönített 500-500 ng fág-DNS-t kétszeres ismétlésben Gene Screen Plus membránon kötöttük meg, és nem oxalátindukált (mínusz), illetve oxalátindukált (plusz) cDNS-szondákkal (2,5 χ 10⁸ cpm/pg cDNS) hibridizáltuk. Az itt szereplő C. sáv a nem rekombináns Xgttl 1 DNS-sel kapott eredményeket mutatja be, és kontrollként szolgál.

A 8A. ábra in vitro transzlációval kapott termékek kromatogramjait mutatja be. Az oxaláttal nem indukált (0. órás lépésből származó; 1. sáv) és az oxaláttal indukált (12. órás lépésből származó; 2. sáv) micéliumokból származó, majd in vitro transzlációnak alávetett teljes poli(A+)RNS transzlációs termékeit immunkicsapásnak vetettük alá, majd 10%-os SDS-PAGE-n futtattuk. A gélt fluorográfiának és autoradiográfíának vetettük alá. A 3. sáv olyan vizsgálat eredményét szemlélteti, amikor az immunkicsapást tisztított oxalát-dekarboxiláz (az antitestekhez való kötődés versenytársa) jelenlétében végeztük. Miként a 8A. ábráról leolvasható, ebben az esetben eltűnt az 55 kDa molekulatömegű anyag jelenlétére utaló folt. A 8B. ábra hibridszelektált transzlációval kapott termékek kromatogramját szemlélteti. Oxaláttal 12 órán át indukált C. velutipesből elkülönített 20 pg/ml poli(A+)RNS-t Gene Screen Plus membránhoz kötött plazmid DNS-sel (1,2 kb méretű cDNSinzert pTZ18U-ban) hibridizáltunk. Az RNS-t leoldottuk, és nyúlretikulocita-lizátumban transzlatáltuk. A transzlációs termékeket immunkicsapásnak vetettük alá, és 10%-os SDS-PAGE-n futtattuk. Az eredményeket a 8B. ábrán szemléltetjük, ahol az 1. sáv az mRNS használata nélkül kapott minta, a 2. sáv az 1,2 kb méretű inzerttel hibridszelektált mRNS használatával kapott minta, a 3. sáv a 12. órában kapott teljes poli(A+)RNS használatával kapott minta, míg a 4. sáv a nem rekombináns vektorszekvenciák használatával kapott minta

HU 219 140 Β kromatogramja. Az ábrán a molekulatömeg-jelzőkkel kapott molekulatömeg-értékeket is feltüntettük.

A 9A. ábra a C. velutipes oxalát-dekarboxiláznak megfelelő 1,5 kb méretű mRNS Northern blot-diagramja. Az oxaláttal nem indukált (0. órás lépésből származó) és az oxaláttal indukált (12. órás lépésből származó) micéliumokból elkülönített, 1-1 pg poli(A+)RNS-t glioxállal denaturáltuk, ‘1,2%-os agarózgélen elválasztottuk, Gene Screen Plus membránra vittük fel, és a³²Pral jelzett cDNS-sel (9xl0^{1 * * * * * 7} cpm/pg) oxalát-dekarboxiláz jelenlétére szondáztuk. A molekulaméret jelölésére 1 kb-os fokbeosztású standard peptidkeveréket (BRL) használtunk. A 9B. ábra a C. velutipesből származó genomiális DNS Southern blot-diagramja. 4 pg genomiális DNS-t restrikciós enzimekkel emésztettünk, 1,2%-os agarózgélen futtattunk, majd Gene Screen Plus membránra vittük át, és a³²P-ral jelzett cDNSinzerthez hibridizáltuk. Molekulaméret-jelzőkként a λ HindlII/EcoRI és a pUC 19 Hinfl emésztéssel kapott anyagokat használtuk.

A 10. ábra A. és B. részén az oxalát-dekarboxilázgénkifejeződés szabályozásának bemutatására oxálsavbeadagolás után változó ideig tenyésztett C. velutipes tenyészetekből kapott 10-10 pg teljes RNS kromatogramjait mutatjuk be. A 10A. ábra glioxállal denaturált RNS-minták etídium-bromiddal megfestett 1,2%-os agarózgélen felvett kromatogramja. A 10B. ábrán bemutatott kromatogram esetén a teljes RNS-t Gene Screen Plus membránra vittük fel, és ³²P-ral jelzett 1,2 kb méretű cDNS-inzerthez hibridizáltuk. A10C. ábrán kihúzott vonallal szereplő görbe az oxalát-dekarboxilázt kódoló poli(A+)RNS relatív mennyiségének időbeli változását szemlélteti (a peptidmennyiségeket a 10B. ábrán bemutatott, autoradiográfiának alávetett kromatogram denzitometrikus foltjainak összegzett területe alapján számítottuk). A 10C. ábrán pontozott vonallal szereplő görbe az ugyanazon tenyészetből elkülönített enzim fajlagos aktivitásának változását szemlélteti az idő függvényében.

A 11. ábra a pOXDl-ben lévő 1420 bázispárból álló cDNS-inzert nukleotidszekvenciáját mutatja be.

A12. ábra a pSR21 plazmid kialakítását szemlélteti.

1. példa

Oxalát-dekarboxiláz tisztítása és jellemzése

A kísérletek leírása

A mikroorganizmus és tenyésztése

ATCC 13547 letéti számú C. velutipes S. törzset 5% dextrózt, 1% peptont, 0,1% KH₂PO₄-ot, 0,05%

MgSO₄-7H₂O-ot és 1% malátakivonatot (Difco) tartalmazó 5,2 pH-értékű táptalaj felületén tenyésztettük. Oltóanyagként a mikroorganizmus micéliumait használtuk, és a tenyésztést nem mozgatott, térfogatuk 1/5-éig táptalajjal megtöltött tenyésztőlombikokban végeztük 25 °C-on. Mintegy 25 nappal a beoltás után az egyes tenyésztőlombikokhoz 12,5 mmol oxálsavat adtunk, és így oxalát-dekarboxiláz-enzim termelődését indukáltuk. Az oxálsav beadása után 2-3 nappal a micéliumokat elkülönítettük, a micéliumtömeget hideg desztillált vízzel mostuk, és -20 °C-on tároltuk. A C. velutipest ferde tenyészetekként tartottuk fenn ugyanezen a táptalajon [Jakoby: Methods in Enzymology 5, 637 (1962)].

Tisztítás

1. lépés: Nyersextraktum előállítása

A fagyasztott micéliumot Waring típusú keverőben szárazjég vagy folyékony nitrogén jelenlétében porrá őröltük. A port háromszoros térfogatú 0,1 mólos kálium-citrát pufferoldattal (pH 3,0) 10 percig 4 °C-on extraháltuk, majd a szuszpenziót 4 °C-on 30 percig 10 000 g gyorsuláson centrifugáltuk. A felülúszót kettős sajtszűrővászon-rétegen keresztülszűrtük.

2. lépés: Acetonos kicsapás

Az acetonos koncentrálást Shimazono és Hayaishi módszerével [J. Bioi. Chem. 227, 151 (1957)] végeztük, azzal a különbséggel, hogy az utolsó két lépést elhagytuk. A következőkben megadandó %-os értékek térfogat%-ok, amit azzal a feltételezéssel számítottunk, hogy a térfogatok összeadódnak (azaz nincs térfogati kontrakció).

a) Az acetonos kicsapáshoz szükséges alacsony hőmérsékletet -10 °C-os sós jégfürdővel biztosítottuk. A mintát 0 °C-ra hűtöttük, és az első (33,3%-os) acetonos kicsapáshoz (Aceton-1.) szükséges hűtött acetont folyamatos mechanikus keverés közben a felülúszóba csepegtettük. Az elegyet 15 percig egyensúlyba hagytuk jutni, majd a képződött csapadékot előhűtött rotorban 2 °C-on 10 000 g gyorsuláson végzett 20 perces centrifugálással elkülönítettük. A 33,33-50%-os frakcionálásból kapott csapadékot a kiindulási térfogat egyötödének megfelelő mennyiségű hideg 0,1 mólos kálium-acetát pufferoldatban (pH 4,5) oldottuk. Az enzimoldatot 16 órán át 4 °C-on 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) szemben dializáltuk; ezt az oldatot kétszer cseréltük. A dialízis során képződött kevés csapadékot (Aceton-II.) centrifugálással eltávolítottuk.

b) A felülúszó acetontartalmát 40%-ra növeltük, és a képződött csapadékot (Aceton-ΠΙ.) eltávolítottuk. Az acetontartalmat 50%-ra tovább növeltük, és az ekkor kapott csapadékot (Aceton-IV.) kevés 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldatban (pH 4,5) oldottuk.

3. lépés: Kromatofokuszálás

DEAE-Sepharose CL-6B gélt (gyártja: Pharmacia)

0,02 mólos kálium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) egyensúlyba hoztunk, és 1x13 cm méretű rétegként betöltöttük egy 10 ml űrtartalmú oszlopba. Az utolsó acetonos kicsapáskor kapott csapadék oldatát 10 ml/óra sebességgel felvittük az oszlopra. Az oszlopot az oszloptérfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) mostuk, majd 4 mmólos savas pufferkeveréket (4-4 mmol DL-aszparaginsav, L-glutaminsav és glicin; pH 2,3) használva gradiens szerint csökkenő pH-jú eluálóoldatokat készítettünk, és az oszlopot 10 ml/óra sebességgel eluáltuk. Az ehiátumot 2 ml-es frakciókba gyűjtöttük. A frakciókat a 280 nm hullámhosszon mért abszorbancia alapján fehérjetartalomra vizsgáltuk, minden frakció pH-ját mértük, és minden frakciót enzimaktivitásra is vizsgáltunk. Az enzimaktivitást mutató frakciókat egyesítettük, vízzel szemben dializáltuk, majd Amicon-gyártmányú mikro6

HU 219 140 Β koncentrátoron (letörési határ: 30 000) betöményítettük. Az enzimet 4 °C-on tároltuk.

Enzimaktivitás vizsgálata

Az oxalát-dekarboxiláz-enzim aktivitását úgy is vizsgáltuk, hogy mértük a ^l4C-nel jelzett oxálsavból (aktivitás: 4,1 mCi/mmol; gyártja: Amersham) az enzim által felszabadított ¹⁴CO2 mennyiségét. A méréshez kis üvegcsöveket használtunk, amelyekbe 1-1 ml reakcióelegyet és 0,2-0,2 ml enzimoldatot töltöttünk. A reakcióelegy összetétele a következő volt: 0,2 mól kálium-citrát (pH 3,0), 0,005 mól kálium-oxalát (pH 3,0), 5,6 nanomól ¹⁴C-nel jelzett oxálsav (aktivitása: 0,0227 pCi). A reakcióelegyet az enzim hozzáadása előtt 5 percig előinkubáltuk. A kémcsöveket gumidugókkal lezártuk, és 37 °C-os vízfürdőben rázás közben 30 percig inkubáltuk. A reakciót a gumidugókon keresztül befecskendezett 0,5 ml 50 térfogat%-os triklórecetsav-oldattal leállítottuk, és a kémcsöveket további 60 percig rázattuk annak érdekében, hogy a felszabadult ¹⁴CO2 teljes mennyisége megkötődjön az üveg kémcsőbe helyezett kis műanyag csőben lévő 0,2 ml metil-benzetónium-hidroxidban (gyártja: Sigma). Ezután az üveg kémcsövekből kiemeltük a műanyag csöveket, tartalmukat toluolalapú szcintillációs mérőfolyadékba töltöttük, és folyadékszcintillációs számlálóval mértük a minták radioaktivitását. A kontrollmintákat a fentiekhez hasonlóan készítettük, azonban a 0,2 ml 50%-os triklór-ecetsavat az enzim előtt adagoltuk be, vagy az enzimet elhagytuk. A kinetikai vizsgálatokban a mért értékeket forralt, denaturált enzimre mért radioaktivitással korrigáltuk.

enzimaktivitási egység definíciója egységnek azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely standard vizsgálati körülmények között 37 °Con percenként 1 mól ¹⁴CO₂-ot szabadít fel. A vizsgálat összhatásfoka rendszerint 60-70% volt. A fehéijét a Lowry-féle mikroelemzési módszerrel határoztuk meg [Peterson: Anal. Biochem. 83, 346 (1977)]. A V_max- és K_m-értékeket Lineweaver és Burk módszerével határoztuk meg [Lineweaver és Burk: J. Am. Chem. Soc. 56, 658-666 (1934)].

A molekulatömeg meghatározása

Az oxalát-dekarboxiláz molekulatömegét gélszűréses kromatografálással határoztuk meg. 100 μΐ oldószerben (0,1 mól kálium-kloridot is tartalmazó 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldat; pH 4,5) oldott 100 pg tisztított enzimet 10x300 nm méretű FPLC gélpermeációs oszlopra (Superose 12) vittünk fel, és az oszlopot 0,5 ml/perc sebességgel eluáltuk a fenti oldattal. A fehérjéket a 280 nm hullámhosszon mért abszorbancia alapján mutattuk ki. A méréshez a következő fehérjéket használtuk standardokként: tiroglobulin (660 kDa, gyártja: Pharmacia), ferritin (440 kDa, gyártja: Pharmacia), kataláz (230 kDa, gyártja: Pharmacia), aldoláz (158 kDa, gyártja: Pharmacia), alkohol-dehidrogenáz (150 kDa, gyártja: Sigma) és szénsav-anhidráz (29 kDa, gyártja: Sigma). Az alegység-összetételt nátrium-dodecil-szulfát (SDS)-poli(akril-amid) géltömbökön végzett elektroforézissel határoztuk meg. A gélkoncentráció 7% és 15% között változott gradiens szerint. Futtatószerként Laemmli-pufferoldatot [Laemmli: Natúré 227, 680 (1970)] használtunk.

A tisztaság jellemzése

A tisztított oxalát-dekarboxiláz homogenitását úgy vizsgáltuk, hogy 10 pg A. csúcsbeli fehérjét O’Farrell módszerével [O’Farrell: J. Bioi. Chem. 250, 4007 (1975)] kétirányú gélelektroforézisnek vetettünk alá.

Aminosav-összetétel meghatározása

A mintákat evakuált és zárt kémcsövekben 110 °C-on 22 órán át hidrolizáltuk 6 mólos vizes sósavoldattal. A hidrolizátumokat LKB 4151 Alpha Plus típusú aminosavanalizátorral elemeztük. A ciszteint és a cisztint perhangyasavas oxidáció után ciszteinsav formájában határoztuk meg. A triptofánt nem határoztuk meg. A VB proteázzal való emésztést Cleveland módszerével végeztük [Cleveland: Methods in Enzymol. 96, 22 (1983)].

Szénhidrát-analízis

A glükoproteinfestést peijodát-Schiff bázisreagenssel végeztük. A természetes cukortartalmat fenol-kénsavas módszerrel [McKelvy és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 132, 99 (1969)] határoztuk meg, standardként glükózt használtunk. Az enzimet Trimble módszerével [Trimble és munkatársai: Anal. Biochem. 141, 515 (1984)] deglükozileztük, reagensként 40 mE/pg aktivitású, S. plicatusból származó Endo-β, N-acetil-glükózaminidázt használtunk (gyártja: Boeringer Mannheim).

Antiszérum előállítása

Oxalát-dekarboxiláz-foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) készített 1 mg/ml koncentrációjú elegyét 0,5% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében 10 percig forralva az enzimet denaturáltuk. 150 pg fehérjeantigén PBS-sel készített elegyét teljes Freund-adjuvánssal emulgeáltunk, majd szubkután injekció formájában újzélandi fehér nyulaknak adtuk be. 3-3 hét elteltével az állatoknak az antitesttermelés továbbserkentésére újabb injekciókat adtunk be. Ezekben az esetekben emulgeálószerként nem teljes Freund-adjuvánst használtunk, és a 2-3. injekciót szubkután úton, a 4. injekciót intravénásán adtuk be. Az antitestszintet Ouchterlony immundiffúziós módszerével határoztuk meg [Garvey és munkatársai: Methods in Immunology 3. kiadás (W. A. Benjámin Inc., New York, 1977)]. Az antitest affinitástisztítását Iwaki és munkatársai módszerével [Cell 57, 71 (1989)] végeztük.

Western blottolás és immundetektálás

A fehérjéket 150 mA állandó áramerősség fenntartásával 3 óra alatt 15 °C-on vittük fel egy Schleicher- és Schuell-gyártmányú nitrocellulóz-membránra, Towbin és munkatársai módszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979)]. Az immundetektáláshoz 1:5000 hígítású antioxalát-dekarboxiláz antitestet használtunk, és a detektálást lúgos foszfatázreakcióval végeztük Amersham-gyártmányú Super-screen immundetektáló rendszeren.

Eredmények

A maximális oxálsav-dekarboxiláz-aktivitást az oxálsav beadása után 2-3 nappal értük el. Egy tipikus tisztítási eljárás eredményeit, ahol 150 g folyékony nitrogénben őrölt porból indultunk ki, az 1. táblázat tartalmazza.

HU 219 140 Β

1. táblázat

A tisztítási lépés megnevezése	Összfehéije, mg	Összakti vitás, egység	Fajlagos aktivitás, egység/mg	Tisztasági szorzószám	Hozam, %
1. Nyersextraktum	4480	950	0,21	1	100
2. Aceton-II.	120	608	5,06	24	64
3. Aceton-IV.	3,8	260	68,8	328	27,3
4. Kromatofokuszálás (a) A. csúcs	0,08	28	350	1670	2,9
(b)B. csúcs	1,24	160	129	614	16,8

A kromatofokuszáló oszlopon az enzim két csúcsra - a 3,3 pH-értéken eluálódó A. csúcsra és a 2,5 pHértéken eluálódó B. csúcsra - vált szét (lásd az 1. ábrát). Az A. csúcsbeli anyag 1670-szeresen tisztított enzim volt, amit 2,9%-os hozammal kaptunk. A B. csúcs- 20 beli anyag két kis mennyiségű szennyezőanyaggal együtt eluálódott, így csak 614-szeresen tisztított anyag volt, amit 15%-os hozammal kaptunk (lásd az 1. táblázatot). Ezeket a szennyezőanyagokat Sepharose 4B gélszűrő-kromatográfiás oszlopon való átbocsátással el tudtuk távolítani, és az így tovább tisztított fehérjét használtuk az aminosav-összetétel meghatározásához.

A további vizsgálatokhoz - nagy tisztasága miatt - az A. csúcsbeli fehérjét használtuk. Az A. csúcsbeli anyag Superose 12 oszlopon végzett gyors fehérjefolyadék- 30 kromatografáláskor egyetlen csúcsként eluálódik, és a 10 pg fehérjével végzett kétirányú gélelektroforézis egyetlen foltot eredményez (lásd a 2B. ábrát). Az enzim kétszeres sorozathígításának kromatográfiás vizsgálata azt mutatja, hogy Coomassie Blue színezékkel való festéssel legalább 45 mg fehérje kimutatható (lásd a 2A. ábrát). Az enzimaktivitás migrációs távolsága (Rf=0,35; 4. gélszelet) megfelelt a nem denaturáló PAGE-n megjelenő egyetlen megfestett folténak (lásd a 3. ábrát). A gél más részein sem fehérje jelenlétét, 40 sem enzimaktivitást nem észleltünk. Ennek megfelelően az oxalát-dekarboxiláz-aktivitást az A. csúcsnak megfelelő fehérje hordozza. Az enzimkészítmények 4 °C-on vagy -20 °C-on tárolva stabilak voltak; a 0,02 mólos kálium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) készí- 45 tett 1 mg/ml koncentrációjú enzimoldat 4 °C-on való 4 hónapos tárolás után kezdeti aktivitásának több mint 70%-át megőrizte.

Az A. és B. csúcsbeli anyag aminosav-összetételét a 2. táblázatban közöljük. Megállapítható, hogy mind- 50 két anyag igen nagy (22%-nyi) mennyiségben tartalmaz savas aminosavakat. Vélhetően ennek tulajdonítható az anyagok kis pl-értéke, noha a natív fehérjében amidált hányadot nem határoztuk meg. Az A. és B. csúcsbeli anyag aminosav-összetétele nagymértékben 55 hasonló volt egymáshoz, azzal az eltéréssel, hogy a B. csúcsbeli anyag az A. csúcsbeli anyaghoz képest kétszeres mennyiségű metionint és tirozint, az A. csúcsbeli anyag pedig a B. csúcsbeli anyaghoz képest kétszeres mennyiségű ciszteinsavat tartalmazott. A két anyag 60

Staphylococcus aureus V8 proteázzal felvett peptidtérképei is nagymértékben hasonlóak voltak (lásd a 4. ábrát). Az A. csúcsbeli anyaggal szemben kifejlesztett, affinitástisztításnak alávetett antitestek a B. csúcsbeli fehérjével keresztreakciót adtak. A kromatofokuszálással két külön csúcsban kapott anyagok tehát az aminosavösszetétel, a peptidtérképek és az immunológiai keresztreaktivitás alapján egymással rokon anyagoknak minősülnek. A két forma pl-értékében észlelhető eltérés a sa25 vas aminosavak amidáltsági fokának eltéréséből származhat, vagy a felépítő oligoszaharidláncok mikroheterogenitására lehet visszavezethető.

2. táblázat

Aminosavak	A. csúcs, mol%	B. csúcs, mol%
Asx	10,57	10,31
Glx	11,75	11,52
Lys	3,2	2,96
Arg	2,84	2,89
His	2,66	2,74
Gly	8,44	9,44
Ser	7,23	7,19
Thr	8,56	8,48
Cys*	0,66	0,28
Tyr	0,84	1,85
Alá	11,03	10,92
Val	6,31	6,52
Leu	7,79	7,19
lle	4,00	3,86
Pro	8,64	8,46
Phe	5,13	4,68
Met	0,34	0,69
Trp	nv	nv
Ammónia	nv	nv

* cisztinsavként meghatározva; nv=ncm vizsgáltuk.

A natív enzim gélszűréssel becsült molekulatömege 560 kD volt. A 7% és 15% között gradiens szerint válto8

HU 219 140 Β zó koncentrációjú SDS-poli(akril-amid)-gélen végzett elektroforézis egyetlen, 64 kD molekulatömegű polipeptid jelenlétét mutatta (lásd a 2A. ábrát). Az összes eltérő koncentrációjú gélen (futtatószerként Laemmli-pufferrendszert használva) következetesen ezt a molekulatömeget kaptuk. Endo-P-N-acetil-glükózaminidáz-H-val való kezelés után a fő deglükozidált sávban lévő polipeptid molekulatömege 55 kD volt (lásd az 5. ábrát). Az enzim tehát egy glükozilezett enzim, és a gélszűréssel kapott nagy látszólagos molekulatömeg vélhetően annak tulajdonítható, hogy egyes glükoproteinek oldatban hajlamosak arra, hogy egymással nem kovalens kötésű interakciós termékeket képezzenek [Farach-Carson és munkatársai: Biotechniques 7,482 (1989); Kleinmanés munkatársai: Biochemistry 25, 312 (1986)].

A kálium-oxalát-szubsztrátum felhasználásával felvett Lineweaver-Burk-diagramokból az enzim látszólagos Κπ,-értékére 4,5 mmol adódott. Az ebből számított V_max-érték 166 mol/perc/mg volt. A foszfátionok az enzim kompetitív inhibitorainak bizonyultak; a reakcióelegyhez 90 mmol PO₄ ² -iont adva Ki értékére 9 mmol-t kaptunk. Az enzim oxalátra nézve szubsztrátumspecifikus volt; a citromsav, ecetsav, oxálecetsav, borostyánkősav és hangyasav egyikét sem hasznosította szubsztrátumként.

Az enzim széles pH-tartományban nem inaktiválódott irreverzíbilisen, és a dekarboxilezés optimális pHértéke 3,0 volt. Az enzim 80 °C-on való 20 perces inkubálás után kezdeti aktivitásának 78%-át megőrizte, de 96 °C-on inkubálva már mintegy 10 perc alatt teljesen inaktiválódott. A szulfhidrilcsoportot tartalmazó reagensek az enzim aktivitását nem befolyásolták; az enzim 50 mmol p-klór-higany(II)-benzolszulfonsav vagy 50 mmol jód-acetát jelenlétében aktivitásának 95%-át megőrizte. Az enzim 10% SDS-sel szobahőmérsékleten 30 percig végzett inkubálás után kezdeti aktivitásának 45%-át megőrizte, de 10% SDS jelenlétében 60 °C-ra melegítve aktivitását csaknem teljes mértékben elvesztette. Az enzim glükoproteinjellegét az is igazolja, hogy perjodát-Schiff bázisreagenssel megfesthető; ebben a vizsgálatban az enzimet concanavalin ASepharose gélhez kötöttük, és 0,5 mólos a-metil-mannozid-oldattal eluáltuk. Az enzim fenol/kénsavas módszerrel becsült semleges cukortartalma 15%.

Az enzimet 8 μΐ nyers antioxalát-dekarboxiláz antiszérummal titrálva a felűlúszóban mért aktivitás a kezdeti érték >60%-ára esett vissza (lásd a 6. ábrát). Az antioxalát-dekarboxiláz antiszérumot 1:5000-es hígításban használtuk; ez az antiszérummennyiség legalább 1,0 ng A. csúcsbeli fehéije kimutatására volt alkalmas. Az antiszérum a V8 proteázzal való emésztés során kapott összes peptiddel (lásd a 4. ábrát) keresztreakcióba lépett, és az A. és B. csúcsbeli anyagok deglükozilezett formáival is keresztreakciót adott. Az A. csúcsbeli anyaggal szemben affinitástisztítással tisztított antiszérum a B. csúcsbeli oxalát-dekarboxilázzal és az OxB Oxalobacter formigenes törzsből származó oxalil-CoAdekarboxilázzal egyaránt keresztreakciót adott, de az árpából (Hordeum vulgare) származó oxalát-oxidázzal nem adott keresztreakciót.

2. példa

Oxalát-dekarboxilázt kódoló DNS molekuláris klónozása és kifejezése

A kísérletek leírása

Molekuláris klónozás

Folyékony nitrogén alatt őrölt C. velutipes-porból Chomczynski és Sacchi módszerével [Anal. Biochem. 162, 156 (1987)] teljes RNS-t vontunk ki, és a poli(A+)RNS-t oligo (dT) cellulózon két ciklusban végzett kromatografálássai szelektáltuk. A cDNS szintézisét és klónozását, valamint a könyvtár immunscreenelését az Amersham-reagenskészlethez csatolt útmutató szerint végeztük. A cDNS-t oxaláttal indukált 12 órás tenyészetből származó mRNS-ből szintetizáltuk úgy, hogy 5 pg poli(A+) RNS-t oligo (dT)-vel primeltünk, majd Xgtl 1 EcoRI restrikciós helyébe klónoztuk. A beburkolt fágokat immunscreenelésre E. coli Y1090 rgazdasejtben növesztettük. A háttér-reaktivitás eltávolítására 1 mg/ml koncentrációjú E. coli Y1090 sejtlizátumra antioxalát-dekarboxiláz antitesteket előadszorbeáltattunk, és ezt használtuk fel az immunscreeneléshez. A pozitív kiónok kimutatására kecske-antinyúlIgG lúgos foszfatázkonjugátumot használtunk, A DNSt Del Sál módszerével [Biotechniques 7, 514 (1989)] állítottuk elő az immunpozitív fágokból, és meghatároztuk azok inzertméretét. A fúziós fehéijéket az Anal. Biochem. 156, 354 (1986) közleményben leírtak szerint jellemeztük, és az inzertek közötti hasonlóság vizsgálatára az inzertek egyikét használtuk szondaként. A 3-as számú kiónból származó 1,2 kb méretű inzertet pTZ18U-ba (USB) szubklónoztuk, és más vizsgálatokhoz szondaként használtuk.

Differenciálhibridizáció

Az immmunpozitív kiónok differenciálhibridizációját a következőképpen tanulmányoztuk. Az oxaláttal nem indukált (0. órás) és az oxaláttal indukált (12. órás) micéliumokból elkülönített mRNS-ekből egyszálú cDNS-szondákat készítettünk. Hybri-slot® Filtration Manifold membránra (Gene Screen Plus-gyártmány) a gyártmányismertetőben megadott útmutatás szerint kétszeres ismétlésben 0,5-0,5 pg rekombináns fág-DNS-t kapcsoltunk, és ezt az oxaláttal indukált, illetve oxaláttal nem indukált micéliumokból származó cDNS-szondákkal hibridizáltattuk. A szonda fajlagos aktivitása 2χ 10⁸ cpm/pg cDNS volt.

Hibridizálás

A felitatott DNS- és RNS-foltok hibridizálását 42 °C-on végeztük a Gene Screen Plus cég útmutatójában leírt formidos módszerrel. Az előhibridizációt éjszakán át végeztük a következő összetételű közegben: 50% ionmentesített formamid, 1% SDS, 1 mólos nátriumklorid-oldat, 10% dextrán-szulfát. A foltokat 42 °C-on 24 órán át hibridizáltattuk a denaturált szondával (1-4χ10⁵ dpm/ml). A membránokat 2xSSC-oldattal szobahőmérsékleten kétszer, 2xSSC+l% SDS-oldattal 65 °C-on 30 percig kétszer, végül 0,lxSSC-oldattal szobahőmérsékleten 30 percig kétszer mostuk. A nyirkos membránokat műanyag burkolatba helyeztük, és erősítőszűrő jelenlétében Kodak XAR filmekre exponáltuk.

HU 219 140 Β

A szonda előállítása

A pTZ18U-ba szubklónozott DNS-t EcoRI-vel emésztettük, és 2%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen futtattuk. Az inzert-DNS-t kivágtuk, és Feinberg és Vogelstein véletlen primerjelölési módszere szerint [Anal. Biochem. 137,226 (1984)] (a-³²P)-dATP-vei jeleztük.

Genomiális DNS elkülönítése és Southem-analízise

Liofilizált C. velutipesből Zolán és Pukkila módszerével [Mól. Cell. Bioi. 6, 195 (1986)] elkülönítettük a genomiális DNS-t. A DNS-t CeCl-gradiensen kétszer futtatva restrikciós enzimekkel emészthető DNS-t kaptunk. 4 pg genomiális DNS-t különböző restrikciós endonukleázokkal emésztettünk, majd 1,2%-os agarózgélen futtattuk. A DNS-t lúgos foltfelitatásos módszerrel [Reed és Mann: Nucleic Acids Rés. 13, 7207 (1985)] Gene Screen Plus membránra vittük fel.

In vitro transzláció

A poli(A+)RNS transzlációját nyúlretikulocita-lizátummal végeztük, a gyártó cég (Promega) útmutatója szerint. A transzlatált fehéijéket specifikus antiszérumokkal kicsaptuk, és SDS-poli(akril-amid)-gélelektroforézissel elemeztük.

Hibridszelektálás

Az oxalát-dekarboxilázból származó mRNS hibridszelektálását úgy végeztük, hogy 20 pg poli(A+)RNS-t 200 pl közegben [összetétele: 65% formamid, 10 mmol PIPES (pH 6, 4), 0,4 mól NaCl, 8 mmol EDTA, 0,5% SDS, 100 pg/ml élesztő tRNS) 50 °C-on 4 órán át olyan Gene Screen Plus membránhoz hibridizáltuk, amire előzetesen 4 pg denaturált cDNS-t kapcsoltunk. A szűrőket a Gene Screen Plus cég útmutatója szerint készítettük el. A hibridizálást, a mosást és a hibridizált RNS eluálását a következő közleményekben leirt módszerekkel végeztük: Jagus: Methods in Enzymol. 152, 567 (1987); Pames és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2253 (1981). Az eluált RNS-t 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk, ezután közvetlenül egy in vitro transzlációs elegyben rekonstituáltuk, végül Anderson és Blobel módszerével [Methods in Enzymology 96, 111 (1983)] immunkicsapást végeztünk.

Northern blot-analizis pg poli(A+)RNS-t vagy 10 pg teljes RNS-t glioxállal denaturáltunk, majd 1,2%-os agarózgéleken futtattunk. Ezeket a műveleteket Sambrook módszerével végeztük [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)]. A kapott anyagot kapilláris segítségével Gene Screen Plus membránra itattuk fel a gyártó útmutatójában közöltek szerint. A szűrőkre szondaként ³²P-ral jelzett 1,2 kb méretű cDNS-inzertet vittünk fel.

Eredmények

Miként már közöltük, az oxaláttal indukált (12. órás) tenyészetből származó mRNS-t λgt 11-be beépítve cDNS-expressziós könyvtárt hoztunk létre. Az E. coli lizátummal előkezelt antitesttel mintegy 47 000 rekombinánst screeneltünk. 15 immunpozitív plakkot kaptunk, amelyeket plakkban tisztítottunk. Ezek közül adott kereszthibridizációt. Az utóbbiak az inzert méreteivel összehasonlítható méretű fúziós fehéijéket kódoltak (lásd a 7A. ábrát). A 15 immunpozitív klónból származó fág-DNS-t kétszeres ismétlésben Gene Screen Plus membránon rögzítettük, és oxaláttal indukált, illetve oxaláttal nem indukált tenyészetből származó cDNS-szondákkal szondáztuk. A 15 immunpozitív klón differenciálhibridizációja azt mutatta, hogy ezek közül 12 hibridizált az oxaláttal indukált tenyészetből származó (azaz oxalát-pozitív) mRNS-ből kialakított cDNS-szondával, míg az oxalát-negatív szondával nem adtak jelet (lásd a 7B. ábrát). Ez azt igazolja, hogy a 12 klón expresszióját az oxalát indukálja.

Az mRNS hibridszelektálásához a 3-as számú λklónból származó 1,2 kb méretű inzert pTZ18U-val képezett szubklónját használtuk. A hibridszelektált RNS in vitro transzlációja és a transzlációs termék immunkicsapása után egy 55 kD molekulatömegű anyagnak megfelelő foltot kaptunk (8B. ábra, 2. sáv), amelynek mérete hasonló volt a teljes poli(A+)mRNS felhasználásakor kapott termék méretéhez (3. sáv), és megfelelt a deglükozilezett enzimfehéije méretének. Nem kaptunk azonban ilyen 55 kD molekulatömegű fehérjét akkor, ha az mRNS-t elhagytuk (8B. ábra, 1. sáv), vagy ha nem rekombináns vektorszekvenciákat használtunk (4. sáv). Oxaláttal indukált (12. órás) tenyészetből származó mRNS felhasználásakor is kaptunk 55 kD molekulatömegű terméket (8A. ábra, 2. sáv), oxaláttal nem indukált (0. órás) tenyészetből származó mRNS felhasználásakor azonban ilyen anyag nem képződött (1. sáv). Minthogy az in vitro transzlációs és immunkicsapásos vizsgálatokban a tisztított oxalát-dekarboxiláz az antigénkötő helyek elfoglalása szempontjából versenytársnak bizonyult, és jelenlétében csökkent az 55 kD molekulatömegű anyag foltjának intenzitása (3. sáv), ez az 55 kD molekulatömegű anyag az oxalát-dekarboxilázzal rokon anyagnak minősül.

A genomiális DNS Southern blot-elemzési adatai szerint - ahol szondaként a 1,2 kb méretű inzertet használtuk - a BamHI, EcoRI, HindlII, PvuII, Sspl, Xbal és Xhol enzimekkel kapott emésztett termékek csak egyetlen foltot adnak, ami azt jelenti, hogy egyetlen másológén van jelen (9B. ábra). A KpnI és PstI enzimmel végzett emésztés termékei 2-2 eltérő intenzitású foltot adnak, ami annak tulajdonítható, hogy az 1,2 kb méretű cDNS-inzert egy-egy belső hasítóhelyet is tartalmaz az adott enzimek számára. Az 1,2 kb méretű szonda az oxaláttal indukált (12. órás) tenyészetből származó poli(A+)RNS egyetlen, 1,5 kb méretű mRNS tagjával hibridizált, míg oxaláttal nem indukált (0. órás) tenyészetből származó RNS esetén hibridizáció nem volt észlelhető (9A. ábra).

Ugyanezen tenyészetekből az oxalátos indukálás után változó időpontokban mintákat vettünk, és a mintákat RNS-szintre, enzimaktivitásra és összfehérje-tartalomra vizsgáltuk. A teljes RNS Northern blot-elemzési adatai azt mutatták, hogy a 0. órás tenyészetben az 1,5 kb méretű sávot szolgáltató anyag nincs jelen, ennek mennyisége a 12. órás tenyészetben éri el a csúcsértéket. Az indukálás után 3 nappal RNS már nem mutat10

HU 219 140 Β ható ki (10B. ábra). Az enzimaktivitás mérését az oxalát beadását követő 12. órában kezdtük. Az enzimaktivitás a 2. napon érte el a csúcsértéket, és ettől kezdődően folyamatosan csökkent. Az összfehéije-tartalomban ennek megfelelő növekedést vagy csökkenést nem észlel- 5 tünk (10C. ábra). Az enzimaktivitás megjelenése és az mRNS-szintek között tehát időszakos kapcsolatot észleltünk, mert az mRNS-szint az indukálás után 12 órával érte el a csúcsértéket, és a maximális enzimaktivitást az oxálsav beadása után 48 órával értük el.

3. példa

Oxalát-dekarboxiláz klónozása A pOXDl oxalát-dekarboxiláz-génjéhez polimeráz láncreakcióval (PCR) egy tranzitpeptidet kódoló DNS-t illesztettünk. Tranzitpeptidként a Nicotiana plumbaginifolia extenzingénjéből származó tranzitpeptidet választottuk. A teljes tranzitpeptidet és az érett extenzinfehéije két aminosavját a dekarboxiláz ATG fölé kapcsoltuk.

A PCR-ban használt 5’-oligonukleotid EXTOXD-5 10 volt, amelynek szerkezete a következő:

’ -GAAGACGATAGGATCCATTTGTTTCAAAG*ATG GGA AAA ATG GCT TCT CTA BamHI *Met Gly Lys Met Alá Ser Leu <-----nem kódoló DNS----->

TTT GCC ACA TTT TTA GTG GTT TTA GTG TCA CTT AGC TTA GCT /TCT Phe Alá Thr Phe Leu Val Val Leu Val Ser Leu Ser Leu Alá Ser GAA [ATG TTC AAC AAC TTC CAA]

Glu [Met Phe Trp Trp Phe Gin] [-] átfedés az oxalát-dekarboxiláz-gén kezdetével * transzlációs starthely a tranzitpeptid kezdeténél / feldolgozási hely a transzlációs termékben

A PCR-ban használt 3’-oligonukleotid EXTOXD-3 volt, amit az eredeti pOXDl szekvencia 210-190 helyzetű szekvenciájával (a KpnI helytől lefelé) szemben vezettünk. Az oligonukleotid szerkezete a következő volt:

5’ - TGGGTCACTGGTCTCATT - 3’

A PCR-reakcióban a fenti két prímért, templátként 30 pedig pOXDl plazmid-DNS-t használva csak foltokat kaptunk.

A teljes hosszúságú termékek feldúsítására ezt a primer terméket ugyanazt a 3’-primert és egy új 5'-prímért használva újra sokszoroztuk. Az új 5’-primer EX- 35 TOXR-6 volt [szerkezete: 5’-GAAGACGATAGGATCCATTTG-3’], ami a fenti EXTOXD-5 távoli 5’szekvenciáját képviseli.

A második PCR-t követően a várt méretnél (mintegy 290 bázispár) megjelent egy sáv. Ezt tisztítottuk, 40 BamHI-KpnI-gyel emésztettük, és olyan pOXDl-be klónoztuk, amiből előzetesen eltávolítottuk a rezidens BamHI-KpnI fragmenst (125 bázispár). Az inzerten keresztül összesen 17 olyan klón szekvenált, amely a nagyobb fragmenst tartalmazta.

A kiónok egyikénél igazoltuk, hogy az a helyes szekvenciájú BamHI-KpnI inzertet tartalmazza. Ebből a klónból BamHI-EcoRI fragmensként kihasítottuk a tranzitpeptid/oxalát-dekarboxiláz gént, a kapott terméket Klenow módszerével tompa végűvé tettük, és 50 pJRIRi Smal helyébe illesztettük be.

A rekombinánsokat hibridizációval azonosítottuk, és szerkezetüket/orientációjukat diagnosztikai emésztésekkel (HindllI-EcoRI, KpnI, HindllI és PstI) vizsgáltuk. Az OX-D kazettát az nptll kazettával azonos 55 orientációban tartalmazó egyik kiónt pSR21-gyel jelöltük (= a Smal helyre illesztett OX-D kazettát tartalmazó klón).

A pOXDl-ben lévő 1420 bázispár méretű cDNSinzert nukleotidszekvenciáját all. ábrán mutatjuk be. 60

A pSR21 plazmid kialakítását a 12. ábrán szemlél25 tétjük.

4. példa

Dohány transzformálása a fentiekben ismertetett vektorokkal

a) A vektorok átvitele Agrobacteriumba

A szerkezeteket a szakirodalomban részletesen leírt közvetlen transzformációval A. tumefaciens LBA4404be építettük be. A szerkezetek jelenlétét és változatlan voltát restrikciós emésztéssel és Southem-blot analízissel vizsgáltuk annak megállapítására, hogy nem történte rekombináció a vektorok Agrobacteriumba való beépítése során.

b) Dohánylevélkorongok transzformálása

N. tabacum var. Samsun dohánynövény leveleiből vágott korongokat a szakirodalomban részletesen ismertetett módon transzformáltunk. A kívánt szerkezetet tartalmazó növényeket PCR-val azonosítottuk, és további vizsgálatokra elkülönítettük.

5. példa

Oxalát-dekarboxiláz-aktivitás meghatározása transzgén növényekben

Az enzimaktivitást az oxalát dekarboxileződésekor képződő két bomlástermék (szén-dioxid és formiát) bármelyikének mérésével vizsgálhatjuk. A ¹⁴C-nel jelzett oxálsavból való ¹⁴CO₂-felszabadulást a következőképpen mértük. Üveg kémcsövekbe töltött reakcióközeget [összetétele: 0,2 mól kálium-nitrát (pH 3), 0,005 mól kálium-oxalát (pH 3), 5,6 nmol ¹⁴C-oxálsav (aktivitása: 0,0227 pCi)] 5 percig előinkubáltunk, majd hozzáadtuk az extraktumot/enzimet. A kémcsöveket lezártuk, és vízfürdőben, rázás közben 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. A reakció leállítására a kémcsövekbe a dugón keresztül 0,2 ml 50 térfogat%-os triklór-ecetsavat fecskendeztünk. A kémcsöveket tovább rázattuk annak érdekében,

HU 219 140 Β hogy a felszabadult ¹⁴CO₂ teljes egésze megkötődjön a kémcsövekben lévő kis műanyag edényekbe töltött 0,2 ml metil-benzetónium-hidroxidban. Ezután a műanyag edényeket kiemeltük, tartalmukat 5 ml szcintillációs folyadékba töltöttük, és folyadékszcintillációs szám- 5 látóval mértük a minta radioaktivitását.

A formiáttermelődést Magro és munkatársai módszerével (1988) mértük, de a módszert a Collybia velutipesből elkülönített oxalát-dekarboxiláznak a Sclerotinia-eredetű enzimétől eltérő biokémiai sajátságait fi- 10 gyelembe véve módosítottuk. Kétlépéses módszert használtunk. Először reakcióelegyeket készítettünk, amelyek 20 μΐ 40 pmólos oxálsavoldatot (pH-ja kálium-hidroxiddal 3,5-re állítva), 15 mmol o-fenilén-diamint és 0,1 mmol szarvasmarhaszérum-albumint tartalmaztak 0,2 mólos citrát pufferoldatban. A reakcióelegyekhez hozzáadtuk az extraktumot/enzimet, és a 0,5 ml végtérfogatú elegyeket 20 percig 25 °C-on inkubáltuk. A dekarboxilezés leállítására az elegyekhez 7,5 végső pH-érték eléréséig K₂HPO₄-ot adtunk. Az ele- 20 gyekhez az elegytérfogat felének megfelelő mennyiségű 45 mmólos nikotinamid-adenin-dinukleotidlítiumsó (NAD)-oldatot adtunk, és az elegyeket összekevertük. 3 perc elteltével az elegyekhez 15 μΐ formiátdehidrogenázt (FDH, aktivitása: 80 E/ml) adtunk. 25 A reakcióelegy abszorbanciáját az FDH beadása előtt és 20 perccel az FDH beadása után 340 nm hullám5’-GAG AAG GAT GAC AGT hosszon mértük, és a növekedés alapján kiszámítottuk a képződött formiát koncentrációját. Minden extraktum esetén oxálsav nélküli kontrollméréseket is végeztünk.

Ezután kiszámítottuk az enzim 1 g fehérjére vonatkoztatott aktivitását.

6. példa

Polimeráz láncreakciókhoz (PCR) és Southernanalízisekhez felhasznált oligonukleotidok

Az oxalát-dekarboxiláz-gén regenerált hajtásokban való jelenlétének kimutatására diagnosztikai PCR-kat végeztünk, amihez a génszekvenciából az Oligo DECI jelű, alább ismertetendő szerkezetű szekvenciát választottuk ki. Ez egy 35S oligonukleotiddal (43) kom15 binálva mintegy 280 bázispár méretű, diagnosztikai értékű PCR-sávot ad. Ezeket az oligonukleotidokat használtuk a gyökereztetett hajtások transzgénjellegének igazolására.

A regenerált transzgénnövények és utódjaik Southem-analíziséhez két további oligonukleotidszekvenciát (jelük: DEC2 és DEC3) használtunk, amelyekből az elemzés céljára mintegy 450 bázispár méretű 5’oxalát-dekarboxiláz szondaffagmenst alakítottunk ki.

A diagnosztikai PCR-ekben promotor oligopeptiddel együtt használandó Oligo DECI (5’ az oxalát-dekarboxiláz kódolószekvenciájában) szerkezete a következő:

GAG CAG ACG TTG-3’

A Southem-analízisekben használandó szondák kialakításához egymással kombinálva használandó DEC2 és DEC3 oligopeptid (az oxalát-dekarboxilázkódoló tartomány közepén és 3’-végén) szerkezete a következő :

DEC2: 5’-CCA TGTA CGA CGG TAC ATT CTT GCT CAC-3’ DEC3: 5’-TGTC AGG AAC ATA AGC GAT ATC ACC ACC-3’

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Oxalát-dekarboxilázt kódoló izolált DNS-fragmens, azzal jellemezve, hogy az 1. számú nukleotidszekvenciát tartalmazza.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált DNS, azzal jellemezve, hogy Collybia velutipesből van elkülönítve.
3. 3. Rekombináns molekula, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti DNS-fragmenst és egy vektort tartalmaz.
4. 4. Transzformált növényi sejt, azzal jellemezve, hogy 45 a 3. igénypont szerinti molekulát tartalmazza.