RO112764B1 - Secventa adn ce codifica oxalat decarboxilaza - Google Patents
Secventa adn ce codifica oxalat decarboxilaza Download PDFInfo
- Publication number
- RO112764B1 RO112764B1 RO95-00988A RO9500988A RO112764B1 RO 112764 B1 RO112764 B1 RO 112764B1 RO 9500988 A RO9500988 A RO 9500988A RO 112764 B1 RO112764 B1 RO 112764B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- oxalate
- enzyme
- oxalate decarboxylase
- gene
- plant
- Prior art date
Links
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 153
- 108010068005 Oxalate decarboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 56
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 12
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 82
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 55
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 14
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 240000006499 Flammulina velutipes Species 0.000 description 10
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- NEEQFPMRODQIKX-REOHCLBHSA-N N(3)-oxalyl-L-2,3-diaminopropionic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)C(O)=O NEEQFPMRODQIKX-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026190 Class E basic helix-loop-helix protein 41 Human genes 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 101000765033 Homo sapiens Class E basic helix-loop-helix protein 41 Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L calcium oxalate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C([O-])=O QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 description 2
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 description 2
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000219318 Amaranthus Species 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 101100326595 Arabidopsis thaliana CAD6 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101150017030 CAD3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102100035149 Cytosolic endo-beta-N-acetylglucosaminidase Human genes 0.000 description 1
- 241000235819 Cytospora Species 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710144190 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 235000016640 Flammulina velutipes Nutrition 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 208000008852 Hyperoxaluria Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000005783 Lathyrus sativus Species 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZWBCVBHKXHPCEI-BVSLBCMMSA-N Met-Phe-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N ZWBCVBHKXHPCEI-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 241000131430 Mycena Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 241000605937 Oxalobacter Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241000233639 Pythium Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 1
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 description 1
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 description 1
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187412 Streptomyces plicatus Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004460 Tanacetum coccineum Species 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N [2-methyl-4-oxo-3-[(2z)-penta-2,4-dienyl]cyclopent-2-en-1-yl] (1r,3r)-2,2-dimethyl-3-(2-methylprop-1-enyl)cyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OC1C(C)=C(C\C=C/C=C)C(=O)C1 ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 108010032737 oxalyl CoA decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229940015367 pyrethrum Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000018405 transmission of nerve impulse Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045269 tryptophyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
Prezenta invenție se referă la secvența de ADN ce codifică oxalat decarboxilaza, utilizată în protecția plantelor la atacul acidului oxalic.
Este cunoscut faptul că cea mai 5 mare parte a oxalatului de la animale, inclusiv oameni își are originea în oxalatul ingerat cu material vegetal. Unele legume cu frunze mari (de exemplu, Amaranthus, spanac, revent] sunt surse bogate de io vitamine și minerale, dar ele conțin acid oxalic ca factor nutrițional stresant. Astfel de plante, când sunt consumate în cantități mari devin toxice pentru oameni datorită chelatilor de oxalat de calciu și precipitării 15 oxalatului de calciu în rinichi ceea ce are ca urmare hiperoxalurie și distrugerea țesuturilor renale ( Decastro, J. Pharm. Biomed. Anal. 6:1 (1986);Hodgkinson, Clin. Chem. 16,547 (1970)].în afară de 20 acestea pot fi amintite cel puțin alte două situații când acidul oxalic este implicat în mod indirect. într-un caz producerea acidului oxalic este un mecanism important de atac utilizat de către Whetziinia 25 sclerotîorium, o ciupercă ce produce daune serioase culturilor cum ar fi floareasoarelui. Acidul oxalic se acumulează în țesuturile infectate în timpul patogenezei timpurii și concentrația sa crește în 30 perioada când patogenul colonizează țesuturile gazdă. Acumularea acidului oxalic în frunze producând simptome de vestejire și eventual moartea frunzei. Astfel, acidul oxalic funcționează ca o toxină mobilă ce 35 se deplasează de la baza sternurilor xilenului de legătură și frunze.(Maxwell, Physiol. Plant Pathol. 3:279 (1973]].
în alt caz, consumul de Latimus sat/vus (măzărichea puiului] produce 40 neurolatirism, care se caracterizează prin spasticitatea mușchilor picioarelor, paralizia membrelor inferioare, convulsii și moarte.
L. sativus este o legumă puternic bogată într-o proteină care crește în condiții 45 extreme, precum locuri expuse curenților de aer și suprafețelor mlăștinoase și nu necesită practici complexe de conducere, în diferite părți ale plantei este prezentă neurotoxina acid β-Ν-oxalil-L-a, β-diami- 50 nopropionic (ODAP], Sinteza ODAP este o reacție în două etape în care acidul oxalic este un substrat de start esențial. ODAP acționează ca un antagonist metabolic al acidului glutamic care este implicat în transmiterea impulsurilor nervoase în creier. Așadar, în ciuda conținutului sau bogat în proteine, leguma nu poate fi folosită ca sursă alimentară (Mickelson et al., (1973) în Modern Nutrition in Health and Disease: Dietotherapy (Goodhart, R.
S. and Shils, Μ. E., Eds] Sth Ed. pp.412433, Lea and Febiger, Philadelphia],
Un studiu al funcției acidului oxalic în sistemele menționate anterior evidențiază rolul său drept un factor de stres important. Este evidentă valoarea unei gene izolate care să codifice un produs proteic care să degradeze acidul oxalic. O astfel de genă poate fi folosită ca un instrument pentru degradarea acidului oxalic în plantele unde el se acumulează ca atare sau este un substrat în sinteza neurotoxinei sau este un mediu pentru patogeneză. Aceasta se poate obține numai prin efectuarea transferului genetic la aceste plante.
De un interes deosebit este sistemul enzimatic cunoscut, care degradează acidul oxalic, oxalat decarboxilaza de la ciuperca Bazidiomiceta Collubia velutipes datorită unei lucrări care folosește o enzimă parțial purificată arată o singură etapă pentru degradarea acidului oxalic la dioxid de carbon și acid formic, un acid organic lipsit de toxicitate în absența oricărui cofactor (Shimozono et al., J Biol. Chem. 227:151 (1957)].
Problema pe care o rezolvă invenția este secvența de ADN care codifică oxalat decarboxilaza utilizată în protejarea la atacul acidului oxalic.
Secvența de ADN, conform invenției, înlătură dezavantajele menționate prin aceea că, secvența ADN care codifică oxalat decarboxilaza, are secvența de nucleotide prezentată în fig.11, precum și variante ale acesteia obținute prin degenerarea codului genetic.
De asemenea,prezenta invenție asigură metode de utilizare a secvenței de codificare a pentru producerea plantelor transgenice care au un conținut scăzut
RO 112764 Bl de acid oxalic. într-o astfel de realizare, invenția de față, face posibilă ameliorarea condițiilor de stres generate de acidul oxalic în cazurile menționate mai sus. Ea face posibilă, de asemenea, dezvoltarea sistemelor de cercetare pentru urmărirea nivelurilor deoxalaților în urină si ser.
în prezenta invenție, se prezintă introducerea unei gene care exprimă oxalat decarboxilaza în plante (inclusiv plante cultivate cum ar fi: floarea-soarelui, soia, fasole în general, rapiță/lucernă, safflower, arahide și trifoi, legume cultivate cum ar fi : lăptuca, tomate, cucurbitacee, cartofi, morcovi, ridichi, mazăre, linte, conopidă si varză de brussel, flori precum petunia si pyrethrum și specii de pomi cum ar fi piersic), prin care se conferă la astfel de plante rezistență la boli, în special boli cauzate de fungi, în care acidul oxalic joacă rol principal, așa cum este cazul în bolile datorate genurilor de fungi Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillius, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillius, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia și Schizophyllum.
în linii mari, prezenta invenție, este orientată spre utilizarea unei enzime care degradează oxalat, așa cum s-a exemplificat prin oxalat decarboxilaza, pentru utilizări comerciale, cum ar fi industria berii, sau pentru utilizări agronomice, cum ar fi reducerea susceptibilității unei plante față de acidul oxalic sau pentru a reduce concentrația endogenă de acid oxalic dintro plantă. Enzimă oxalat decarboxilaza care degradează oxalatul poate fi folosită pentru reducerea mortalității plantelor sau distrugerii datorate bolilor sau altui fenomen în care acidul oxalic joacă un rol invaziv critic. Producerea oxalat decarboxilazei poate avea ca rezultat prevenirea mortalității plantelor și infecțiilor de la bolile în care acidul oxalic este critic. Asemenea boli sunt provocate, în special, printe altele, de genurile specifice de fungi, notate mai sus.
Aici este expusă invenția oxalat decarboxilazei substanțial purificate și caracterizate. Enzimă are un pH acid, este stabilă pe un domeniu larg de pH și este moderat termostabilă. Greutatea moleculară a enzimei pe SDS-PAGE este 64 kDa în stare glicozilată și 55 kDa în stare deglicozilată.
De asemenea, aici se expune invenția unei gene substanțial integrală și substanțial pură, care codifică enzimă oxalat decarboxilaza cu o secvență ADN specifică precum cea prezentată în secvența ID nr.1. Gena ce codifică enzimă care prezintă activitate oxalat decarboxilaza având o greutate moleculară (deglicozilată) de aproximativ 55 kDa, așa cum s-a determinat prin SDS-PAGE.
Invenția se referă, de asemenea, la compoziții pentru utilizarea pentru combaterea patogenezei plantei, compoziții care includ substanțe chimice ce prezintă activitate de degradare a acidului oxalic. în mod deosebit . activitate oxalat decarboxilazică. în mod specific, compusul are activitate oxalat decarboxilazică într-o cantitate suficientă pentru descompunerea acidului oxalic produs de patogeni. Se va aprecia că o altă utilizare agrochimică pentru un asemenea compus este aceea de a combina cu un purtător corespunzător, care este acceptabil agronomic, permițând eliberarea compusului direct către plantă sau către sol.
Aici, este descrisă, de asemenea, o celulă transformată de plantă, celulă care este transformată cu o genă care codifică oxalat decarboxilaza. Gena care codifică o astfel de enzimă poate include secvența ADN menționată, Secvența ID nr.1.
Este descrisă aici o metodă pentru asigurarea protecției împotriva acidului oxalic pentru o plantă care are nevoie de o asemenea protecție. Metoda include furnizarea la o plantă care are nevoie de o astfel de protecție, a unei enzime care degradează acidul oxalic într-o cantitate suficientă pentru efectuarea unei asemenea protecții. De preferință, se are în vedere că enzimă care degradează acidul oxalic este oxalat decarboxilaza codificată printr-o genă ce are secvență menționată în Secvența ID nr. 1. Metodologia pentru asigurarea unei asemenea protecții poate lua o multitudine de forme inclusiv transformarea unei plante cu o genă care codifică o enzimă ce degradează acidul oxalic și, în special, care codifică oxalat decarboxilaza. Alternativ, metoda poate
RO 112764 Bl include furnizarea unei enzime care degradează acidul oxalicîn combinațiie cu un purtător agronomic acceptabil pentru aplicare directă la o plantă sau la solul în care crește planta. s
Oxalat decarboxilaza purificată a acestei invenții, utilizează ca agent de luptă contra patogenezei și utilizarea sa în transformarea celulei de plantă asigură o metodă de combatere a bolilor plantelor, io fie în timpul prognozei, fie la stadiul de invazie. Această invenție aduce o speranță deosebită datorită faptului că principala calamitate a plantelor de importanță agricolă cultivate comercial, de exemplu, 15 plante de cultură cum ar fi floarea soarelui, este produsă de specii de fungi precum Sclerotima care secretă acid oxalic.
Dacă se va folosi o aplicare externă a enzimei pentru protejarea unei plante 20 sau părți a unei plante față de patogen, enzima se poate dilua pentru a forma o soluție sau suspensie lichidă, sau se poate amesteca cu un diluant solid pentru aplicarea ca pulbere. Natura precisă a 25 aplicării va depinde în parte de patogenul [ii] particular (i) și planta (1 e) avută în vedere. Metode detaliate pentru adaptarea metodelor generale de aplicare la plante cultivate specifice și patogeni specifici se 30 pot găsi în “ Metods for evaluating pesticides for controlof plant pathogens” K. D. Hickey, ed., The American Phytological Society, 1986. Adjuvanții care se pot adăuga formulării includ agenții auxiliari 35 de solubilizare, agenți de umectare și stabilizatori, sau agenți de producere a produselor microcapsulate. Astfel de adjuvanți sunt binecunoscuți în domeniu.
Aplicările externe pot să utilizeze, 40 de asemenea, microorganisme recombinate, fie într-o formă viabilă, fie după convertire, într-o forma neviabilă printr-o metodă care să nu inactiveze enzima.
Purificarea oxalat decarboxilazei de 4 5 la C. Velutipes ca și caracterizarea enzimei izolate se descriu în exemplele de mai jos. S-au separat două forme ale enzimei prin localizare cromatografică. Cele două izoenzime s-au arătat a fi înrudite prin 50 compoziția de aminoacizi, configurație peptidică și reactivitate imunologică.
Maximul A care s-a eluat la pH 3,3 s-a folosit pentru studii ulterioare; Km s-a găsit a fi de 4,5 mM și Vmax a fost 166 pmol/min/mg. Masa moleculară a subunității enzimei glicozilate este 64 kDa, în timp ce masa proteinei deglicozilate este 55 kDa. Enzima prezintă un pH acid, este foarte stabilă pe un domeniu larg de pH și este moderat termostabil.
Gena care codifică oxalat decarboxilaza derivată de la fung având secvența arătată în Secvența ID nr: 1, a fost donată așa cum s-a descris în exemplele care urmează. Pe scurt, cADN-ul care codifică enzima s-a obținut imunocreeting de la o bancă de expresie Zgtll. Translatarea în vitro a mARN-ului hibrid selectat a dat o proteină de 55kDa. Hibridizarea genomică Southern a arătat că oxalat decarboxilaza este codificată printr-o genă unică. Sonda cADN a hibridizat la o singură specie de mARN de 1,5 kb. S-a dovedit că mARN-ul este indus prin acid oxalic. S-a observat o relație temporală între activitatea enzimatică și nivelurile mARN, arătând că expresia oxalat decarboxilazei este reglată la nivel transcripțional.
Gena care are structura Secvenței nr.1, conținând secvența de codificare pentru enzima matură oxalat decarboxilaza se poate atașa la elemantele genetice reglatoare care sunt necesare pentru expresia unei gene structurale într-o celulă gazdă definită. Primul tip de element reglator necesar este o regiune promotoare de genă care conține secvențe ADN recunoscute de către dispozitivele biologice ale celulei plantei și care induce transcripția secvenței ADN într-un ARN mesager (mARN). Apoi se translatează ARN-ul întrun produs proteic codificat de către regiunea structurală a genei. Promotorul este atașat în fața sau la 5'-ul genei pentru oxalat decarboxilaza, ceea ce se poate realiza conform metodelor standard cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Horbor Laboratory, New York, pp. 104-106.
Regiunile promotor care se pot folosi pentru expresia genei oxalat decarboxilaza în celulele de plantă includ pro
RO 112764 Bl motori care sunt activi într-un domeniu larg al diferitelor țesuturi vegetale. De exemplu, promotorul 35S de la virusul mozaicului conopidei, poate fi adecvat acestui scop. Alt tip de promotor ce se poate folosi în celule de plantă este unul dintre cei care se exprimă în condiții mai restrictive. Incluși în această clasă sunt promotorii activi numai într-un anumit țesut sau anumite țesuturi ale plantei și/sau induși spre a io fi activi prin anumiți stimuli cum ar fi rănirea. Un exemplu de acest tip de promotor este regiunea 5' de la gena pentru gena fenilamoniac liază (PAL). Acest tip de promotor care este prezentat în 15 Liang et al., (1989), PNAS, USA, 86:9284-9288. Expresia genei oxalat decarboxilaza în gazde bacteriene poate fi obținută prin folosirea promotorilor obținuți din surse bacteriene. Exemplele 20 de asemenea promotori includ promotorul tip pentru expresie în bacterii precum E.Coli, așa cum s-a exemplificat în Amann et al., (1983). Gene 25:167-168, sau promotorul gliceraldehid fosfat 25 dexidrogenaza (GAPD) pentru expresie în drojdie, așa cum s-a exemplificat în Edens et al., (1984), Cell 37:629-633. Secvențele promotor de gene pot fi, de asemenea , derivate parțial sau în între- 30 gime de la secvența promotor găsite în celule, altfel, decât ale celulei gazdă, cu condiția ca ei să îndeplinească condițiile de mai sus pentru transcripție și translație.
Un al doilea element genetic 35 regulator care poate fi dorit, dar nu neapărat necesar, atașat la gena oxalat decarboxilaza, este o secvență terminator sau secvență de poliadenilare care promovează eficient terminarea trans- 40 cripției genei, și la eucariote promovează, de asemenea, poliadenilarea, adică adiția unui număr oarecare de adenozin nucleotide la capătul 3’ al mARN-ului. Pot fi folosite pentru a atașa regiunea 45 terminator în urma sau la 3'-ul genei metode standard cunoscute în domeniu. (Vezi, de exemplu, T. Maniatis et al., de mai sus pp. 104-106). O secvență de o astfel secvență terminator/poliadenilare 50 pentru expresie în plante este cel de la gena octopin sintaza de la un plasmid Ti de la Agrobacterium tumofaciens cum s-a enunțat în DeGreve etal., (1982). J. Mol. Appl. Genet. 1:499-511. Un exemplu de asemenea terminator pentru expresie în gazde bacteriene este secvență terminatoare de transcripție rho-independentă de la Salmonella typhimurium, vezi, de exemplu, E.E. Winkler, (1987), “Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Cellular & Molecular Biology”, F. C. Neidhardt, editor; American Society for Microbiology. Secvențele terminator de gene pot fi derivate , de asemenea, parțial sau în întregime, de la secvențe terminator găsite în cele ale celulei gazdă care au aceiași lungime și îndeplinesc criteriile de mai sus pentru terminarea transcripției și poliadenilării cerută de către celula gazdă.
Alt tip de element regulator care poate fi atașat la genă pentru oxalat decarboxilaza este o secvență ADN, care codifică un semnal peptidic. Semnalul peptidic se atașează la terminusul amino al proteinei și pernițe proteinei să se localizeze la peretele celular sau să fie secretat din celula gazdă. în timpul acestui proces de localizare, peptidă semnal este clivată producând un produs proteic cu secvența proteinei mature. Secvența ADN pentru semnalul peptidic se inserează între promotor și regiunea codificatoare. Se pot folosi pentru atașarea secvenței ADN pentru semnalul peptidic metode standard cunoscute în domeniu (vezi, de exemplu, Maniatis, T., et al., de mai sus, pp 104106). Exemple, de asemenea, secvențe semnal, includ semnalul peptidic de la o genă extensivă a plantelor (Chen & Verner, 1985, EMSO J.4 2145-2151] de la gena bacteriană pe1 B (pectatliaza) de la Erwinia carotovara((Lei etal., (1987), J. Bacteriol, 169:4379) și de la preprofactorul de drojdie (Smith et al., 1985, Science 229:1219-1229). Secvențele semnal protidic pot fi derivate, de asemenea, în întregime sau parțial de la secvențe semnal găsite în celulele diferite de cele ale celulei gazdă, care au aceleași lungimi și îndeplinesc condițiile de mai sus pentru prelucrarea și localizarea proteinei în celula gazdă.
RO 112764 Bl
Pentru inserția genei oxalat decarboxilaza poate fi folosită oricare dintre diferitele metode cunoscute pentru introducerea genelor străine în plante. Metodologia aleasă pentru realizarea trans- 5 formării plantei cu gena oxalat decarboxilaza este în funcție de planta gazdă. Ca exemplu, o metodologie bine caracterizată ce ar fi utilă pentru transformarea plantei cu gena oxalat decarboxilaza este io transformarea mediată de Agrobacterium.
Transformarea mediată de Agrobacterium folosind gena oxalat decarboxilaza urmează procedurile bine cunoscute pentru acesta metodologie. Inițial, se introduce 15 o casetă genetică adecvată pentru expresie în plantă se introduce o tulpină inofensivă de Agrobacterium tumefaciens ca gazdă intermediară. Caseta genei oxalat decarboxilaza se introduce în regiunea T-ADN 20 a unei plasmide recombinate care conține un marker genetic detectabil cum ar fi, o genă codificatoare pentru neomicin fosfatransferazall,fosfinotricinacetiltransferaza sau altele asemenea. Această metodologie 25 este menționată în numeroase publicații în literatură, inclusiv Horsch et al., (1985], Science 227:12x29-1231. Bucăți de țesut de plante, de exemplu, frunză, cotiledon sau hipocotil se coincubează cu bacterii 30 timp de 2-3 zile înainte de a se omorî bacteriile, folosind antibiotice precum carbenicilină. Suplimentar, se includ în mediul de cultură pentru țesuturile vegetale, antibiotice corespunzătoare marke- 35 rului genetic selectabil folosit, astfel, încât să crească celulele de plantă transformată.
S-au regenerat plantele de la celulele transformate și apoi s-au testat pentru prezența și expresia genei oxalat decar- 40 boxilaza. Pentru identificarea transformanților virali se pot folosi imunocercetări și teste pentru activitate oxalat decarboxilazică. De asemenea, ca un test funcțional al țesuturilor intacte se poate 45 folosi toleranta la acid oxalic exogen.
Așa cum s-a notat pentru transformarea plantei în afară de transformarea Agrobacterium sunt accesibile câteva alte metodologii. Exemple ale câtorva astfel de 50 metodologii de eliberare a ADN-ului includ electroporarea, adică eliberarea indusă chimic prin protoplaste microinjectare, balistică precum și altele. Un exemplu de tipuri de plante care nu sunt în mod special corespunzătoare transformării mediate de Agrobacterium sunt soia și anumite cereale, inclusiv porumbul. Aceste plante vor putea beneficia în întrgime de încercările de transformare a plantelor folosind alte metodologii decât transformarea mediată de Agrobacterium.
Avantajele prezentei invenții constă în utilizarea genei ce codifică oxalat decarboxilaza pentru transformarea plantelor pentru ca acestea să-si sintetizeze singure gena oxalat decarboxilaza sau prin aplicarea de exalat decarboxilaza ca pesticid, cel mai probabil, în combinație cu un purtător adecvat ce este acceptabil în agricultură. Un beneficiu important al utilizării ca pesticid este cel ecologic, aceasta fiind nepoluantă și nedăunătoare plantelor.
în continuare, se prezintă exemplele de realizare a inveției, în legătură cu fig.
1-12 care reprezintă:
- fig. 1, Profilul de eluție al oxalat decarboxilaza din coloana de cromatofocusare. Proteina de la etapa Acetonă-IV s-a încărcat într-o coloană DEAE-Sepharoză CL-68 (1x13 cm] echilibrată cu acetat de potasiu D,02M (pH 4,5], Proteinele legate s-au reluat cu un gradient de pH descrescător. Activitatea a fost asociată cu maximul de eluție A la pH 3,3 si maximul de eluție B la pH 2,5. Incluse, benzile proteice corespunzătoare celor două maxime. Maximele A (traseu A] și B (traseu B] s-au stabilit prin SDS-PAGE 11% și s-au colorat cu Coomassie Blue. Traseul S prezintă markerii moleculari de masă de la Sigma(SDS-7).
-fig. 2, Criterii de puritate. (A] S-au separat pe gradient SDS-14 7-15% de două ori diluții seriale (traseele 1 la 7 )de oxalat decarboxilaza începând cu 3pg proteină (traseul 1], (B) Sau separat prin focalizare izoelectrică 10pg de oxalat decarboxilaza (maxim A] (pH 2,5-5,0 amfoliții Pharmacia ] în dimensiunea inițială și prin SDS-PAGE 1 2% în cea de-a doua dimensiune. Traseul S arată standele de calibrare SDS-7 (Sigma) pentru estimarea
RO 112764 Bl greutății moleculare. în (A] și(B) gelurile s-au colorat cu Coomassie Blue.
-fig. 3, Corelarea activitate-bandă. S-au supus electroforezei 5OO ng proteină în două trasee de gel poliacrilamidic 6% nedenaturat: un traseu s-a colorat cu Coomassie Blue s-a decupat în 12 secțiuni de câte 4mm. Fâșiile de gel s-au incubat în 200pg de tampon acetat de potasiu 0,1 pH 4,5. Acrilamida s-a sfărâmat și s-a io umezit peste noapte la 4°C. Activitatea enzimatică s-a cercetat și s-a corelat la banda din traseu colorat. Distanța migrată (Fț de 0,35, fâșia de gel nr.4) de activitate enzimatică ( 0,2 unități] s-a corelat cu cea 15 a benzii unice colorate (500 ng). Nu s-a găsit nici o bandă proteică sau activitate enzimatică în nici o altă parte a gelului.
- fig. 4, Comparație a modelelor digestului Cleveland de la două forme de 20 oxalat decarboxilaza. S-au generat hărțile peptidice direct în gel pentru depozitare 4,5% al unui gel de separare 14%. S-au tăiat 10 pg din polipeptidele maximului A și maximului B din gelul SDS-poliacrilamidic 25 11%, si s-au digerat cu 100pg/ml protează V8 (S. Aureus, Sigma). Peptidele s-au elecropotat la o membrană nitrocelulozică și s-au imunodetectat cu diluție 1:5000, de anticorp anti-oxalat 30 decarboxilaza. Trasee: 1, maximul A al proteinei 1 și 2, maximul B al proteinei.
-fig. 5, Deglicozilarea oxalat decarboxilazei. S-a tratat 1pg din maximul enzimatic A cu 1 mU (traseu 3) și 10 mU 35 (traseu 4) de EndoH timp de 22 h și s-au separat în SDS-PAGE 11%. Traseele 1 și 2 conțin controale netratate pentru maximul A. Traseul S (dreapta) arată markeri de greutate moleculară (Phar- 40 macia) și traseul S (stânga) are greutatea moleculară cea mai ridicată, markerii precolorați (BRL).
- fig. 6, Imunotitrarea activității enzimei. Sau incubat 1,5 pg de enzimăîn 45 tampon acetat de potasiu 0,02M. pH 4,5 cu diferite volume de ser (1) la 25°C, timp de 2h. Imunocomplexele s-au scos prin centrifugare la 12000 xg timp de 10 min. și s-a determinat activitatea reziduală prin 50 test standard. Incubarea controlului s-a realizat cu ser preimun (Pi).
- fig. 7, (A) fuziunea proteinelor oxalat decarboxilaza-p-galactozidază. S-au lizat microplăcile induse IPTG în tampon Laemmli 1 % și s-au separat pe SDS-PAGE 10%, s-au transferat la nitroceluloză si s-au sondat cu anticorpii anti-oxalat decarboxilaza. Numerele traseelor de sus corespund la clonele numerele “C” este traseul de control cu macroplaca de la nonrecombinat. (B) Hibridizarea diferențială a ARN-urilor de la plăcile imunopozitive. Fagul ADN (500ng) izolat de la clone a fost legat la membrană Gene Screen Plus în duplicat și s-au hibridizat cu oxalat neindus (minus) și oxalat-indus sonde cADN( 2,5 x 108 cpm/pg cADN). “C”se referă la ADN nerecombinant λ gtll..
-fig. 8, (A) Translare in vitro. S-au imunoprecipitat și s-au separat prin SDSPAGE 10% produsele de translare ale ARN poli (A+) neinduse translatate total in vitro, 0-h (traseul 1) și stadiile induse oxalat [traseul 2), 12-h. Gelul s-a fluorografiat și autoradiografiat. Traseul 3 arată dispariția benzii de 55 kDa când oxalat decarboxilaza purificată a fost prezentată drept competitor pentru legare la anticorp în timpul imunoprecipitării. [B] Translarea hibrid-selectivă. ARN poli (A+) (20pg/ml) izolat de la C. velutipes s-a hibridizat cu plasmid ADN (1,2 kb insert cADN în pTZI8U]legat la membrană Gene Screen Plus. ARN-ul s-a eluat și s-a transplatat în lizat reticulocitar de iepure și produsele translatate s-au imunoprecipitat și s-au separat prin SDS-PAGE 10%. Traseul 1 nici un mARN; traseul 2, mARN hibrid selectat de la insertul 1,2 -kb: traseul 3 ARN poli(A+) total 12-h; și trăsei 4 secvențele vectorului nerecombinat. Este indicată masa molaculară a markerilor.
-fig 9, (A) Northern blot care arată mARN de 1,5 kb de la oxalat decarboxilaza de la C. velutipes. 1 pg ARN poli (A+J de la stadiile neinduse (h) și de la stadiile oxalat induse [1 2h] au fost glioxat denaturate și s-au separat pe gel de agaroză 1,2%, s-au pătat la membrană Gene Screen Plus și s-au sondat cu cADN marcat -(a32P) (9 x 107 cpm/pg) pentru oxalat decarboxilaza. S-a utilizat ca standard de mărime etalon de 1kb (BRL).
RO 112764 Bl (B) Southern blot al ADN genomic de la
C. velutipes. S-a digerat ADN genomic (4 pg], cu enzime de restricție s-a separat pe gel de agaroză 1,2%, pata s-a transferat la membrana Gene Screen Plus și 5 s-a hibridizat cu insertul cADN marcat (a32P). Ca standarde de mărime moleculară s-au utilizat digerate ÂHindlll/ECoRI și UCISHinfl.
-fig. 10, Reglarea expresiei genei io oxalat decarboxilazei. Se prezintă ARN-ul total (10 pg) izolat din cultură de C. velutipes în diferite momente după adăugarea acidului oxalic. (A) Gel agaroză 1,2% colorat cu bromură de etidiu arată 15 încărcări relative de ARN glioxal denaturat. (B) ARN-ul total transferat la Gene Screen Plus și hibridizat la insertul cADN 1,2 marcat -(a32P). Cantitatea relativă a ARN poli (+A) care codifică oxalat decarboxilaza 20 (O) de la ariile integrate ale traseului densiometric de la autoradiografia (El). Activitatea specifică a enzimei izolate din aceiași cultură este, de asemenea, prezentată[.J. 25
- fig. 11, Secvența nucleotidică a insertului cADN de 1420 bp în pOXD1.
- fiq. 12, Construcția plasmidului pSR21.
Exemplul 1. Purificarea și caracterizarea 30 oxalat decarboxilaza
Protocoalele experimentale: Organismul și condiții de creștere Se crește C. velutipes (tulpina S.
A.T.C.C. 13547]pe suprafața mediului care 35 conține dextroză 5%, peptonă 1 %, KH2P04 0,1%, MgS04 x 7H20 D,05% și extract de malț Difco 1% la pH 5,2. Organismul se crește de la inoculare de miceliu la 25°C, în culturi staționare într-un volum 40 de mediu reprezentând 1/5 din volumul baloanelor de cultură. După circa 25 zile de la inoculare se induce enzimă oxalat decarboxilaza prin adăugare de acid oxalic
12,5 mM la fiecare vas de cultură. Se 45 recoltează miceliul după 2-3 zile de la adăugarea acidului oxalic și miceliul se spală cu apă distilată rece și se depozitează la -20°C, C. velutipes se menține pe același mediu înclinat (Lakoby, 50 Methods in Enzymology 5:637 (1962)].
Purificare:
Etapa 7. Prepararea extractului brut Miceliul înghețat se macină într-un amestecător Waring timp de 10 min. cu gheață uscată sau azot lichid. Pudra se extrage cu 3 volume tampon citrat de potasiu 0,1 M, pH 3,0, timp de 10 min. la 4°C și suspensia se centrifughează la 10000 x g, timp de 30 min. la 4°C. Supernatantul se filtrează printr-un strat dublu de tifon.
Etapa 2. Precipitare cu acetonă
Se adaptează concetrațiile de acetonă după Shimozo și Hayaishi (J. Biol. Chem. 227:151 (1957)), exceptând faptul că ultimele două etape s-au realizat. Procentajele cuantificate sunt pe bază de vol/vol asumând volumele adiționale, [a] temperatura scăzută pentru precipitarea acetonică se menține la -10°C printr-o baie gheață-sare. Proba se răcește până la 0°C și prima precipitare acetonică la 33,3% se obține prin adăugare în picătură de acetonă răcită la supernatant cu agitare mecanică constantă (Acetonă I). Amestecul se echibrează timp de 15 min. și precipitatul format prin centrifugare într-o centrifugă prerăcită la 10000 x g, 20 min. la 2°C. Precipitatul obținut de la fracționarea 33,3%-50% în 1/5 din volumul de strat al tamponului acetat de potasiu 0,1M răcit și la pH 4,5 soluția enzimatică se dializează timp de 16h la 4°C contra de 2 ari schimbat tamponul acetat de potasiu 0,02 M, pH 4,5 și o mică cantitate de pecipitat format în timpul dializei se îndepărtează prin centrifugare (Acetona II). (b) Supernatantul se aduce la 40% acetonă (Acetonă III) și precipitatul se îndepărtează. Precipitatul de la adăugarea ulterioară până la 50% (acetonă] se dizolvă într-un volum de acetat de potasiu 0,02M, pH 4,5.
Etapa 3. Focalizarea cromatografică
Se echilibrează și se folosește pentru pregătire o coloană de 10 ml de DEAE-Sepharoză CE-68 (Pharmacia) (1 x 13cms] în tampon acetat de potasiu 0,02M pH 4,5. Precipitatul de la ultima precipitare acetonică se încarcă la o rată de curgere de 10 ml/h. Se spală coloana
RO 112764 Bl cu două volume de coloană de acetat de potasiu O,O2M pH 4,5 și se efectuează eluția prin dizolvarea unui volum intens de pH folosind un amestec de tamponare acid, 4 mM (4 mM fiecare acid aspartic -DL, ξ acid L-glutamic, și glicerină, pH 2,3). Eluția se efectuează la o rată de curgere de 10ml/h și se colectează 1D ml de fracțiune; se urmăresc proteinele prin adsorbție de 280 nm; se testează io fracțiunile pentru activitatea enzimatică si se determină pH-ul fiecărei fracțiuni. Fracțiunile conținând activitate enzimatică se colectează și se distilează contra apă si se concentrează într-un microcon- 15 centrator Amicon (30000 separate). Enzimă se depozitează la 4°C.
Controlul enzimei Activitatea oxalat decarboxilazică se determină, de asemenea, prin măsu- 20 rarea eliberării de 14C02 de acid oxalic (14C) (Amerscham 4,1 mCi/ml). Controlul enzimei se relizează in fiole mici de sticlă care au un conținut de 1 ml, din următorul amestec de reacție: citrat de potasiu 0,2 25 M, pH 3,0, oxalat de potasiu 0,005 M, pH 3,0, acid oxalic-(14C)5,6nM (0,0227 pCi) și o,2 ml de soluție de enzimă. Eprubetele se preincubează 5 min. înaintea adăugării enzimei. Eprubetele se sigilează 30 cu dopuri de cauciuc și se incubează la 37°C, timp de 30 min. într-o baie de apă agitată. Reacția se termină prin injectarea de 0,2 ml acid tricloracetic 50°v/v prin dopurile de cauciuc și eprubetele se agită 35 pentru un timp suplimentar pentru captarea în întregime a 14CD2 degajat în 0,3 ml hidroxid metilbenzentonil (Sigma) plasate într-un tub de plastic în interiorul eprubetei de sticlă. Tuburile de sticlă se 40 retrag și conținutul se transferă la 5 ml de toluen pe baza fluidului de scintilare și se determină radioactivitatea într-un contoar de scintilare în lichid. Se montează eprubete martor în care se adaugă 0,2 45 ml de TCA 50% înaintea enzimei s-au enzimă a fost omisă. Din cinetica experimentelor se corectează valorile pentru radioactivitatea obținută de la enzimă denaturată termic. 50
Definiția unei unități:
O unitate se definește ca fiind cantitatea de enzimă care eliberează 1 μΜ de 14C02 per minut la 37°C, în condiții standard de control. Totalul eficienței controlului a fost de obicei între 60 și 70%. Proteina se determină prin metoda Lowry (Peterson, Anal. Biochem. 83:346 (1977)). Vmax și Km se determină prin Lineweave-Burk plot (Leneweaver & Burk. J-Am.Chem.Soc. 56:658-666 (1934)].
Determinarea masei moleculare
Masa moleculară a oxalat decarboxilazei se determină prin cromatografie de filtrare pe gel. Enzimă purificată (100pg în 100pl) se încarcă pe o coloană FPLC în gel de permeație (Superoză 12:10 x 300 nm) la o rată de curgere de 0,5ml/minut folosind tampon de acetat de potasiu 0,02 M, KCI 0,1 M, pH 4,5 la temeratura camerei. Proteinele se detectează la 280 nm. Proteinele standard folosite sunt tiroglobulina (660 kDa, Pharmacia), feritina (440 kDa, Pharmacia), catalaza (8230 kDa, Pharmacia], aldoza (158 kDa Pharmacia), alcool dehidrogenaza (150 kDa, Sigma], și anhidraza carbonică (29 kDa, Sigma). Compoziția subunității se determină prin electroforeză în placa de gel dodecilsulfat de sodiu poliacrilamidic în gradiente de geluri 7%, folosind sistemul de tampon Laemmli] (Laemmli, Nature 227:680 (1970)].
Criterii de puritate
Omogenitatea oxalat decarboxilazei unificate se determină prin separarea a 10pg de proteină (maximul A) pe elecroforeză în gel bidimensională conform O’Farrell, J.Biol.Chem. 250:4007 (1975)].
Compoziția aminoacidică
Se hidrolizează probele în HCI 6M din eprubetele sigilate evacuate la 110°C, timp de 22 h. Hidrolizatele se analizează cu un analizor de aminoacizi (LKB 4151 Alpha Plus). Cisteina și cistina se determină cu acid cistic după oxidare cu acid performic. Triptofanul nu se determină. Digestia cu protează se va face cum s-a descris mai devreme (Cleveland, Methods in Enzymol, 96/222(1983)9.
RO 112764 Bl
Analiza carbohidraților
Colorarea glicoproteinei se face folosind reactivul propionat-baze Schiff. Conținutul de zahăr natural se determină prin metoda fenol-acid sulfuri (McKelvy et al.., Arch. Biochem. Biophys. 132:99 (1969)), cu glucoza drept standard. Enzima se deglicozilează prin Endo-β-,Νacetilglucozaminidaza H de la S. Plicatus, [Boehringer Mannehein, 40 mU/pg] conform lui Trimble (Trimble et al., Anal. Biochem. 141:515(1984)).
Prepararea antiserului □xalat decarboxilaza (1 mg/ml) se denaturează termic prin fierbere timp de 10 min. în PBS în prezență de SDS 0,5%. Antigenul proteic (150 pg) din PBS se emulsionează cu adjuvant Freund complet și se injectează subcutanat într-un iepure alb neozeelandez. După o perioadă de trei săptămâni se vor da următoarele susțineri în adjuvanți Freund incomplet. Se dă a 4-a injecție intravenos. Titrul anticorpului se urmărește folosind tehnica imunodifuziei Ouchterlony (Garvey et al., (1977) Metods in Immunol, 3rd Ed., W.A.Benjamin lnc.,N.Y.). Purificarea de afinitate a anticorpului se face conform lui Iwaki et al., Cell 57:71(1989).
Westhern blot-ul și imunodetecția
Proteinele se transferă la o membrană microcelulozică (Schleicher & Schuell) la un curent constant de 150 mA, timp de 3 h, la 15°C, conform procedurii lui Towbin et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350(1979)). Imunodetecția se face folosind diluție 1:5000 de anticorp anti-oxalat decarboxilaza și se detectează calea reacției fosfatazei alcalină (Amerscham, Su perecreen immunoscreeningg system).
Rezultate
Activitatea maximală a oxalat decar boxilazei se obține după 2 sau 3 zile de la adăugarea acidului oxalic. Rezultatele unei proceduri tipice de purificare sunt date în tabelului 1. Enzima se separă în două maxime pe o coloană de focalizare cromatografică: maximul A se eluează la pH 3,3, și maximul B se eluează la pH 2,5 (fig. 1). Maximul A se purifică de 1670 de ori cu o recuperare de 2,0%, în timp ce maximul B se coeluează cu 2 contaminanți minori și se purifică de 614 ori cu 15% recuperare (tabelul 1). Acești contaminanți se îndepărtează după trecere printr-o coloană de cromatografie cu gel de filtrare Sepharoză 48, și această proteină se folosește pentru determinarea compoziției de aminoacizi. Datorită purității ridicate a maximului A acesta proteină se folosește pentru lucrul în continuare. Materialul din maximul A se eluează ca un maxim unic pe o coloană de cromatografie a proteinei în lichid rapid Superoza 12, si 10pg de proteină se dau un singur spot pe electroforeza bidimensională în gel (fig. 2B). Cele două diluții seriale făcute de două ori arată că cel puțin 45mg de proteină se pot detecta prin colorare Coomassie Blue (fig. 2A). Distanța migrată a activității enzimatice (Rf=D,35, fâșia de gel 4) se corelează cu cea a singurei benzi colorate pe PAGE nedenaturat (fig.3). Nu se găsește nici o bandă proteică s-au activitate enzimatică în nici o altă parte a gelului. Astfel, banda proteică corespunzătoare maximului A are activitate oxalat decarboxilazică. Preparatele enzimatice sunt stabile la 4 sau -20°C, și mai mult de 70% din activitatea inițială poate fi măsurată după 4 luni de stocare la 4°C, la 1 mg/ml în acetat de potasiu 0.02M (pH 4,5).
RO 112764 Bl
Tabelul 7
Tabelul purificării de la un experiment tipic
| Etapa de purificare | Proteină totală | Activitate totală | Activitate specifică | Purificări X | Randament % |
| 1. Extract brut | 4480 | 950 | 0,21 | 1 | 100 |
| 2. Acetonă II | 120 | 608 | 5,06 | 24 | 64 |
| 3. Acetonă V | 3,8 | 260 | 68,8 | 328 | 27,3 |
| 4. Focalizare cromatografică a. Maxim A | 0,08 | 28 | 350 | 1670 | 2.9 |
| b. Maxim B | 1,24 | 160 | 129 | 614 | 16,8 |
* se utilizează 150 g de pudră măcinată în azotat lichid.
Datele compoziției aminoacizilor ale celor maxime indică prezența unui conținut foarte ridicat de aminoacizi acizi (22%) (tabelul 2). Aceasta ar putea contribui la valorile scăzute ale pH, deși proporția amidării în proteina nativă nu s-a determinat. Cele două maxime au compoziții aminoacide foarte asemănătoare unui conținut în metionină și tirozină de 2 ori mai ridicat în maximul B și a unui conținut în acid cisteic de 2 ori mai ridicat în maximul A. înrudiri suplimentare sunt indicate prin configurația peptidică a celor două maxime folosind proteaza V8 de Staphylococcus aureus (fig. 4). Anticorpii purificați prin afinitate direcționați împotriva maximului A reacționează încrucișat cu proteina maximului B. Compoziția de aminoacizi, hărțile peptidice și reactivitatea imunologică încrucișată arată că cele două maxime rezolvate pe cromatifocalizare sunt înrudite unul cu altul. Cele două forme cu diferențe în pH pot fi datorate gradelor diferite de amidare sau aminoacizilor acizi, sau pot fi datorate microheterogenității din catenele oligozaharidice constituiente.
Tabelul 2
Compoziția de aminoacizi
| Maxim A %3 | Maxim B % | |
| Asx | 10,57 | 10.31 |
| Glx | 11,75 | 1 1 .52 |
| Lys | 3,2 | 2.96 |
| Arg | 2,84 | 2,89 |
| His | 2,66 | 2,74 |
| Gly | 8,44 | 9,44 |
| Ser | 7,23 | 7,19 |
| Thr | 8,56 | 8,48 |
| Cysc | 0,66 | 0,28 |
| Tyr | 0,84 | 1,95 |
| Ala | 1 1,03 | 10,92 |
| Val | 6,31 | 6,52 |
| Leu | 7,79 | 7,19 |
| lle | 4,00 | 3,86 |
| Pro | 8,64 | 8,46 |
| Phe | 5,13 | 4,68 |
| Met | 0,34 | 0,69 |
| Trp | Ndb | ND |
| Amoniac | ND | ND |
a: moli % b: nu s-a determinat c: determinat ca acid cistic.
RO 112764 Bl
Masa moleculară a enzimei native estimată prin filtrare în gel a fost 560 kDa. Electroforeza pe gradient SDS-gel poliacrilamidic arată prezența unei singure polipeptide de 64kDa (fig.2A). Această mări- 5 me moleculară este obținută constant cu toate procentele diferite de gel folosite cu sistemul de tampon Laemmli. Când enzima se tratatează cu endo-p-N-acetilglucozaminidaza N, mărimea benzii principale degli- io cozilate este 55kDa (fig. 5). Enzima se găsește a fi glicozilată și mărimea moleculară aparent ridicată obținută prin filtrarea în gel poate datorătă tendinței anumitor glicoproteine de a interacționa 15 necovalentîn soluție (Farach-Carson et al., Biotechniques 7:482 (1989); Kleiman et al., Biochemistry 25:312 (1986)).
De la punctele Lineweaver-Burk se calculează un km aparent cu valoarea de 2C
4,5 mM pentru oxalat de potasiu ca substrat. Aceasta dă un Vmax de 166 pmoli/min/mg. Enzima este inhibată competitiv prin ioni fosfat și se obține un Ki de 9mM când se adăugă la reacție 90 2 5 mM P04 2'. Enzima este specifică pentru oxalat ca substrat deoarece acidul citric, acidul acetic, acidul oxalacetic, acidul succinic și acidul formic nu s-au folosit ca substrat. 30
Enzima nu este inactivată ireversibil pe un domeniu extins de valori ale pH-ului, pH-ul optim pentru decarboxilare fiind 3,0. Enzima și-a păstrat 78% din activitatea inițială după 20 de min. de incubare la 35 80°C. Inactivarea aproape totală se observă la 96°Cîn 10 min. de incubare. Activitatea enzimatică nu este afectată prin reactivi cu grupare sulfhidril, enzima menținând 95% din activitatea sa în 4o prezența a 50 mM acid />clormercurbenzensulfonic sau 50 mM iodacetat. Oxalat decarboxilaza și-a păstrat 45% din activitatea sa după incubare cu SOS 10% timp de 30 min. la temperatura camerei. 4 5 Totuși, când se încălzește la 60% în prezență de SDS 10% aproape întreaga sa activitate se pierde. Natura glicoproteinei este indicată prin colorație pozitivă cu reactivul periodat-bază Schiff; 5o el se leagă la concavaliva A-Sepharoza și se eluează cu α-metilmonozidă. Conținutul zahărului neutru se estimează a fi 15% prin metoda fenol/acid sulfuric.
Imunotitrarea enzimei cu 8 pl de antiser brut anti-oxalat decarboxilaza reduce la mai puțin de 60% din activitatea inițială în supernatant (fig. 6). Antiserul contra oxalat decarboxilaza folosit la o diluție 1:5000 poate detecta un minim de 1,0 ng a proteinei maximului A. Antiserul reacționează încrucușat cu toate peptidele obținute de la o digestie V8 proteazică [fig. 4] si cu formele deglicozilate ale maximelor A ale enzimelor. Antiserul purificat prin afinitate contra maximului A reacționează încrucișat cu maximul B al oxalat decarboxilazei și oxalilCoA decarboxilaza de la Oxalobacter form/genes tulpina OxB. Ea nu reacționează încrucișat cu oxalat decarboxilaza de la Hordeum vulgare (orz).
Exemplul 2 - Clonarea moleculară și expresia ADN-ului care codifică oxalat decarboxilaza
Protocol experimental
Clonare moleculară
Se extrage ADN-ul total de la pudra măcinată în azot lichid de C. velutipes conform metodei lui Chomzynski și Sacchi (Anal.Biochem. 162:156 [1987]) și se selectează ARN poli(A+] prin două cicluri de cromatografie pe celuloză oligo(dT). Sinteza cADN, clonarea și imunocreening-ul băncii se realizează urmând instrucțiunile de la Amerscham. Se sintetizează cADN-ul din mARN dintr-o cultură de 12 h indusă oxalat prin inițiere oligo(dt) a 5 pg de ARN poli (A+) și se donează într-un sit restricție EcoRI al lui Agtll. Fagii s-au crescut în gazda E. Coli Y1090 r pentru imunocreening.
Anticorpii antioxalat decarboxilaza se vor preadsorbi cu 1 mg/ml lizat celular E.Coli Y1090 pentru îndepărtarea ractivității și se va folosi pentru imunocreening. Pentru detectarea clonelor pozitive, se folosesc conjugat alcalin fosfatază IgG capră anti-iepure. ADN-ul se prepară de la fagii imunopozitivi conform lui Del Sal (Biotehniques 7:514 (1989)) și se determină mărimea insertului lor. Fuziunea proteinelor se caracterizează conform la ( Anal. Biochem. 156:354 [1986]]; înrudirea inserțiilor se studiază
RO 112764 Bl folosind ca sondă unul dintre inserți. Insertul 1,2 kb de la clona nr. se subclonează în pTZ18U (USB) și se folosește ca sondă pentru alte experimente. 5
Hibridizarea diferențială
Hibridizarea diferențială a clonelor imunopozitive se studiază prin prepararea de sonde cADN cu împletire simplă sintetizată de la mADN-ul izolat din miceliu io la O h și la 1 2 h de inducție prin oxalat. Fagul ADN recombinat (O,5pg) se leagă la membrană Gene Screen Plus în duplicat Hybrid-slot™ Filtration, în mod diversificat conform instrucțiunilor din manualul Gene 15 Screen Plus și se hibridizează la sonde cADN induse și neinduse oxalat. Activitatea specifică a sondei este 2 x 1Oacpm/pg cADN.
Hibridizare 2 o
Hibridizarea ADN-ului și ARN-ului se face la 42°C folosind procedura formamidă din manualul Gene Screen Plus. Se face peste noapte o prehibridizare în formamidă deionizată 50%, SDS 1%, 25 cloruă de sodiu 1M și dextran sulfat 10%. Petele se hibridizează la sonda denaturată (1-4 x 105 dpm/ml)la 42°C timp de 24 h. Membranele se spală succesiv în două spălări fiecare de 2 x SSC la temperatura 30 camerei 2 x SSC plus SDS 1% la 65°C timp de 30 min. și 0,1 x SSC la temperatura camerei timp de 30 min. Membranele umezite înfășutate în plastic sunt expuse la filme Kodac XAR în prezența 35 ecranului de intensificare.
Prepararea sondei
ADN-ul subclonat în pTZ18U se digeră cu ECoRI și se separă pe gel de agaroză cu punct de topire scăzut 2%, 40 insertul ADN s-a incizat și se marchează cu (a-32P) dATP prin metoda de marcare cu primer oarecare al lui Feinberg și Vogelstein (Anal. Biochem. 137:226 (1984)]. 4 5
Izolarea ADN-ului genomic și analiza Southern
Se izolează ADN genomic de la C. velutipes liofilizat prin metoda lui Zolan și Pukkila (Mol.Cell.Biol. 6:125 (1986)]. ADN- 50 ul se stratifică de 2 ori pe gradient CeCI pentru a obține ADN-ul care poate să fie digerat cu enzimă de restricție. Se digeră 4pg ADN genomic cu diferite endonucleaze de restricție și se separă pe gel de agaroză 1,2%. Se transferă ADN-ul la membrană Gene Screen Plus prin procedura de pătare alcalină (Reed S. Mann, Nucleic Acids R Resc 13:7207 )1985)).
Translatarea in vitro
ARN poli(A+) se translatează folosind un reticulocitar de iepure, conform instrucțiunilor fabricantului (Promega). Proteinele translatate se precipită prin antiseruri specifice și se analizează prin electroforeză SDS-gel poliacrilamidic.
Selecție hibridă
Selecția hibridă a mARN de oxalat decarboxilaza se realizează prin hibridizarea ARN poli(A-t-) (20 pg în 200 pl formamidă 65% Pipes 10 mM, pH 6,4, NaCI 0,4 M, EDTA 8 mM, SDS 0,5%, 100 pg/ml tARN de drojdie) la 50°C, timp de 4 h, la membrana Gene Screen Plus pe care s-a legat cADN denaturat (4pg). Filtrele se prepară conform manualului Gene Screen Plus ș-a hibridizare, spălare și eluția ARNului hibridizar se realizat conform (Jagus, Methods in Enzimol. 152:567 (1987); Parnes etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2263 (1981)). Se extrage ARN-ul eluat cu fenokcloroform (1:1), se precipită în etalon, se reconstituie direct in vitro amestecul translatat și se imunoprecipitează conform lui Anderson și Blobel (Methods in Enzimology 96:111(1983]).
Analiza Northerm blot
Se denaturează 1 pg ARN poli(A+] sau 10 pg ARN total cu glioxal și se separă pe geluri de agaroză 1,3% conform lui Sambrook (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) și se pătează prin capilaritate pe o membrană Gene Screen Plus după instrucțiunile din manualul Gene Screen Plus. Filtrele se sondează cu insertul cADN 1,2 kb 32P-marcat.
Rezultate
Așa cum s-a notat mai sus, se construiește o bancă de expresie cADN de la mARN indus oxalat la 12-h în λ gtll.
RO 112764 Bl
Se cercetează aproximativ 47000 recombinați cu anticorpul preparat cu lizat E. Coli. Se obține 1 5 plăci imunopozitive și se purifică, 12 dintre aceștia se hibridizează încrucișat. Aceștia codifică 5 fuziuni de proteine comparabile mărimilor insertului (fig.7A). Fagul ADN de la 15 clone se imobilizează în duplicat pe o membrană Gene Screen Plus și se sondează cu sonde cADN neinduse oxalat. i c Hibridizarea diferențială a celor 15 clone imunopozitive arată că 12 au hibridizat la sonda cARN și nu au dat nici un semnal cu oxalat minus mARN [fig.7B.]. Astfel, expresia a 12 clone se induce prin oxalat. is
Subclona pTZ1 8U a insertului 1,2 kb de la clona 3 a λ se folosește pentru a hibridiza selectiv mARN-ul. Translatarea in vitro a ARN-ului selectat hibrid și imunoprecipitarea produsului translatat 20 dă o bandă de 55 kDa (Fig. 8B, traseul
2) care este similară mărimii obținută cu mARN poli(A+] total (traseul 3) și corespunde mărimii proteinei deglicozilate. Această proteină de 55 kDa nu se obține 25 când este omis mARN-ul (fig. 8B] (traseul 1] sau cu secvențele vectorului nerecombinat (traseul 4] și nu cu mARN 0-h neindus (traseul 1), banda de 55 kDa se prezintă a fi înrudită cu oxalat 30 decarboxilaza ca oxalat decarboxilază purificată concurând pentru siturile de legare antigenice, și produce o descreștere în intensitatea benzii de 55 kDa (traseul
3) din translarea in vitro și experimentele 35 de imunoprecipitare. Petele Southern genomice care folosesc ca sondă insertul
1,2 kb arată prezența de benzi unice cu BamRI, Hindlll, Pvull, Sspl, Xbal și Xhol, indicând prezența unei singure copii a genei 40 (fig. 9B). Cele două benzi ale intensităților inegale obținute cu Kpnl și Pstl se datorează prezenței situsurilor interne (sit unic pentru fiecare enzimă] în insertul cADN de 1,2 kb pentru aceste enzime. Sonda 1,2 kb hibridizează la o singură specie de mARN de 1,5 kb de la ARN poli(A+) 12-h indus oxalat și nu hibridizează la ARN-ul de la traseul neindus (fig.9A).
Se colectează în aceeași serie de culturi probe de la stadii diferite după inducție și se analizează pentru nivelurile ARN, activitatea enzimatică și proteina totală. Northernblot-ul ARN-ului ARN-ului total arată că banda 1,5 kb este absentă la 0-h și se maximizează la 12-h. La trei zile după inducție nu se detectează nici un ARN [fig. 10B.) Activitatea enzimatică se detectează la 12-h după adăugare de oxalat și la meximul activității se observă în 2 zile după care există un declin constant. Nu se observă o creștere sau descreștere în proteina totală (fig. 10C). De aici, se observă o relație temporală între apariția activității enzimatice si nivelurile mARN, deoarece nivelurile mARN ating maximul la 12-h după inducție și activitatea enzimatică maximă se obține la 48 h după adăugarea acidului oxalic.
Toate referințele citate aici sunt încorporate prin referire.
Exemplul 3. Clonarea oxalat decarboxilazei
Pentru atașarea ADN-ului care codifică o peptidă de tranzit la gena oxalat decarboxilaza a p0XD1, se folosește PCR. Peptidă de tranzit aleasă este cea de la gena extinsă de la Nicotină plumbaginofilia. întreaga peptidă de tranzit plus doi aminoacizi ai proteinei extensină matură ce fuzionează în amonte ATG-ului decarboxilazei. 5-ui oligonucleotidei PCR a fost EXTOXD-5:
-G A AG ACG ATAGGATCCATTTGTTTCAA AG * ATG GGA AAA ATG BamHI *Met Gly Lys Met —ADN care nu codificăGCT TCT CTA TTT GCC ACA TTT TTA GTG GTT TTA GTG TCA
Ala Ser Leu Phe Ala The Phe Leu Val Val Leu Val Ser
CTT AGC TTA GCT /TCT GA A (ATG TCC AAC ACC TCC CA A)
Leu Ser Leu Ala Ser Glu (Met Phe Trp Trp Phe Gin] (-) Suprapunerea cu stratul genei oxalat decarboxilaza * Startul translațional la începutul peptidei de tranzit / Prelucrarea sitului în produsul de translație
RO 112764 Bl
3-ui nucleotidei PCR a fost EXTOXD3, desemnat împotriva secvenței la poziția 210-190 pe secvența p0XD1 originală (aval-ul sitului Kpnl):
-TGGGTCACTGGTCTCATT-3'
Folosind primerii de mai sus într-o reacție PCR cu plasmidul ADN p0XD1 ca matrice se obțin numai pete.
Pentru îmbogățire în vederea obținerii produselor de lungime integrală, acest produs primar se reamplifică folosind aceleași 3', dar un primer 5' nou, EXTOXR- [5 -GAAGACGATAGGATCCATTTG-3 )care reprezintă îndepărtarea secvenței 5' a lui EXTOXD-5 de mai sus.
Urmărind o a doua rundă a PCR, se vizualizează o bandă de mărime așteptată [aproximativ 290bp). Aceasta se purifică, se digeră cu BamHI-Kpnl și se donează în pOXD1 din care fragmentul rezident BamHI-Kpnl[125 bp], fusese îndepărtat. Se secvențializează un total de 17 clone care conțin fragmentul mai mare de-a lungul insertului .
Se confirmă o clonă care conține secvența corectă în insertul BamHI-Kpnl. Gena oxalat decarboxilaza/peptidă de tranzit se îndepărtează din această clonă ca un fragment BamHI-EcoRI, care s-a teșit cu Klenow și se inserează în situl Smal al lui pJRIRi.
Se identifică recombinați! prin hibridizare și sa confirmat/orientat cu digesturi de diagnostic [HinflII-EcoRI, Kpnl, Hindlll și Pstl). O clonă care conține caseta □X-D în aceiași orintare ca și caseta nptll s-a numit:caseta pSR21 = QX-D insertată în situl Smal.
Exemplul 4. Transformarea tutunului folosind vectorii descriși mai sus [a] Transferul vectorilor la Agrobacterium
Construcțiile se introduc în A. Temefaciens LBA4404 prin transformare directă urmând procedurile publicate.
Prezența și integritatea construcțiilor se verifică prin digestie de restricție și experimente blod pentru a verifica că nu se întâlnește nici o recombinare în timpul transferului vectorilor la Agrobacterium.
[b] Transferarea discului de frunză de tutun
Se transformă discuri de frunze de tutun [N. Tabacum, varietate Samsun] folosind proceduri bine stabilite publicate anterior. Plante conținând construcția se identifică prin PCR și se selectează pentru analiza ulterioară.
Exemplul 5. Determinarea activității oxalat decarboxilazice în plante transgenice
Activitatea enzimei se determină prin măsurarea celor două produse de degradare ale oxalat decarboxilazei [dioxid de carbon și format). Eliberarea de 14CC2 de la acid organic 14C se măsoară după cum urmează [Mehta și Datta, 1991). Se preincubează fiole de sticlă care conțin un amestec de reacție (vezi mai jos) timp de 5 min. înaintea adăugării de extras/enzimă. Fiolele se sigilează și se incubează la 37°C timp de 30 min. într-o baie cu apă agitată. Reacția se oprește prin injectarea a 0,2 ml de acid tricloacetic 50%(v/v) prin dop. Fiolele se agită în hidroxid de metilbenzentonil (0,2 ml) conținut într-o filă de plastic în interiorul unei eprubete de sticlă. Fiolele se golesc și conținutul se transferă la fluidul de scintilație și s-a determinat radioactivitatea printr-un contoar de scintilație în lichid.
Amestec de reacție Azotat de potasiu pH 3,0,2 M Oxalat de potasiu pH 3,0,005 M Acid oxalic-(14C) 5,6nM (0,0227 pCi) Producția de format se măsoară prin metoda lui Magro et al., (1988) adaptată pentru proprietățile biochimice diferite ale oxalat decarboxilazei izolate de la Collybia velutipes mai degrabă decât de la Sclerotinia. Se folosește o metodă în două etape. Inițial, se pregătește amestecuri de reacție conținând 20 pl de acid oxalic 40 pM (pH corectat cu hidroxid de potasiu la pH 3,5), o-fenilendiamină 15 mM și albumină serică bovină 0,1 mM într-un tampon citrat (0,2M). Se dăugă extractul/enzimă (volumul final 0,5 ml) și reacțiile se incubează la 25°C, timp de 20 min. Decarboxilarea se oprește prin adăugare de KaHP04 (pentru a da un pH final 7,5). Se adaugă și se amestecă o jumătate
RO 112764 Bl volum de sare nicotinamidă adeninucleotidlitiu [NAD] 45 mM. După trei minute se adăugă 15 pl de format dehidrogenaza (FDH, 80U/ml). Concentrația formatului produs se estimează apoi prin măsurarea 5 creșterii în absorbanță la 340nm a amestecurilor de reacție înainte și după 20 min. după adăugarea de FDH. Se realizează controale fără acid oxalic pentru fiecare extract și activitatea ulterioară se io calculează pe baza proteinei.
Exemplul G. Oligonucleotide pentru PCR și analiza southern
Pentru diagnosticele PCR în vederea confirnării prezenței genei oxalat decar- 15 boxilază în vlăstarii regenerați se alege oligoDECI de la secvența genei. în combinație cu oligonucleotida 35S (43] aceasta dă o bandă PCR de diagnostic de circa 289bp. Aceste oligonucleitide se 20 folosește pentru confirmarea stării transgenice vlăstarelor înrădăcinate. Pentru a genera o sondă oxalat decarboxilază 5'se folosește încă două secvențe oligonucleotidice DEC2 și DEC 3, un fragment de 25 aproximativ 450 bp pentru utilizare în analiza Southern a plantelor transgenice generate și a urmașilor lor.
Oligonucleotida DEC1-5'în secvența care codifică oxalat decarboxilaza pentru 30 utilizare cu promotor oligo în diagnostice PCR.
5-GAG AAG GAT GAC AGT GAG CAG ACG TTG-3'
Oligonucleotidele DEC2 și DEC3 - 35
Mid și 3' din regiunea care codifică oxalat decarboxilaza se folosește combinate pentru a genera sonde pentru analize Southern:
DEC2
-CCA TGA CGA CGG TAC ATT CTT GCT CAD3' DEC3
5'-TGA AGG AAC ATA AGC GAT ATC ACC ACD3'
Claims (3)
- Revendicări1. ADN, caracterizat prin aceea că, codifică oxalat decarboxilaza, care are secvența de nucleotide prezentată în fig. 11, precum și variante ale acesteia obținute prin degenerarea codului genetic.
- 2. ADN, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, se utilizeză pentru protecția plantelor la atacul acidului oxalic, prin aplicarea oxalat decarboxilazei în combinație cu un purtător adecvat, acceptat în agricultură.
- 3. ADN, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, se utilizează pentru protecția plantelor la atacul acidului oxalic, prin încoporarea în genomul plantei, prin transformare, a ADN-ului ce codifică oxalat decarboxilaza, precum și a regiunilor de inițiere și de terminare care reglează exprimarea acestuia, obținându-se astfel, o celulă de plantă transformată, precum și o plantă recombinată.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US98569592A | 1992-11-30 | 1992-11-30 | |
| PCT/GB1993/002462 WO1994012622A1 (en) | 1992-11-30 | 1993-11-30 | Oxalate decarboxylase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO112764B1 true RO112764B1 (ro) | 1997-12-30 |
Family
ID=25531712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO95-00988A RO112764B1 (ro) | 1992-11-30 | 1993-11-30 | Secventa adn ce codifica oxalat decarboxilaza |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5547870A (ro) |
| EP (1) | EP0673416A1 (ro) |
| JP (1) | JPH08503851A (ro) |
| AU (1) | AU677976B2 (ro) |
| BG (1) | BG62574B1 (ro) |
| BR (1) | BR9307548A (ro) |
| CA (1) | CA2149907A1 (ro) |
| HU (1) | HU219140B (ro) |
| RO (1) | RO112764B1 (ro) |
| UA (1) | UA34467C2 (ro) |
| WO (1) | WO1994012622A1 (ro) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5945273A (en) * | 1997-06-03 | 1999-08-31 | Human Genome Sciences, Inc. | Human oxalyl-coa decarboxylase |
| US5635616A (en) * | 1995-06-02 | 1997-06-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Human oxalyl-CoA decarboxylase |
| US8178090B2 (en) * | 1995-06-07 | 2012-05-15 | Danisco A/S | Recombinant hexose oxidase |
| US7745599B1 (en) * | 1995-06-07 | 2010-06-29 | Danisco A/S | Hexose oxidase-encoding DNAs and methods of use thereof |
| US6297425B1 (en) | 1997-03-21 | 2001-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Gene encoding oxalate decarboxylase from aspergillus phoenices |
| DE69841200D1 (de) * | 1997-05-23 | 2009-11-12 | Oxthera Inc | Oxalate-abbauende mikroorganismen oder oxalate-abbauende enzyme zur verhütung der oxalate-verwandten krankheiten |
| US6355242B1 (en) | 1997-05-23 | 2002-03-12 | Ixion Biotechnology, Inc. | Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease |
| US8486389B2 (en) * | 1997-05-23 | 2013-07-16 | Oxthera, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing oxalate-related disease |
| US20040120941A1 (en) * | 1997-05-23 | 2004-06-24 | Allison Milton J. | Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease |
| ZA986308B (en) * | 1997-07-18 | 1999-11-24 | Pioneer Hi Bred Int | The induction of stress-related factors in plants. |
| US6166291A (en) | 1997-07-18 | 2000-12-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Production of pathogen resistant plants |
| WO2005110469A2 (en) * | 2004-05-07 | 2005-11-24 | Oxthera, Inc. | Methods and compositions for reducing oxalate concentrations |
| SI1962873T1 (sl) * | 2005-12-14 | 2013-10-30 | Oxthera Intellectual Property Ab | Farmacevtski sestavki, ki vsebujejo bakterijo za zmanjšanje oksalata |
| DE602006020347D1 (de) | 2005-12-16 | 2011-04-07 | Oxthera Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur oxalatreduktion |
| JP5997610B2 (ja) * | 2009-11-25 | 2016-09-28 | キャプトザイム エルエルシー | シュウ酸塩に関連した症状を治療する方法及び組成物 |
| MX2012007681A (es) | 2009-12-31 | 2013-01-29 | Pioneer Hi Bred Int | Ingenieria de resistencia de plantas a enfermedades causadas por patogenos. |
| KR20180044225A (ko) | 2015-04-02 | 2018-05-02 | 캡토자임, 엘엘씨 | 불용성 및 가용성의 옥살레이트의 분해를 위한 고효율의 옥살레이트 분해 효소 |
| CN107868775A (zh) * | 2016-09-23 | 2018-04-03 | 武汉康复得生物科技股份有限公司 | 草酸脱羧酶的制备及其制品和应用 |
| US12359212B2 (en) | 2019-11-22 | 2025-07-15 | Mozza Foods, Inc. | Recombinant micelle and method of in vivo assembly |
| US11326176B2 (en) | 2019-11-22 | 2022-05-10 | Mozza Foods, Inc. | Recombinant micelle and method of in vivo assembly |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652452A (en) * | 1985-02-11 | 1987-03-24 | Calgene, Inc. | Oxalic acid removal in beer production |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| WO1988008450A1 (en) * | 1987-05-01 | 1988-11-03 | Birdwell Finlayson | Gene therapy for metabolite disorders |
| ATE105585T1 (de) * | 1987-12-21 | 1994-05-15 | Univ Toledo | Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium. |
| BR9205664A (pt) * | 1991-02-25 | 1994-06-07 | Ici Plc | CDNA derivado de RNA, DNA genômico, enzima que tem habilidade para degradar oxalato, oxidase de oxalato, processo para degradar ácido oxalico em uma planta, processo para reduçao de oxalato em um tecido de planta, célula de planta transformada, processo para combater patogênese de planta por infecçao com fungo que secreta ácido oxálico e planta |
| FR2673644A1 (fr) * | 1991-03-05 | 1992-09-11 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia. |
-
1993
- 1993-11-30 RO RO95-00988A patent/RO112764B1/ro unknown
- 1993-11-30 WO PCT/GB1993/002462 patent/WO1994012622A1/en not_active Ceased
- 1993-11-30 AU AU55711/94A patent/AU677976B2/en not_active Expired
- 1993-11-30 BR BR9307548A patent/BR9307548A/pt not_active IP Right Cessation
- 1993-11-30 JP JP6512936A patent/JPH08503851A/ja active Pending
- 1993-11-30 CA CA002149907A patent/CA2149907A1/en not_active Abandoned
- 1993-11-30 UA UA95058456A patent/UA34467C2/uk unknown
- 1993-11-30 HU HU9501503A patent/HU219140B/hu unknown
- 1993-11-30 EP EP94900946A patent/EP0673416A1/en not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-10-18 US US08/324,533 patent/US5547870A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-19 BG BG99731A patent/BG62574B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5547870A (en) | 1996-08-20 |
| CA2149907A1 (en) | 1994-06-09 |
| BG62574B1 (bg) | 2000-02-29 |
| BR9307548A (pt) | 1999-06-01 |
| HUT71786A (en) | 1996-02-28 |
| WO1994012622A1 (en) | 1994-06-09 |
| HU219140B (hu) | 2001-02-28 |
| AU5571194A (en) | 1994-06-22 |
| UA34467C2 (uk) | 2001-03-15 |
| EP0673416A1 (en) | 1995-09-27 |
| AU677976B2 (en) | 1997-05-15 |
| JPH08503851A (ja) | 1996-04-30 |
| HU9501503D0 (en) | 1995-07-28 |
| BG99731A (bg) | 1996-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RO112764B1 (ro) | Secventa adn ce codifica oxalat decarboxilaza | |
| FI112800B (fi) | Menetelmä oksalaatin pilkkomiskyvyn viemiseksi kasviin ja menetelmä kasvitaudin torjumiseksi | |
| Fakhoury et al. | Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus | |
| KR101957550B1 (ko) | 항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법 | |
| RO112642B1 (ro) | Constructie genetica ce determina sterilitate masculina la plante | |
| WO2020176224A1 (en) | Antimicrobial ncr2 peptides | |
| CZ209293A3 (en) | Gene of plant chitinase and use thereof | |
| WO1995021924A1 (en) | Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms | |
| US7745699B2 (en) | Weed controller metabolism proteins, genes thereof and use of the same | |
| HUT65677A (en) | Production of plants resistant to attacks of sclerotinia sclerotiorum | |
| ES2268902T3 (es) | Modificacion genetica especifica de la actividad de la trehalosa-6-fosfato sintasa y expresion en un entorno o heterologo. | |
| AU2002359021C1 (en) | A method for increasing resistance of monocot plants against abiotic stresses | |
| CZ289646B6 (cs) | Antimikrobiální proteiny, rekombinantní DNA, které je kódují, antimikrobiální prostředek, který je obsahuje, a způsob boje proti houbám či bakteriím | |
| WO2008030858A2 (en) | Use of esterase expressed in plants for the control of gram-negative bacteria | |
| JP2000175698A (ja) | ピラノースオキシダーゼを含有するピラノース測定用試薬 | |
| AU692228B2 (en) | Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms | |
| Hunter | Characterisation of ACC oxidase during leaf maturation and senescence in white clover (Trifolium repens L.): a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy at Massey University | |
| Tzeng et al. | Expression and Characterization of Rice Manganese Superoxide |