BG99731A

BG99731A - Оксалатдекарбоксилаза

Info

Publication number: BG99731A
Application number: BG99731A
Authority: BG
Inventors: Asis Datta; James Dunwell; Anuradha Mehta; K. Natarajan
Original assignee: Syngenta Limited
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 1996-02-28
Also published as: HUT71786A; JPH08503851A; EP0673416A1; WO1994012622A1; AU5571194A; AU677976B2; RO112764B1; UA34467C2; BG62574B1; US5547870A; HU219140B; HU9501503D0; CA2149907A1; BR9307548A

Abstract

Изобретението се отнася до ензим, който разграждаоксалова киселина, в частност - до ензима оксалатдекарбоксилаза и до ДНК последователност, която я кодира. Изобретението се отнася също до рекомбинантна молекула, съдържаща последователността, която кодира оксалатдекарбоксилазата, и до клетка гостоприемник, трансформирана с нея. Освен това изобретението се отнася още до метод за защита на растенияот увреждащите ефекти на оксаловата киселина и до метод за редуциране съдържанието на оксалова киселина в растения.

Description

ОКСАЛАТАЕКАРБОКСИЛАЗА □Власт на приложение

Настоящото изобретение се отнася най-общо за ензим, който разгражда оксалова киселина. В частност, изобретението се отнася за ензима оксалатдекарбоксилаза за

ДНКпоследователност, която я кодира. По-нататък изобретението се отнася за рекомбинантна молекула, съдържаща последователността, транс•орни рана с нея. В допълнение, изобретението се отнася за на оксалоеата киселина и за метод на редуциране съдържанието киселина в растение.

Предшествуващо състояние на техниката

Ловенето от оксалатите в животни, в това число и в хората, произлизат от оксалатите, приети с растителни храни. Някои листни зеленчуци (напр. Atnaran thus, спанак, ревен) са богати източници на витамини и минерали, но те съдържат оксалова киселина като хранителен стресов Фактор. Такива растения, консумирани в големи количества, стават токсични за хората, тъй като оксалатите хелатират калций, а преципитнрането на калциев оксалат в бъбрека води до хипрероксалурия и разрушаване на бъбречните тъкани (Decastro,

J. Pharm. Biomed. Anal

6:1 (19ΘΘ);

Hodkinson,

Clin

Chem. 16:547 (1970).

други

Отделно примера, от това могат да бъдат цитирани където оксаловата киселина

В единя случай , образуването киселина е важен атакуващ механизъм , използуван най-малко два въвлечена по на оксалова от Whetzi inia sclerotoriи<т гъба , която причинява сериозни вреди по култури като слънчогледа киселина се нат рупва ин*ектираните тъкани рано в патогенезата и концентраци ята нараства през времето, в което патогенът колонизира тъканите на гостоприемни., а

Натрупването на оксалова киселина в листата причинява симптоми на увяхване и евентуално листна смърт. По този начин оксаловата киселина функционира като пждвижен токсин, който се придвижва от основата на стъблата по кс илемни я сок към листата (Maxwell, Physiol. Plant Pathol. 3:279 (1973)) друг случай, консуми рането на

Lathyrus sat!Vos причинява невролатиризъм, който характеризира със спазъм на парализа на и смърт. L . saiivus е богато на белтък стидаустойчиво бобово растение, което вирее при екс т реми и услови я такива като вет рови тос т мочурливос т, обработка

Невротоксинът киселина (ОААП) присъствува

Синтезата иа киселина метаБоли тен ачаствува

Следователно, и не изисква сложна техническа (?- /Т-аксалил-И-а , 0-ди аминопропионова различни части на растението

ОДАП е двустъпкова реакция, в която оксаловата важен изходен суБс т рат

ОААП действува като антагонист на глнтаниновата киселина, която е предаването независимо от на нервни те

ИМПУЛСИ в мозъка неговото богато белтъчно съзържание, това бобово растение не може да се използува като хранителен източник (Mickelson et al, (1973) in

Modern Nutrition in Health and

Disease: Dietotherapy (Goodhart,

R.S. and Shil», М.Е., Eds)

5th

Ed. рр. 412-433, Lea and Febiger,

Philadelphia)

Изследване ♦ункцията на оксаловата киселина гореспоменатите системи хвърля светлина върху нейната роля на важен стресов жактор. Очевидна ценността на изолиран ген, кодиращ Белтъчен продукт, който разгражда оксалова киселина

Такъв ген би могъл да се използува като средство за разграждане на оксаловата киселина в растения, където тя се натрупва като такава или е субстрат в ситезата на нев ротоксин, или е среда за па тогенеза

Това Би могло да се постигне чрез преноса на единичен ген в тези растения

От и звес тни те ензимни с истеми , разграждащи оксалова киселина, окс алатдекарБок силазата от гъба velutipes от ос оБен интерес едно съобщението,че час т ично ензим е показал просто оксаловата киселина, в отсъствието на всякакво изискване за кояактор, до въглероден двуокис и мравчена киселина, нетоксична органична киселина (Shima2ono

Biol

СЬем

227:151 (1957) )

Настоящото изобретение осигурява пречистена оксалатдекарБоксилаза и АНК-последсвателност която я кодира

Изобретението също така осигурява методи за използуване на кодиращата последователност за получаване на т рансгенни растения с ниско съдържание на оксалова киселина. По този начин настоящото прави

ВЪЗМОЖНО облекчаването на с т ресови те условията, предизвикани от оксаловата киселина в случаи те, споменати по-горе

То съию така прави възможно разработването на системи за определяне нивото на оксалати в урината и серума.

ЗАДАЧИ И ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Предмет на изобретението е да пречисти напълно и да охарактеризира точно оксалатдекарбоксилаза.

Друг предмет на изобретението да изолира, характеризира и конструира ген, който може да се използува за експресията на оксалатдекарбоксилаза в микроби и рас тени я

По-натанъшен предмет на това изобретение е да се въведе ген, експресиращ полски култури, такива като слънчоглед, соя, бобови изобщо, рапи ца/каньола, люцерна, ша*раника, Фъстък и детелина, зеленчукови култури , такива като маруля , домат, тиквени растения, картоФ, морков , репичка, грах зеле , каржиол и брюкселско зеле цвет я , такива като петуни я и пиретрум и дървесни видове такива като праскова), при това придавайки на такива растения

УСТОЙЧИВОСТ към болести м по-специално към гъбни болести, в коит_О оксаловата киселина и-зае главна роля, каквито более т и т е, причинени от родовете гъби

Sc 1erotintia,

Paxil lus, Mycera, Leucostoma, Rhi zoc tomia к Sc nizophyiium.

Sc 1erotiит,

Aspergi11 us ,

St reptomyces,

Penicilium, Pythium,

Настоящото изобретение е широко насочено към използуването на ензим, разграждащ оксалати, какъвто е примерът с оксалатдекарбоксилазата, за търговски цели, като в пивоварнат а индустрия или за използуване в земеделието с цел да се редуцира чувствителността на растение към оксалова киселина или да се редуцира концентрацията на ендогенната оксалова киселина в растение. Оксалатразграждащият ензим оксалатдекарбоксилаза може да се използува, за да се редуцира растителната смъртност или увреждането от болести или друг Феномен, в който оксаловата киселина играе определяща инвазивна роля

Продукцията на оксалатдекарбоксилаза може да има за резултат предотвърт явянето на растителната смъртност и на инфекцията от болести, в които оксаловата киселина е определяща. Такива болести се причиняват заедно с други и от слеци*ичните родове гъби , отбелязани погоре

По-нататък представено изобретението на оксалатдекарбокслаза, основнво пречистена и охарактеризирана

Ензимът има кисело р!, стабилен е в широк pH-интервал и е умерено термостабилен

Молекулното тегло на ензима, определено чрез SDS-PAGE, кйа в гликозилирано състояние и 55 кДа в дегликози лирано състояние.

Представено е също така всичко съществено от изобретението (конструкцията) на основно пречистен ген, който кодира оксалатдекарбоксилазен ензим, със специфична ЙНКпоседоват елност , представена в SEQ ID Н?1. Генът кодира ензим,

който проявява оксалат	дек албок.с и лазна	активност	и е с молекулно
тегло (негликозилиран)	приблизително	55 к й а,	определено чрез
SDS-PAGE.
Изобретението	съшо така се	отнася	до препрати за
използуване в борбата	с растителните	более ти,	които препарати

включват химикали, проявяващи активност на разграждан· на оксалоеа киселина, в частност оксалатдекарбоксилазна активност. По-специално, съединението има оксалатдекарбоксилазна активност в количество, достатъчно да разпадне оксалова киселина, произведена от патогени. Ще бъде изтъкнато, че друго приложени· на подобен препарат в селското стопанство е комбинирането ми с подходящ носител, който е приемлив в земеделието и позволява

Описана е също така трансформирана растителна клетка, която е трансформирана с ген, кодиращ оксалатдекарбоксилаза.

Генът , кодиращ този ензим, може да включва

ДНКпоследователността, представена в SEQ ID Н? 1

Описан е метод за осигуряване защита на растение с рущу оксалова киселина при нужда от такава защита

Методът включва обезпечаване на растението, при нужда от такава защита с ензим, който разгражда оксалова киселина в количество достатъчно да осигури подобна защита. Предпочитателно ензимът, който разгражда оксалоаа киселина, е оксалатдекарбоксилаза, която се кодира от ген с последователността, представена в SEQ ID W1. Методологията за осигуряване на такава защита може да приеме множество Форми, които включват трансформацията на растение с ген, който кодира ензим, разграждащ оксалова киселина и в частност кодираш оксалатдекарбоксилаза. Като алтернатива, методът може да включва обезпечаване на ензим, ком5инация с носи тел, приложим в земеделието, за директно

Други предмети и предимства на настоящото изобретение ше с т ана т ясни от описанието на изобретението, което с ледва.

ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГВРИ

Фиг. 1 — Профил на елимране на оксалатдекарбоксилаза от хроматоФокус*раща колона. Белтъкът от стъпката Ацетон-IV беше нанесен върху колона DEAE-Sepharose CL-6B (lx 13 cm), уравновесена с 0.02 М калиев ацетат (pH 4,5). Свързаните белтъци бяха елуирани с падаш градиент на pH. Активността беше свързана с пик А, елуираш се при pH 3,3 и с пик В, елуиращ се при pH 2,5. Вдясно е представен гел с белтъчни ивици, отговарящи на двата пика. Пикове А (пътека А) и В (пътека В) бяха разделени чрез 117. SDS-PAGE и оцветени с Кумаси-блу. Пътека S показва маркери за молекулна маса на Sigma (SDS-7).

Фиг. 2 — Критерии за чистота. (А) Двукратни сериини разреждания (пътеки 1 до 7) на оксалатдекарбоксилаза, като се беше разделена чрез изоелектрично Фокусиране (pH 2,5-5,0, амФОлити, Phamacia) в първо направление и чрез 127. SDS-PAGE във второто направление. Пътека S показва калибриращи стандарти за оценка на молекулното тегло SDS-7 (Sigma).

В (А) и (В) теловете бяха оцветени с Кумаси-блу.

Фиг. 3 -- Корелация активност-ивица. Беше проведена електрофореза на 500 нг белтък в две пътеки на 67. неденатвриращ полиакриламиден гел; едната пътека беше оцветена с Кумаси—блу, а другата беше разрязана на дванадесе- 4-милиметрови отрязъка.

Гелните късчета бяха инкубирани в 200 мкл 0,1 М калиево—ацетатен буФер, pH 4,5. Акриламидът беше стрит и накиснат през ноща на 4 °C. Ензимната активност беше определена и съотнесена с ивицата в оцветената пътека. Растоянието на придвижване (R.

0,35, гелио късче Н-4 ) на ензимната активност (0.2 единици корелира с тази на единичната оцветена ивица (500 нг).

Фиг .

Сравняване прояилите на разграждане по

Cleveland на двете яорми оксалатдекарбоксилаза.

Пептидните карти бяха направени директно в 4.57. стекинг гел и 157. разделяш гел.

мкг полипептиди от пик А и пик В бяха изрязани от 117. SDS полиакриламиден гел и разградени със 100 мкг/мл Μβ-протеаза ( S.

aureus, Sigma). Пептидите бяха пренесени чрез електроблотинг върха нитроцелулозна мембрана и идентифицирани имунологично чрез антитяло срущу оксалатдекарбоксилазата, разре^дено

Пътеки:

1, белтък от пик А и 2, белтък от пик В

Фиг. 5 — Дегликозилиране на оксалатдекарбоксилаза. 1 мкг от ензима на пик А беше третиран с 1 мЕ (пътека 3) и 10 мЕ (пътека 4) Endo Н за 22 часа и разделен в 117. SDS-PAGE. Пътеки 1 и 2 съдържат нетретирани контроли за пик А. Пътека S (вдясно) показва маркерите за молекулно тегло на Pharmacia, на пътеката S (вляво) са цветните маркери за високо молекулно тегло (BRL) .

Имунологично титруване на ензимната ак тивност

1,5 мкг ензим в 0.02

М калиево-ацечатен бу»ер, pH

4.5, бяха инкубирани с различни на 25 °C за

Иманокомплекси те бяха утаени на 12

000 хд за мин и ос татъчната активност определена чрез стандартен тест

Беше проведено контролно инкубиране с преимунен серум (Р1).

Фиг. 7 -- Слети белтъци - оксалатдекарбоксилаза-^агалактозидаза. Макроплаки, инднцирани с IPTG, бяха лизирани в 17. бу»ер на Lae^mli и разделени на 107, SDS-PAGE, пренесени върху нитроцелулоза и сондирани с антиоксалатдекарбоксилазни антитела. Циарите над пътеките отговарят на номерата на клоновете, С е контролната пътека с иакроплака от нерекомбинант [???]. (В) йиъеренциална хибридизация на РНК ст имунопозитивни плаки. Фагова ДНК (500 нг), изолирана от клоновете, беше свързана за Gene Screen Ρ1 us-мембрани в две повторения и хибридизирана с оксалат-неиндуцирана (минус) и оксалат-индуцирана (плюс) кДНКсонди (2,5x10® cpm/мкг кДНК). С' отговаря на контролна нерекомбинантна ламбда gtll-ДНК.

Фиг (А)

In virta транслация продукти от in ν-ϊ tro-Ί ранс ли рана тотална поли (А+)-РНК от неиндуцирани,

0-h (пътека 1) и 12-h оксалат-индуцирани (пътека ) е т ап и беше инунопреципити рана и разселена чрез 107 SDS-PAGt.

ι елът оеше

-ррогра»иран и автогадис~ра»иран . Ивица о показва изчезването на 55-кДа-овата ивица в присъствие на пречистена оксалатдекарбоксилаза като конкурент за свързване с ант и тела⁷а повреме на имунопреципитацията (Bi Транслация на матрица, о т д е лена зез хибридизация

Поли (А+ i Рпк (20 мкг/ил) , и золи рана от 12-h veJutlpes, беше к,н кДНК

Screen F7jbре тик заззделени чрез 107

SDS-PAGE

ИНСВрТв» П Ь ’ g » а нерекомбииантна векторна последователност. Отбелязани са маркерите за молекулна маса.

Фиг. 9 -- (А) РНК-бло^т . показваш 1,5 кн мРНК за оксалатдекарбоксилаза на С. verutlpes. 1 мкг поли(А+)РНИ от

неинднци рани	(Oh)	и	оксалат-индуцирани (12h)	етапи	бяха
денату ри ра«и	с глиоксал	и разделени на 1,27.	агарозен	гел,
п рех в ъ рлечи	върху	Gene	Screen Plus-мембрана и	сондирани с

( d.'p-pp )-бе* язана кДНК (9x10^ срт/м»-) за оксалатдекарбоксилаза. 1 кн-стълбица ( BRL ) Беше използувана като стандарт за молекулна маса. (В) ДНК-блот на геномна ДНК от С. velutipes. Геномна ДНК

(4 мкг)	беше	радградена с	рее трик.тазни	ензими, разделена на 1,27.
агарозен	гел	, прехвърлена	ч рез	Б л о т	върху Gene Screen Plus-
мембрана	и	хибридизи рана	с	и-серт	, (<я--²Р )-белязан инсерт .

Хидролизите ламбда Hindi. I I / EcoRi и pUC 19 Hinfi бяха използувани като стандарти за молекулна големи-а.

Регулация на с ала т а генна експресия. Показана е тотална РНК .

мкг), изолирана от ку*-ури на Е velutipez в разлино време с лед добавянето на оксалова к иселина.

(А) 1,27.

агарозен гел, осветен с етидиев бромид, който пок азва относителните колинес^теа ( В) ’от а лн а _;S И хибриди;

н-5елязан

1.2-»ерт, > С ) ОткосиГ '1 онределе-з пр интегрираните ^_-с-и.и на дене и томет ри pa-а* а авторад»с*рама 'В). Показана е съиз и специфичната активно;· -а ензима, и зол и оан от същата калтуса.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Прелистената оксалатдекарбоксилаза на това изобретение, нейното използуване като агент за атака на патогенезата и нейното използуване в растителната клетъчна транс*ормация, осигурява метод за контрол над растителните болест и, в който оксаловата киселина играе определяща роля по време патогенеза’а или по време на инвазивния стадии. Това изобретение има специално предимство, тъй като в култивирането на растения, важни за селското стопанство, голям бич представляват видовете гъби, като Sc 1erotinia, който секретират оксалова киселина.

Предимствата на това изобретение могат да бъдат на оксалатдекарбокс и л азат а като традиционен пес тицид, найвероятно в комбинация с подходящ носи тел който е приимлив за з егчедел иетс· една от избоди при оксалатдеказбзйсилаза като пес тицид е, -е тя е е * незапърс яваша и не вреди на рас тенметс.

Ако трябва да се използува външно приложение на ензима за защита -а растение или на част ст растение срущн за да образува воден разтвор и*и суспе-сия и - и да се раз ред * т е· да се на приложение до расте-и е е ме т оо и ие па*оген и бъз f Or control * piant оде-в

Hie

Phy t оса tnc· logic al Society

1*66

Бъдат и ; = е е н и в ре-зей т ат _а , в к л.ю у в а т аген т и, улес-яваси разтворимостта, овлажнители и стабилизатори, или агенти, които образуват микрокапсвлиран продук т

Такива добавки са добре известни в

За външно приложение могат да се използуват още рекомбинантни микроорганизми живо състояние или след превръщането им в нежива *орма чрез метод , който не инакт ивира ензима

Прение

С.

velutiрев, както и характеризирането на изолирания ензим са описани в

Примери те ♦орми на ензима

За двата изоензима Беше показано, че са родс твени по аминокиселинен състав, пептидно картиране и кръст ос ана □реактивност. Пик А, елуиращ се при pH

3,3, Беше използуван за по-нататъшни изследвания; беше намерено

Беше 166 мкмол/мин/мг. Молекулната маса на снБединииата на гликоз и лирания ензим е 64 кАа, докато масата на значи телно стабилен е е 55 кДа. Ензимът показва ки село рI .

в ши рок рн-интервал и е умерено произход и с последователност , показана на SEQ ID Ю, беше клониран, както

& ОП х	само е		нте , >	'сито с	аедва!.	a U р а И о	, к А Η К, кодираща
еноипа	, беше	ПО А	ум е*~ а	- ре з	И	» Р Й н И Н Г	на експ реейонна
б V* 5 И О	' е и а е	й — 0 р	а — q 1.11	. т_Санс	*· a и н я а	~ ^itro	на мРнК, отделена
- ре-з	У и 5 р и д * 3	а щ м я ж	даде 5 5 - и С а	белтък		ДНК-хиЕ ридизаиия

показ а	, н Е- С ♦.	с аламдек арбе» с и <	аз ат а	с е	кодира от	еди н	ичен ген,
кДНК-с	ондата	кибридизираше с	eg и н	еди	нервен вид	мРНК	с дължина
1,5 к	и ^лоб аз н·	Беше показано,	а е	мРНк	се и н д н и и	ра от	о· са лее а

киселина. Беше наблюдавана зависимост във време^то межди ензимн ата аи'и = нС'С^т и нивото което показва. ~е експреси ята на окс &гатдек арбокси лазата се регулира на транскрипцяонно ниво

Генът с първиу-а^а структура, посочена на SEQ 1D №1 , която съдържа поеледов ат елносτ т а на зрелия оксалатдекарбоксилазен енз им, може да се прикани към генни регулаторни елемент и , които са необходими за експресията на с т ра к 7 н рн и я ген е опре;е<.ена клет ка-гос топри емни й

Първият тип регулаторен е ленен т, и Сй Τ О се изисква, е об.-аст на генен промотор, който съдържа ДНК-последователности разпознаваши се от биологичната машинари я на растителната клетка, и който индицира транскрипцията йНК-последователността в матрична РНК (мРНК). мРНК след това се т ранели ра в Белтъчен продукт, който се кодира от облает та на ген. Промоторъ' е прикачва ♦ронтално на, или 5' ъ~|, гена за оксалатдекарбо*силаза, което може да се извърши съгласно извее тни стандартни методи. Виж, an ри мер,

Naniatis et al, ί

1982) Molecular

С1 оп , Cold Spring

Промоторни обла:’и експрес и я вк^ю^ват промстори, кои * о т е .а н и а ο < ν* ρ λ. a ?·' о w. е

ϊ. О И •т Q.

мс *е експреси

Γ·

- £~ на растени е’е с-еделен и

5'-ре-_г които могат активни в ши

ЕС

И 3 п сда се в рас т и използуват за елни к лет ки , рок набс ромоторът от

С⁵· ei )ΟΓ d a >· ^т и е за тази в рас т имени нс

и.

ΙΑ -τ Κ ρ И ,Α . Β τ k Η

П ри тип промотор за тоз и .л а с

ТИП е t al., (1989 )

USA ,

Аресия^а н.а оксалатдекарбоксилазния ген в микробни госотоприемници може да се постигне чрез използуване на промотор* , получени от микробни източници. Принери за такива промоторм включват trp-промоторът за експресия е бактерии, такива като Е. coli, какъвто пример е даден в Amann et al, (1983) Gene 25:167-176), или промоторът на глицералдехид«ос*атде х ид рогеназат а за експреси я дрожди , какъвто пример е даден в Edens et al, (19Θ4), Cell 37:629-633

Пое ледовет елнос т и те на гениите промотори могат също така да бъдат получен и час тично или

И 3 цяло от промоторни последователности, открити клетки, различни от клеткатагостоприемник, доколкото те отговарят но горепосочените критерии за транскрипция и транслация

Втори генетичен регулаторен еле—ен който по желание, без това да необходимо, може да бъде прикачен към оксалатдекарбоксилазния ген, е терминатор или последователност за поли адени ли ране, която за ежективно завършване на транскрипцията на по ли аденили ране

е., добавянето на известен брой аденозинови наклеотиди към З-края на мРНК. Познатати стандартни методи могат да се използуват, за да се прикачи терминатора зад, или 3 към, гена (Биж, например, рр.104106 ) ^т е ом и н ас и я /по·* и адени ли ране за експресии в растения е тази на t'j/ne/accens «акто се съобщава

Т1-плазм.2а в DeGreve et нс-аСас te’duT·

1:499-511 аз morej j а wink. 1 е г (1987 ) , sc herιспi_а coll and salmonella t ν'ρh i mur lum :

hieidha^rot , ed in chief;

American

Society for

Microbiology

Г енн и последователиос ти за терминация могат също така да се получат частично или изцяло от терминаторни последователности, намерени в клетки, различни от тези на клетката-гостоприемник, доколкото отговарят на горепосочените критерии за терминация на транскрипцията полиаденилиране, изисквани от клетката гос топриемни к

A per т който меже да се прикачи към гена за оксалатдекарбоксилаза, е ДНК-последователност, кодираща сигнален пептид

Сигнални я т пептид се прикачва към амино-к рая на белтъка и позволява белтъкът да се локализира в клетъчнат а стена или да се секретира от клет кат а-гос топриемник

По време на този процес на локализаци я сигналният пептид се отс т ран ява при к ое τ о се получ ава белтъчен продукт последователност т а на з рели я белтък

Могат да се използуват известни рутинни методи , за да се прикачи ДНК-последователността на сигнални я пептид. (

Ви» например, Т

Maniatis et al . , noгоре, рр.104-106) включват сигналния ne- т и д and Varner. 1985,

ЕМВ2 J на

Erwinia carotovora (Lei et al, (1987), J.

Bacterid . 169 :

ч 379 ) и з т

1985, Science

9-1р29 ) пептиди могат почвчат ли изцяло

СТ пое лед os а* е '.нос т и н амерен и в и *е~> и .· ет кат а-н

OT-_OBSp«-f на и те кри за зреене и локали, за_и я на бел. тъка е к-ет кат а-гос or ри емн и >

Всеки един за тичните ме^тоди. извес-ни за въвеждане н а чьж.ди гени в расте-ия, с е оксалатдек арбокс илазни я ген оксалатдек арбокси лазни я растението-гос топриемник растението-гос топриемник васира зависимост о^т

Например, методология, която би била от полза т рансФОрмаци я посредс твсг

Agrobacterium.

ген пое редс т во~

Agrobacterium, следва добре известните за тази методолог и я процедури

Първо, генна касета, подходяща за експресия в растения се въвежда в обезвреден щам

Agrobacterium tumefaciens като междинен гос т опри еемн и к.

Касетата рекомбинанте- плазмид, съдържащ маркерен ген за селекция, такъв като коди ращ неоми цинФОСФОтрансФераза или позобни. Тази методология е използувана в редица публикации , вклк—ващи Honsch et al , (19Θ5

Sc ience рас т и * е -.н а т ъ к ан листа, семедел, бактерии е са се убият чрез използуване на антибиотици, такива като карбе·

Допълнителни антибиотици, отговарящи за селения, се за к у л т и в и рас тат са-с това цает регенерирани от -т ранс«ормирани ^те с ле нали^ииет й н о индивидузл-и

Т санСФОР^-а- ’ W — ОП ат е

и зпел з уе ат методи и т ес ? ове а

а^лв’декаобскси ла з н а а * ” И Ен ОС Т ,

Кето *чнкциона * е17 тест за интактни тъкани може съшо така да се използува толерантността към екзогенна оксалова киселина.

Както бе отбелязано, отделно от трансформацията посредством Hgrobacterium, са на разположение и няколко дручги методологии за растителна транСФорпаци». Примери за тези драги ДНК-въвеждащи методи включват електропорация, т.е., въвеждане в прот оплас т и, индуциранр по химичен път, микроинжектиране, микробомБардиране и др^ги

Пример за рас тени я , кои то не са подходящи за трансформация посредством

Agrobacterium, са соя и някои хлебни растения, включително царевицата

Тези растени я биха могли да използуват напълно възможностите за рас т и т елна трансформаци ч рез използуване на методи, различни от т рансФорпаци пое редс твом

Agrobacter-.-^т

Определени аспекти на настоящото изобретение ще бъдат описани в по-големи детайли в Примерите, които следват

ПРИМЕРНИ ИЗПЪЛНЕНИЯ

Пример 1

ПРЕЧИСТВАНЕ И ХАРАКТЕРИЗИРАНЕ НА ОКСАЛАТЙЕКАРБОКСИЛАЗА

Експериментални ^протоколм-^п^т^анизъм и н-ж.оеия на растеж:

С. velutipes 'щам S. А.Т.С.С. 13547) беше култивирана върху повърхността на среда, съдържаше 5’·. декстреза. 14 пептон, 0,14 КН₂Р0«, 0,054 Мд50л.7Н₂0) и 14 а-г-екстракт на Di^co г-ри pH 5,2. Орга-изпът беше култивиран от изцелен инокулат при 25^1>С стационарни к^ллари с обем на cpeca’a една пе^та от обема и,а чрез добавяне на 12,5 тМ

1Θ матраци за култивиране. Около 25 дни оксалатдекарбоксилаза беше индициран оксалова киселина кът всеки килтурален матрак

Мицелът беше събиран до 3 дни след добавянето на оксалова киселина, промиван със студена дестилирана вода и съхраняван на

-20°С. С velutipes беше съхранявана върха скосена повърхност на същата среда (Jakoby, Methods in Enzymology 5:637 (1962))

Пречистване:

Стъпка 1

Приготвяне на суров екстракт

Замръзеният мицел беше стрит във Waring-блендор за мин със суу. лед или с течен азот. Прахът беше екстрахиран с три обета

0,1 М калиевоцитратен бу*ер, pH 3,0 за 1О мин на 4°С саспенсията центрофугирана на

000 X д за 30 мин на 4°С

Надс тоящата течност беше .илтривана през два слоя марля

Стъпка 2.

Утаяване с ацетон

Кон центрациите на ацетона бяха заимствавани от Shimazono and

Hay ai5hi (J. Biol.

Chem

227:151 (

1957)) изключение на че последните две

Стъпки не

Бяха п роведен и

Процент и те бяха пресмятани на базата обет/обет, като се вземаха предвид сумарните обети (а)

Ниска ацет оново хапки на зс таде- ацет механично (Ацет он-1 ) мин и утайка беше отстране~а в предварително охладен ротор на 10 000 кд, 20 мин на , -· <·, ацетатен бу*ер с pH А,5. Ензимният разтвоо беше диализиран за 16 часа при 4°C срещу две смени на 0,02 М калиево-ацетатен буфер, pH 4,5, и малката утайка, образувана ηовреме на диализата, беше отстранена чрез центрофугиране (Ацетон-11) (b)

Надстоящата течност беше доведена до 407. ацетон (Ацетон-111) и получената утайка изхвърлена

Утайката от следващо добавяне до

507. (АцетонIV) беше разтворена в малък обем 0,02 М кали ево-ацетатен бу*ер, pH 4,5

Стъпка

Хромато*окус и райе

DEAE-Sepharове

CL-6B (Pharmacia) беше уравновесена в 0,02 М калиево-ацет атен буфер, pH 4,5, и използувана за да се опакова нл-колона (IX 13 см вмес тимост)

Утайката от последното аиетоново утаяване беше нанесена при проточна скорост 10 мл/ч. Колоната беше проми та с два обема на колоната

0,02 М калиево-аце⁷а^тен бу«ер, pH 4, елуирането проведено чрез разгръщане на вътрешен рН-градиент при използуване на & мМ кисела буферна смес (4 мМ всяка от

DLаспарагинова киселина киселина и глицин, pH 2 проточна скоростЮ мл/ч и събрани мл-Фракиии;

белтъните бяха пооследени чрез поглъщане при 280 нм; Фракциите

Бяха изследвани за ензимна активност и определено pH на вс яка »раК ция

Фракциите, които съдържаха ензимна

Бяха обединени, диализиран и с решн вода концентрирани

000 отрязък) ензимно определяне:

Оксвлатдекврбоксилазната активнаст Беше определена чрез измерване освобождаването на ^1Z1CQ^ от [^1ЛС]-оксалова киселина >. Ar.er sr.affi, 4,1 мКи/ммол ) . Ензимното определяне Беше извършено в малки стъклени епруветки, които съдържаха 1 мл от слеона^та реакционна смес: 0,2 М калиев ци^тоат, pH 3,0, 0,005 М калиев

оксалат, pH

3,0, 5,6 нмола (0,0227 мкКи ) ( ^ХАС) -оксалова киселина

и 0,2 мл ензимен разтвор. Епруветките бика премнкаби рани за 5

мин преди

добавянето на ензима. Епруветките бяха затворени с

гумени запушалки и инкубирани на 37°С за 30 мин е клатеща се

водна баня.	Реакцията беше спряна чрез инжектиране на 0,2 мл 507.
обем/обем	трихлороцетна киселина през гумените тапи и
епруветки те	бяха клатени допълнително още 60 мин за улавяне на

всичкия ^1АС0₌, преминал в 0,2-та мл метилбензето^иева основа (Sigma), поставена в пластмасови епруветки вътре в стъклените

епрувет ки.

Пластмасовите епруветки бяха отделени, съдържанието

им прехвърлено в 5 мл толуолова сцинтилационна течност и радиоактивността определена с течен сцинтилационен брояч. Бяха заложени нулеви епруветки, в които преди ензима беше добавена

0,2 мл 507	ТХА или ензимът беше премахнат. В експерименти по
изследване	на кинетиката стойностите бяха коригирани чрез

приспадане радиоактивността на ензим, денатуриран чрез нагряване да кипене.

Определение за единица:

Една единица беше определена като количеството ензим, който освобождава 1 мимол ^iAC0s за една мин на 37°C при с т андартни

УС лов и я на определяне.

определянето беше

Бел т-_с., беше опредеr~. ¢= me τοα a :? a

ПИ к DCε/· м е

L- Vs г у ; — £· ~ >' ·—. ο Г¹- . w _ »

Бιос hem, S3:3^6

5ό:658-ό66 (1 оксалатдекарбоксплаза’а Беше

Определяне на молекулна маса:

Молекулнат а мас а определена чрез гел-Филтрационна хроматогра*мя

Пречистен ензим (100 мкг в (Superose

12:

х 300 нм) при проточна скрост 0,5 мл/мин и използуване на

0,02 М калиево-ацетатен бу*ер, 0,1 М KCL, pH 4,5, при стайна температура

Бе л т ь ц и т е сг·ределени спег¹роФОтометрично при дължина на вълната 2Θ0 нм стандартни белтъци бяха тиреоглоБнлин (660 кДа , Pnarmaci а) , ♦ ери тин (440 кДа,

Pharmacia ) , каталаза (230 кДа , Р*-аггпас i а ) , (158 кДа, Pharmacia)

150 к.Да,

Sigma) и карбоанхидраза (29 кДа, Sigma)

Снбединиччи ят състав ри ламидна вер*икална гел-елек т рОФореза в 77. до 157. градиентен гел чрез

Laemmli (Laemmli, Nature

680 . 1970))

Критерии за чистота:

Хогтогеннсзс τ т а на пречистената оксалатдекарбоксилаза Беше определена чрез разделяне на 10 мкг Белтък (пи· А) на двудименсионална електрофореза, съгласно 0'Farrell iC Parrel), J . Bic 1. Cnem. 250:4 007 < 1975 i ) .

нм и - ~ · и „ e и <-ен състав;

Προδπ’β Бяха хидролизирани с 6М НС1 е обезеъзд-ше-и и затворе-чи епруветки на 11?^:С за 22 ч. Хидролиза* и те бяха анализирани с амииокисе ·-ине- анализатор (LKB 4151 н1с>,_а Plus' . Lnc’enw и цистин бя*а сгоеделени като цнстеинова кисе-и-а с •.eg скисление с пеомраече«а киселина. ТоиптоФвн не беше с-седеля».

Разграждане с претеаза 06 Беше направено, както Беше описано по in Enzymol. 96:222 (1963)

Въглехидратен анализ

Г ликопро^еините

Бяха оцветени

- рез използуване на реагента перйодат-Ши* База. Естественото захарно съдържание беше определено чрез метода на «енол-сярната киселина

Arc h

Biochem. Eiophys

132: (1969)) с пюкоза като стандарт

Ензимът

Беше дегликозилиран чрез Енс!О~0 , N-ацет илглюкоза!тинидаза от S plicatuB, (Boehringer Manneheim, 40мЕ/мкг) съгласно Trimbe ( Tr imbe (1964 i }

ОксалатдекарБоксилазата беше топлинно денатнрирана чрез кипване за 10 мин в PBS в присъствие на 0,57.

НцС. Белтъчният антиген (150 мкг) в

PSB беше епулгиран с пълен аоювант н а Фрсйнд и инжектиран подкожно в

Новозеландски Бял

Пое ледваш» асилваши дози бяха приложени в непълен аоювант на Фройнд

Четвърта инжекция

Беше направена и-тоавенозно. Титърът на а^тит ялото беше отчетен пои използуване имвнодияузионна^а et al (1977)

Methods in Iffinunol

3rd Ес. to.A. Benjamin те т-с* o г>рен ис-в ане et а

Се 11 5&

V. *>

Белтъците Бяха mA пое тс = за

5^Г'С съгласие, ме-сра al (Fro;. \at 1 .

Ас ас . Scι . USA направено чрез използуване на ан тиоксалатдекарБоксилазно ан ти т яло при раз pew дане

1:5000 и проявяване чрез реакция с алкална *осъатаза ( Amersnam система за имуноскрининг Super-screen ) .

Резултат и·.

Максимална активност на оксалатдекарбоксилазата беше

получена 2	или	3 дни	след добавянето	на оксалова	киселина.
Резултат и те	от т	ипична	п роцедн ра	за пречистване	с а	дадени в
Т аблица 1 .	Върху	х рома тоФокзсираща	колона	ензииьт	се	разделя на

два пика: пик А се елзираше при pH 3,3, а пик В се елуираше при pH 2,5 (Фиг. 1). Пик А беше пречистен 1670 пъти с добие 2,97., докато пик В коелнираше с два малки по количество белтъка и беше пречис^тен 614 пъти с 157. добив (Таблица 1). Тези съпъ тс ’внващи белтъци биха могли да се отстранят след прекарване през гелфилтрасионна хроматorра*ска колона Sepharose 4В и този белтък беше използуван за определяне на аминокиселинния състав оради висок а'а чистота на г,ик А, този

Белтък Беше използуван з а понататъш-а работа. Материалът е пик А се елзираше като единичен пик от колона за високоефективна Белтъчна течна хроматография Su perose 12 и 10 мкг белтък дадоха eg инично петно върху двздиме-сионална гел-електро*осеза (Фиг. 2В) . Сесиините geykpa'-n разреждания на ензима показаха, че чрез оцве^тяеане с Кунаси-5лу мо^гат да се детектиоат минимум 45 мг белгъ* (Фиг.

-а:^тояниетс придвижване «а е«зимнв’а акт

0,35, -е.-.но къс-е 4) йорехираше с това на единичната о_ветена ивица е-р··· недена^т-риращ PAGE (Фиг. 3.). В ни.то ед-а дрн-а част на ге-е -е бяха о’(ри'и белтъ-ни ивици или ензимна активност. Ензимни-e препарати бяха стабилни на 4 или -20°С и след съхра-е-*е 4 месеца на 4°С при '.концентрация) 1 мг/мл в 0.02 М калиев ацетат (pH 4,5) Биха могли да се измерят 707. от акт ивнос т, началната

ТАБЛИЦА 1

ТИПИЧЕН ЕКСПЕРИМЕНТ НА ПРЕЧИСТВАНЕ*

Стъпка на	тотален	тот ална	специфична	пречистване	добив
пречистване	белтък	активност	ак т ивнос т	пъти	7.
	( мг )	(. eg и н и, ц и }	(Е/мг)
1. Суров	4480	950	0,21	1	100
екс тракт
2. Ацетон	120	608	5,06	24	64
I I
3. Ацетон1	3.8	260	68.8	328	27,3
V
4 . Хромато
♦ок нс иране
а . Пик А	С . 08	28	350	1670	2,9
5 . Пик Е	1.24	х О ^;н·’	129	614	16 . S

йанни’е за агичо» иселиненния състав на двата г.ика показаха нали-ието на м>-ого високо съдържание на кисели използувани 15? г прах, с-ри^т с течен азот аминокиселини (227.) (Таблица 2) техните ниски стойности за натиения белтък не беше ами*-окиселинен състав,

2Ь

На това pJ , въпреки с изключение на би могло да се че амидираната пика имат много дължат част в близък два пъти по-високото метиониново и тирозиново съдържание в пик и на два пъти повисокото съдържание на цистеинова киселина пик А. Допълнително родство беше показано чрез пептидните карт на дват а пика чрез използуване на протеаза VS от Staphyloccoccus aureus (Фиг . 4) тетно прение теми те антитела, насочени с решн пик

А, реагираха кръстосано белтъка от пик В

Аминокиселинии ят състав, пептидните карти и имунологичната кръстосана реактивност показват, че двата пика разделени след хромато*окнсиране, са родствени един с дрнг

Двете «озми с различи pl биха могли да произлизат от различни степени на амидиране или на съдържание на кисели аминокиселини, или биха могли да се дъ лжат на ми ►рохетерогенност в съставялите ги олигозахаридни вериги.

ТАБЛИЦА 2

АМИНОКИСЕЛИНЕН СЪСТАВ

пик А	пик B 7.
	7.-
As*	10,57	10,31
G1 х	11,75	11,52
Lys	3,2	2,69
Arg	2,04	2,09
His	2,66	2,74
Gly	0.44	9.44
Ser	7,23	7,19
Thr	0.56	0.40
Cys=	0,66	0,20
Tyr	0,04	1,05
Ala	11,03	10,92
Vai	6,31	6,52
Leu	7,79	7,19
He	4,00	3,06
Pro	0,64	0,46
Phe	5.13	4,60
Met	0,34	0,69
Trp	H0°	HO
hmohя k	HO	HO

а: Молен процент

Ь: Неопределено с: Определено като цистеинова киселина

Молекулната маса на нативния ензим, определена чрез гел26

Филтрация, беше 560 кДа. Електрофореза в 7-157. градиентен НДС полиакриланиден гел показа наличието на единичен полипептид от кДа (Фиг. 2А) . Тази молекулна маса беше получава-а постоянно за всички различни проценти на гела, проведен е бн*ерната система на Laemmli

Когато ензимът беше третиран с ендо-β-ΝН, големината на голямата дегликозилирана ивица беше 55 кДа (Фиг

5)

Беше намерено, че ензимът е гликозилиран и наблюдаваната висока молекулна голепи-а, получена чрез гел-Филтрация, би могла да се дължи на тетденцнята на някои гликопротеинм да взаимодействуват нековалентно в раз^твор (Farach

Carson et al. Biotechniques 7:462 (19Θ9) ; Kleinman et

От диаграмите на Lineweaver-Bnuk, за калиев оксалат като субс т рат , беше изчислена стойност за

Km 4,5 мМ

Tosa даде г*. Т

166 мкмол/пин/мг . Ензимът биваше конкурентно и-*ибиран от •о:*атни йони и когато кън реакцията беше добавен мМ Р0^ ⁼ , беше получена оксалати като субстрат тъй като той не използуваше за снбстра-и лимонена оцетна киселина, оксалова киселина, янтърна киселина и

-оавчена киселина.

Ензимът не се инхибираше необратимо в широк интервал от стойности за pH и pH-оптимума за декарбоксидиране . Ензммът с а^г· азваше първоначалната си активност с лес xv минути активност не се повлияваше от реагенти със сулвхиррилни г рнп и , тъй като ензимът съхраняваше от акт и внос τ т а присъс тепето на мМ

Р~

Оксалатдекарбоксилазата запазваше 457 от своята ак ’ивност след * * оромерк у рибензенс у лфонов а киселина или 50 мМ иоооацетат инкубиране с 107. НДС за 30 минути на стайна температура. Обаче почти цялата изчезваше

Гликопротеиновата природа на ензима Беше пок азана чрез положително оцветяване с реагента перйодат-Ши*

База; той се свързваше с конкавалин A-Sepharose и Беше елуиран с

0,5

М а-метилманозид

Съдържанието на неутрални захари

Беше оценено на 157. чрез метода на *енол/сярната киселина ймуноти т руването на ензима мкл суров антиоксалатдекарбоксилазен ан т и серум елимини ра >607.

от първоначалната ак т ивнос т надстоящата течност (Фиг

6)

Ант исерамът с рещу оксалатдекарбокси лаза, използуван при разреждане

1:5000 Би могъл да открие минимум ,0 нг от белтъка на пик А

Антисерумът реагираше кръстосано всички пе~тиди, получен и след разграждане с протеаза VB (Фиг дегликози ли рани те *орми на пикове А и В на ензима. Антмсернмът, кой т о

Беше ааинитетно ηреч истен срещу белтъка на π и и

А, реагираше кръстосано с пик

В на оксалатдекарбоксилазата оксалил-СоА-декарбоксилаза от

О* al abac ter form!genes, шам

ОхВ

Той не реагираше кръстосано с о».салвтдекарбоксмлаза от

Пример 2

МОЛЕКУЛНО КЛОНИРАНЕ И ЕКСПРЕСИЯ НА ДНК, КОДИРАш^ □КСАЛАТДЕКАРБ ОКСИЛАЗА

Експери-ентален протокол:

Молекулно клониране:

'отална РНК Беше екстра/иоана от С, velutipes, стоика на прах е течен азо^т, съгласно метода на Chomczynski и Sacchi (Anal. Biochem. 162:156 (1967) и поли(А) PHK беше селекционирана чрез два цикъла на хроматorра*ия върху олиго (дТ) целулоза.

Синтезата и клонирането на кДНК и имуноскрининга на библиотеката бяха проведени следвайки инструкциите на

Amersham.

кйНК беше синтезирана от rtPHK на кмлтнри, индицирани часа с оксалат, ч рез олиго(дТ) като зародиш при матрица 5 гчкг поли (А+)-РНК и клони рана

EcoRI-pecтрикционното място на ламбда gtll.

Опакованите *аги бяха намножени в гостоприемнмк Е. са!ί Υ1090 г~ за имуноскрининг . Антиоксалатдекарбоксилазните антитела Бяха предварително адсорбирани с 1 мг/мл клетъчен лизат на Е. coli Y1090 за отстраняване на Фоновата реактивност и използувани за имнноскриниг. За откриване на положителните клотнове Беше използуван кози антизаешки IgG-конюгат с алкална «ос«атаза. ОНК Беше приготвена от имуноположителни «аги съгласно Del Sal (Biotechniques 7:514 ( 19Θ9) ) и определена големината на техните инсерти. Слетите белтъци Бяха характеризирани съгласно (Annal. Biochem. 156:354 (1966«!·, родството на инсертите беше изследвано чрез използуване на един от инсертите като сонда. 1,2 кн—инсерта от клон № 3 беше субклониран в ρΤΖΙΘϋ ((JSB) и използуван като сонда за други експерименти.

йи*еренциална хибридизация к ленове йи«еренииалната хибридизация на имунonоложит елни т е беше изследвана мрез приготвяне на едноверижна kjJHKч ас а на синтезирана от мРНК, изолирана от мицел пои 0 часа и 12 (0,5 м к г) беше свързана за Gene

Screen Ρ1 us-мембрани в дуплики на Ну Ьг islot™

Филтрационен умножит ел съгласно и не т рн кциите на ръководството на Gene Screen Plus и хиБридиз и рана към индицирани с оксалат и неиндуцирани кДНК-сонди. Специфичната активност на пробата беше 2 х 10® cpm/мкг кДНК.

Хибридизация:

Хибридизацията на ДНК- и РНК-блотовете беше проведена на 42°С, чрез използуване на Формамидната процедира в ръководството на Gene Screen Plus. Прехебредезация през ноща беше направена в 507. дейонизиран Формамид, 17. НДС, 1 М натриев хлорид, 107.

декс т ранснлФат

Блотовете бяха хибридизирани с денатурирана сонда (1-4 х 10⁼ dpm/мл) при 42°С за 24 часа

Мембраните бяха измити последователно в промивки, всяка в температура, 2XSSC плюс

17. НДС на 6 5°С за мин, O,1XSSC на стайна температура за 30 мин

Влажните мембрани бяха експониран» в пластични опаковки върху

Kodak XAR-филми в присъствие на усилващ екран.

Приготвяне на сондата рТ Σ18U беше хидролизирана с EcoRI и

ДНК-мнсерта, разделен в 27.

гел на нискотопяща се агароза, беше изрязан и белязан с (а-³=Р)дАТ Ф по метода за белязане чрез случай н и зарс*д и ши на

Feinberg и

Voaelstein ( Anal .

В i ос herr .

137:226 инг анализ рана от лиофилизи рана l-.

по метода на Zolan и Pukki1

ДНК беше пречистена два път ( 19986 ) на CsCl-градиент, за да

ДНК която би могла да се хидролизира с рестрикиионни ензими.

Четири микрзграма геномна рестрикиионни ендонуклеази и разделена в 1,27. агарозен гел. ДнК беше прехвърлена върха Gene Screen Plus-мембрана чрез метода за алкален блотинг (Reed and Mann, Nucleic Acids Res. 13:7207 (1985) ) .

Транслация in vitro:

Поли(А+) РНК беше транслирана чрез използуване на заешки ретикнлоцинтен лизат съгласно инструкциите на производителя (Promega). Транслираните белтъци бяха утаени чрез специфичен антисерум и анализирани чрез НДС-полиакри ламидна гелелект роФореза.

Хибридно селекциониране

Хибридното селекцизниране на оксалатдекарбоксилазната м^рНК беше проведено чрез хибридизация на поли(А+) РНК (20 мкг в

200 мкл

657 Формамид,

0,57 НДС, 100 мкг/мл дрождена тРНК) при °C часа към Gene

Screen Ρ1us-мембрана, върху която беше свързвнв денатурирана кцН> (4

Фи лт ри те бяха приготвени съгласно ръ ков одс твото на Gene

Screen Plius и бя а проведени хибридизация, миене и ельиране на хибридмзиралата

РНК (Jagus,

Hethods in Епгуто!

152:5=9 (1987); Parnes et al,

Proc . Na11 нс ad . Sc i

USA 78:2253 (19=1)).

Елуираната РНК беше екс т рахи рана в етанол, разтворена направо в in vitro-транслационнатa с мес и имзнопреципити рана съгласно

Anderson и Blobel (Methods in Enzymology 96

111

Един микрограм no<»iA+) РНК или мкг тотална

РНК бяха оенатурирани с глиоксал, разделени в 1, съгласно аг

Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ,

Cold Spring Harbor, N.Y.) и пренесени по капилярен път върху Gene Screen Plus-мембрана, съгласно инструкциите в ръководството на Gene Screen Plus.

Резултат и:

Както беше отбелязано по-горе,

AaMSgagtll беше коне т ру и рана кДНК-експрес и онна библиотека от

12-ч оксалат индицирана мРНК

Бяха скринм рани приблизително

000 рекомбинанта антитялото, получено с Е col i-лизат

Бяха получени и пречистени петнадесет имуноположителни клона; от тях дванадесет хибрисизираха кръстосано. Те кодираха слети белтъци с

ДНК от 15-те ипаноположителни клона беше имобиризи рана върху

Gene Screen

Plus-мембрана в дуплики и сондирана с оксалатинднци рана кДНК-проби

Диференциалната хибридизация на

15-те имуноположмтелни клона показа, че 12 хибридизират кДНК-сондвта от оксалат-плюс. мРНК и не дават сигнал оксалат-минус мРНК (Фиг

7В)

По този нан ин експресията на 1 клона се индицираше от о<салат

Снб клонъ к лон беше използнван, за са се отдели чрез хибридизация мРНК. Транслаци ята vi t го на така отделената чрез хиБридизаци я мРНК (Фиг

2В, пътека 2), която беше сходна с големината, получена с дег ли коз и лиран белтък. Този 55-кДа белнтък не се получаваше, когато се премахнеше мРНК (Фиг. ΘΒ. пътека 1) или с нерекомбинантните векторни последователности (пътека 4). Продуктът от 55 » за беше получен с 12-ч мРНК (Фиг. ΘΑ, пътека 2) и не беше получен с неиндуцирана, О-ч мРНК (пътека 1); за ивицата от 55 кДа беше показано, че е родствена с оксалатдекарбоксилазата, тъй като пречистената оксалатдекарбоксилаза я конкурираше за местата на свързване с антигена и причиняваше понижаване в интензивността на 55 кДаовата ивица (пътека 3) в експериментите no in v-j tro-транслаци я и иманопреципитаци я.

Геномни ДНК-Блотове пои използуване на 1,2 кн-инсерта като сонда показаха наличиено на единични ивици при хидролизите с BamHI, EcoRI, Hindlll, PvuII, Sspl, Xbal и Xho, което показва наличието на еднокопиен ген (Фиг. 9В) . Двете ивици с нееднакви интензивност и, получени с ΚρπΙ и с PstI, бяха следствие от нахиичието на вътрешни места за тези ензими (единично място за всеки ензим) в 1,2 кн-кДНК инсерта. Сондата от 1,2 кн хибридизираше с единичен вид мРНК от 1,5 кн от 12-ч оксалатинсацирана поли(А+) РНК, а хибридизация с РНК от неиндуцираната пътека не беше наблюдавана (Фи^р. 9А) .

От съшите партиди култури бяха събирани проби от различни стадии след индукция и анализирани за нивото на РНК, ензимна активност и тотален белтък. РНК-блотв на тотална РНК показа, че 1,5 кн-ивицата отсъствнва на Очи достига връх на 12 ч. Три дни след индукция не би могла да се открие РНК (Фиг. 10Б). Ензимна активност беше открита 12 ч след добавянето на оксалат и на втория ден беше наблюдавана пикова активност, след което тя постепенно намаляваше. Не беше наблюдавано съгласувано покачване или намаляване тоталния белтък (Фи г

10С)

Следователно, беше наблюдавала времева зависимост между появата на ензимна активност и нивата на мРНК, тъй като нивата на мРНК а максималната ензимна активност беше получена 4Θ ч след добавянето киселина.

Всички цитирани литературни изночниии са съответните места.

на оксалова посочени на

Пример 3

Клониране на оксалатдекарбоксилазата

За прикачване на ЙНК, кодираща сигнален пептид, към оксалатдекарбоксилазния ген на pOXDl, беше използувана ПВР (полимеразна верижна peak ци я)

Беше избран сигналният пептид на екстензмновия ген от Niccotiana plumbaginifoliа. Целият сигнален пептид бяха свързани пред декарбоксилазния ATG-кодон.

5' ПВР-олигоннклеотитът беше EXT0XD-5:

5'- GAAGACGATAGGATCCATTTGTTTCAAAG'ATG GGA AAA ATG

BamHI *Met Gly Lys Met <------некодираща ДНК

GCT TCT CTA TTT GCC АСА TTT TTA GTG GTT TTA GTG TCA

Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Vai Vai Leu Vai Ser

CTT

AGC

TTA

GCT

ZTCT GAA [ATG

TTC

AAC

AAC TTC CAAJ

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser Glu [Met

Phe

T rp

Trp Phe Gin] [-J

Припокриване c началото на оксалатдекарбоксилазни я ген

Надало затранслация в началото на сигналния пептид / Място на зреене в транслационммя продукт

ПВР-олигонуклеотитът беше EXT0XD-3, насочен срещу последователност в позиция 211-190 на оригиналната ρΰΧΒΙпоследователност (надолу след Κρη1-мястото}:

5' TGGGTCACTGGTCTCATT

При използуване на горните зародиши

ПВР-реакиия с pOXDl-плазмидна ДНК като матрица Бяха получени само непълноценни продукти

За да обогатим този първичен продукт на пълноразмерни но на нов 5'-зародиш, EXT0XR-6 (5'-GAAGACGATAGGATCCATTTG-3'), която представлява отделената 5последователност на EXTOXD-5 по-горе

След втория етап на

ПВР Беше визуализирана ивица с очакваната големина (прибл

290 нд)

Тя беше пречистена, хидролизирана с BamHI-Kpnl и клонирана в pOXDl, от който

Беше отстранен присъствуващият там

BamHI-ΚρπI-Фрагмент (125 нд)

Общо седемнадесет клона, съдържащи по-големи я фрагмент,

Бяха секвенирани в областта на инсерта

За един от клоновете Беше потвърдено, че съдържа правилната последователност в инсер^та BamHI-Kpnl, Генът сигнален пеп тид/оксалатдекарБоксилаза

Беше изолиран от този клон като

BamHI-EcoPi-Фрагмент, крайша бяха затъпени с Klenow и включен в Smal—мястото на pJRIRi бяха идентифицирани чрез хибридизация, а ори ен т ац и ят а потвърдена чрез диагностични хидролизи (HinoIIIEcoRI, ΚρηI,

Hind III и

PstI). Клонът, съдържащ ОХ—D—каеета^та в същата ориент а ц и я, както opt I I-касе*ат а, Беше наречен pSR21 — O-D-касета, включена в Smai-мястото

Фигура 11 показва нуклеотидната последователност на кДНК-инсерта. от 1420 нд в pOXDl.

зв

Фигура 12 илюстрира конструирането на плвзмида pSR21.

Пример 4

Трансформация на тютюн при използуване на векторите, описани по горе (а) Пренос на вектори_в Aqrobacterium

Конструкциите бяха въведени чрез директна трансформация, следвайки tumefaciens LBA4404 публикуваните процедури

Наличието и цялостта на конструкциите бяха потвърдени чрез рестриктазна хидролиза и ДНК-блот-експерименти , проведени за да се провери дали не е станала рекомбинация повреме на преноса на векторите в Aqrobacterium (Ь) Трансформация на тютюневи листни дискчета

Листни дискчета от тютюн (N. tabacum , сорт Samsun) бяха транСФормирани чрез използуване на рутинни методи, публикувани по-рано

Растения, съдържащи конструкцията, бяха идентифицирани чрез ПВР и отбрани за по-нататъшен анализ

Пример 5 растени я

Ензимната активност е определена чрез измерване на всеки от двата разпадни продукта при декарбокси ли райето на оксала* (въглероден двуокис и Формат). Освобождаването на ^iACO₌ от ^1ЛС оксалова киселина е определено. както следва (Metha and Datta. 1991). епруветки, съдържащи peakционна смес, (виж подолу ) се гоеимкнбират за пет ни-.--и греди добавяне на екстракт/ензим.. Епруветките се затварят и инкубират на 37‘^:>С за 30 минути в клатеща се водна баня. Реакцията се спира чрез инжектиране на 0,2 мл 507. (обем/обем) трихлороцетна киселина през запушалката. Епруветките се клатят в метилбензетониевата основа (0,2 с т ъклените съдържанието мл), поставена в пластмасови епруветки еп руветк и

П лае τмасови те еправетки се им се прехвърля в 5 мл сцинтиларионна вътре в отделят, течност и радиоактивността се определя чрез течен сринтиларионен брояч

Peak ционна смес

0,2 М Калиев нитрат pH 3

0,005 М Калиев оксалат pH 3

Образуването на *ормат се измерва чрез метода на Магдо et. al.

(19ΘΘ), адаптиран, като са взети предвид по-скоро различните биохимични характеристики на оксалатдекарбоксилазата , и з оли ран а от

Сollybia velutipes, от колкото на тази от

Използува се двустъпков метод. Първо, залага се реакционна спес, съдържаща мкл 40 икМ оксалова киселина (pH доведено с калиево основа go pH 3,5), 15 мМ о-*ен»лендиамин и

0,1 мМ говежди серумен албумин в цитратен буяес (0,2 М).

Е»стракт/ензимът се добавя (краен обеп 0,5 мл) и реакциите се инкубират на 25°С за 20 минути. Декарбоксили райето се спира чрез добавяне на К₌НРО₄ (за получаване на крайно pH 7,5;. йобавя се половин обеп 45 мМ никотинамидадениндиннклеотид, литиева сол, и се разбърква.

След три

МИНУТИ се доБавя15 мк л ♦орматдехидрогеназа (ФйХ, S0 Е/мл). След това конрентрарията на образувания «ормат се отпита чрез измерване на покачването в

-о-лъшането на реакционните снеси при 340 ни, преди и 20 c^eg добавянето на ФйХ. За всеки екстракт се приготвят контроли бе:· оксалова киселина и впоследствие активността се пресмята на базата на белтъка.

Пример 6

ОЛИГОНиКЛЕОТИДИ лА ПВР И ДНК-БЛОТ АНАЛИЗ

За да се потвърди наличието на оксалатдекарБоксилазния ген в регенерирали поници, за диагностични ПВР-и от генната последователност Беше избран олигоннклеотидът DEC1. В комбинация с 35Б-олигонуклеотида (43) той дава диагностична ПВР-ивица от около

2Θ0 нд

Тези олигонуклеотиди бяха и зползнвани за потвърждаване транегенния статус на вкоренени поници

Две други олигоннклеотидни последовотелности, DEC2

DEC3,

Бяха използувани за получаване на

5' оксалатдекарБоксилазен *рапмент-сонда от приблизително 450 нд за ползвване в ДНК-бл.от анализи на регенерирали транегенни растения и тяхното потомство.

Олигонуклеотид DEC1

5' в оксалатдекарБоксилазната коди раща последователност за използуване промоторен олигонуклеотид в диагност ични

ПБР-и

5'

GAG АДо GAT

GAC

AGT GAG GAG ACG ~TG

Олигонуклестиди

DEC2 и DEC3

В средата оксалатдекарБокси лазната коди раша оБ лае т , и зползувани комбинирано за получаване на сонди за ДНК блет-анализ

DEC2

5'

CCA TGA CGA EGG ТАС АТТ

СТТ GCT САС - 3

DE СЗ '

TGC AGG ААС ДТА AGE GAT

ATE АСЕ АСЕ

Claims

1. Изо/иран ДНК-Фрагменτ, кодираш оксалатдекарбоксилаза.

2. Фрагментът съгласно претенция 1, където споменатият фрагмент кодира гъбна оксалатдекарбоксила.

Фрагментът съгласно претенция 2, където споменатият

Фрагмен т кодира оксалатдекарбоксилаза на Collybia velutipes.

Фрагментът съгласно претенция 3, където споменатият

Фрагмен т има последователността на SEQ ID И?1.

5. Рекомбинантна молекула, съдържаща ДНК-Фрагмента на претенция

1 и вектор.

6. Трансформирана растителна клетка, съдържаща молекулата, съгласно претенция 5.

7. Основно пречистена оксалатдекарбоксилаза.

Θ. Окса'атдекарбоксилазата съгласно претенция 7, където споме-атата оксалатдекарбоксилаза е гъбна оксалатдекарбоксилаза.

9. Окса*атдекарбоксилазата съгласно претенция Θ, където окса*атдекарбоксилазата е оксалатдекарбоксилаза на Collybia velutιpes .

10. ОксалатдекарБоксилазата съгласно претенция 7, където споменатата оксалатдекарбоксилаза се кодира от ДНКпоследователността на SEQ ID Н?1.

11. Препарат, характеризираш се с това, не съдържа количество оксалатдекарбоксилаза, достатъчно да разгради оксалова киселина, и приемлив за земеделието носител.

12. Метод за защита на растение от оксалова киселина, характеризиращ се с това, че при нажда от такава защита в растението се внася количество оксалатдекарбоксилаза, достатъчно да осъществи споменатата зашита.

13. Методът съгласно претенция 12, където споменатият метод се характеризира с това, че включва въвеждане в споменатото растение на ДНК-Фра-мент , кодираш оксалатдекарбоксилаза при условия такива, че споменатият Фрагмент се експресира така, че се произвежда споменатата оксалатдекарбоксилаза.

14. Методът съгласно претенция 12, където споменатият метод се характеризира с това че се извършва контакт на споменатото растение с количество оксалатдекарбоксилаза достатъчно да осъществи споменалата защита.

15. Растение, в чинно геном чрез генетична трансформация е включен трайно ген, кодиращ оксалатдекарбоксилаза.