BG62574B1

BG62574B1 - Оксалатдекарбоксилаза

Info

Publication number: BG62574B1
Application number: BG99731A
Authority: BG
Inventors: Asis Datta; James M. Dunwell; Anuradha Mehta; K. Natarajan
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 2000-02-29
Also published as: BR9307548A; HU9501503D0; UA34467C2; JPH08503851A; US5547870A; BG99731A; HU219140B; AU5571194A; HUT71786A; CA2149907A1; AU677976B2; RO112764B1; WO1994012622A1; EP0673416A1

Description

Област на изобретението

Изобретението се отнася най-общо до ензим, който разгражда оксалова киселина, поспециално до ензима оксалатдекарбоксилаза и до ДНК-последователност, която я кодира. Изобретението се отнася и до рекомбинантна молекула, съдържаща последователността, която кодира оксалатдикарбоксилазата и до клеткагостоприемник, трансформирана с нея. В допълнение изобретението се отнася до метод за защита на растенията от вредното влияние на оксаловата киселина и до метод за редуциране съдържанието на оксалова киселина в растение.

Предшестващо състояние на техниката

Повечето от оксалатите в животните и в хората произлизат от оксалатите, възприети с растителните храни. Някои зеленчуци, напр. Amaranthus, спанак, ревен, са богати източници на витамини и минерали, но те съдържат оксалова киселина като хранителен стресов фактор. Такива растения, консумирани в големи количества, стават токсични за хората, тъй като оксалатите хелатират калция, а преципитирането на калциев оксалат в бъбрека води до хипероксалурия и разрушаване на бъбречните тъкани (Decastro, J.Pharm.Biomed.Anal. 6:1 (1988); Hodkinson, Clin.Chem. 16:547 (1970).

Могат да се цитират най-малко два други примера, в които оксаловата киселина е въвлечена по индиректен начин. В единия случай образуването на оксалова киселина е важен атакуващ механизъм, използван от Whetziinia sclerotorium - гъба, която причинява сериозни вреди по култури като слънчогледа. Оксаловата киселина се натрупва в инфектираните тъкани рано в патогенезата и концентрацията й нараства през времето, в което патогенът колонизира тъканите на гостоприемника. Натрупването на оксалова киселина в листата причинява симптом на увяхване и евентуално листна смърт. По този начин оксаловата киселина функционира като подвижен токсин, който се придвижва от основата на стъблата по ксилемния сок към листата (Maxwell, Physiol. Plant Pathol. 3:279 (1973)).

В друг случай консумирането на Lathyrus sativus (секирче) причинява невролатиризъм, който се характеризира със спазъм на подбедрените мускули, парализа на долните крайници, конвулсии и смърт. L.sativus е богато на белтък студоустойчиво бобово растение, което вирее при екстремни условия, такива като ветровитост и мочурливост, и не изисква сложна техническа обработка. Невротоксинът β-Ν-оксал;1л-1_-а,Р-диаминопропионова киселина (ОДАП) присъства в различни части на растението. Синтезата на ОДАП е двустьпкова реакция, в която оксаловата киселина е важен изходен субстрат. ОДАП действа като метаболитен антагонист на глутаминовата киселина, която участва в предаването на нервните импулси в мозъка. Следователно, независимо от неговото богато белтъчно съдържание, това бобово растение не може да се използва като хранителен източник (Mickelson et al, (1973) in Modem Nutrition in Health and Disease: Dietotherapv (Goodhart, R.S. and Shils,. M.E., Eds) 5th Ed.pp.412-433, Lea and Febiger, Philadelphia).

Изследването функцията на оксаловата киселина в споменатите системи хвърля светлина върху нейната роля на важен стресов фактор. Очевидна е ценността на изолиран ген, кодиращ белтъчен продукт, който разгражда оксалова киселина. Такъв ген би могъл да се използва като средство за разграждане на оксаловата киселина в растения, където тя се натрупва като такава или е субстрат в синтезата на невротоксин, или е среда за патогенеза. Това би могло да се постигне чрез преноса на единичен ген в тези растения.

От известните ензимни системи, разграждащи оксалова киселина, окслатдекарбоксилазата от базидиомицетната гъба Collybia velutipes е от особен интерес поради едно съобщение, че частично пречистен ензим е показал просто едностъпково разпадане на оксаловата киселина, в отсъствието на всякакво изискване за кофактор, до въглероден двуокис и мравчена киселина, нетоксична органична киселина (Shimazono et al, J.Biol. Chem.227:151 (1957)).

Изобретението осигурява пречистена оксалатдекарбоксилаза и ДНК-последователност, която я кодира.

Изобретението също така осигурява методи за използване на кодиращата последователност за получаване на трансгенни растения с ниско съдържание на оксалова киселина. По този начин изобретението прави възможно об лекчаването на стресовите условия, предизвикани от оксаловата киселина в случаите, споменати по-горе. То също така прави възможно разработването на системи за определяне нивото на оксалати в урината и серума.

Техническа същност на изобретението

Обект на изобретението е да се пречисти напълно и да се охарактеризира точно оксалатдекарбоксилаза.

Друг обект на изобретението е да се изолира, характеризира и конструира ген, който може да се използва за експресията на оксалатдекарбоксилаза в микроби и растения.

Друг обект на това изобретение е да се въведе ген, експресиращ оксалатдекарбоксилаза, в растения (включващи полски култури, такива като слънчоглед, соя, бобови изобщо, рапица/каньола, люцерна, лен, шафраника, фъстък и детелина, зеленчукови култури, такива като маруля, домат, тиквени растения, картоф, морков, репичка, грах, леща, зеле, карфиол и брюкселско зеле, цветя, такива като петуния и пиретрум, и дървесни видове, такива като праскова), при това придавайки на такива растения устойчивост към болести, поспециално към гъбни болести, в които оксаловата киселина играе главна роля, каквито са болестите, причинени от родовете гъби Sclerotintia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillum, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Phizoctonia и Schizophyiium.

Изобретението е широко насочено към използването на ензим, разграждащ окслати, какъвто е примерът с оксалатдекарбоксилазата за търговски цели, като в пивоварната индустрия или за използване в земеделието, за да се редуцира чувствителността на растение към оксалова киселина или да се редуцира концентрацията на едногенната оксалова киселина в растение. Оксалатразграждащият ензим оксалатдекарбоксилаза може да се използва, за да се редуцира растителната смъртност или увреждането от болести, или друг феномен, в който оксаловата киселина играе определяща инвазивна роля. Продукцията на оксалатдекарбоксилаза може да има за резултат предотвратяването на растителната смъртност и на инфекцията от болести, в които оксаловата киселина е определяща. Такива болести се причиняват заедно с други и от специфичните ро дове гъби, посочени по-горе.

По-нататък е представено изобретението на оксалатдекарбоксилаза, основно пречистена и охарактеризирана. Ензимът има кисело pl. стабилен е в широк pH-интервал и е умерено термостабилен. Молекулното тегло на ензима, определено чрез SDS-PAGE, е 64 kDa в гликозилирано състояние и 55 kDa в дегликозилирано състояние.

Представено е също така всичко съществено от изобретението (конструкцията) на основно пречистен ген, който кодира оксалатдекарбоксилазен ензим, със специфична ДНКпоследователност, представена в SEQ ID N1. Генът кодира ензим, която проявява оксалатдекарбоксилазна активност и е с молекулно тегло (негликозилиран) приблизително 55 kDa, определено чрез SDS-PAGE.

Изобретението също така се отнася до препарати за използване в борбата с болести по растенията, които препарати включват химикали, проявяващи активност на разграждане на оксалова киселина, в частност оксалатдекарбоксилазна активност. По-специално съединението има оксалатдекарбоксибадна активност в количество, достатъчно да разпадне оксалова киселина, произведена от патогени. Ще се посочи, че друго приложение на подобен препарат в селското стопанство е комбинирането му с подходящ носител, който е приемлив в земеделието и позволява внасяне на препарата директно в растението или в почвата.

Описана е също така трансформирана растителна клетка, която е трансформирана с ген, кодиращ оксалатдекарбоксилаза. Генът, кодиращ този ензим, може да включва ДНКпоследователността .представена в SEQ IQ N1.

Описан е метод за осигуряване защита на растение срещу оксалова киселина при нужда от такава защита. Методът включва обезпечаване на растението, при нужда от такава защита с ензим, който разгражда оксалова киселина в количество, достатъчно да осигури подобна защита. За предпочитане ензимът, който разгражда оксалова киселина, е оксалатдекарбоксилаза, която се кодира от ген с последователността, представена в SEQ ID N1. Методологията за осигуряване на такава защита може да приеме множество форми, които включват трансформацията на растение с ген, който кодира ензим, разграждащ оксалова киселина, в частност кодиращ оксалатдекапроксилаза.

Като алтернатива методът може да включва осигуряване на ензим, разграждащ оксалова киселина, в комбинация с носител, приложим в земеделието ,за директно приложение в растение или в почва, в която вирее растението.

Други обекти и предимства на изобретението ще станат ясни от описанието на изобретението, което следва.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 представлява профил на елуиране на оксалатдекарбоксилаза от хроматофокусираща колона. Белтъкът от стъпката Ацетон-IV е нанесен върху колона DEAE-Sepharose CL-68 (1 х 13 cm), уравновесена с 0.02 М калиев ацетат (pH 4,5). Свързаните белтъци се елуират с падащ градиент на pH. Активността е свързана с пик А, елуиращ се при pH 3,3, и с пик В, елуиращ се при pH 2,5. Вдясно е представен гел с белтъчни ивици, отговарящи на двата пика. Пикове А (пътека А) и В (пътека В) са разделени чрез 11 % SDS-PAGE и оцветени с Кумаси-Блу. Ивица S показва маркери за молекулна маса на Sigma (SDS-7).

Фигура 2 - критерии за чистота. (А) Двукратни серийни разреждания (пътеки 1 - 7) на оксалатдекарбоксилаза, като се започне с 3 pg (пътека 1) белтък, са разделени на 7-15% градиент SDS-PAGE. (В) 10 pg оксалатдекарбоксилаза (пик А) е разделена чрез изоелектрично фокусиране (pH 2,5-5,0, амфолити, Pharmacia) в първо направление и чрез 12% SDSPAGE във второто направление. Ивица S показва калибриращи стандарти за оценка на молекулното тегло SDS-7 (Sigma).

В (А) и (В) теловете са оцветени с Кумаси-блу.

Фигура 3 - корелация активност-ивица. Проведена е електрофореза на 500 mg белтък в две пътеки на 6% неденатуриращ полиакриламиден гел; едната пътека е оцветена с Кумасиблу, а другата е разрязана на дванадесет 4 - mm отрязъка. Гелните късчета са инкубирани в 200 0,1 μΜ калиево-ацетатен буфер, pH 4,5. Акриламидът е стрит и накиснат през нощта на 4°С. Ензимната активност е определена и съотнесена с ивицата в оцветената пътека. Разстоянието на придвижване (R 0,35, гелно късче N4) на ензимната активност (0.2 единици) корелира с тази на единичната оцветена ивица (500 mg).

Фигура 4 - сравняване профилите на разграждане по Cleveland на двете форми оксалатдекарбоксилаза. Пептидните карти са направени директно в 4,5% стекинг гел и 15% разделящ гел. 10 pg полипептиди от пик А и В са изрязани от 11 % SDS-полиакриламиден гел и разградени със 100 pg/ml νδ-протеаза (S.aureus, Sigma). Пептидите са пренесени чрез електроблотинг върху нитроцелулозна мембрана и идентифицирани имунологично чрез антитяло срещу оксалатдекарбоксилазата, разредено 1: 5000.

Ивици: 1, белтък от пик А и 2, белтък от пик В.

Фигура 5 - дегликозилиране на оксалатдекарбоксилаза. 1 pg от ензима на пик А е третиран с 1 тЕ (пътека 3) и 10 тЕ (пътека 4) Endo Н за 22 h и разделен в 11 % SDSPAGE. Пътеки 1 и 2 съдържат нетретирани контроли за пик А. Ивица S (вдясно) показва маркерите за молекулно тегло на Pharmacia, на ивицата S (вляво) са цветните маркери за високо молекулно тегло (BRL).

Фигура 6 - имунологично титруване на ензимната активност. 1.5 pg ензим в 0.02 М калиево-ацетатен буфер, pH 4.5, са инкубирани с различни обеми серум (1) на 25 °C за 2 h. Имунокомплексите са утаени на 12 000 xg за 10 min и остатъчнта активност е определена чрез стандартен тест. Проведено е контролно инкубиране с преимунен серум (Р1).

Фигура 7 - слети белтъци - оксалатедакарбоксилаза-Р-галактозидаза. Макроплаки, индуцирани с IPTG, са лизирани в 1 % буфер на Laemmli и разделени на 10% SDS-PAGE, пренесени върху нитроцелулоза и сондирани с антиоксалатдекарбоксилазни антитела. Цифрите над пътеките отговарят на номерата на клоновете, “С” е контролната пътека с макроплака от мерекомбинант [???]. (В) Диференциална хибридизация на РНК от имунопозитивни плаки. Фагова ДНК (500 ng), изолирана от клоновете, е свързана за Gene Screen Plus-мембрани в две повторения и хибридизирана с оксалатнеиндуцирана (минус) и оксалат-индуцирана (плюс) кДНК-сонди (2,5x10^s cpm/pg кДНК). С” отговаря на контролна нерекомбинантна ламбда dtl 1-ДНК.

Фигура 8 -(A) In virto транслация. Транслационните продукти от in vitro-транслирана тотална поли (А+)-РНК от неиндуцирани, O-h (пътека 1) и 12-h оксалат-индуцирани (пътека

2) етапи е имунопреципитирана и разделена чрез 10% SDS-PAGE. Гелът е флуорографиран и автогадиографиран. Ивица 3 показва изчезването на 55-кОа-овата ивица в присъствие на пречистена оксалатдекарбоксилаза като конкурент за свързване с антителата при имунопреципитацията.(В) Транслация на матрица, отделена чрез хибридизация. Поли (А+) РНК (20 pg/ml), изолирана от 12-h оксалатиндуцирана С. velutipes, е хибридизирана с плазмидна ДНК (1.2-кн кДНК инсерт в pTZ18U), свързана за Gene Screen Plus-мембрана. РНК е елуирана и транслирана в заешки ретикулоцитен лизат; транслираните продукти са имунопреципитирани и разделени чрез 10% SDS-PAGE. Ивица 1, няма РНК; ивица 2, шРНК , отделена чрез хибридизация с 1,2-кн инсерта; ивица 3, 12-h тотална поли (А+)РНК; и ивица 4, нерекомбинатна векторна последователност. Отбелязани са маркерите за молекулна маса.

Фигура 9 - (А) РНК-болт, показващ 1,5 кн тРНК за оксалатдекарбоксилаза на С. velutipes. 1 pg поли (А+) РНК от неиндуцирани (Oh) и оксалат-индуцирани (12h) са етапи денатурирани с глиоксал и разделени на 1,2% агарозен гел, прехвърлени върху Gene Screen Plus-мембрана и сондирани с (d³²P) -белязана кДНК (9 х 10⁷ cpm/pg) за оксалатдекарбоксилаза. 1 кн-стълбица (BRL) е използвана като стандарт за молекулна маса. (В) ДНК-блот на геномна ДНК от С. velutipes. Геномна ДНК (4 pg) е разградена с рестриктазни ензими, разделена на 1,2% агарозен гел, прехвърлена чрез болт върху Gene Screen Plus-мембрана и хибридизирана с инсерт, (а³²Р)-белязан инсерт. Хидролизите ламбда Hindlll/EcoRI и pUC 19 Hinfl са използвани като стандарти за големина на молекулата.

Фигура 10 - регулация на оксалатдекарбоксилазната генна експресия. Показана е тотална РНК (10 pg), изолирана от култури на С. velutipes в различно време след добавяне на оксалова киселина. (А) 1,2% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид, който показва относителните количества на РНК, денатурирана с глиоксал. (В) Тотална РНК, пренесена върху Gene Screen Plus и хибридизирана С^32Рбелязан 1,2-кн кДНК-инсерт. (С) Относително количество на поли (А+) РНК, кодираща оксалатдекарбоксилаза (О), определено по интегрираните площи на денситометрираната авторадиограма (В). Показана е също и специ фичната активност на ензима, изолиран от същата култура.

Подробно описание на изобретението

Пречистената оксалатдекарбоксилаза на изобретението, използването й като агент за атака на патогенезата и използването й в растителната клетъчна трансформация осигурява метод за контрол над растителните болести, в който оксаловата киселина играе определяща роля при патогенезата или при инвазивния стадий. Изобретението има специално предимство, тъй като в култивирането на растения, важни за селското стопанство, голяма опасност представляват видовете гъби, като Scierotinia, които секретират оксалова киселина.

Предимствата на изобретението могат да се използват или чрез растителна трансформация, или чрез прилагане на оксалатдекарбоксилазата като традиционен пестицид, найвероятно в комбинация с подходящ носител, който е приемлив за земеделието. Една от важните изгоди при използването на оксалатдекарбоксилаза като пестицид е, че тя е екологично чиста, незамърсяваща и не вреди на растението.

Ако трябва да се използва външно приложение на ензима за защита на растение или на част от растение срещу патогени, ензимът може да се разреди, за да образува воден разтвор или суспензия, или да се смеси с разредител в твърдо състояние, за да се приложи на прах. Прецизният начин на приложение ще зависи до определена степен от конкретния патоген(и) и прицелно растение (я). Подробни методи за адаптиране на общите методи на приложение към специфични култури и патогени могат да се намерят в “Methods for evaluating pesticides for control of plant pathogens”, K. D. Hickey, ed., The American Phytopathological Society, 1986. Допълнения, които могат да се прибавят в рецептата, включват агенти, улесняващи разтворимостта, овлажнители и стабилизатори, или агенти, които образуват микрокапсулиран продукт. Такива добавки са добре известни в практиката.

За външно приложение могат да се използват още рекомбинантни микроорганизми в живо състояние или след превръщането им в нежива форма чрез метод, който не инактивира ензима.

Пречистването на оксалатдекарбоксилаза от С. velutipes, както и характеризирането на изолирания ензим са описани в примерите подолу. След хроматофокусиране са разделени двете форми на ензима. За двата изоензима е показано, че са родствени по аминокиселинен състав, пептидно картиране и кръстосана имунореактивност. Пик А, елуиращ се при pH 3,3, е използван за по-нататъшни изследвания. Установено е, че К е 4,5 мМ a V е 166 nmol/ min/mg. Молекулната маса на субединицата на гликозилирания ензим е 64 kDa, докато масата на дегликозилирания белтък - 55 kDa. Ензимът показва кисело pl, значително стабилен е в широк pH-интервал и е умерено термостабилен.

Генът, кодиращ оксалатдекарбоксилаза с гъбен произход и с последователност, показана на SEQ ID + 1, е клониран, както е описано в примерите, които следват. Накратко, сДНК, кодираща ензима, е получена чрез имуноскрининг на експресионна библиотека в λ-gtll. Транслация in vitro на mPHK, отделена чрез хибридизация, дава 55 kDa белтък. Геномна ДНК-хибридизация показва, че оксалатдекарбоксилазата се кодира от единичен ген. сДНКсондата хибридизира с един единствен вид mPHK с дължина 1,5 килобази. Показано е, че тРНК се индуцира от оксалова киселина. Наблюдавана е зависимост във времето между ензимната активност и нивото на mPHK, което показва, че експресията на оксалатдекарбоксилазата се регулира на транскрипционно ниво.

Генът с първичната структура, посочена на SEQ ID + 1, която съдържа последователността на зрелия оксалатдекарбоксилазен ензим, може да се прикачи към генни регулаторни елементи, които са необходими за експресията на структурния ген в определена клетка-гостоприемник. Първият тип регулаторен елемент, който се изисква, е област на генен промотор, който съдържа ДНК-последователности, разпознаващи се от биологичната машинария на растителната клетка, и който индуцира транскрипцията на ДНК-последователността в информационна РНК (mPHK). тРНК след това се транслира в белтъчен продукт, който се кодира от областта на структурния ген. Промоторът се прикачва фронтално на, или 5' спрямо, гена за оксалатдекарбоксилаза, което може да се осъществи съгласно известни стандартни методи. Например Maniatis et al, (1982) Mole cular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 104 - 106.

Промоторни области, които могат да се използват за експресия на оксалатдекарбоксилазния ген в растителни клетки, включват промотори, които са активни в широк набор от различни растителни тъкани. Например 35Sпромоторът от мозаичния вирус по карфиола може да бъде подходящ за тази цел. Друг тип промотор, който може да се използва в растителни клетки, е такъв, който експресира при по-ограничени условия. Този клас включва промотори, които са активни само в определена (и) тъкан (и) на растението и/или се индуцират към активност от определени стимули, като например нараняване. Пример за този тип промотор е 5'-регулаторната област на гена за фенилаланинамоняклиаза (ФАЛ). Този тип промотор е дискутиран в Liang et al., (1989), PNAS, USA, 86:9284-9288. Експресията на оксалатдекарбоксилазния ген в микробни гостоприемници може да се постигне чрез използване на промотори, получени от микробни източници. Примери за такива промотори включват trpпромотора за експресия в бактерии, такива като E.coli, какъвто пример е даден в Amann et al, (1983) Gene 25:167-178), или промотора на глицералдехидфосфатдехидрогеназата за експресия в дрожди, какъвто пример е даден в Edens et al, (1984), Cell 37:629-633. Последователностите на гениите промотори могат също така да се получат частично или изцяло от промоторни последователности, открити в клетки, различни от клетката-гостоприемник, доколкото те отговарят но горепосочените критерии за транскрипция и транслация.

Втори генетичен регулаторен елемент, който по желание, без това да е необходимо, може да се прикачи към оксалатдекарбоксилазния ген, е терминатор или полиаденилационна последователност, която съдейства за ефективно завършване на транскрипцията на гена, а в еукариоти също така спомага за полиаденилиране, т.е. добавянето на известен брой еданозинови нуклеотиди към 3'-края на тРНК. Познатите стандартни методи могат да се използват, за да се прикачи терминаторът зад, или 3' към, гена. (Виж, например, Т. Maniatis et ак, по-горе, pp. 104 - 106). Пример на такава последователност за терминация/полиаденилиране за експресия в растения е тази на октопинсинтазния ген от Ti-плазмида на Agro bacterium tumefaciens, както се съобщава в DeGreve et al, (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1:499511. Пример на такъв терминатор за експресия в микробни гостоприемници е последователността от Salmonella typhimurium за ро-независима терминация на транскрипцията. Виж. например, М. Е. Winkler, (1987), “Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology”, F. C. Neidhardt, ed. in chief; American Society for Microbiology. Генни последователности за терминация могат също така да се получат частично или изцяло от терминаторни последователности, намерени в клетки, различни от тези на клетката-гостоприемник, доколкото те отговарят на посочените критерии за терминация на транскрипцията и полиаденилиране, изисквани от клеткатагостоприемник.

Друг тип регулаторен елемент, който може да се прикачи към гена за оксалатдекарбоксилаза, е ДНК-последователност, кодираща сигнален пептид. Сигналният пептид се прикачва към аминокрая на белтъка и позволява белтъкът да се локализира в клетъчната стена или да се секретира от клетката-гостоприемник. При този процес на локализация сигналният пептид се отстранява, при което се получава белтъчен продукт с последователността на зрелия белтък. Могат да се използват известни рутинни методи, за да се прикачи ДНК-последователността на сигналния пептид. (Виж например Т. Maniatis et al., по-горе, рр. 104 106). Примери за такива сигнални последователности включват сигналния пептид от гена за екстензин на растения (Chen and Varner, 1985, EMBO J. 4:2145-2151) от бактериалния ре1В-ген (пектатлиаза) на Erwinia carotovora (Lei et al, (1987), J. Bacteriol. 169:4379) и от препро-фактора на дрожди (Smith et al, 1985. Science 229:1219-1229). Последователностите за сигнални пептиди могат също така да се получат частично или изцяло от терминаторни последователности, намерени в клетки, различни от тези на клетката-гостоприемник, доколкото те отговарят на споменатите критерии за зреене и локализация на белтъка в клетката-гостоприемник.

Всеки един от различните методи, известни за въвеждане на чужди гени в растения, може да се използва за включване на оксалатдекарбоксилазния ген в растението-гостоприемник. Методологията, избрана за извърш ване на растителна трансформация с оксалатдекарбоксилазния ген, варира в зависимост от растението-гостоприемник. Например една добре охарактеризирана методология, която би била от полза в растителната трансформация с оксалатдекарбоксилазния ген, е трансформация чрез Agrobacterium.

Трансформация с оксалатдекарбоксилазния ген чрез Agrobacterium следва добре известните за тази методология процедури. Първо, генна касета, подходяща за експресия в растения, се въвежда в обезвреден щам на Agrobacterium tumefaciens като междинен гостоприемник. Касетата на оксалатдекарбоксилазния ген се въвежда в Т-ДНК-областта на рекомбинантен плазмид, съдържащ маркерен ген за селекция, такъв като ген, кодиращ неомицинфосфотрансфераза II, фосфинотрицинацетилтрансфераза или подобни. Тази методолигия е използвана в редица публикации, включващи Horsch et al., (1985), Science 227:12291231. Късчета растителна тъкан, напр. листа, семедел, хипокотил се коинкубират с бактериите за 2 - 3 дни, преди бактериите да се убият чрез използване на антибиотици, такива като карбеницилин. Допълнителни антибиотици, отговарящи на използваните маркерни гени за селекция, се включват в средата за култивиране на растителната тъкан така, че да растат само трансформирани растителни клетки.

Растения, регенерирани от трансформираните клетки, след това се тестират за наличието и експресията на оксалатдекарбоксилазния ген. За идентифициране на индивидуални трансформанти могат да се използват имунологични методи и тестове за оксалатдекарбоксилазна активност. Като функционален тест за интактни тъкани може също така да се използва толерантността към екзогенна оксалова киселина.

Както бе отбелязано, отделно от трансформацията чрез Agrobacterium, на разположение са и няколко други методологии за растителна трансформация. Примери за тези други ДНК-въвеждащи методи включват електропорация, т.е. въвеждане в протопласти, индуцирано по химичен път, микроинжектиране, микробомбардиране и други. Пример за растения, които не са подходящи за трансформация чрез Agrobacterium, са соя и някои хлебни растения, вкл. царевицата. Тези растения могат да използват напълно възможностите за растителна трансформация чрез използване на методи, различни от трансформацията чрез Agrobacterium.

Определени аспекти на изобретението са описани в по-големи детайли в примерите, които следват.

Примерни изпълнения

Пример 1. Пречистване и характеризиране на оксалатдекарбоксилаза

Експериментални протоколи - организъм и условия на растеж: С. velutipes (щам S.A.T.C.C. 13547) се култивира върху повърхността на среда, съдържаща 5 % декстроза, 1 % пептон, 0,1 % КН₂РО₄, 0,05 % MgSO₄.7H,O) и 1 % малт-екстракт на Difco при pH 5,2. Организмът се култивира от мицелен инокулат при 25°С в стационарни култури с обем на средата една пета от обема на матраци за култивиране. Около 25 дни след инокулирането ензимът оксалатдекарбоксилаза се индуцира чрез добавяне на 12.5 тМ оксалова киселина към всеки културален матрак. Мицелът е събиран 2 до 3 дни след добавянето на оксалова киселина, промиван със студена дестилирана вода и съхраняван на 20°С. С. velutipes е съхранявана върху скосена повърхност на същата среда (Jakoby, Methods in Enzymology 5:637 (1962)).

Пречистване. Етап 1. Приготвяне на суров екстракт. Замразеният мицел се стрива във Waring-блендер за 10 min със сух лед или с течен азот. Прахът се екстрахира с три обема 0,1 М калиевоцитратен буфер, pH 3,0 за 10 min на 4°С и суспензията е центрофугирана на 10 000 Xg за 30 min на 4°С. Надстоящата течност се филтрува през два слоя марля.

Етап 2. Утаяване с ацетон. Концентрациите на ацетона са заимствани от Shimazono and Hayaishi (J. Biol. Chem. 227:151 (1957)), c изключение на това, че последните два етапа не са проведени. Процентите се пресмятат на базата обем/обем, като се вземат предвид сумарните обеми, (а) Ниската температура за утаяването с ацетон се поддържа чрез леденосолева баня на -10°С. Пробата се изстудява до 0°С и първото ацетоново утаяване при 33,3 % се прави чрез добавяне на капки на изстуден ацетон към надстоящата течност при постоянно механично разбъркване. (Ацетон-1). Сместа се еквилибрира за 15 min и образуваната утайка се отстранява чрез центрофугира не в предварително охладен ротор на 10 000 Xg, 20 min на 2°С. Утайката, получена от фракциониране 33,33 % - 50 %, се разтваря в една пета от началния обем студен 0,1 М калиевоацетатен буфер с pH 4,5. Ензимният разтвор се диали-зира за 16 h при 4°С срещу две смени на 0,02 М калиево-ацетатен буфер, pH 4,5, и малката утайка, образувана по време на диализата, се отстранява чрез центрофугиране (Ацетон-П). (Ь) Надстоящата течност се довежда до 40 % ацетон (Ацетон-Ш) и получената утайка се изхвърля. Утайката от следващо добавяне до 50 % (Ацетон-IV) се разтваря в малък обем 0,02 М калиево-ацетатен буфер, pH 4,5.

Етап 3. Хроматофокусиране. DEAESepharose CL-6B (Pharmacia) се еквилибрира в 0,02 М калиево-ацетатен буфер, pH 4,5, и използва, за да се опакова 10 ml-колона (1 х 13 cm вместимост). Утайката от последното ацетоново утаяване се нанася при проточна скорост 10 ml/h. Колоната се промива с два обема на колоната 0,02 М калиево-ацетатен буфер, pH 4,5, а елуирането е проведено чрез развиване на вътрешен рН-градиент при използване на 4 тМ кисела буферна смес (4 тМ всяка от DL-аспарагинова киселина, L-глутаминова киселина и глицин, pH 2,3). Елуирането се осъществява при скорост на потока 10 ml/h и събрани 2 ml-фракции; белтъците са наблюдавани при абсорбция 280 nm; фракциите се изследват за ензимна активност и се определя pH на всяка фракция. Фракциите, които съдържат ензимна активност, са обединени, диализирани срещу вода и концентрирани с Amiсоп-микроконцентратор (30 000 отрязък). Ензимът се съхранява на 4°С.

Ензимно определяне. Оксалатдекарбоксилазната активност се определя чрез измерване освобождаването на ¹⁴СО₂ от [^|4С]-оксалова киселина (Amersham, 4,1 mKu/mmol). Ензимното определяне се извършва в малки стъклени епруветки, които съдържат 1 ml от следната реакционна смес: 0,2 М калиев цитрат, pH 3,0, 0,005 М калиев оксалат, pH 3,0, 5,6 nmol (0,0227 pKu) (¹⁴С)-оксалова киселина и 0,2 ml ензимен разтвор. Епруветките се преинкубират за 5 min преди добавянето на ензима. Епруветките се затварят с гумени запушалки и инкубират на 37°С за 30 min на водна баня на клатачка. Реакцията се спира чрез инжектиране на 0,2 ml 50 % обем/обем трихлоро цетна киселина през гумените тапи и епруветките се клатят допълнително още 60 min за улавяне на всичкия ^|4СО₂, преминал в 0,2-та ml метилбензетониева основа (Sigma), поставена в пластмасови епруветки вътре в стъклените епруветки. Пластмасовите епруветки се отделят, съдържанието им се прехвърля в 5 ml толуолова сцинтилационна течност и радиоактивността се определя с течен сцинтилационен брояч. Заложени са нулеви епруветки, в които преди ензима се добавят 0,2 ml 50 % ТХА или ензимът се отстранява. В експерименти по изследване на кинетиката стойностите се коригират чрез приспадане радиоактивността на ензим, денатуриран чрез нагряване до кипене.

Определение за единица. Една единица се определя като количеството ензим, който освобождава 1 pmol ¹⁴СО₂ за 1 min на 37°С при стандартни условия на определяне. Общата ефективност на определянето е обикновено между 60 - 70 %. Белтък се определя по метода на Lowry (Peterson, Anal. Biochem. 83:346 (1977)). V_max и K_m се определят по диаграмата на Lineweaver-Bruk (Lineweaver and Bruk, J. Am. Chem. Soc. 56:658-666 (1934)).

Определяне на молекулна маса. Молекулната маса на оксалатдекарбоксилазата се определя чрез гел-филтрационна хроматография. Пречистеният ензим (100 pg в 100 ml) се нанася върху FPLC гел-проникваща колона (Superose 12: 10 х 300 nm) при скорост на потока 0,5 ml/min и използване на 0,02 М калиево-ацетатен буфер, 0,1 М KCL, pH 4,5, при стайна температура. Белтъците се определят спектрометрично при дължина на вълната 280 nm. Използваните стандартни белтъци са тиреоглобулин (660 kDa, Pharmacia), феритин (440 kDa, Pharmacia), каталаза (230 kDa, Pharmacia), алдолаза (158 kDa, Pharmacia), алкохолдехидрогеназа (150 kDa, Sigma) и kapбоанхидраза (29 kDa, Sigma). Субединичният състав се определя чрез натриево-додецилсулфатна полиакриламидна вертикална гел-електрофореза в 7% до 15% градиентен гел чрез използване буферната система на Laemmli (Laemmli, Nature 227:680 (1970)).

Критерии за чистота. Хомогенността на пречистената оксалатдекарбоксилаза се определя чрез разделяне на 10 pg белтък (пик А) на двудименсионална електрофореза съгласно O’Farrell (O’Farrell, J.Biol.Chem. 250:4007 (1975)).

Аминокиселинен състав. Пробите се хидролизират с 6М НС1 в обезвъздушени и затворени епруветки на 110°С за 22 h. Хидролизатите се анализират с аминокиселинен анализатор (LKB 4151 Alpha Plus). Цистеинът и цистинът се определят като цистеинова киселина след окисление с пермравчена киселина. Триптофан не е определян. Разграждане с протеаза VB се провежда, както е описано по-горе (Cleveland, Methods in Enzymol. 96:222 (1983)).

Въглехидратен анализ. Гликопротеините се оцветяват чрез използване на реагента перйодат-Шиф база. Естественото захарно съдържание се определя чрез методи на фенол-сярната киселина (McKelvy et al., Arch. Biochem. Biophys. 132: (1969)) c глюкоза като стандарт. Ензимът се дегликозира чрез Ендо-β, N-ацетилглюкозаминидаза от S.plicatus, (Boehringer Manneheim, 40 mE/pg) съгласно Trimbe (Trimbe et al., Anal.Biochem. 141:515 (1984)).

Приготвяне на антисерум. Оксалатдекарбоксилазата (1 mg/ml) се подлага на топлинна денатурация чрез кипване за 10 min в PBS в присъствие на 0,5% HDC. Белтъчният антиген (150 pg) в PBS се емулгира с пълен адювант на Фройнд и инжектира подкожно на Новозеландски бял заек. Последващи усилващи дози се прилагат в непълен адювант на Фройнд подкожно след период от три седмици. Четвърта инжекция се прави интравенозно. Титърът на антитялото се отчита при използване на имунодифузионната техника на Ouchterlony (Garvey et al. (1977) Methods in Immunol. 3 rd Ed.W.A. Benjamin Inc., N.Y.). Афинитетното пречистване на антитялото се прави съгласно Iwaki et al (Iwaki et al. Cell 57&71 (1989)).

Имуноблотинг и имунодетекция. Белтъците се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана (Schleicher & Schuell) при 150 mA постоянен ток за 3 h на 15°С съгласно метода на Towbin et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76:4359 (1979)). Имунологичното определяне се осъществява чрез използване на антиоксалатдекарбоксилазно антитяло при разреждане 1:5000 и проявяване с взаимодействие с алкална фосфатаза (Amersham, система за имуноскрининг Super-screen).

Резултати. Максимална активност на оксалатдекарбоксилазата се получава 2 или 3 дни след добавяне на оксалова киселина. Резултатите от типична процедура за пречистване са дадени в таблица 1. Върху хроматофокуси раща колона ензимът се разделя на два пика: пик А се елуира при pH 3,3, а пик В - при pH 2,5 (фиг. 1). Пик А се пречиства 1670 пъти с добив 2,9%, докато пик В коелуира с два малки по количество белтъка и се пречиства 614 пъти с 15% добив (таблица 1). Тези съпътстващи белтъци могат да се отстранят след прекарване през гел-филтрационна хроматографска колона Sepharose 4В и този белтък се използва за определяне на аминокиселинния състав. Поради високата чистота на пик А този белтък се използва за по-нататъшна работа. Материалът в пик А се елуира като единичен пик от колона за високоефективна белтъчна течна хроматография Superose 12 и 10 pg белтък дават единично петно върху двудименсионална гел-електрофореза (фиг. 2В). Серийните двукратни разреждания на ензима показват, че чрез оцветяване с Кумаси-блу могат да се открият (определят) минимум 45 mg белтък 5 (фиг. 2В). Разстоянието на придвижване на ензимната активност (R_f = 0,35, гелно късче 4) корелира с това на единичната оцветена ивица върху неденатуриращ PAGE (фиг. 3). В нито една друга част на гела не са открити 10 белтъчни ивици или ензимна активност. Ензимните препарати са стабилни на 4 или -20°С и след съхранение 4 месеца на 4°С при (концентрация) 1 mg/ml в 0,02 М калиев ацетат (pH 4.5) могат да се измерят 70% от началната 15 активност.

Типичен експеримент на пречистване*

Таблица 1

Стъпка на пречистване	Тотален белтък, mg	Тотална активност, единици	Специфична активност E/mg	Пречистване, пъти	Добив, °/ /0
1. Суров екстракт	4480	950	0,21	1	100
2. Ацетон II	120	608	5,06	24	64
3. Ацетон I	3,8	260	68,8	328	27,3
V 4. Хромато фокусиране а. Пик А	0,08	28	350	1670	2,9
б. Пик В	1,24	160	129	614	16,8

* Използвани са 150 g прах, стрит с течен азот.

Данните за аминокиселинния състав на двата пика показват наличието на много високо съдържание на кисели аминокиселини (22%) (таблица 2). На това могат да се дължат техните ниски стойности за pl, въпреки че амидираната част в нативния белтък не е определяна. Двата пика имат много близък аминокиселинен състав, с изключение на два пъти по-високото метиониново и тирозиново съдържание в пик В и на два пъти по-високото съдържание на цистеинова киселина в пик А. Допълнително родство е показано чрез пеп50 тидните карти на двата пика чрез използване на протеаза VB от Staphyloccoccus aureus (фиг. 4). Афинитетно пречистените антитела, насочени срещу пик А, реагират кръстосано с белтъка от пик В. Аминокиселинният състав, пептидните карти и имунологичната кръстосана реактивност показват, че двата пика, разделени след хроматофокусиране, са родствени един с друг. Двете форми с различия в pl могат да произлизат от различни степени на амидиране или на съдържанието на кисели аминокиселини, или могат да се дължат на микрохетерогенност в съставящите ги олигозахаридни вериги.

Таблица 2.

Аминокиселинен състав

	Пик A. 7 /О	Пик B, 7 Zo
Asx	10,57	10,31
G 1 х	11.75	11,52
Lys	3,2	2,69
Arg	2,84	2,89
His	2.66	2,74
Gly	B.44	9.44
Ser	7,23	7,19
Thr	Θ.56	8.48
Cys=	0,66	0,28
Tyr	0.04	1,85
Ala	11,03	10.92
Vai	6.31	6,52
Leu	7,74	7,19
lie	4,00	3,86
Pro	B,64	8,46
Phe	5,13	4,68
Met	0,34	0,69
Trp	HG^B	HO
Дпоня k	HO	HO

а: молен процент

Ь: неопределено с: определено като цистеинова киселина

Молекулната маса на нативния ензим, определена чрез гел-филтрация, е 560 kDa. Електрофореза в 7-15% градиентен НДС-полиакриламиден гел показва наличието на единичен полипептид от 64 kDa (фиг. 2А). Тази молекулна маса се получава постоянно за всички различни проценти на гела, проведен в буферната система на Laemmli. Когато ензимът е третиран с ендо-р-М-ацетилглюкозаминидаза Н, големината на голямата дегликозилирана ивица е 55 kDa (фиг. 5). Установено е, че ензимът е гликозилиран и наблюдаваният голям размер на молекулата, получена чрез гел-филтрация, може да се дължи на тенденцията на някои гликопротеини да взаимодействат нековалентно в разтвор (Farach - Carson et al., Biotechniques 7:482 (1989); Kleinman et al. Biochemistry 25:312 (1986)).

От диаграмите на Lineweaver-Bruk за калиев оксалат като субстрат е изчислена стойност за Km 4,5 mM. Това дава V_max от 166 μπιοί/ 40 пин/mg. Ензимът се подлага на конкурентно инкубиране от фосфатни йони и когато към реакцията е добавен 90 mM РО₄ ²', се получава Ki 9 тМ. Ензимът е специфичен за оксалати като субстрат, тъй като той не използва за 45 субстрати лимонена, оцетна, оксалова, янтърна и мравчена киселина.

Ензимът не се инхибира необратимо в широк интервал от стойности за pH и рН-оптимума за декарбоксилиране е 3,0. Ензимът за50 пазва 78% от първоначалната си активност след 20 min инкубиране на 80°С. Ензимната активност не се повлиява от реагенти със сул фхидрилни групи, тъй като ензимът съхранява 95% от активността си в присъствието на 50 тМ р-хлоромеркурибензенсулфонова киселина или 50 тМ йодоацетат. Оксалатдекарбоксилазата запазва 45% от своята активност след инкубиране с 10% НДС за 30 min на стайна температура. Обаче при нагряване до 60°С в присъствието на 10% НДС почти цялата активност изчезва. Гликопротеиновата природа на ензима е показана чрез положително оцветяване с реагента перйодат-Шиф база; той се свързва с конкавалин A-Sepharose и се елуира с 0,5 М α-метилманозид. Съдържанието на неутрални захари се определя на 15% чрез метода на фенол/сярната киселина.

Имунотитруването на ензима с 8 μΐ суров антиоксалатдекарбоксилазен антисерум елиминира 60% от първоначалната активност в надстоящата течност (фиг. 6). Антисерумът срещу оксалатдекарбоксилаза, използван при разреждане 1:5000, би могъл да открие минимум 1,0 ng от белтъка на пик А. Антисерумът реагира кръстосано с всички пептиди, получени след разграждане с протеаза VB (фиг. 4) и с дегликозилираните форми на пикове А и В на ензима. Антисерумът, който е афинитетно пречистен срещу белтъка на пик А, реагира кръстосано с пик В на оксалатдекарбоксилазата и с оксалил-СоА-декарбоксилаза от Охаюbacter formigenes, щам ОхВ. Той не реагира кръстосано с оксалатдекарбоксилаза от Hordeum vulgaris (ечемик).

Пример 2. Молекулно клониране и експресия на ДНК, кодираща оксалатдекарбоксилаза

Експериментален протокол. Молекулно клониране. Тотална РНК се екстрахира от С. velutipes, стрита на прах в течен азот, съгласно метода на Chomezynski и Sacchi (Anal. Biochem. 162:156 (1987), и поли(А) РНК се селекционира чрез два цикъла на хроматография върху олиго (gT) целулоза. Синтезата и клонирането на сДНК и имуноскрининга на библиотеката се провеждат, следвайки инструкциите на Amersham. сДНК е синтезирана от мРНК на култури, индицирани 12 h с оксалат, чрез олиго (gT) като зародиш при матрица 5 pg поли (А+)-РНК и клонирана в EcoRIрестрикционното място на ламбда gtll. Опакованите фаги се намножават в гостоприемник E.coli Y1090 г за имуноскрининг. Антиоксалатдекарбоксилазните антитела предварително се адсорбират с 1 mg/ml клетъчен лизат на E.coli Y1090 за отстраняване на фоновата реактивност и използвани за имуноскрининг. За откриване на положителните клонове се използва кози антизаешки IgG-конюгат с алкална фосфатаза. ДНК се приготвя от имуноположителни фаги съгласно Del Sal (Biotechniques 7:514 (1989)' и се определя големината на техните инсерти. Слетите белтъци се охарактеризират съгласно (Annal.Biochem. 156:354 (1986)). Родството на инсертите се изследва чрез използване на един от инсертите като сонда. 1,2-книнсертът от клон + 3 се подлага на субклониране в pTZ18U (USB) и се използва като сонда за други експерименти.

Диференциална хибридизация. Диференциалната хибридизация на имуноположителните клонове се изследва чрез изготвяне на едноверижна сДНК-сонда, синтезирана от тРНК, изолирана от мицел при 0 h и 12 h на индукция с оксалат. Рекомбинантната фагова ДНК (0,5 g) се свързва за Gene Screen Plusмембрани в дуплики на Hybrislot™ филтрационен умножител съгласно инструкциите на ръководството на Gene Screen Plus и се хибридизира към индуцирани с оксалат и неиндуцирани сДНК-сонди. Специфичната активност на пробата е 2 х 10⁸ срт/ g кДНК.

Хибридизация. Хибридизацията на ДНКи РНК-блотовете се провежда на 42°С чрез използване на формамидната процедура в ръководството на Gene Screen Plus. Прехебридизация през нощта се провежда в 50% дейонизиран формамид. 1% НДС, 1 М натриев хлорид, 10% декстрансулфат. Блотовете се хибридизират в денатурирана сонда (1-4 х 10⁵ dpm/ ml) при 42°С за 24 h. Мембраните се измиват последователно в 2 промивки, всяка в 2XSSC на стайна температура, 2XSSC плюс 1 % НДС на 65°С за 30 min, 0,lXSSC на стайна температура за 30 min. Влажните мембрани се експонират в пластични опаковки върху Kodak XAR-филми в присъствие на усилващ екран.

Приготвяне на сондата. ДНК, субклонирана в pTZ18U, се хидролизира с EcoRI и ДНК-инсерта, разделен в 2% гел на нискотопяща се агароза, се изрязва и се бележи с (а³²p)gAT<D по метода за маркиране чрез случайни зародиши на Feinberg и Vogelstein (Anal. Biochem. 137:226 (1984)).

Изолиране на геномна ДНК и ДНК-блотинг анализ. Геномна ДНК се изолира от ли офилизирана C.velutipes по метода на Zolan и Pukkila (Mol.Cell.Biol. 6:195 (1986)). ДНК се пречиства два пъти на CsCl-градиент, за да се получи ДНК, която би могла да се хидролизира с рестрикционни ензими. 4 pg геномна ДНК се хидролизира с различни рестрикционни ендонуклеази и се разделя в 1,2% агарозен гел. ДНК се прехвърля върху Gene Screen Plusмембрана чрез метода за алкален блотинг (Reed and Mann, Nucleic Acids Res. 13:7207 (1985)).

Транслация in vitro. Поли(А+) PHK ce транслира чрез използване на заешки ретикулоцитен лизат съгласно инструкциите на производителя (Promega). Транслираните белтъци се утаяват чрез специфичен антисерум и анализират чрез НДС-полиакриламидна гелелектрофореза.

Хибридно селекциониране. Хибридното селекциониране на оксалатдекарбоксилазната шРНК се провежда чрез хибридизация на поли (А⁺) РНК (20 pg в 200 pl 65% формамид, 0,5% НДС, 100 pg/ml дрождена тРНК) при 50°С 4 h към Gene Screen Plus-мембрана, върху която се свързва денатурирана сДНК (4 pg). Филтрите се приготвят съгласно ръководството на Gene Screen Plus и се провежда хибридизация, промиване и елуиране на хибридизиралата РНК (Jagus, Methods in Enzymol. 152:567 (1987): Parnes et al., Proc.Natl.Acad. Sci. USA 78:2253 (1981)). Елуираната РНК се екстрахира c фенол-хлороформ (1:1), утаява в етанол, разтваря направо в in vitro-транслационната смес и имунопреципитира съгласно Anderson и Biobel (Methods in Enzymology 96:111 (1983)).

РНК-блот анализ. 1 pg поли (А⁺) РНК или 10 pg тотална РНК се денатурират с глиоксал, разделени в 1,2% агарозен гел съгласно Sambrook (Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) и са пренесени по капилярен път върху Gene Screen Plus-мембрана съгласно инструкциите в ръководството на Gene Screen Plus. Филтрите се сондират с ^32р-белязан 1,2 кв сДНК-инсерт.

Резултати. Както е отбелязано по-горе, сДНК експресионна библиотека е конструирана от 12-часова оксалат-индуцирана тРНК в λ-gtll. Скринирани са приблизително 47 000 рекомбинанта с антитялото, получено с E.coliлизат. Получени са и пречистени петнадесет имуноположителни клона; от тях дванадесет хибридизират кръстосано. Те кодират слети бел тъци с големини, сравними с големините на инсертите (фиг. 7А). Фаговата ДНК от 15-те имуноположителни клона се имобилизира върху Gene Screen Plus-мембрана в дуплики и сондира с оксалат-индуцирана и неиндуцирана сДНК-проби. Диференциалната хибридизация на 15-те имуноположителни клона показва, че 12 хибридизират със сДНК-сондата от оксалат-плюс тРНК и не дават сигнал с оксалат минус тРНК (фиг. 7В). По този начин експресията на 12 клона се индуцира от оксалат.

Субклонът pTZ18U на 1,2-кв-инсерта от λ клон 3 се използва, за да се отдели чрез хибридизация тРНК. Транслацията in vitro на така отделената чрез хибридизация тРНК и имунопреципитацията на транслирания продукт дава ивица от 55 kDa (фиг. 8В, ивица 2), която е сходна с големината, получена с тотална поли(А⁺) тРНК (ивица 3) и отговаря на големината на дегликозилиран белтък. Този 55-kDa белтък не се получава, когато се премахне тРНК (фиг. 8В, ивица 1) или с нерекомбинантните векторни последователности (ивица 4). Продуктът от 55 kDa се получава с 12-ч тРНК (фиг. 8А, ивица 2) и не е получен с неиндуцирана, О-ч тРНК (ивица 1); за ивицата от 55 kDa е показано, че е родствена с оксалатдекарбоксилазата, тъй като пречистената оксалатдекарбоксилаза я конкурира за местата на свързване с антигена и причинява понижаване в интензивността на 55 kDa-овата ивица (ивица 3) в експериментите по in vitroтранслация и имунопреципитация.

Геномни ДНК-блотове при използване на 1,2 кв-инсерта като сонда показват наличието на единични ивици при хидролизите с BamHI, EcoRI, Hindlll, PvuII, SspI, Xbal и Xho, което показва наличието на еднокопиен ген (фиг. 9В). Двете ивици с нееднакви интензивности, получени с ΚρηΙ и с PstI, са следствие от наличието на вътрешни места за тези ензими (единично място за всеки ензим) в 1,2 квсДНК инсерта. Сондата от 1,2 кв хибридизира с единичен вид тРНК от 1,5 кв от 12-ч оксалатиндуцирана поли(А+) РНК, а хибридизация с РНК от неиндуцираната пътека не е наблюдавана (фиг. 9А).

От същите партиди култури се събират проби от различни стадии след индукция и се анализират за нивото на РНК, ензимна активност и тотален белтък. РНК-блотът на тотална РНК показа, че 1,5 кв-ивицата отсъства на 0 h и достига връх на 12-тия h. Три дни след индукция не може да се открие РНК (фиг. 10В). Ензимна активност е открита 12 h след добавяне на оксалат и на втория ден е наблюдавана пикова активност, след което тя постепенно намалява. Не е наблюдавано съгласувано покачване или намаляване на тоталния белтък (фиг. 1 ОС). Следователно е наблюдавана времева зависимост между появата на ензимна активност и нивата на тРНК, тъй като нивата на тРНК достигат връх 12 h след индукция, а максималната ензимна активност е получена 48 h след добавяне на оксалова киселина.

Всички цитирани литературни източници са посочени на съответните места.

Пример 3. Клониране на оксалатдекарбоксилазата. За прикачване на ДНК, кодира5 ша сигнален пептид, към оксалатдекарбоксилазния ген на pOXDl, се използва PCR (полимеразна верижна реакция). Избран е сигналният пептид на екстензиновия ген от Niccotiana plumbaginifolia. Целият сигнален пептид, 10 заедно с две аминокиселини на зрелия екстензинов белтък, са свързани пред декарбоксилазния ATG-кодон.

5’ ПВР-олигонуклеотидът е EXTOXD-5: 5'-GAAGACGATAGGATCCATTTGTTTCAAAG*ATG GGA AAA ATG

BamHI *Met Gly Lvs Met

4----некодираща ДНК---->

GCT TCT CTA TTT GCC АСА TTT TTA GTG GTT TTA GTG TCA Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Vai Vai Leu Vai Ser

CTT AGC TTA GCT /ТСТ GAA [ATG TTC AAC AAC TTC CAA] Leu Ser Leu Ala Ser Glu [Met Phe Trp Trp Phe Gin] [-] Припокриване c началото на оксалатдекарбоксилазния ген * Начало за транслация в началото на сигналния пептид / Място на зреене в транслационния продукт

3' PCR-олигонуклеотидът е EXTOXD-3, насочен срещу последователност в позиция 2ΙΟΙ 90 на оригиналната pOXDl-последователност (низходящо след Kpnl-мястото):

5-TGGGTCACTGGTCTCATT-3'

При използване на горните зародиши в PCR-реакция с pOXDl-плазмидна ДНК като матрица са получени само непълноценни продукти.

За обогатяване на този първичен продукт на пълноразмерни продукти, той се реамплифицира чрез използване на същия 3'-, но на нов 5'-зародиш, EXTOXR-6 (5'-G AAGACGATAGGATCCATTTG-3'), която представлява отделената 5'-последователност на EXTOXD-5 по-горе.

След втория етап на PCR се визуализира ивица с очакваната големина (прибл. 290 ng). Тя се пречиства, хидролизира се с BamHIΚρηΙ и се клонира в pOXDl, от който се отст35 ранява присъстващият там BamHI-KpnI-фрагмент (125 ng). Общо седемнадесет клона, съдържащи по-големия фрагмент, се секвенират в областта на инсерта.

За един от клоновете е потвърдено, че съдържа правилната последователност в инсерта BamHI-Kpnl. Генът сигнален пептид/оксалатдекарбоксилаза се изолира от този клон като BamHI-EcoRI-фрагмент, чиито краища са загьпени с Klenow, и е включен в Smal-мястото на pJRIRi.

Рекомбинантите са идентифицирани чрез 45 хибридизация, а ориентацията е потвърдена чрез диагностични хидролизи (Hindlll-EcoRl, Kpnl, Hindlll и PstI). Клонът, съдържащ ОХD-касетата в същата ориентация, както nptllкасетата, е означена pSR21 = OX-D-касета, ин50 сертирана в Smal-мястото

Фигура 11 показва нуклеотидната последователност на сДНК-инсерта от 1420 вр в pOXDl.

Фигура 12 илюстрира конструирането на плазмида pSR21.

Пример 4. Трансформация на тютюн при използване на векторите, описани по-горе.

(a) Пренос на вектори в Agrobacterium

Конструкциите са въведени в A. tumefaciens LBA4404 чрез директна трансформация, следвайки публикуваните процедури.

Наличието и цялостта на конструкциите са потвърдени чрез рестриктазна хидролиза и ДНК-блот-експерименти, проведени, за да се провери, дали не е станала рекомбинация по време на преноса на векторите в Agrobacterium.

(b) Трансформация на тютюневи листни дискчета

Листни дискчета от тютюн (N. tabacum, сорт Samsun) са трансформирани чрез използване на рутинни методи, публикувани по-рано. Растения, съдържащи конструкцията, са идентифицирани чрез PCR и отбрани за по-нататъшен анализ.

Пример 5. Определяне на оксалатдекарбоксилазната активност в трансгенни растения. Ензимната активност е определена чрез измерване на всеки от двата разпадни продукта при декарбоксилирането на оксалат (въглероден двуокис и формат). Освобождаването на ^|4СО₂от ¹⁴С оксалова киселина е определено, както следва (Metha and Datta, 1991). Стъклени епруветки, съдържащи реакционна смес, (виж по-долу) се преинкубират за 5 min преди добавяне на екстракт/ензим. Епруветките се затварят и инкубират на 37°С за 30 min в клатеща се водна баня. Реакцията се спира чрез инжектиране на 0,2 ml 50% (обем/обем) трихлороцетна киселина през запушалката. Епруветките се клатят в метилбензетониевата основа (0,2 ml), поставена в пластмасови епруветки вътре в стъклените епруветки. Пластмасовите епруветки се отделят, съдържанието им се прехвърля в 5 ml сцинтилационна течност и радиоактивността се определя чрез течен сцинтилационен брояч.

Реакционна смес

0,2 М Калиев нитрат pH 3

0,005 М Калиев оксалат pH 3

5,6 nmol (0,0227 μ Ci) [¹⁴С] -оксалова киселина.

Образуването на формат се измерва чрез метода на Margo et al. (1988), адаптиран, като са взети предвид по-скоро различните би охимични характеристики на оксалатдекарбоксилазата, изолирана от Collybia velutipes, отколкото на тази от Sclerotinia. Използва се двуетапен метод. Първо, залага се реакционна смес, съдържаща 20 μΐ 40 μΜ оксалова киселина (pH доведено с калиева основа до pH 3.5). 15 тМ о-фенилендиамин и 0,1 тМ говежди серумен албумин в цитратен буфер (0,2 М). Екстракт/ензимът се добавя (краен обем 0.5 ml) и реакциите се инкубират на 25°С за 20 min. Декарбоксилирането се спира чрез добавяне на К₂НРО₄ (за получаване на крайно pH 7.5). Добавя се половин обем 45 тМ никотинамидадениндинуклеотид, литиева сол и се разбърква. След 3 min се добавят 15 μΐ форматдехидрогеназа (FDH, 80 U/ml). След това концентрацията на образувания формат се отчита чрез измерване на покачването в поглъщането на реакционните смеси при 340 пт, преди и 20 min след добавянето на FDH. За всеки екстракт се приготвят контроли без оксалова киселина и впоследствие активността се пресмята на базата на белтъка.

Пример 6. Олигонуклеотиди за ПВР и ДНК-блот анализ. За да се потвърди наличието на оксалатдекарбоксилазния ген в регенерирали поници, за диагностични PCR-и от генната последователност е избран олигонуклеотидът DEC1. В комбинация с 355-олигонуклеотида (43) той дава диагностична PCR-ивица от около 280 вр. Тези олигонуклеотиди се използват за потвърждаване трансгенния статус на вкоренени поници.

Две други олигонуклеотидни последователности, DEC2 и DEC3, се използват за получаване на 5’-оксалатдекарбоксилазен фрагмент-сонда от приблизително 450 вр за ползване в ДНК-блот анализи на регенерирали трансгенни растения и тяхното потомство.

Олигонуклеотид DEC1 - 5' в оксалатдекарбоксилазната кодираща последователност за използване с промоторен олигонуклеотид в диагностични PCR.

5'-GAG AAG GAT GAC AGT GAG GAG ACG TTG - 3'

Олигонуклеотиди DEC2 и DEC3 - В средата и 3' в оксалатдекарбоксилазната кодираща област, използвани комбинирано за получаване на сонди за ДНК блот-анализ.

DEC2

5’ - CCA TGA CGA CGG ТАС АТТ СТТ GCT САС - 3'

DEC2

5' - TGC AGG AAC ATA AGC GAT ATC ACC ACC - 3'

Claims

Патентни претенции 5

1. Изолиран ДНК-фрагмент, кодиращ оксалатдекарбоксилаза.
2. Фрагментът съгласно претенция 1, където споменатият фрагмент кодира гъбна окса- 10 латдекарбоксилаза.
3. Фрагментът съгласно претенция 2, където споменатият фрагмент кодира оксалатдекарбоксилаза на Collybia velutipes.
4. Фрагментът съгласно претенция 3, къ- 15 дето споменатият фрагмент има последователността на SEQ ID + 1.
5. Рекомбинантна молекула, съдържаща ДНК-фрагмента на претенция 1 и вектор.
6. Трансформирана растителна клетка. 20 съдържаща молекулата, съгласно претенция 5.
7. Основно пречистена оксалатдекарбоксилаза.
8. Оксалатдекарбоксилазата съгласно претенция 7, където споменатата оксалатде- 25 карбоксилаза е гъбна оксалатдекарбоксилаза.
9. Оксалатдекарбоксилазата съгласно претенция 8, където оксалатдекарбоксилазата е оксалатдекарбоксилаза на Collybia velutipes.
10. Оксалатдекарбоксилазата съгласно претенция 7, където споменатата оксалатдекарбоксилаза се кодира от ДНК-последователността на SEQ ID + 1.
11. Препарат, характеризиращ се с това, че съдържа количество оксалатдекарбоксилаза, достатъчно да разгради оксаловата киселина, и приемлив за земеделието носител.
12. Метод за защита на растение от оксалова киселина, характеризиращ се с това, че при нужда от такава защита на растението се осигурява количество оксалатдекарбоксилаза, достатъчно да осъществи тази защита.
13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че включва въвеждане в растението на ДНК-фрагмент, кодиращ оксалатдекарбоксилаза при такива условия, че при експресирането му се произвежда споменатата оксалатдекарбоксилаза.
14. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че се извършва контакт на растението с количество оксалатдекарбоксилаза, достатъчно да осъществи споменатата защита.
15. Растение, в чийто геном чрез генетична трансформация е включен трайно ген, кодиращ оксалатдекарбоксилаза.