FI117202B - Yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadut solut, DNA-kontruktit, vektorit ja menetelmät fytaattia hajottavien entsyymien ilmentämiseksi toivotuissa suhteissa - Google Patents

Description

117202

Yhdistelmä-DNA-tekniikana saadut solut, DNA-konstruktit, vektorit ja menetelmät fytaattia hajottavien entsyymien ilmentämiseksi toivotuissa suhteissa

Rekombinantceller, DNA-konstruktioner, vektorer ooh förfaran-den för expression av fytatnedbrytande enzymer i önskade pro-portioner

Oheinen keksintö kohdistuu rihmasienikantoihin, jotka kykenevät yli-ilmentämään vähintään kahta fytaattia hajottavaa entsyymiä toivotuissa suhteissa. Ohessa on myös kuvattu DNA-sek-venssit, promoottorit, DNA-konstruktit sekä vektorit, joita voidaan käyttää tällaisten kantojen valmistamiseksi.

Mineraalit ovat olennaisia tekijöitä kaikkien organismien kasvulle. Yksimahaisiin eläimiin (esim. sikoihin, siipikarjaan) kohdistuvassa karjantuotannossa ja kalanviljelyssä rehua on tavallisesti täydennetty mineraaleilla. Kasvien siemenet ovat runsas mineraalilähde, sillä ne sisältävät ioneja, jotka ovat muodostaneet komplekseja fytiinihapon fosfaattiryhmien kanssa. :T: Märehtijät eivät tarvitse epäorgaanista fosfaattia tai mineraa- lej a, koska pötsin mikro-organismit tuottavat entsyymej ä, * « · jotka katalysoivat fytaatin (myo-inositoli-heksafosfaatti) kon-.*··. versiota inosi toliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi. Tässä prosessissa fytaatin kanssa kompleksoituneet mineraalit vapau-tuvat.

• i

Fytaattia esiintyy varastoituneen fosforin lähteenä käytännön i eesti kats oen kaikis s a kas viperäi s i s s ä rehui s s a (yleiskatsaus esitetty teoksessa: Phytic Acid, Chemistry and « · *.* * Applications, E. Graf (Ed. ), Pilatus Press: Minneapolis, MN, :T: USA, (1986). Fytiinihappo on vilja- ja palkokasvien siementen ..V normaali osa. Sen tehtävänä on sitoa uudelle kasville olennai- • * \.I set ravinnemineraalit kasvin itäessä siemenestä. Kun siemenes-• · ’*;·* sä läsnäoleva fytaasientsyymi poistaa fytiinihapon fos faatti-ryhmät, niin fytiinihapon kyky sitoa metalli-ioneja häviää ja :*·*: mineraalit ovat kasvin saatavilla. Karjalle tarkoitetussa rehuviljassa fytiinihapon sitomat hivenaineet ovat vain osit- 117202 2 tain yksimahaisten, fytaasiaktiivisuutta vailla olevien eläinten imeytettävissä. Vaikka paksusuolessa tapahtuukin jonkinlaista fytaatin hydrolyysiä, niin kuitenkin suurin osa fytaa-tista läpäisee yksimahaisten eläinten ruuansulatuskanavan ja erittyy lantaan, jonka kautta se aiheuttaa osaltaan uloste-peräisestä fosfaattisaastumisesta johtuvia ongelmia alueilla, j oilla harj oitetaan laaj amittaista karj ankasvatusta. Paksusuolessa vapautuneella epäorgaanisella fosforilla ei ole ravitsemuksellista arvoa karjalle, koska epäorgaaninen fosfori imeytyy ainoastaan ohutsuolessa. Niinpä huomattava määrä ravitsemuksellisesti tärkeistä ravinnemineraaleista ei ole yksimahaisten eläinten potentiaalisessa käytössä.

Fytaatin konversiota inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosforiksi voidaan katalysoida mikrobientsyymeillä, j oita kutsutaan yleisesti fytaaseiksi. Fytaasit kuten fytaasi EC 3. 1. 3. 8. kykenevät katalysoimaan myo-inositoli-heksafosfaatin hydrolyysiä D-myo-inositoli-1, 2, 4, 5, 6-pentafosfaatiksi ja ortofosfaa-tiksi. Alalla on esitetty, että tietyt homeperaiset fytaasit hydrolysoivat inositoli-pentafosfaatin tetra-, tri- ja alemmik-| si fosfaateiksi; esim. A. ficuum: is ta saatujen fytaasien on ,··, esitetty tuottavan myo-inositolin di- ja mono-fosfaatin seok-| siä (Ullah, 1988). Fytaasia tuottavia mikro-organismeja ovat t TII bakteerit, kuten Bacillus subtilis (V. K. Powar ia V. J. Jagan-• ~ ^^ ! /*;* nathan, J, Bacteriol. 151: 1102-1108, 1982) sekä Pseudomonas i.i j (D. J. Cosgrove, Austral. J. Biol. Sei. , 23:1207-1220, 1970); * hiivat, kuten Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayini ja P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 17: 24-26, 1984); sekä homeet kuten Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda ja S. Yamamoto, Agric. Biol. Chem. , 32: 127 5-1282, j 1968). Fytaasi a tuottamaan kykenevien mikrobien mahdollinen • ♦ « 4 käyttö yksimahaisille eläimille tarkoitetun rehun lisäaineena * * (Shieh ja Ware, patenttijulkaisu OS 3 297 548; Nelson, T. S. et *· - ai. , J. Nutrition, 101: 1289-1294, 1971) on raportoitu aikaisem-

w 9 P

*...· min. Tähän saakka tämän periaatteen eli fytaasin kaupallinen « # soveltaminen ei ole kuitenkaan osoittautunut toteuttamiskelpoi- * · · seksi mikrobiperäisten fytaasien suurista tuotantokustannuksista johtuen.

117202

Alalla on myös esitetty, että mikrobiperäisiä fytaaseja voidaan käyttää tietyistä teollisuusprosesseista saatavassa eläin-rehussa, esim. vehnä ja maissiprosessituotteissa. Maissin mär-käjauhatusprosessissa syntyy gluteeneja, joita myydään eläinre-huksi. Fytaasin lisääminen saattaa esitetysti parantaa rehu-tuotteen ravintoarvoa. Homeperäiset fytaasientsyymit ja proses-siolosuhteet (t noin 50 'C ja pH noin 5,5) on kuvattu aikaisemmin eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 0 321 004. Alalla on esitetty, että soijajauhoa käsiteltäessä fytaatin läsnäolo tekee tämän jauhon ja prosessijätteet sopimattomiksi ajatellen niiden käyttöä rehuna kalojen, siipikarjan ja muiden ei-märehti joiden, sekä maidolla ruokittujen vasikoiden kasvatuksessa. Alalla on esitetty, että fytaasin avulla voidaan parantaa runsaasti proteiinia sisältävän soijamateriaalin ravitsemuksellista ja kaupallista arvoa (katso Finase Enzymes by Alko esitettä, jonka julkaisija on Alko Oy, Rajamäki, Suomi). Alko Oy on käyttänyt fytaasin ja iL_ niger: istä saadun happaman fosfataasin, jonka pH-optimi on 2,5, yhdistelmää eläinrehun lisäaineena yhtiön fytiinihappoa hajottavassa tuotteessa Finase F ja Finase S. Kustannuksiltaan edullinen fytaasilähde * ·'*: voisi parantaa huomattavasti soijajauhon arvoa eläinrehuna (Shieh et ai, 1969).

t »•t* » · » ft ft ft ft

Aspergillus ficuum-home tuottaa fytaasia ja vähemmän spesi- ft · · fisiä happamia fosfataaseja solun ulkopuolisina entsyymeinä (Shieh et ai, 1969). UI1ah on raportoinut puhdistaneensa villi- tyyppisestä A. ficuum-kannasta sellaista fytaasia, jonka näennäinen molekyylipaino on 61,7 kDa (määritettynä SDS-PAGE- menetelmällä, ja korjattuna glykosylaation suhteen); pH-opti- : * mit olivat 2,5 ja pH 5,5; Km oli noin 40 μηι ja omi nais aktiivi- :*·* suus noin 50 U/mg (Ullah, A. , Preparative Biochem. , ;.y 18: 443-458, 1988); PCT-patenttihakemuksessa WO 91/05053 on • * myös kuvattu Aspergillus ficuum: ista peräisin olevan fytaasin eristäminen ja molekyyli tason kloonaus, jonka fytaasin pH-opti- mit ovat pH 2,5 ja pH 5,5, Km noin 250 μΜ ja ominaisaktiivi- ;*·*: suus noin 100 U/mg proteiinia.

« ft , 117202 4

Happamat fosfataasit ovat entsyymejä, jotka hydrolysoivat katalyyttisesti monia erilaisia fosfaattiestereitä, ja joiden pH-optimi on tavallisesti myös vähemmän kuin 6,0 (Hollander, 1971); esim. EC 3. 1. 3. 2 katalysoi ortof osfori (5)-monoesterei-den hydrolyysiä ortofosfaattituotteiksi. Alalla on esitetty, että hapan fosfataasi on eristetty A. ficuum:ista. Happaman fosfataasin deglykosyloidun muodon näennäinen molekyylipaino on 32,6 kDa (Ullah et ai., 1987).

Oheisen keksinnön tavoitteena on saada aikaan rihmasienistä eristettyjä rekombinanttifosfataaseja, jotka tehostavat fosforin vapautumista fytaatista ja fytiinihapon suoloista. Keksinnön muina tavoitteina on saada aikaan kahden tai useamman sellaisen rekombinanttientsyymin tehokas ja kustannuksiltaan edullinen lähde, joita entsyymejä voidaan käyttää kaupallisesti rehuissa ja teollisuusprosesseissa siten, että käsittelyn tarve on mahdollisimman vähäinen.

Aspergillus niger var. awamori-kannasta ALK0243 puhdistettiin olennaisesti kaksi entsyymiä, fytaasi ja pH2, 5 hapan fosfataa-si. Molemmista entsyymeistä eristettyjen sisäisten peptidien « .···, aminohapposekvenssi määritettiin ja aminohapposekvensseistä *·, johdettuja nukleotidisekvenssejä käytettiin koettimien valmis- e tami seksi, j oi ta koetti mi a käytettiin näiden kahden geenin « · kloonaamiseksi molekyylitasolla. Perimän nukleotidisekvenssi J * · ···/ määritettiin kummallekin geenille j a samoin määritettiin • * > *·* ' (mikäli tarpeen) koodaavan alueen sekvenssi kloonaamalla cDNA.

Vertaamalla fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin aminohappo-sekvensseistä johdettuja aminohapposekvenssejä muihin tunnettuihin fosfataaseihin pystyttiin tunnistamaan mahdollinen ent-ί syymiaktiivisen kohdan sekvenssi. Transformoi nti vektorit vai- • «e ;*!* mistettiin käyttäen rihmasienten luonnollisia promoottoreita » ,.V 3a useiden erilaisten heterologisten promoottorisekvenssien « t kykyä ohjata vastaavien geenien ilmentymistä verrattiin toi- • * *·* siinsa. Sitten valittiin sellaiset rekombinantti-isäntäsolut, jotka ylituottivat fytaasia ja pH2, 5 hapanta fosfataasia mää-rinä, jotka olivat noin 2-4000-kertaa ja 10-126-kertaa suurem- • % pia (vastaavasti) kuin ne entsyymimäärät, joita Aspergillus- 5 117202 kanta ALK0243 (ATCC 38854) erittää. Samoin valikoitiin ne kahdella geenillä transformoidut isäntäsolut, jotka ilmensivät suurempia määriä näitä kahta rekombinanttientsyymiä, eli sekä fytaasia että pH2,5 hapanta fosfataasia. Tunnistettiin valikoituja kantoja kahdella geenillä transformoiduista soluista, jotka kannat syntetisoivat ja erittivät fytaasia yhdessä pH2,5 happaman fosfataasin kanssa toivotuissa räätälöidyissä kyseisten entsyymiaktiivisuuksien suhteissa, esim. siten, että pH2, 5 happaman fosfataasin aktiivisuuden ja fytaasiaktiivisuuden välinen suhde on 3: 1-16:1. Ohessa kuvatut transformoidut rekom-binantti-isäntäsolut ratkaisevat tekniikan tasoon liittyvät ongelmat ja tarjoavat hinta-hyötysuhteeltaan edullisen lähteen, kaupallisiin prosesseihin sopiville kaupallisille fosfataasi-entsyymeille, jotka vapauttavat mineraaleja kasvimateriaalissa läsnäolevista fytaateista in vitro, eli rehun käsittelyprosesseissa, tai in vivo, eli annostelemalla yhtä tai useampaa tällaista entsyymiä eläimille.

A. niqer var. awamori-kannasta ALK0243 (ATCC 38854, tunnettu myös nimellä IFO4033) puhdistetun fytaasin näennäinen molekyyli’; lipaino on 80000 - 86000 daltonia (SDS-PAGE), ja 45000 - 48000 ·"*: daltonia (SDS-PAGE) endoglykosidaasi F/N-glykosidaasi F-käsit-

• M

telyn jälkeen. Puhdistettu fytaasi näyttää olevan monomeerinen ,*··. ei-denaturoivissa olosuhteissa, isoelektrisen pisteen ollessa m * • noin 5, 3. Tällä fytaasientsyymillä on aktiivisuutta ilman t * · [iV metalli-ionej a, eli se on metalli-ioneista riippumaton; tämän entsyymin pH-optimi on noin 5,0; ja sen lämpötila op ti mi on alueella 55-60 *C.

A. niger var. awamori-kannasta ALK0243 puhdistetun pH2,5 hap-;,i * paman fosfataasin näennäinen molekyylipaino on noin 66000 dal- :T töniä (SDS-PAGE), ja 46000 - 49000 daltonia (SDS-PAGE) sen jäl- ;.V keen, kun hiilihydraatit on poistettu endoglykosidaasi F/N-gly- • \.I kosidaasi F-käsittelyllä. Puhdistettu pH2, 5 hapan fosfataasi *·*\ näyttää olevan tetrameerinen ei-denaturoivissa olosuhteissa, isoelektrisen pisteen ollessa noin 4-4,25; natriumfytaatin ΓΛ tapauksessa ilmeinen Km on 0,7 mM pH-arvossa 2,5 ja paranitro- 117202 6 fenyylifosfaatin tapauksessa ilmeinen Km on 4 mM; pH-optimi on noin pH2, 5; ja lämpötilaoptimi on noin 55 * C.

Fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin transloidut nukleotidi-sekvenssit tuottivat polypeptidejä, joiden pituus oli 470 aminohappoa ja 479 aminohappoa, vastaavasti. Ennustetun fytaasi-polypeptidin ja ennustetun pH2, 5 happaman fosfataasi-polypep-tidin lasketut molekyylipainot olivat noin 51400 daltonia ja noin 52700 daltonia, vastaavasti.

Kahdella geenillä transformoitujen rekombinantti-isäntäsolujen tuottaman rekombinantti pH2, 5 happaman fosfataasin ja rekombi-nantti fytaasin halutulla suhteella päästään tasapainotettuun entsyymiseokseen, jossa yhteistoiminnan tuloksena oleva entsyymiaktiivisuus katalysoi nopeasti ja tehokkaasti fytaatin lähes täydellistä hydrolyysiä inositoliksi ja vapaaksi fosfaatiksi, mineraalien vapautuessa tällöin fytiinihapon kompleksista.

Tämän keksinnön edellä esitetyt piirteet ja monet siihen liittyvät edut ovat ilmeisempiä ja keksintö on ymmärrettävissä pa-:T: remmin seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen ja liitteenä ·’*; olevien piirustusten perusteella, joissa piirustuksissa: i * • · ' »

HM

,···. KUVIO 1 esittää Aspergillus nicrer var. awamori-kannasta AL-K0243 (ATCC 38854) puhdistetun, metalli-ioneista riippumatto- f * * "Y man fytaasientsyymin pH-optimia, pH-optimin ollessa noin pH5; *’ ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta ollessa alueella pH2-pH7 (kuten alla olevassa esimerkissä 1 on kuvattu); * - KUVIO 2 esittää edellä esitetyn kuvion 1 mukaisen puhdistetun :T fytaasientsyymin lämpötilaoptimia alueella 55-60 '0, yli 20 % ..V suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta ollessa alueella 25-65 * C; t * • · «il * KUVIO 3 esittää Aspergillus niger var. awamori-kannas ta AL-!,t.; K0243 puhdistetun pH2, 5 happaman fosfataasin, jonka näennäinen Γβ|ί Km on 0, 7 mM natriumfytaatin tapauksessa, pH-arvossa 2, 5, 117202 7 pH-optimin ollessa noin pH2, 0-2, 5 37 ' C: ssa; ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta ollessa alueella pHl, 5-pH3,5 (kuten alla olevassa esimerkissä 1 on kuvattu); KUVIO 4 esittää edellä esitetyn kuvion 3 mukaisen pH2,5 happaman fosfataasin lämpötilaoptimia, joka on noin 55 * C, yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta ollessa alueella 25-60 "C; KUVIO 5 esittää tuotteen FINASE, joka on fytaasia ja fosfataa-seja sisältävä kaupallinen valmiste, suhteellisen fytaasiaktiivi s uuden (eli fosfaatin vapautuminen natriumfytaatista) riippuvuutta pH: sta 37 * C: ssa (neliöt) ja 55 ‘C:ssa ( + ); KUVIO 6 esittää tuotteen FINASE (kuvio 5) suhteellisen fytaasi aktiivi s uuden (eli fosfaattia vapauttavan aktiivisuuden) riippuvuutta lämpötilasta, eli alueella 10-70 *C# pH-arvossa 5; KUVIO 7 esittää radioaktiivisesta merkityn, degeneroidun oligo-nukleotidifytaasikoettimen PHY-1 autoradiogrammia, joka koetin hybridisoituu ankarissa (stringent) olosuhteissa genomisesta » * « DNA: sta entsyymeillä BamHI; EcoRI; Xbal; BamHI + EcoRI; BamHI + Xbal; ja EcoRI + Xbal aikaansaatujen (alla olevassa esimer- • · r *·*; kissä 2 kuvatulla tavalla) endonukleaasi fragmentti en kanssa; * r « *

«M

• 4 I I

ϊ·! ' KUVIO 8 esittää radioaktiivisesta merkityn, spesifisen oli go- * » V ‘ nukleotidin eli pH2, 5 happaman fosfataasikoettimen PHY31 autoradiogrammia, joka koetin hybridisoituu ankarissa (stringent) olosuhteissa genomisesta DNA: sta entsyymeillä BamHI; Hindlll, Kpnl, PstI, Sali, Sphl tai SstI aikaansaatujen (alla olevassa : j· esimerkissä 2 kuvatulla tavalla) endonukleaasifragmenttien M· ‘ rv kanssa; 9 · ► * t* * : . KUVIO 9A ja KUVIO 9B (SEQ. ID. NO. 18) esittävät' Aspergillus niger var. a wamori - kannan ALK0243 (ATCC#38854) fytaasi geeni n * « genomisen nukleotidi sekvenssi n; esimerkissä 2 kuvatulla tavalla fytaasipolypeptidille johdettua aminohapposekvenssiä (SEQ. ID. NO. 19); sekä tämän geenin säätelevää 5' -promoottorialuetta; β 117202 KUVIO 10A, KUVIO 10B, KUVIO 10C ja KUVIO 10D esittävät fytaa-sia ilmentävien vektorikonstruktien pFFl, pFF2, pFF3 ja pFF4 järjestäytymistä (kuten alla olevassa esimerkissä 4 on kuvattu); KUVIO 11A ja KUVIO 11B (SEQ. ID. NO. 20) esittävät pH2# 5 happaman fosfataasigeenin nukleotidisekvenssiä sekä entsyymille johdettua aminohapposekvenssiä (SEQ. ID. NO. 21); KUVIO 12A, KUVIO 12B, KUVIO 12C ja KUVIO 12D esittävät fytaa-sia ilmentävien vektorikonstruktien pFF-6A, pFF8, pFF9 ja pFFll rakenteita, jotka konstruktit on suunniteltu mahdollis-ten E. coli-nukleotidisekvenssien poistamiseksi (kuten alla olevassa esimerkissä 4 on esitetty); KUVIO 13A, KUVIO 13B, KUVIO 13C ja KUVIO 13D esittävät pH2, 5 hapanta fosfataasia ilmentävien vektorikonstruktien pPHO-l-4A rakennetta, joista konstrukteista voidaan eristää lineaarisia kappaleita alla esimerkissä 4 kuvatulla tavalla; ... KUVIO 14A ja KUVIO 14B esittävät kahden trans f ormaatiovektorin « > · ^ • · · järjestäytymistä, joissa kummassakin vektorissa on pH2, 5 hap- 4 4 *·; paman fosfataasin geeni ja fytaasin geeni, ja joista käytetään

«M

·*·* merkintää pFIN-lA ja pFIN-lB (kuten alla olevassa esimerkissä 4 on esitetty); • « « m 4 ♦ 4 * * * ϊ.: * KUVIO 15 esittää fytaasi aktiivi s uutta transformoitujen A.

niger var. awamori-s ubklooni en (transformanttien) maljamääri- tyksessä, jotka subkloonit ylituottavat fytaasia jopa 1260-ker- taisinä määrinä alkuperäisen ALKO243-kannan tuottamiin määriin : .·.verrattuna. (Kloonien ympärille indikaattorina toimivan • · · ’*.*..* mol ybdaatti kompleksi n muodostamien renkaiden koko on verrannol-• » ♦ *. .linen entsyymiaktiivisuuteen, kuten alla olevassa' esimerkissä * * : V4 on kuvattu); « «· • · 4 *

IM

..’..KUVIO 16 esittää kromosomaalisen fytaasigeenin kopioiden luku-» * .1** määrää ja mRNA-tasoja fytaasi geenillä transformoidussa A^_ • · 9 117202 niger var. awamori-kannassa ALK02268, määritettynä Southern-blot analyysillä ja Northern-blot analyysillä, vastaavasti (kuten alla olevassa esimerkissä 4 on kuvattu). Kuviossa 15 nähtävä fytaasiaktiivisuuden merkittävä kasvu transformoiduissa soluissa johtuu kloonatun yhdistelmä-DNA-tekniikana saadun fytaasigeenikonstruktin yhden tai useamman kopion integroitumisesta kromosomaaliseen DNA: hän (katso alla oleva esimerkki 4); KUVIO 16A esittää trans formoimattoman vertailukannan ALK02268 Southern-blot analyysiä (kaistat 1, 4 ja 7) sekä ylituottavien fytaasitransformanttien vastaavaa analyysiä (kaistat 2, 5, 8, 9 ja 10); KUVIO 16B esittää trans formoimattomassa vertailukannassa AL-K02268 (kaista 1) ja transformoiduissa kannoissa (kaistat 2-6) läsnäolevien mRNA-määrien Northern-blot analyysiä; KUVIO 17 ja KUVIO 18 esittävät fytaasia ja pH2, 5 hapanta fosfa- taasia vastaavan kromosomaalisen geenin kopioiden lukumäärää ja mRNA-tasoa kahdella geenillä transformoidussa A. niger var.

awamori-kannas s a ALK0243 määäritettynä Southern-blot analyysil- lä ja Northern-blot analyysillä, vastaavasti (kuten esimerkis- .···. sä 5 on kuvattu); • 1 ··· ”” KUVIO 17A esittää transformoimattoman vertailukannan ALK0243 » 1 *··;1 (kaista 2) ja kahdella geenillä transformoitujen kantojen • 1 · ··· i (kaistat 3, 4 ja 5) Southern-blot analyysiä, käyttäen fytaasi-·2 : geeni koetti mi a; KUVIO 17B esittää trans formoimattoman vertailukannan (kaista 1) ja kahdella geenillä transformoitujen kantojen (kaistat 2, ; 3 ja 4) Northern-blot analyysiä, käyttäen fytaasi n mRNA-koetti-

IM

.•:\mia; • « * .'KUVIO 18A esittää trans formoimattoman vertailukannan ALK0243 9 9 9 2 \..:( kaista 3) ja kahdesti transformoitujen kantojen (kaistat 4, 5 ••••;ja 6) Southern-blot analyysiä, käyttäen pH2, 5 hapan fosfataasi- «· v :\\geeni koettimia; • ♦ • 1 10 1 1 7202 KUVIO 18B esittää transformoimattoman vertailukannan (kaista 1) ja kahdella geenillä transformoitujen kantojen (kaistat 2, 3 ja 4) Northern-blot analyysiä, käyttäen pH2, 5 hapanta fosfa-taasia vastaavia mRNA-koettimia; KUVIO 19 esittää graafisesti fytaasiaktiivisuuden tasoja 24 erilaisessa transformantissa, käytettäessä rengasmaisia tai lineaarisia plasmidivektorikonstrukteja (kuten alla olevassa esimerkissä 6 on kuvattu); sekä KUVIO 20 esittää erilaisten promoottoreiden vaikutusta rekombi-nanttifytaasin aktiivisuustasoihin ja pH2, 5 happaman fosfataa-sin aktiivisuustasoihin kahdella geenillä transformoiduissa A. niger var. awamori-kannoissa ALK0243 ja ALK02268, kuten alla olevassa esimerkissä 6 on esitetty.

Seuraavilla ohessa käytetyillä käsitteillä on seuraava merkitys: Käsitteellä "fosfataasi" tarkoitetaan entsyymiä, joka kykenee vapauttamaan fosfaattia fosfaattipitoisesta aineesta, esimer- • · ♦ V * kiksi fytaatista. Kuvaavina esimerkkeinä fosfataaseista voi-• · · :^/ daan mainita homeperäiset fytaasit sekä happamat ja neutraalit ·;* fosfataasit kuten pH2, 5 hapan fosfataasi ja pH6 neutraali M** **’*· fosfataasi.

» * • · • Ψ · lii ‘•/.Ohessa käytetyllä käsitteellä “nukleiinihappo" tarkoitetaan * * · luonnollista tai synteettistä DNA: ta tai RNA: ta, polynukleotidejä (sellaiset, jotka käsittävät enemmän kuin kolme (yhdeksän) nukleotidiä) sekä oligonukleotidejä (eli jotka käsittävät enemmän kuin yhdeksän (kolme) nukleotidiä).

« · « * · f i < et* * * * * :/ Ohessa käytetyllä käsitteellä “kykenee hybridisoitumaan anka-* * /.•rissa (stringent) olosuhteissa" tarkoitetaan kiinnittymistä * * /••kyseessä olevaan kohdenukleotidisekvenssiin tai sitä täydentä-♦ *

Tvään vastinjuosteeseen vakio-olosuhteissa, eli korkeassa lämpö-*** » '...tilassa j a/tai pienessä suolapitoisuudessa, millä pyritään «t · • · · « ♦ e « η 117202 estämään asiaan liittymättömien sekvenssien kiinnittymistä. Sopiva menettelytapa (jossa käytetään 0, 1 x SSC ja kiinnittämistä 68 'C: ssa 2 tunnin ajan) on kuvattu teoksessa Maniatis, T. et ai. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N. Y. , sivut 387-389, 1982.

Ohessa käytetyllä käsitteellä " nukleotidisekvenssi" tarkoitetaan nukleotidien tai nukleosidien sekvenssiä ja sen piiriin voivat kuulua epäjatkuvat sekvenssit; esim. genomisissa sek-vens s eis s ä i ntroni s ekvens s i t ja vastaavat voivat katkai s ta koodaavan alueen eksonisekvenssit.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "jatkuva nukleotidisekvenssi" tarkoitetaan peräkkäisten, yksi toisensa jälkeen liittyneiden nukleotidien sekvenssiä.

Käsitteellä " koodaava alue" tarkoitetaan nukleiinihapon sisältämää nukleotidisekvenssiä, jonka transkribointi ja translaatio johtavat kyseessä olevan kohdeaminohapposekvenssin muodostumiseen; esim. eksonialueet perimän DMA: ssa, jotka alueet mRNA: ksi transkriboitumisen jälkeen ohjaavat kyseessä olevan .···, aminohapposekvenssin translaatiota. Käytetyllä käsitteellä " koodautunut" tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, jota koodaa- ***· van alueen nukleotidi sekvenssissä läsnäolevat nukleotiditrip-• · **“ letti koodit koodaavat.

• f • · · • · ; * * * ·.· * Ohessa käytettyä käsitettä " transformaatiovektori" käytetään käsitteen "vektorikonstruktin" synonyyminä, ja näillä käsitteillä tarkoitetaan rekombinanttikonstruktia (esim. plasmidi-DNA*. ta), johon on sisällytetty kyseessä oleva, fytaasia ja/tai ; :* pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaava nukleotidisekvenssi, ja a** ♦ .*:*-tämän käsitteen erään alaluokan muodostavat "ilmentämisvek-• » « * (i·/ torit" eli " ekspressiovektorit". Edustavina esimerkkeinä trans-* · ' 1 · ·' f ormaatiovektoreista voidaan mainita E. coli-pl as mi di vektorit: »·« (esim. pBR322, pUC18, pUC19 ja muut vastaavat) sekä ne vekto- * · .‘*?rit, joita voidaan käyttää rihmamaisten sienikantoj en trans for- :V .moi mi seksi (esim. pLO-3, pFF-6, pPHO-1 ja muut vastaavat).

• * 117202 12

Kyseessä oleva, fytaasia ja/tai pH2,5 hapanta fosfataasia vastaava nukleotidisekvenssi voi sisältää vastaavan geenin 5' -alueesta peräisin olevia sääteleviä sekvenssielementteja (joita esimerkiksi kutsutaan "natiiveiksi säätelyelementeik-si" ); tai siihen on voitu lisätä heterologinen promoottori (joka esimerkiksi on peräisin kannasta, muunnoksesta, lajista tai suvusta, joka on jokin muu kuin A. niger var. awamori-kan-ta ALK0243, tai eri geenistä, esim. GA- tai GAPDH-promoottori-nukleotidisekvenssi) käynnistämään kohteena olevan nukleotidi-sekvenssin ilmentymisen. Kohteena oleva transformaatiovektori voi myös sisältää sopivia restriktiokohtia, joihin voidaan lisätä ylimääräisiä nukleotidisekvenssejä, jotka helpottavat vektori-DNA: n kromosomaalista integraatiota. Tarkastelun kohteena olevien transformaatiovektoreiden avulla fosfataasinuk-leotidisekvenssejä voidaan viedä isäntäsoluun siten, että ne voivat integroitua tehokkaasti isäntäsolun DNA: hän ja siten, että transformoitu isäntäsolu ilmentää tämän nukleotidisekvenssin koodaavan alueen tuotetta.

Käsitteellä "promoottori" tarkoitetaan nukleotidisekvenssiä, joka kykenee ohjaamaan alavirtaan sijaitsevan nukleotidisek-;·;ν venssin kuten transkribointia ja translaatiota säätävien sig-naalisekvenssien ja muiden vastaavien ilmentymistä. Promootto- * 1 reiden edustavia esimerkkejä on esitetty jäljempänä esimerkeis- * ··;1 sä 3-5, ja niistä voidaan mainita GA- ja GAPHD-promoottori • 1 [·"·1 sekä fytaasi- tai pH2, 5 hapan fosfataasin oma luonnollinen ϊ promoottori.

» · 1 • e 1 * 1 1 Käsitteellä 11 selektiota mahdollistava merkki" tarkoitetaan sellaista nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodaamaan poly- peptidin, jonka ilmentyminen transformoidussa solussa johtaa : siihen, että tämä solu voidaan tunnistaa tai valikoida solu- «1« · population muista soluista. Havainnollistavina esimerkkeinä • e ..V voidaan mainita anti geeni merkit, fenotyyppi merkit'(esim. solun • · - * koko, muoto, kuroutumistavat ja vastaavat) sekä lääkeaineen 5...: vastus tus kykyyn kuten fleomysiinin vastustuskykyyn perustuvat ·1·1.merkit.

··1 ·♦ 1 • · 1 117202 13

Ohessa käytetyllä käsitteellä "transformoitu rekombinantti-isäntäsolu" tarkoitetaan solua, jonka kromosomaaliseen DNA: hän on integroitunut transformaatiovektorin nukleotidisekvenssi. Edustavina esimerkkeinä keksinnön mukaisista transformoiduista rekombinantti-isäntäsoluista voidaan mainita sellaiset bakteeri- ja homesolut, jotka kykenevät syntetisoimaan ja/tai erittämään rekombinanttifytaasia ja/tai yhtä tai useampaa muuta rekombinättifosfataasia, esimerkiksi fytaasi, jota koodittaa sellainen nukleotidisekvenssi, joka kykenee hybridisoitumaan ankarissa (stringent) olosuhteissa sekvenssin SEQ. ID, NO. 18 kanssa; sekä rekombinantti pH2,5 hapanta fosfataasia, esimerkiksi fosfataasi, jota koodittaa sellainen nukleotidisekvenssi, joka kykenee hybridisoitumaan ankarissa olosuhteissa sekvenssin SEQ. ID. NO. 20 kanssa.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "fytaasin nukleotidisekvenssi" tarkoitetaan sekvenssiin SEQ. ID. NO. 18 sisältyvää nukleotidisekvens siä. 1 (

Ohessa käytetyllä käsitteellä "pH2,5 hapan fosfataasi nukleoti-disekvenssi" tarkoitetaan sellaista nukleotidisekvenssiä, joka .*:* t kykenee hybri di s oi tumaan ankari s s a (s tri ngent) oi os uhtei s s a #·*·., sekvenssin SEQ. ID. NO. 20 kanssa.

'lit Ohessa käytetyllä käsitteellä "fosfataasi" tarkoitetaan kaik- , • * /·* kia sellaisia entsyymejä, jotka kykenevät pilkkomaan substraa- i · * tissa olevan fosfaattiesterisidoksen, ja niitä ovat fytaasit * sekä happamat ja neutraalit fosfataasit.

Käsitteellä "fytaasi" tarkoitetaan entsyymiä, joka kykenee j hydrolysoimaan fytaattisubstraatissa, joista voidaan mainita • il inositoliheksafosfaatti, inositolipentafosfaatti, inositolitet- * * · * ,*j’ rafosfaatti ja inositolitrifosfaatti ja niiden suolat, olevan * · fosfaattiesterisidoksen.

»e · e * « * * Käsitteellä "puhdistettu fytaasi" tarkoitetaan oheisen keksin- * * ;"':nön mukaista puhdistettua entsyymiä, joka on eristetty ja :V.olennaisesti puhdistettu A. niger var. awamori-kannasta AL-• * 14 1 1 7202 K0243. Kyseiset entsyymit ovat monomeerisia denaturoimattomissa olosuhteissa, ja niiden isoelektrinen piste on noin 5, 3; niiden näennäinen molekyylipaino SDS-PAGE-menetelmällä on noin 80 000 daltonista 86 000 daltoniin; näennäinen raolekyylipaino hiilihydraatin poistamisen (joka tapahtuu esim. endoglykosi-daasi F/N-glykosidaasi F-käsittelyllä) jälkeen on noin 45 000 - 48 000 daltonia (SDS-PAGE-menetelmällä). Kyseisillä puhdistetuilla fytaasientsyymeillä on seuraavat katalyyttiset ominaisuudet: entsyymit ovat metalli-ioneista riippumattomia entsyymej ä, j otka kykenevät hydrolysoimaan fosfaattiesteri-sidoksen natriumfytaattisubstraatissa. Näiden kyseisten entsyymien pH-optimi on noin pH 5 37 ' C: ssa, yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta saavutetaan pH-alueella 2-7; ja niiden lämpötilaoptimi on alueella 55-60 1 C ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta saavutetaan alueella 25-65 ' C. Yhden yksikön suuruinen fytaasiaktiivisuus (PU) on se määrä entsyymi-proteiinia, joka tarvitaan vapauttamaan 1 nmol epäorgaanista fosfaattia natriumfytaatista yhdessä minuutissa 37 2C: ssa, alla olevassa esimerkissä 1 kuvatuissa määritysolosuhteissa.

Käsitteellä "rekombinantti fytaasi" tarkoitetaan sellaista fytaasientsyymiä, jota koodittaa kuvioiden 9A ja 9B mukainen V koodi ttava nukleotidi sekvenssi SEQ. ID. NO. 18; ja jota tuotti,2 taa rekombinantti-isäntäsolu, joka on transformoitu kyseisen •r fytaasinukleotidisekvenssin sisältävällä transformaatiovekto-*··« ·3; rilla. Tämän kyseisen, fytaasinukleotidisekvenssin koodattavan • · · : 2 alueen transkription perusteella ennustettu molekyylipaino • 1 · · ,V: polypeptiditranslaatiotuotteelle (siis ennen glykosylointia) on noin 51 000 - 52 000 daltonia.

Käsitteellä "metalli-ioneista riippumaton" tarkoitetaan sitä, että entsyymin aktiivisuus on mitattavissa Mn21-, Mg21- ja -Ca2--ionien puuttuessa. Tämä ei tarkoita kuitenkaan sitä,

IM

V ettei entsyymin aktiivisuus voisi olla suurempi Mn21-, Mg21-• · :#1“1tai Ca21-ionien läsnäollessa.

♦ • « M e · 2 ]|]«äsitteellä "hapan fosfataasi" tarkoitetaan entsyymiä, jonka *.·•pH-optimi fosfaattiesterisidoksen hydrolysoimiseksi substraa- »e · % » ♦ 3 9 9 117202 15 tissa on alle pH5,0 olevassa pH-arvossa, edullisesti alle pH3, 0 olevassa pH: ssa.

Käsitteellä "pH2, 5 hapan fosfataasi" viitataan entsyymiin, jonka pH-optimi esim. natriumfytaattisubstraatissa olevan fosfaattiesterisidoksen hydrolysoimiseksi substraatissa on pH-alueella 2, 0-2, 5.

Käsitteellä "puhdistettu pH2,5 hapan fosfataasi" tarkoitetaan oheisen keksinnön mukaista puhdistettua entsyymiä, joka on eristetty ja olennaisesti puhdistettu A. niger var. avamori-kannasta ALK0243. Kun tämä entsyymi on puhdistettu kyseisestä rihmamaisesta sienikannasta, niin sillä on seuraavat ominaisuudet: eli denaturoimattomissa olosuhteissa eristetty entsyymi on neljä samanlaista monomeeria käsittävä tetrameerinen glykop-roteiinikompleksi, jonka näennäinen isoelektrinen piste on noin 4,0-4,25. Kunkin monomeerin näennäinen molekyylipaino on noin 66 000 daltonia denaturoivissa olosuhteissa ja SDS-PAGE-menetelmällä määritettynä, ja näiden monomeerien ilmeinen mole-kyylipaino on 46 000 - 49 000 daltonia (SDS-PAGE) hiilihydraatin olennaisen poistamisen jälkeen. Kyseisillä puhdistetuilla pH2, 5 happamilla fosfataasientsyymeillä on seuraavat katalyyt- * .·**. ti s et ominaisuudet: nämä entsyymit . kykenevät katalysoimaan natriumfytaattisubstraatissa olevan fosfaattiesterisidoksen hydrolyysiä, näennäisen Km-arvon ollessa noin 0,7 mM (eli 37 * C: ssa ja pH-arvossa 2,5, kuten alla olevassa esimerkissä 1 on • * m / kuvattu). Näiden kyseisten entsyymien pH-optimi on pH-alueella '** * noin 2-2,5 (siis 37 ’C:ssa), yli 20 % suurimmasta entsyymiak tiivisuudesta saavutetaan pH-alueella 1,5-3,5; ja niiden lämpö-tilaoptimi on 55 *C ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta saavutetaan alueella 25-60 *C. pH2, 5 happaman fosfataa-: sin yhden yksikön suuruinen aktiivisuus (HFU) on se määrä ent-

• M I

syymiproteiinia, joka tarvitaan vapauttamaan 1 nmol epäorgaa- « ..V nista fosfaattia p-nitrofenyylifosfaatista yhdessä minuutissa | \ l 37 ’C: ssa, alla olevassa esimerkissä 1 kuvatuissa määritysolo- • ♦ suhteissa.

• 4 «*· 4 4 4 » • M 44 4 a < · 4 4 • ♦ 117202 16 Käsitteellä " rekombinantti pH2, 5 hapan fosfataasi" tarkoitetaan sellaista pH2,5 hapanta fosfataasientsyymiä, jota koodit-taa sellainen nukleotidisekvenssin koodaava alue, joka sekvenssi kykenee hybridisoitumaan ankarissa (stringent) olosuhteissa kuvioiden 11A ja HB mukaisen nukleotidisekvenssin SEQ. ID. NO. 20 kanssa, ja jota entsyymiä tuottaa rekombinantti-isäntä-solu, joka on transformoitu kyseisen pH2,5 hapan fosfataasi nukleotidisekvenssin sisältävällä kohdetransformaatiovektoril-la. Havainnollistavassa esimerkissä kyseinen, pH2,5 hapanta fosfataasia vastaava nukleotidisekvenssi on sekvenssin SEQ. ID. NO. 20 koodaava alue, jonka koodaaman polypeptidin näennäinen molekyylipaino (ennen glykosylointia) on noin 52 000 53 000 daltonia.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "erittynyt" tarkoitetaan solun ulkopuolista proteiinia, esim. "erittynyttä" proteiinia, joka on syntetisoitu solussa ja joka on siirtynyt solun ulkopuoliseen kasvualustaan, josta sen läsnäolo tai entsyymiaktiivisuus voidaan määrittää.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "fytaasiaktiivisuus" tarkoite-taan fytaasin katalyyttistä aktiivisuutta, esim. natriumfy-| taattisubstraatin hydrolysoimista siten, että vapautuu fosfaat- tia, mikä voidaan mitata tarkoituksenmukaisesti esimerkiksi • « » •••j alla olevissa esimerkeissä kuvatulla fosfaattimäärityksellä.

• * # » vt· • · ; Ohessa käytetyllä käsitteellä "pH2, 5 happaman fosfataasient- tt t V ; syymin aktiivisuus" tarkoitetaan pH2,5 happaman fosfataasin aktiivisuutta, esim. paranitrofenyylifosfaattisubstraatissa olevan fosfaattiesterisidoksen hydrolysoimiseksi (alla olevissa esimerkeissä kuvatussa kokeessa).

• i ♦ · » • · *'··* Käsitteitä " ylituottaa" ja "yli-ilmentää" käytetään toistensa * * *. . synonyymeinä ja niillä tarkoitetaan sitä, että kyseessä oleva, • * t • V transformoitu rekombinantti-isäntäsolu kykenee syntetisoimaan ja erittämään kyseistä entsyymiä määrinä, jotka ovat vähintään .·*** noin 2 kertaa suurempia kuin ne entsyymi määrät, joita A. niger • m .ΓΙ^ var. awamori-kannan ALKO 243 (ATCC 38854) solut syntetisoivat • * • * 17 1 1 7202 samoissa olosuhteissa. Kuten esimerkissä 4 on esitetty (alla olevat taulukot 8 ja 9) kannan ALK02268 ylituotanto johtaa esimerkin 1 mukaisesti toteutetuissa ravistelupull©kasvatuksissa erittymiseen, joka vastaa noin 45 kertaa suurempaa fytaa-sientsyymin aktiivisuutta millilitrassa kasvualustaa verrattuna erittymiseen ALK0243-soluista samoissa olosuhteissa. Havainnollistavat, keksinnön kohteena olevia nukleiinihappoja käsittävät transformantit (jotka on kuvattu myös esimerkissä 4) tuottavat noin 6 kertaa suuremman aktiivisuuden kuin ALK02268-kanta (katso taulukko 7; jopa noin 300 kertaa suurempi aktiivisuus kuin ALK0243-kannan tapauksessa). Muut esimerkin 4 mukaiset transformantit (katso taulukot 8 ja 9) tuottavat millilitraa kohden fytaasiaktiivisuuksia, jotka ovat noin 2100-kertaisia kantaan ALK0243 verrattuna. pH2#5 happaman fos-fataasin ylituotantoa havainnollistetaan samalla tavalla alla olevan esimerkin 4 mukaisilla transformanteilla, jotka tuottivat noin 130 kertaa suuremman aktiivisuuden millilitraa kohden (katso taulukko 11) kuin ALK0243. Vertailun vuoksi kanta ALK02268 tuottaa noin 41-46 % kannan ALK0243 tuottamasta pH2,5 happaman fosfataasientsyymin aktiivisuudesta.

I Käsitteellä "pH2,5 happaman fosfataasin ja fytaasin välinen suhde" tarkoitetaan pH2, 5 happaman fosfataasientsyymin aktii- ♦ ·"·. visuuden ja fytaasiaktiivisuuden välistä suhdetta, ja tässä • e* tapauksessa tämä suhde voidaan laskea jakamalla pH2, 5 happaman- \**'t fosfataasin entsyymiaktiivisuus millilitrassa näytettä (eli /*! HFU-yksiköiden lukumäärä/ml) fytaasin entsyymiaktiivisuudella • · » :*V millilitrassa näytettä (eli PU-yksiköiden lukumäärällä/ml).

* · « ’·* ’ Edustavia menetelmiä fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin aktiivisuuden määrittämiseksi on esitetty alla olevissa esimerkeissä. Vertailun mahdollistamiseksi, alla olevissa esimerkeissä esitetyt tulokset esittävät sitä fytaasin aktiivisuutta ja : vastaavasti sitä pH2, 5 happaman fosfataasin aktiivisuutta, :T; jonka A. nicrer var. awamori-kanta ALK0243 (ATCC 38854) tuottaa „V ja erittää kasvualustaan 5 vuorokauden pituisen fermentaatio- * t ‘ viljelyn aikana alla olevissa taulukoissa 7 ja 8 (esimerkki 3) » * kuvatuissa olosuhteissa. Näissä olosuhteissa viljellyt ALKO 243- soiut tuottavat noin 80-450 PU: ta fytaasia ja noin • e» «· e ♦ t « • * • e 117202 18 5000-6000 HFU: ta pH2,5 hapanta fosfataasia; ja vertailun vuoksi ylituottavan fytaasikannan A. niger var. awamori ALK02268 tuotanto noin 3000-9000 PU: ta ja 2000-3000 HFU:ta. Näiden esimerkkeinä käytettyjen kantojen tapauksessa pH2, 5 happaman fosfataasin ja fytaasin välinen suhde (eli HFU/PU) on noin 0, 6 ravistelupullofermentoinnin kasvualustassa, viljel-täessä ALK02268-kantaa 5 vuorokauden ajan, ja tämä suhde on 64,7 ALK0243-kannan tapauksessa (katso alla olevat taulukot 11 sekä 14-16). Kuten alla olevassa esimerkissä 5 on kuvattu, pH2, 5 happaman fosfataasin aktiivisuuden (HFU) ja fytaasiaktii-visuuden välinen suhde (PU) oli noin 4-16 taulukon 14 mukaisten trans formaattien tapauksessa, ja tämä suhde oli noin 3-6 niiden transformanttien tapauksessa, joiden transformanttien entsyymiaktiivisuudet on esitetty taulukossa 15 (PU) ja taulukossa 16 (HFU). Kyseessä olevalla "pH2,5 happaman fosfataasin ja fytaasin välisellä suhteella" päästään tasapainotettuun entsyymi seokseen, jossa yhteistoiminnan tuloksena oleva entyymi-aktiivisuus katalysoi nopeasti ja tehokkaasti fytaatin lähes täydellistä hydrolyysiä inositoliksi ja vapaaksi fosfaatiksi, mineraalien vapautuessa tällöin fytiinihapon kompleksista kaupalliselle tuotteelle toivotussa pH: ssa (esim. yksimahaisen eläimen mahan pH: ssa) ja lämpötilassa. Käsitteellä "yhteistoi-minnan tuloksena oleva entsyymiaktiivisuus" tarkoitetaan sitä, s + *··** että kyseinen suhde saa aikaan entsyymiseoksessa sellaiset ominaisuudet, että a) fytaatin katalyysi inositoliksi ja »e* vapaaksi fosfaatiksi on nopeampi; b) fytaatin konversio inosi-·,· : toliksi ja vapaaksi fosfaatiksi on tehokkaampi; sekä c) fytaa- :V: tin konversio (eli IP6, katso alla olevat esimerkit) inosito liksi ja fosfaatiksi on täydellisempi (eli suurempi kuin 80-prosenttinen konversio, kuten alla olevan esimerkin 1 taulukosta 1 nähdään).

• · • · ·

Yksi "normalisoitu fytaasiyksikkö" eli " PNU" määritellään A.

• e * ”” **! , ftiqer ALK0243-kannan tuottaman fytaasiaktiivisuuden suuruudek-?\ si, joka on tässä tapauksessa 85 PU/ml. Yksi "normalisoitu happaman fosfataasin yksikkö" eli "APNU" määritellään A. niqer «M — “ ’ ym/ ALK0243-kannan tuottaman happaman fosfataasiaktiivisuuden suu-J·· ruudeksi, joka on tässä tapauksessa 5500 PU/ml.

• t t • » « · 117202 19

Keksinnön suoritusmuodoissa saadaan aikaan fytaasia vastaavat nukleotidisekvenssit sekä myös pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaavat nukleotidisekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan ankarissa (stringent) olosuhteissa vastaavasti nukleotidisek-vens s i n SEQ. ID. NO. 18 tai SEQ. ID. NO. 2 0 kanssa. Kys ei s ten nukleotidisekvenssien avulla voidaan muodostaa oligonukleotidi-koettimia, transformaatiovektoreita, transformoituj a rekombi-nantti-isäntäsoluj a, j otka tuottavat rekombinanttifytaasi- proteiinia ja pH2,5 hapanta fosfataasiproteiinia, ja muita vastaavia jäljempänä kuvatulla tavalla.

Keksinnön muissa suoritusmuodoissa saadaan aikaan transformoidut rekombinantti-isäntäsolut, esim. E. coli, Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Cephalosporium, Rhizopus, j a muut vastaavat, jotka sisältävät kyseisten, keksinnön mukaisten, fytaasia ja/tai pH2,5 hapanta fosfataasia vastaavien nukleotidisekvenssien kopioita. Edullisessa suoritusmuodossa nämä transformoidut rekombinantti-isäntäsolut on valittu rihmasieni-lajien, kuten Aspergillus, Trichoderma ja Rhizopus joukosta; ja eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa nämä kyseiset 2*;\ is äntäs olut on valittu Aspergillus niger-homeen lajikkeiden ja kantojen joukosta. Kaikkein edullisimmassa suoritusmuodossa kyseiset isäntäsolut on valittu sellaisista rekombinantti-isän- ^ * ,···, täsoluista, jotka sisältävät fytaasinukleotidisekvenssin, ja e * joista esimerkkeinä voidaan mainita seuraavien fytaasia yli-tuottavien kantojen transformoidut solut: GAI-6, GAL-142, 1 GAN-1, GAG-12, GAO-248, GAI-12, GAK4-46, GAI-2, GAK4-52, GAM-111, GAK4-47, GAM-225, GAD-103, GAD-23, GAD-103, GAD-23, GAD-130, GAM-199, GAE-3, GAE-32, GAM-111, ja GAL-65 (kuten alla olevassa esimerkissä 4 on kuvattu). Eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa l\' kyseiset isäntäsolut on valittu sellaisista rekombinantti-isän-;T täsoluista, jotka on transformoitu pH2, 5 hapan fosfataasinuk- ,.V leotidisekvenssin sisältävillä vektoreilla, ja joista esimerk- keinä voidaan mainita seuraavien kantojen transformoidut • * solut: GAO-69, GAW-131, GBL-128, GBL-97, GAO-61, GAW-89, GAW-130, GAW-121, O GBL-87, GBL-119, GAO-84, GAW-54, GBL-I29, GAW-141, GBL-103, GAW-112, GBL-92, GAW-114, ja GAT-143 117202 20 (kuten alla olevassa esimerkissä 2, 4, 5 tai 6 on kuvattu).

Muista edullisista isäntäsoluista voidaan mainita seuraavien transformoitujen kantojen joukosta valitut solut: GAX-11, GAX-12, GBE-14, GBH-134, GBH-15, GBJ-9, GBJ-10, GBJ-13, GBM6, GBJ-26, GBJ-27, GBJ-28, GBJ-31, GBJ-35, GBJ-38, GBJ-40, GBJ-76, ja GBJ-82 (kuten alla olevassa esimerkissä 2, 4, 5 tai 6 on kuvattu). Alan asiantuntijalle on selvää, että ohessa aikaansaatujen nukleotidisekvenssien, transformaatiovektoreiden ja transformoitujen rekombinantti-isäntäsolujen avulla voidaan tunnistaa muita sellaisia kantoja, joilla on olennaisesti samat ominaisuudet kuin edellä tunnistetuilla kannoilla.

Alan asiantuntijoille on selvää, että keksinnön mukaisia nuk-leotidisekvenssejä ja johdettuja aminohapposekvenssejä käyttämällä voidaan muodostaa nukleotidi- ja vasta-ainekoettimia transformanttien luonnollisten varianttien ja mutanttien tunnistamiseksi ja eristämiseksi, joita mutantteja on saatu esimerkiksi käsittelemällä kemikaaleilla, UV-säteilyllä, gammasäteilyllä ja muulla vastaavalla tavalla. Mutanteissa fytaa-sin, pH2,5 happaman fosfataasin tai sekä fytaasin että pH2, 5 happaman fosfataasin ilmentyminen on saattanut voimistua. ,·;· Edustavista seulontamenetelmistä viimeksimainittujen mutant- B · tien tunnistamiseksi voidaan mainita Northern- ja Southern- *** blot- sekä Western-blot-menetelmät, joissa käytetään vasta-**· ···· aineita, jotka kohdistuvat peptideihin (luonnollisia tai syn- ft * *···* teettisiä), jotka sisältyvät kyseisen fytaasin ja kyseisen i pH2, 5 happaman fosfataasin johdettuun aminohapposekvenssiin.

ft - · • · - * * •

Alan asiantuntijalle on luonnollisestikin selvää, että transformoitujen rekombinantti-isäntäsolujen seoksia voidaan käyttää fytaasin sekä yhden tai useamman fosfataasin tuotannon : .v aikaansaamiseksi; esim. fytaasia tuottavasta kannasta peräisin ··· - ,··· oleviin transformoituihin rekombinantti-isäntäsoluihin voidaan • · *· · sekoittaa pH2, 5 hapanta fosfataasia tuottavasta kannasta peräi-:V sin olevia transformoituja rekombinantti-isäntäsoluja. Tällä ft·· ft • ··· ft ft ft·· ··· • ft ft ft ft λ • • ft 2i 1 1 7202 tavalla voidaan muodostaa sekasoluviljelmiä siten, että solut vapauttavat toivotussa suhteessa fytaasientsyymin aktiivisuutta ja pH2,5 happaman fosfataasientsyymin aktiivisuutta.

Kyseisiä, oheisen keksinnön mukaisia transformoituja rekombi-nantti-isäntäsoluja voidaan käyttää myös olennaisesti puhtaiden rekombinanttifytaasivalmisteiden tuottamiseksi. Edullisessa suoritusmuodossa näissä transformoiduissa rekombinantti-isäntäsoluissa on, fytaasinukleotidisekvenssit, jotka koodaa-vat polypeptidiä, jolla on fytaasin aminohapposekvenssi RHGXRXP, missä R on arginiini, H on histidiini, G on glysiini, X on mikä tahansa aminohappo ja F on proliini.

Keksinnön suoritusmuodoissa saadaan myös aikaan rekombinantti-fytaasin ja rekombinantti pH2,5 happaman fosfataasin "seoksia", joiden puhtausaste vaihtelee, ja joissa on aikaansaatu olennaisesti puhtaan pH2,5 happaman fosfataasin entsyymiaktiivisuuden ja olennaisesti puhtaan fytaasin entsyymiaktiivisuuden toivottu suhde. Tällaisen tasapainotetun entsyymiseoksen muodostaminen toivotuissa suhteissa antaa seokselle ominaisuudeksi yhteistoiminnasta johtuvan entsyymiaktiivisuuden (kuvattu edellä), jota voidaan räätälöidä kattamaan kaikki valitussa kaupallisessa sovellutuksessa (esim. jäljempänä b .···; kuvatut käytöt) toivotut ominaisuudet. Rekombinantti fytaasi n • aa ja rekombinantti pH2, 5 happaman fosfataasin lähtömateriaaleja ovat esimerkiksi fermentoi nti alustat, tuotantoa varten tarkoi-

B

,**! tetut kasvualustat ja vastaavat, jotka on saatu transformoi- • f 4 1 :;v duista rekombinantti-isäntäsoluista tai valituista kannoista, * 1 *** jotka ylituottavat kyseessä olevaa fytaasia ja/tai pH2, 5 hapan ta fosfataasia. Kyseisten entsyymien jälkikäsittely tuotteeksi voi käsittää solujen ja solujätteiden poistamisen (esim. sen-! trifugoimalla, suodattamalla ja vastaavalla tavalla), mitä : seuraa väkevöinti (esim. ultrasuodattamalla, ioninvaihtoon tai ·"**. affiniteettiin perustuvalla kromatografialla tai vastaavalla » ..y tavalla), tai tämä lähtöaine voi sopia kaupallisiin prosessei-hin yksinkertaisen puhdistamisen (esim. lyofilisoinnin) jäi- e *··1' keen. Kyseessä olevia seoksia voidaan valmistaa yhdistämällä yhtäsuuret (tai erisuuret) määrät kyseisiä entsyymivaimisteitä • ♦ • · „ 117202 22 (jotka ovat esimerkiksi peräisin eri soluviljelmistä) siten, että päästään vastaavien entsyymiaktiivisuuksien väliseen toivottuun suhteeseen, tai kyseisiä seoksia voi esiintyä samassa viljelmässä (esim. kahdella geenillä transformoidun rekombinantti-isäntäsolun tuote, kuten jäljempänä on kuvattu). Edullisen suoritusmuodon mukaisesti kyseisessä seoksessa fosfa-taasientsyymin (esim. pH2,5 happaman fosfataasin) aktiivisuuden ja fytaasientsyymin aktiivisuuden välinen suhde on noin 3: 1 - 16: 1.

Keksinnön suoritusmuodoissa saadaan aikaan transformoidut rekombinantti-isäntäsolut, joiden muodostamiseen on käytetty yhtä tai useampaa sellaista transformaatiovektoria, jossa on fytaasinukleotidisekvenssi ja yksi tai useampi fosfataasi, eli pH2, 5 hapan fosfataasinukleotidisekvenssi, ja jossa vektorissa kunkin entsyymin ilmentäminen tapahtuu itsenäisen promoottori-sekvenssin säätelyn alaisuudessa. Kyseiset transformoidut isäntäsolut valikoidaan sen perusteella, ilmentävätkö nämä solut kahta (tai useampaa) proteiinituotetta toivotulla ent-s yymi akti ivi suus aiueella.

:T: Transformoiduilla rekombinantti-isäntäsoluilla tuotetuilla fos-fataaseilla ja keksinnön suoritusmuotoja olevilla menetelmillä ti» saavutetaan seuraavat edut alalla aikaisemmin käytettyihin • · » « .···. muihin entsyymi vai mi s teisiin verrattuna, eli kyseisten, keksin-·'/. non kohteena olevien fosfataasien entsyymiaktiivisuus näytteen i « yksikkötilavuutta kohden on suurempi, entsyymiproteiinin saanto näytteen yksikköti1avuutta kohden on suurempi, ne ovat kustannuksiltaan edullisempia, niitä on väkevöitävä ja/tai puh-, distettava vähemmän kaupallisessa tuotteessa tai menetelmässä käytettäessä, niiden avulla päästään fytaatin tehokkaampaan ♦ -konversioon vapaaksi inositoliksi ja orgaaniseksi fosfaatiksi :T'ja ne aiheuttavat vähemmän sivuvaikutuksia ruuansulatuksessa ..Veläinrehussa käytettyinä.

« V

m Ψ ".'.Kyseisiä, keksinnön mukaisia transformoiduilla rekombinantti- » P » '^^isäntäsoluilla tuotettuja fosfataaseja voidaan käyttää kaupal-:**’iisissa menetelmissä mineraalien vapauttamiseksi fytaatin 117202 23 kanssa muodostuneista, kasvimateriaalissa kuten siemenissä ja ' jauhatuksen sivutuotteessa, esim. soijajauhossa, läsnäolevista komplekseista siten, että vähäarvoisista materiaaleista saadaan tehokkaasti ja edullisesti hyvälaatuista rehua muita kuin märehtiviä eläimiä varten. Esimerkkeinä kaupallisista menetelmistä, joissa kyseisiä entsyymejä voidaan käyttää, voidaan mainita märkäjauhatus, kasviproteiinin eristäminen (erityisesti soijaproteiinin eristäminen), leivontaan tarkoitetun viljan käsittely ja muut vastaavat.

Edullisessa suoritusmuodossa kyseiseisiä, keksinnön mukaisia fosfataaseja lisätään suoraan eläinrehuun siten, että eläin syö fosfaatit, jotka vapautuvat sitten in vivo esimerkiksi ei-märehtivän eläimen ruuansulatuskanavassa. Tässä tapauksessa kyseiset fosfataasit on valittu siten, että niiden vastaavien entsyymiaktiivisuuksien pH-optimi on sama kuin ei-märehtivän eläimen ruuansulatuskanavassa vallitseva pH (joka on pH-alueel-la 1-6).

Niistä sopivista menetelmistä kohde-entsyymien käsittelemiseksi tuotteissa käyttöä varten voidaan mainita sumutuskuivaus, stabilointi nestemäisissä valmisteissa, rakeistus ja kapseloin-ti, jotka menetelmät ovat tuttuja alan asiantuntijalle.

* * ♦

Ψ 9 9Ψ M

,···, Keksinnön kohteena olevat fos f at aasi entsyymit ja kyseiset t + tentsyymiseokset kykenevät hajottamaan fytaatin vapaaksi fos-* * * *;*.* faatiksi tehokkaammin ja nopeammin kuin yksikään entsyymikom- ’·" 'ponentti yksinään käytettynä. Keksinnön suoritusmuodoissa saadaan aikaan fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin seos, joka kykenee hajottamaan fytaattien ja fytiinihapon inositoli- fosfaatit, inositoliheksafosfaatin, IP6; inositolipentafos- : : *f aatin, IPS; inositolitetrafosfaatin, IP4; inositolitrifos-• «« ;'** faatin, IP3; inositolidifosfaatin, IP2; inositolimonofosfaat-* ,,Yin, IPl; vapaaksi inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi.

·./,Kyseisessä seoksessa päästään yhteistoiminnallisiin entsyymi-• ♦ '-/aktiivisuuksiin muodostamalla entsymaattinen kaskadi fytaatti-Ϋ*Substraatin hajottamiseksi nopeammin, täydellisemmin ja te-•'•’frokkaammin epäorgaaniseksi fosfaatiksi ja inositoliksi. Esi- • m 117202 24 merkiksi fytaasi, jonka edullinen substraatti on fytaatti (IF6), voi katalysoida tehokkaasti IP6: n hydrolyysiä yhdisteiksi IP5, IP4, IP3 ja IP2, mutta ei vapaaksi inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi. Sitä vastoin pH2,5 hapan fosfataa-si voi suosia yksinkertaisia fosfaattisubstraatteja (esim, IP5, IP4, IP3, IP2 ja IPl), ja se voi katalysoida näiden substraattien tehokasta hydrolysoitumista vapaaksi inositoliksi ja epäorgaanisiksi fosfaateiksi. Oletetaan, että kun keksinnön kohteena olevan fosfataasin osuus saatetaan fytaasiaktiivisuu-den ja pH2,5 happaman fosfataasin aktiivisuuden välisen suhteen toivotulle alueelle, niin tällöin keksinnön kohteena oievät seokset ovat tasapainotettuja entsyymiseoksia, joilla on yhteistoiminnan tuloksena syntyvää entsyymiaktiivisuutta. Tällä tavalla toteutettujen, keksinnön kohteena olevien seosten avulla päästään vapaan inositolin ja epäorgaanisen fosfaatin suurempien määrien nopeampaan, tehokkaampaan ja täydelli-sempaän vapautumiseen fytaatista ja fytiinihaposta, kumman tahansa komponenttina toimivan fosfataasientsyymin samassa ajassa (ja myös samoissa pH- ja lämpötilaolosuhteissa) tuottamaan määrään verrattuna.

Esimerkki 1 • · *

Fosfataasien puhdistaminen ja aminohapposekvenssin määritys (fytaasipeptidi ja hapan fosfataasipeptidi) •"I [Yleiset materiaalit ja menetelmät on kuvattu kappaleessa, • · ’**;* jonka otsikkona on "Materiaalit ja menetelmät", ja joka on :esitetty tämän ja kaikkien myöhempien esimerkkien lopussa. ] « * · f « · *

Fytaasin la pH2,5 happaman fosfataasin puhdistaminen Fytaasientsyymi ja pH2,5 hapan fosfataasientsyymi puhdistettiin 4-8 'C: n lämpötilassa (mikäli toisin ei ole mainittu) : /jiiger var. awamori-kannan ALK0243 (ATCC 38854) kasvualustan *** ,*:esoluttomasta suodoksesta/tiivisteesta. Viljelmän suodos/tii- ^•#viste (990 ml) kyllästettiin 70-prosenttisesti (jäissä) ammo- : .hiumsulfaatilla ja sakka poistettiin sentrifugoimalla nopeu-* *« \,.äella 10 OOOxg 15 minuutin ajan. Sitten supernatantti (1070 • · :*-ml) erotettiin hydrofobisella kromatografialla Octyl-Sepharose ••.«CL-4B (Pharmacia) -pylvästä käyttäen. Pylvästä (5 cm x 17 cm) • ♦ • e 117202 25 tasapainotettiin 20 mM bis-Tris/HCl-puskurilla, pH 6,2, joka sisälsi 0,436 g yhdistettä (NH«)aS04 millilitrassa; superna-tantti kaadettiin pylvääseen ja adsorboitumattomat proteiinit poistettiin huuhtomalla 500 ml: 11a tasapainotukseen käytettyä puskuriliuosta. Adsorboituneet proteiinit eluoitiin pylväästä käyttäen 500 ml ammoniumsulfaatin lineaarista gradienttia pitoisuudesta 70 % pitoisuuteen 0,0 % 20 mM bis-Tris/HCl-puskurissa, pH 6,2. Kymmenen ml: n fraktioita kerättiin ja niistä analysoitiin fytaasientsyymin ja pH2, 5 happaman fosfataasient-syymin aktiivisuus. Suurin osa fytaasiaktiivisuudesta eluoitui aikaisin tässä gradientissa. Vastaavasti eri entsyymin aktiivisuuksia sisältäneet fraktiot yhdistettiin kulloinkin toisiinsa; ne väkevöitiin ultrasuodattamalla käyttäen Amicon PM10-kalvosuodattimia. Suola poistettiin fytaasia sisältävistä fraktioista johtamalla ne PD10 (Pharmacia) -geelisuodatuspylväiden läpi, jotka pylväät oli tasapainotettu 50 mM bis-Tris/HCl-puskurilla, pH 6,2. Ensin kuvataan fytaasin puhdistaminen, sitten happaman fosfataasin puhdistaminen.

Fytaasi puhdistettiin ensin anioninvaihtokromatografisesti DEAE-Sepharose-pylväällä (Pharmacia). Lyhyesti, 24,5 ml; n näyte laitettiin kooltaan 5 cm x 7 cm olevaan pylvääseen, jota i « « /··, oli tasapainotettu 50 mM bis-Tris-HCl-puskurilla, pH 6,2.

• +

Adsorboitumattomat proteiinit poistettiin huuhtomalla tasapai-notuspuskurilla (100 ml) ja adsorboituneet proteiinit eluoi- • * [···* tiin käyttäen 200 ml lineaarista NaCl-gradienttia pitoisuudes-: ta 0, 0 M pitoisuuteen 0, 5 M tasapainotuspuskurissa, Fraktiois- * - * 5,* * ta määritettiin fytaasiaktiivisuus ja ne fraktiot, joissa todettiin aktiivisuutta, yhdistettiin ja väkevöitiin 600 μΐ: ksi käyttäen pientä Centricon-30-väkevöintilaitetta. 100 μΐ: n annoksia laitettiin noin 23 *C: ssa Superose 12 HR 10/30 : .* HPLC-pylvääseen (Pharmacia) ja proteiinit eluoitiin 50 mM ·*! * .••vbis-Tris/HCl-puskurilla, pH 6,2, virtausnopeudella 0,3 ml/min.

• · *· Aktiiviset fraktiot tunnistettiin, yhdistettiin ja ' väkevöitiin : .ja siirrettiin 50 mM natrium formaatti puskuri in, pH 3,8 käyt- M* V.täen pientä Centricon-30-väkevöintilaitetta. Formaattipuskuris-• * /•‘sa olevaa entsyymiliuosta puhdistettiin edelleen käyttäen e·* • •.•kationinvaihtoon perustuvaa kromatografiaa. 2 ml: n suuruisia * ♦ • « 26 1 1 7202 entsyyminäytteitä laitettiin Mono S HR 5/5 FPLC-pylvääseen (Pharmacia), jota oli tasapainotettu 50 mM natriumformaatilla (pH 3,8) noin 23 *C:ssa. Pylväs huuhdottiin tasapainotuspuskurilla (10 ml) ja sitoutunut proteiini eluoitiin nopeudella 60 ml/h, käyttäen 20 ml lineaarista NaCl-gradienttia pitoisuudesta 0 mM pitoisuuteen 430 mM tasapainotukseen käytetyssä for-maattipuskurissa. Tällä menetelmällä, jonka saanto oli 18,4 %, saatiin puhdistetuksi fytaasia, jonka ominaisakti!visuus oli noin 275 900 (PU/mg), lasketun puhdistumisen ollessa 130-kertainen (taulukko A).

Taulukko A

Yhteenveto fytaasin puhdistuksesta

Kokonai s - Omi nai s- aktiivi- Kokonais- aktiivi- Puhdistu- suus proteiini suus Saanto minen

Vaihe (PU) (mg) (PU/mg) (%) (kertainen)

Viljelmän 4, 486, 680 2, 119 2, 117 100 1 suodos

Ammonium- 3, 771, 750 1, 263 2, 986 84, 1 1,4 sulfaattia sisältävä super- V · natantti #**

Octyl- 1, 765, 881 32, 3 54, 671 39, 4 26 ·:· Se pharos e ··«* ·*« *···* DEAE- 1, 453, 470 8, 4 173, 032 32, 4 82 S Sepharose ··« » :V-Superose 12 1, 010, 888 5, 7 177, 349 22, 5 84

Mono S 827, 566 3, 0 275, 885 18, 4 130 ϊ :*tEdellä yhdistetyistä Octyl-Sepharose-fraktioista saadut, hapan-#«· * **·*ta fosfataasia sisältävät fraktiot väkevöitiin ensin ultra-

Suodattamalla Amicon PM10-suodattimella, minkä jälkeen ne ♦ · - ^^käsiteltiin kromatografisesti molekyyliseulan avulla, käyttäen '••♦kooltaan 2, 6 cm x 94 cm olevaa Sephacryl S-200-pylvästä (Phar-:"*macia), jota oli tasapainotettu 50 mM bis-Tris/HCL-puskurilla *t· ·* » * · * » * • * 117202 27

(pH 6,2). Proteiinit eluoitiin nopeudella 20 ml/h ja aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja erotettiin edelleen käyttäen anioninvaihtoon perustuvaa kromatografiaa kooltaan 5 cm x 7 cm olevalla DEAE-Sepharose-pylväällä (Pharmacia), jota oli tasapainotettu 50 mM bis-Tris/HCl-puskurilla, pH 6, 2. Pylväs huuhdottiin 100 ml: 11a tasapainotuspuskuria ja adsorboituneet proteiinit eluoitiin käyttäen 200 ml lineaarista NaCl-gradienttia pitoisuudesta 0,0 M pitoisuuteen 0, 5 M tasapainot us puskuri s s a. Sitten yhdistetyt aktiiviset fraktiot väkevoitiin; ne siirrettiin 20 mM bis-Tris/HCl-puskuriin, pH

6,0, ultrasuodattamalla Amicon PM10-kalvon avulla; ja sitten anioninvaihtoon perustuva kromatografinen vaihe toteutettiin toiseen kertaan, käyttäen tällä kertaa Mono Q HR 5/5 HPLC-pylvästä (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 20 mM bis-Tris-/HC1-puskurilla, pH 6,0, noin 23 ’ C:ssa. Näyte lisättiin 3,5 ml: n suuruisina annoksina; pylvästä huuhdottiin 10 ml: 11a tasapainotukseen käytettyä puskuria; ja proteiinit eluoitiin nopeudella 60 ml/h käyttäen 20 ml lineaarista NaCl-gradienttia pitoisuudesta 0,0 mM pitoisuuteen 350 mM tasapainotuspuskurissa. Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin 400 μΐ: n kokonaistilavuudeksi ja siirrettiin 20 mM i bis-Tris/HCl-puskuriin, pH 6,2, joka sisälsi 150 mM NaCl, käyttäen pientä Centricon-30-väkevöintilaitetta. Puhdistamista *«· •5·jatkettiin toteuttamalla ensin kromatografinen käsittely mole-»*·· .’••jkyyliseulan avulla, käyttäen Superose 12 HR 10/30 HPLC-pylväs-* #*«tä (Pharmacia), jota oli tasapainotettu bis-Tris/HCL-näytepus-i ’/· kurilla. Tähän pylvääseen laitettiin 100 μΐ: n suuruisia näyt- | * teitä ja proteiinit eluoitiin 23 *C: ssa nopeudella 18 ml/h.

Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin, siirrettiin 20 mM histidiini/HCl-puskuriin, pH 5,8, käyttäen PD10-geelisuodatuspylvästä, ja toinen puhdistusvaihe toteutettiin i * anioninvaihtoon perustuvalla kromatografiällä käyttäen Mono Q HR 5/5 HPLC-pylvastä. Pylvääseen laitettiin 1 ml: n suuruisia «/-näytteitä, pylvästä huuhdottiin 5 ml: 11a histidiini/HCl-näyte- e puskuria noin 23 *C: ssa. Proteiinit eluoitiin nopeudella 60 ««« i * Ψ·9 9 «· · • · * • * • · 117202 28 ml/h käyttäen 20 ml lineaarista NaCl-gradienttia pitoisuudesta 0 mM pitoisuuteen 350 mM tasapainotuspuskurissa. Tällä menetelmällä, jonka saanto oli 13 %, saatiin puhdistetuksi pH2, 5 hapanta fosfataasia siten, että puhdistuminen oli 126-kertai-nen, taulukko B.

Taulukko B

Yhteenveto pH2, 5 fosfataasin puhdistuksesta Kokonai s- Omi nai s - aktiivi- Kokonais- aktiivi- Puhdistu- suus proteiini suus Saanto minen

Vaihe (PU) (mg) (PU/mg) (%) (kertainen)

Viljelmän 116, 523, 000 2, 119 54, 990 100 1 suodos

Ammonium- 88, 275,000 1, 263 69, 893 75, 8 1,3 sulfaattia sisältävä super- natantti

Octyl- 68, 296, 470 583 117, 147 58, 6 2,1

Sepharose ... Sephacryl 52,237, 600 97, 9 533, 581 44, 8 9,7 • ft > » s /··. DEAE- 46, 127, 692 54, 6 844, 830 39, 6 15,4 ***· Sepharose «* p '”1 Mono Q 19, 326, 753 3, 28 5, 892, 303 16, 6 107 4 « ^ * : .· Superose 16, 876, 978 nd nd 14,5 nd • * *

Mono Q 15, 197, 050 2, 2 6, 907, 750 13,0 126 nd * ei määritetty ♦ · ♦ s - 4 * *11. Fytaasi: Edellä kuvatuilla menetelmillä puhdistetun fytaasin s e *** ilmeiseksi molekyyli painoksi saatiin SDS-FAGE-menetelmällä ; piioin 80 000 - 86 000 daltöniä. Tällä olennaisesti puhdistetuilla (SDS-PAGE-menetelmällä) proteiinilla saatiin positiivinen *** ^;*ireaktio Schiff: in hiilihydraattivärjäyksessä perjodihappoa ^“käyttäen (eli puhdistettu fytaasientsyymi on glykoproteiini).

• * * 0 * • · 29 1172C2

Sen jälkeen, kun puhdistettua fytaasia oli käsitelty endogly-kosidaasi F/N-glykosidaasi F-seoksella, entsyymin näennäinen molekyylipaino (SDS-PAGE-menetelmällä) muuttui noin 45 000 -46 000 daltoniksi, minkä perusteella voitiin päätellä, että noin 44 % molekyylipainosta johtui hiilihydraatista. (Glykosi-disen sidoksen ja tämän hiilihydraattiosan luonnetta ei määritetty). Denaturoimattoman, puhdistetun fytaasientsyymin mole-kyylipainoksi todettiin noin 90 000 daltonia molekyyliseulan avulla toteutetulla geelisuodatuksella (eli perustuen entsyymin Stokesin säteeseen), ja näennäiseksi molekyylipainoksi todettiin 100 000 daltonia luonnollisessa gradienttigeeli-PAA-elektroforeesissa. Viimeksimainittujen tulosten perusteella voidaan olettaa, että denatoroitumaton puhdistettu fytaasient-syymi esiintyy monomeerina. Kyseisen fytaasin isoelektrinen piste on 5, 3 isoelektrisen fokusoinnin perusteella.

pH2, 5 hapan fosfataasi: Edellä kuvatuilla menetelmillä puhdis tetun pH2, 5 happaman fosfataasin alayksikön näennäiseksi molekyylipainoksi saatiin SDS-PAGE-menetelmällä 66 000 daltonia. Tällä olennaisesti puhdistetulla (SDS-PAGE-menetelmällä) entsyymillä saatiin positiivinen reaktio Schiff:in värjäyksessä lY- per jodi happoa käyttäen, mikä osoittaa, että pH2, 5 hapan fosfa-taasi on myös glykoproteiini. Sen jälkeen, kun hiilihydraatti oli poistettu endoglykosidaasi F/N-glykosidaasi F-seoksella, * * ,*·%proteiinin näennäiseksi molekyylipainoksi saatiin SDS-PAGE-me-netelmällä 46 000 - 49 000 daltonia. (Glykosidisen sidoksen ja t * ^ T. tämän hiilihydraattiosan luonnetta ei määritetty). pH2,5 happa-*· man fosfataasin näennäiseksi molekyylipainoksi saatiin 280 000 daltonia luonnollisessa gradienttigeeli-PAA-elektroforeesissa, minkä perusteella voidaan päätellä, että puhdistettu, denaturoi tumaton entsyymi on neljä 66 000 daltönin suuruista alayk- • *t; sikköä käsittävä tetrameeri. Tämän happaman fosfataasin iso-;Yelektrinen piste on noin 4-4,25 isoelektrisen fokusoinnin «/.perusteella.

9 • e t 9 9 9 9 999 f · 9 99 9 Ψ 999 4 9 9 9 f 1 9 % * 117202 30

Puhdistetun fytaasi- la puhdistetun pH2, 5 happaman fosfataasi-entsvvmin katalyyttiset ominaisuudet;

Fytaasi: Puhdistetulla fytaasilla oli optimaalinen entsyymi-aktiivisuus (mitattuna 37 'Crssa olosuhteissa, joissa substraattia oli läsnä ylimäärin) noin pH-arvossa 5,0, ja pH-arvossa 2,5 todettiin pientä nousua ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta saavutettiin pH-alueella 2-7 (kuvio 1). Puhdistetun fytaasientsyymin lämpötilaoptimin (optimaalisen Na-fytaattisubstraatin läsnäollessa ja pH-arvossa 5,0) todettiin olevan alueella 55-60 1C, ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta saavutettiin lämpötila-alueella 25-65 * C (kuvio 2). Puhdistettu fytaasientsyymi katalysoi natriumfy-taatin hydrolyysiä ilman lisättyä metallia (eli tällä entsyymillä ei todettu olevan metalli-ionien absoluuttista tarvetta ja näin ollen se oli “metalli-ioneista riippumaton1'); puhdistetun fytaasientsyymin aktiivisuus kasvoi kuitenkin Mn2--, Mg2'1·- ja Ca2--ionien läsnäollessa.

pH2, 5 hapan fosfataasi: pH2,5 happaman fosfataasin näennäiseksi Km-arvoksi Na-fytaattisubstraatin läsnäollessa, 37 1C:ssa ja pH-arvossa 2,5 määritettiin noin 0,7 mM; ja kun substraat- .··1. tina käytettiin para-nitrofenyyli fosfaatti a (PNP), niin näen-* naiseksi Km-arvoksi saatiin 4 mM 37 1C:ssa ja pH-arvossa 2,5. Puhdistetun pH2, 5 happaman fosfataasi entsyymi n pH-optimi oli • » ."I pH-alueella 2,0-2,5 (37 1C:ssa, Na-fytaattisubstraatin optimaa-• · ♦ ! listen pitoisuuksien läsnäollessa), ja yli 20 % suurimmasta ak- «·« *.1 1 tiivisuudesta saavutettiin pH-alueella 1,5-3,5 (kuvio 3).

pH2, 5 happaman fosfataasin välittämän Na-fytaatin hydrolyysis-sä lämpötilaoptimiksi todettiin noin 55 " C, ja yli 20 % suurimmasta entsyymiaktiivisuudesta saavutettiin lämpötila-alueella : 25-60 1 C (kuvio 4). Vertailun vuoksi kaupallisen, puhdistamat-

4·« I

toman Finase-valmisteen pH/aktiivisuus-profiili on esitetty ku- 4 1 <β·Β· viossa 5 ja lämpötila/aktiivi s uus-riippuvuus on esitetty 4 4 4 * kuviossa 6.

•41 4 » « 4 • 44 » 4 444 • 1 • 1 444 4 1 4 1 1 4 4 • » 117202 31

Fytaatin hajottaminen fytaasilla ia pH2,5 happamalla fosfataa-silla sekä niiden seoksilla:

Finase on Aspergillus-homeesta saatujen entsyymien kaupallinen valmiste, joka on fytaasin ja fosfataasin seos. Finasessa pH2, 5 happaman fosfataasin aktiivisuuden (HFU) ja fytaasiak-tiivisuuden (PU) väliseksi suhteeksi määritettiin noin 7: 1. Keksinnön puitteissa toteutetussa kokeessa kaupallisella Fina-se-entsyymivalmisteella saavutettua fytaatin hajoamisnopeutta verrattiin hajoamisnopeuteen, joka saavutettiin puhdistettua fytaasia, puhdistettua pH2, 5 hapanta fosfataasia sekä niiden seoksia sisältävillä valmisteilla, joissa happaman fosfataasin ja fytaasin väliset suhteet vaihtelivat. Happaman fosfataasin aktiivisuuden (HFU) ja puhdistetun fytaasin aktiivisuuden (PU) välinen suhde on noin 0,4:1, kun taas happamalla fosfataasilla ei ole lainkaan fytaasiaktiivisuutta pH-arvossa 5,0. Entsyymi-seosten suhteet on esitetty taulukoissa 1. a ja 1. b. Mainittu vertaaminen toteutettiin pH-arvossa 2,5, 37 *C:ssa ja pH-ar-vossa 5,0, 37 *C:ssa, käyttäen 10 mM Na-fytaattia substraattina. Kokeissa käytettyjen kaikkien erilaisten valmisteiden entsyymiaktiivisuudet pH-arvossa 2, 5 olivat 10 000 HPU Na-fytaattisubstraatin yhtä millimoolia kohden [HPU on fytaasiak-..... tiivisuuden yksikkö mitattuna pH-arvossa 2, 5 käyttäen 0, 2 M

• 4 4 glysiini (HC1)-puskuria, pH 2,5, Na-sitraattipuskurin sijasta, ♦ » katso "Materiaalit ja menetelmät" esimerkin 1 lopussa. ) pH-ar- 4tt ·;·* vossa 5, 0 toteutetuissa kokeissa entsyymin annostus Na-fytaat-tisubstraatin millimoolia kohden oli 10 000 PU, lukuunottamat- * * : ta koetta, joka toteutettiin käyttäen pelkkää puhdistettua • J ·* hapanta fosfataasia. Näytteitä otettiin reaktioseoksesta esi tettyjen aikojen jälkeen (tunteja, h; 0, 1, 2, 8, 24 ja 48 h); näytteet kylmäkuivattiin ja niistä analysoitiin myöhemmin inositoli-heksa-, penta-, tetra- ja trifosfaatit (eli vastaa- : vasti IP6, IP5, IP4 ja IP3), sekä vapaa inositoli (Ins) ja • * ”1. epäorgaaninen fosfori (Pi). Inositoli-heksa-, penta-, tetra- • · \ . ja trifosfaatit analysoitiin Sandberg et ai. : in (Γ987) esittä- • e t • V mällä menetelmällä. Inositoli analysoitiin HPLC-menetelmällä käyttäen Sugar Pak I-pylvästä (300 mm x 6,5 mm, Waters), käyt-,·*·[ täen eluenttina 0, 1 mM Ca-EDTA-liuosta (Calcium-Titriplex ·ΓΙβ Merck 8439), virtausnopeus 0,6 ml/min 90 *C:ssa. Osoittamiseen » ♦ • 4 117202 32 käytettiin Rl-ilmaisinta (Waters), käyttäen standardina myo-inositolia (Fluka) konsentraatio alueella 0,1-0,5 mg/ml. Epäorgaaninen fosfori analysoitiin tavalla, joka on kuvattu esimerkin 1 lopussa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät”. Näistä kokeista saadut tulokset on esitetty alla olevissa taulukoissa la ja Ib.

• « *

« » I

♦ ψ * ♦ M» * * * * * * * · ««« * * • t · • * 1

• »* I

* - t • i · • « « ♦ I 9 ? av* * # | * * « * M» t * ' * * * · ♦ · * * v * t * « * * *

I

»•I * · * · i * i • * * · ♦ * · » * * * • * « * 117202 33

Taulukko la pH2, 5 Saanto, % teoreettisesta3

Entsyymi(t) Aika annos/mmol substraattia__(h) IP6 IP5 IF4 EP3 Ins P; 0 100 0 0 0 0

Finase 1 40 13 19 0 0 10.000 HPU 2 39 20 51 8 0 8 0 0 2 38 5 24 0 0 0 0 57 48 0 0 0 0 94 103 Ö Ϊ00 0 Ö Ö 0

Fytaasi 1 20 29 20 0 0 10.000 HPU 2 5 30 68 22 0 8 0 0 (+) 24 0 24 0 0 0 0 0 _ 48 0 0 0 0 0 87 Ö Ϊ33 Ö Ö 0 Ö pH2,5 hapan fosfataasi 1 67 8 26 0 0 10.000 HPU 2 54 9 37 (+) 0 8 26 2 42 12 1 24 2 1 8 4 40 48 1 0 5 1 67 88 0 100 0 0 0 0 0

Fytaasi 9,000 HPU 1 44 23 32 20 0 16 : pH2,5 hapan fosfataasi i,000 HPU 2 6 13 71 17 0 31 J.., 8 0 2 10 0 2 79 HFU:PU 24 0 0 0 0 33 93 _·{· 0.8:1 48 0 0 0 0 63 98 .···. “* 0 ' Γόο Ö Ö 0 Ö 5

Fytaasi 5,000 HPU 1 38 12 47 ’ (+) 0 15 !.* : pH2,5 hapan fosfataasi 5,000 HPU 2 17 7 76 (+) 6 27 :Y; 8 0 0 7 19 12 69 HFU:PU 24 0 0 0 0 76 99 4.4:1 48 0 0 0 0 101 104 0 Ϊ00 Ö Ö 5 Ö 0

Fytaasi 1,000 HPU 1 40 16 39 (+) 0 10 pH2,5 hapan fosfataasi 9,000 HPU 2 27 8 26 (+) I 17 I : 8 7 2 21 n 9 45 ;·Γ- HFU:PU 24 0 0 6 5 46 79 \ . 36.4:1 48 0 0 0 0 '102 103 »9 * 1 —'lii. '~| . I < 1 ' 1 • ♦ - « Saanto, % teoreettisesta: Na-fytaattisubstraatin (XP6) läh- :...· töpitoisuus, 10 mM, tässä määrityksessä asetettiin vastaamaan 100 % teoreettista saantoa (eli IP6: n saanto); IP6: n tapauk- : \ sessa jäljelle jääneen Na-fytaatin pitoisuus kokeen lopussa «* v

• I

• e 117202 34 jaettiin lähtöpitoisuudella, jolloin saatiin taulukoissa la ja Ib esitetyt %-arvot; yhdisteiden IP5, IF4, IP3, Ins ja P tapauksessa kunkin hajoamistuotteen suurin teoreettinen pitoisuus, joka saatiin vapautetuksi yhdisteestä IP6 (happamalla hydrolyysillä), laskettiin ja se asetettiin vastaamaan kunkin hajoamistuotteen 100 % teoreettista saantoa; jäljelle jääneen hajoamistuotteen pitoisuus kokeen päättyessä jaettiin teoreettisella pitoisuudella, jolloin saatiin taulukoissa la ja Ib esitetyt %-arvot; (+) tarkoittaa jäämiä.

• 99 • · b • t * ··· • * »e» e «e » « «««· e s · ««« • t 9 9 4 I * * • •e * • » • w · • t ^ « 4 * B · · • I » 9 9 »19 • » ’ • t * % Ψ · * · ' te* • · 4t» V « e ·« I 4 999 f» · » ♦ » 9 4 9 9 117202 35

Taulukko 1b pH5, 0 Saanto, % teoreettisestaa

Entsyymi(t) Aika annos/mmol substraattia__(h) IP6 IP5 W4 IP3 Ins pt- 0 100 0 0 0 0

Finase I 51 16 24 0 0 10.000 PU 2 35 22 29 14 0 8 0 7 1 18 0 24 0 0 0 0 18 __48 0_0_0_0 52 88 0 100 0 0 0 0

Fytaasi 1 43 33 27 11 0 10.000 PU 2 23 18 24 21 0 8.1 2 6 24 0 24 0 0 0 0 0 _ 48 0 0 0 0 0 90 0 lÖÖ Ö 0 0 0 Ö pH2,5 hapan fosfataasi 1 107 0 0 0 0 0 OPU 2 106 00000 10.000 HPU 8 105 0 0 0 0 0 24 93 0 (+) . (+) 0 1 __48 % 0 (+) (+) Q_1 0 100 0 0 0 0 0

Fytaasi 10,000 RU 1 30 26 45 <+) 0 18 pH2,5 hapan fosfataasi 1,000 HPU 2 27 23 36 32 0 21 V ? 8 1 2 10 29 0 46 HFU:PU 24 0 0 (+) (+) 4 82 *\\Λ 1-4:1__48_0_0 (+) (+) 17 90 ·**[ 0 100 0 0 0 o o

Fytaasi 10,000 PU 1 34 12 65 0 0 21 : pH2,5 hapan fosfataasi 5,000 HPU 2 27 22 38 28 0 24 ::v 8 1 2 9 27 0 50 ; HFU:PU 24 0 0 0 0 21 88 _5.4:_1_______ 48 0 0 0 0 59 96 0 100 0 0 0 0 0

Fytaasi 10,000 PU 1 30 Π 54 0 0 24 pH2,5 hapan fosfataasi 9,000 HPU 2 31 22 36 28 1 24 : 8 (+) 2 9 25 9 51 HFU:PU 24 0 0 0 0 46 88 9.4:1 48 0.0 0 0 102 102 * * ----- ----- M * • I · * * · • v ψ »»« Ä Kuten edellä olevassa taulukossa la.

• » * vt * « · » * * * 117202 36

Taulukoissa la ja Ib esitetyistä tuloksista nähdään, että puhdistettu fytaasientsyymi ja pH2, 5 hapan fosfataasientsyymi sekä kaupallinen Finase-entsyymiseos katalysoivat Na-fytaatin hydrolyysiä inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi, mutta eri nopeuksilla, pH-optimin ollessa kulloinkin erilainen. Kunkin puhdistetun entsyymin optimaalisissa pH-olosuhteissa (eli pH-arvossa 5,0 puhdistetun fytaasin tapauksessa; ja pH-arvossa 2,5 puhdistetun pH2,5 happaman fosfataasin tapauksessa) kaikki kolme entsyymivalmistetta vapautti noin yhtä suuret määrät epäorgaanista fosfaattia 48 tunnissa (eli 90 % Pi fy taasin tapauksessa; 88 % Pi happaman fosfataasin tapauksessa; ja 88 % tai 103 % Pi Finase-seoksen tapauksessa). Näistä tu loksista nähdään kuitenkin myös, että inositolin (Ins, taulukot la ja Ib) tuotanto on selvästi hitaampaa pH-arvossa 5,0 kuin pH-arvossa 2,5. Inositolia, joka on Na-fytaattihydrolyy-sin lopputuote, ei kyetty ilmaisemaan pH-arvossa 2, 5 eikä pH-arvossa 5, 0, kun puhdistettua fytaasientsyymiä käytettiin yksinään, vaikka IP6, IP5, 1P4 ja IP3 hävisivätkin täydellisesti hydrolyysiäjan kuluessa. Tästä voidaan vetää se johtopäätös, että puhdistettujen fytaasientsyymien mahdolliset hydrolyytti-set lopputuotteet ovat inositolin di- ja/tai monofosfaatit. :T Sitä vastoin fytaatin (eli IP6 = inositoliheksafosfaattien) «*”: hajotus puhdistetulla happamalla fosfataasilla pH-arvossa 2,5 ees tuotti lopputuotteena inositolia. Näiden yhdistettyjen tulos-/*\, ten perusteella voidaan päätellä, että fosfataasien kaupalli- s * sessa seoksessa, kuten Finase-tuotteessa, pelkkä fytaasi ei * · t ;:y riitä fytaatin täydelliseksi hajottamiseksi inositoliksi ja ·’ epäorgaaniseksi fosfaatiksi. Pikemminkin näiden tulosten perusteella voidaan päätellä, että inositolilopputuotteita voidaan saada sellaisten entsyymien vaikutuksesta, jolla entsyymillä on samankaltainen substraattispesifisyys kuin puhdiste- • * •J tulla pH2,5 happamalla fosfataasilla. Niinpä ohessa tarkastel- :T tiin sitä mahdollisuutta, että fytaasin avulla toteutetun :.y fytaattihydrolyysin tuotteet (eli XP5, IP4, IP3, IP2 ja IP1) e saattavat toimia happaman fosfataasin käyttökelpoisina sub-straatteina, joka hapan fosfataasi voi muuntaa nämä inositoli-fosfaatit vapaaksi inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi*: si. Niinpä näistä tuloksista voitiin todeta aikaisemmin odotta- • e 117202 37 maton yhteistoiminnallinen entsyymiaktiivisuus fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin välillä fytaatin hajotuksessa. Jotta tätä mahdollisuutta voitaisiin tarkastella edelleen, puhdistetun fytaasin ja puhdistetun pH2, 5 happaman fosfataasin s ubs traattis pes i fi s yydet arvi oi ti i n.

Puhdistetun fytaasin ja puhdistetun pH2, 5 happaman fosfataasin substraattispesifisyyksiä verrattiin 37 *C: ssa käyttäen fy- taattisubstraatin yhtäsuuria pitoisuuksia (eli 20 mM) sekä samaa lämpötilaa (eli 37 *C). Fytaasin aktiivisuus määritettiin pH-arvossa 5,0 ja happaman fosfataasin aktiivisuus määritettiin pH-arvossa 2, 5 käyttäen molybdaatti-fosfaattiin perustuvaa osoitusjärjestelmää, joka on kuvattu esimerkin 1 lopussa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät". Alla olevassa taulukossa 2 on verrattu toisiinsa näiden kahden erilaisen entsyymin suhteellisia aktiivisuuksia eri substraattien tapauksessa.

Taulukko 2

Olennaisesti puhdistetun fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin substraattispesifisyys pH2,5 happaman :t: ; Fytaasin fosfataasin '··*. suhteellinen suhteellinen *..* aktiivisuus aktiivisuus •S· Substraatti_(% )*_(% )*» • ees 5βββ' F vt i ini hapon Na- suola 100 36 J Fytiinihapon K-Mg-suola 106 34 i.5 ; Fytiinihapon Ca-suola 56 43 •V: Glukoosi-6-fosfaatti 11 62 * ATP 7 72

Fruktoosi-1,6-difosfaatti 8 107

Fruktoosi-6-fosfaatti 1 18 L-a-glyserofosfaatti 1 71 . , p-nitrofenyylifosfaatti 24 100 9 9 999 .*;* * Prosentuaalinen suhteellinen aktiivisuus = "mitattu aktiivi- *·* e suus, joka on laskettu prosentteina fytaasin standardisubstraa-•*V tiliä saadusta aktiivisuudesta (eli Na-fytaatilla asetettiin : * 100 prosentiksi) ·***; Prosentuaalinen suhteellinen aktiivisuus * "mitattu aktiivi- T. suus, joka on laskettu prosentteina happaman fosfataasin stan-**··- dardi substraatill a (eli p-nitrof enyyli fosfaatilla) saadusta ak- tiivisuudesta (asetettiin 100 prosentiksi) ".

9 9 * 9 9 9 38 1 1 7202

Taulukossa la, taulukossa Ib ja taulukossa 2 esitetyistä tuloksista nähdään, että puhdistettu fytaasi, joka tosin välittää tehokkaasti fytiinihapon hydrolyysiä, katalysoi vähemmän tehokkaasti muiden yksinkertaisempien, fosfaattia sisältävien substraattien hydrolyysiä. Sitä vastoin puhdistettu pH2,5 hapan fosfataasi, joka hydrolysoi suhteellisen tehokkaasti yksinkertaisia fosfaatteja, oli suhteellisen tehoton ajatellen fytiinihapon hydrolyysin katalyysiä. Tämä tulos tukee kuvitelmaa yhteistoiminnallisesta entsyymiseoksesta, jonka tapauksessa puhdistetulla fytaasilla saadut tuotteet (esim. inositoli di- ja mono-fosfaatit) voivat toimia puhdistetun pH2, 5 happaman fosfataasin substraatteina siten, että reaktiosta saadaan lopputuotteina vapaata inositolia ja epäorgaanista fosfaattia.

"Tasapainotetut” entsyymiäeokset

Seuraavaksi tarkasteltiin sitä mahdollisuutta, että tehokas yhteistoiminnallinen entsymaattinen seos saadaan mahdollisesti syntymään optimoimalla puhdistetun fytaasin ja puhdistetun pH2, 5 happaman fosfaataasin ne määrät, jotka sekoitetaan yhteen valmisteessa siten, että näiden kahden erilaisen entsyymin aktiivisuudet saadaan “tasapainoon", eli siten, että saa-:T' daan yhteistoiminnallinen entsyymiaktiivisuus tietyssä pH:ssa ja lämpötilassa optimaaliseen nopeuteen, tehokkuuteen ja täy- »· · dellisyyteen pääsemiseksi, kun fytaattia hajotetaan vapaaksi *·** .···- inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi. Tätä varten suori- ·*” tettiin tutkimuksia, joissa valmistettiin puhdistetun fytaasin • · · *!Y ja pH2,5 happaman fosfataasin seoksia käyttäen niissä näiden • kahden entsyymin aktiivisuuksia määrätyissä suhteissa, mutta vaikka puhdistetun fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin tällaisiin “tasapainotettuihin" seoksiin liittyi etuna nopeutunut fytaatin hydrolyysi ja täydellisempi konversio vapaaksi · ' inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi kaupallisiin val-:T misteisiin verrattuna, niin kuitenkaan taloudellisesti edulli- ··*·’ sena ei voida pitää tällaisen “tasapainotetun" entsyymi seoksen ♦ \.I puhdistamista, standardisointia, laaduntarkkailua (QC) ja *"t\ laadun takaamista (QA) useimmissa kaupallisissa prosesseissa ··· • s « e « - * « « 117202 39 (esim. eläinrehussa) käyttöä ajatellen niin, että päästäisiin esimerkiksi pH2,5 happaman fosfataasin ja fytaasin entsyymiaktiivisuuksien välisten suhteiden toivotuille alueille.

Tämän jälkeen, näiden ongelmien ratkaisemiseksi, tarkasteltiin sitä mahdollisuutta, että molekyylitason tekniikoita voitaisiin ehkä käyttää sellaisten rekombinanttientsyymien tuottamiseksi, joiden entsyymien laatu olisi riittävän hyvä siten, että aikaansaadaan yhdenmukaiset standardisoidut valmisteet, joissa päästään välttämättömään hinta-hyöty-suhteeseen sekä QC/QA-ominaisuuksiin, jotka vaaditaan kaupallisena tuotteena käyttökelpoisilta "tasapainotetuilta" seoksilta.

Fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin aminohapposekvenssin määri ttämi ne n:

Puhdistettujen proteiinien sisäisten aminohapposekvenssien selvittämiseksi proteiineista valmistettiin peptidifraktioita käyttäen TPCK-trypsiiniä (tavalla, joka on kuvattu jäljempänä olevassa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät"). Lisäksi puhdistettu pH2, 5 hapan fosfataasi alkyloitiin (käyttäen 4-vinyy-lipyridiiniä) ja sitten se pilkottiin lysylendopeptidaasi .*;· C: llä, kuvatulla tavalla (Materiaalit ja menetelmät). Tulokse-• ♦ - .>··. na olleet peptidit puhdistettiin käänteisfaasia käyttäen suu-m*l ripaineisella nestekromatografisella menetelmällä (RP-HPLC) käyttäen C18 RP-pylvästä (tavalla, joka on kuvattu jäljempänä * olevassa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät"). Puhdistettu- ί ·*- : jen peptidien aminoterminaalinen sekvensointi suoritettiin •V : käyttäen kaasupulssinestefaasisekvenssimäärittäjää, ja vapautu neet PTH-aminohapot analysoitiin RP-HPLC-menetelmällä (tavalla, joka on kuvattu kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät"). Karboksiterminaalinen sekvensointi suoritettiin käyttäen : kineettistä pilkkomista karboksipeptidaasi Y: llä, PITC-johdan- naisen muodostamista sekä näiden PITC-aminohappoj en RP-HPLC- * ** · analyysiä.

i« e

I M

e • ·

• M

Alla olevissa taulukoissa 3 ja 4 on esitetty fytaasista ja s s pH2, 5 fosfataasista trypsiinillä saatujen peptidien aminohap-•\v posekvenssi sekä pH2,5 fosfataasista lysylendopeptidaasilla e m 40 11 7202 saatujen peptidien aminohapposekvenssit. Kuten taulukoissa 3 ja 4 esitetyistä tuloksista voidaan nähdä, eräät peptidivalmisteet eivät olleet puhtaita. Taulukoissa 3 ja 4 näiden peptidien aminohapposekvenssejä on myös verrattu geenien ja cDNA:n nukleotidisekvenssistä johdettuun aminohapposekvenssiin (alla oleva esimerkki 2), eli sulut [] taulukoissa 3 ja 4.

Aspergillus niqer var. awamori-kannasta ALK0243 puhdistetun fytaasin aminoterminaalisessa sekvenssissä todettiin N-termi-naalinen sekvenssi (eli peptidi#1081/N-phy Taulukko 3; LAVPAS(R)NQSTXDT), SEQ ID NO:22, joka on samankaltainen, muttei samanlainen kuin A. ficuum:in fytaasille esitetty aminotermi-naalinen sekvenssi (eli Ullah, 1988; LAVPASRNQSSGDT, SEQ ID NO:23). Yksi peptidi (eli #420/10 phy; LYVEMMQ(N)QA(E)Q(T)PLV, SEQ ID NO: 24) oli sekvenssiltään samankaltainen, muttei samanlainen kuin A. ficuum:n fytaasille esitetty sisäinen peptidi (katso Ullah, 1988, MMQCQAEQEPLVRVLVNDRX, SEQ ID NO:25). Fytaasin karboksiterminaalinen sekvensointi antoi sekvenssin XSA-OH. Yksi peptidi (eli #675; taulukko 3) sisälsi KDPR-sekvenssin, SEQ ID NO:26, joka on homologinen sen sekvenssin • · « *·’ ’ kanssa, jonka sekvenssin on esitetty olevan läsnä muissa * 9 fosfataaseissa (eli KDPRA, SEQ ID NO:27, Ullah, 1991).

» • · * * • * • * • » • · ·

• I I

·«« * • * · * • 9 9 9 9 · 9 ··« • * • ^ * • 9 9 • • · « 9 • e· • · f 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 99 9 9 117202 41

Taulukko 3

Fytaasista eristettyjen peptidien aminohapposekvenssi

Peptidin Aminohappo- [DNA-sekvenssistä johdettu numero_sekvenssi* aminohapposekvenssi 1 _ #132/12 phy Tyr-Tyr-Gly-HjsfLeu)-GIy-AIa-GIy-Asn-Pro-Leu-Gly-Pro-Thr-Gln [Tyr-Tyr-GIv- His--Gly-Ala-Gly-Asn-Pro-Leu-GIy-Pro-Thr-Gln] #133 Thr-Gly-Tvr-Vai'Gln(Asn)-Tyr-Vai-Gln-Mct-(Gln) [ei löytynyt DNA:sta] #242/1 phy Ala-Gln-Pro-Gly-Gln-Ala-Ala-Pro-Lys [Ala-Gln-Pro-Gly-Gln-Ser-Ser-Pro-Lys] #420/10 phy Lcu-Tyr-Val-Glu-Met-Met-Gln-(Asn)-Gln-Ala-(Glu)-Gln-(Thr)-Pro-Leu-Val [Leu-Tyr-Val-Glu-Met-Met-Gln- Cvs -Gln-Ala- Glu -Gin- Glu -Pro-Leu-Val] #410/13 phy Phe-Ile-Glu-Gly-Phe-Gln-Ser-Asp-Lys [Phe-Ile-Glu-Gly-Phc-Gln-Ser-Asp-Lys]

#416/7 phy Tyr-Ala-Phe-Leu-Lys [Tyr-Ala-Phe-Leu-LysJ

#659/6 phy Gly-Leu-Ser-Phe-Ala-Arg [Gly-Leu-Ser-Phe-Ala-Arg] #670&#796/2 phy Val-Ile-Ala-Scr-Gly-Glu-Lys [Val-Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Lys] #418/3 phy Phe-Tyr-Gln-Arg [Phe-Tyr-Gln-Arg] #785/1 lphy Phe-Tyr-Gln-Arg {= #418, edellä} ja Asp-Ser-Phe-Val-Arg (not pure) [ Asp-Ser-Phe-Val-Arg] #248 (ei puhdas) Val/Tyr-Leu/Glu-Val/Ser-Asn/Leu-Asp/Gln [vertailu DNAihan mahdotonta] #784/9 phy Tyr-Glu-Ser-Leu-Thr-Arg [Tyr-Glu-Ser-Leu-Thr-Arg] ·;·, #675 (ei puhdas) Ser-Aia-Ala-Ser-Leu-Asn-Ser (trypsiinientsyymin fragmentti} * Leu-Lys-Asp-Pro-Arg [Leu-Lys-Asp-Pro-Arg] * * * » ‘ · · · * #783 (ei puhdas)/ Val-Ile-Ala-Ser-Glv-Glu-Lys {pieni määrä = #670 ja 796, yllä} • l· 4 phy e · · ·. Tyr-Pro-Thr-Glu-Ser-Lys [Tyr-Pro-Thr-Glu-Ser-Lys]

«II

: .*. #244 (ei puhdas) Tyr/Asp-Phe/Pro-Asn/Ala-X/X-Glv [vertailu DNA:han mahdotonta] »i* · ϊ : : #793 Leu-Glu-Asn/Pro-Asp/Phe-Leu-Asp/Ser-Gly/Leu-Phe/Val-Thr-Leu) [Leu-Glu- Asn - Asp -Leu- Ser - Gly - Vai -Thr-Leu-Thr] #792 (kaksois- TyT-Tyr-GIy-His-Gly-Ala-GIy-Asn-Pro-Lcu-Gly-Pro-Thr-Gln-Gly-Val-Gly-Tyr-AIa- sekvenssi)/15 phy Asn-Glu-Leu-Ile-Ala {=#132 (puolet edellisestä) ja Val-Tyr-Phe-Ala-Gln-Val-Leu-Ser . . Tästä kaksoissekvcnssista voidaan johtaa seuraavat sekvenssit : Val-Thr-Phe-Ala-Gln-Val-Leu-Ser [Val-Thr-Phe-Ala-Gln-Val-Leu-Ser] . ·. ja Tyr-Tyr-Gly-His-Gly-Ala-Gly-Asn-Pro-Leu-Gly-Pro-Thr-Gln-Gly-Val-Gly-Tyr-

Ala-Asn-Glu-Lcu-Ue-Ala .·*·* [Tyr-Tyr-Gly-His-Gly-Ala-Gly-Asn-Pro-Leu-Gly-Pro-Thr-Gln-Gly-VaUGly-Tyr-Ala- I .* Asn-GIu*Leu-Ile-Ala #11 • » #800/13 phy Phe-Ile-Glu-Gly-Phe-Gln-Ser-Thr [Phe-Ilc-Glu-Glv-Phe-Gln-Ser-Thr] « ♦ «Il .. . ft I · a m » 9 42 1 1 7 2 0 2

Taulukko 3 (jatkoa)

Fytaasista eristettyjen peptidien aminohapposekvenssi

Peptidin numero Aminohappo- [DNA-sekvenssistä johdettu sekvenssi9 aminohapposekvenssi]11 #797 /14 phy Asp/Asn-T yr-Leu-Gln-Ser-Leu- [Asp-Tyr-Leu-GIn-Ser-Leu-Lys]

Lys 795 (Outoa käyttäytymistä Asn-Ile-Glu-Pro-Phe-GIn-Val-Asn [ei löytynyt DNA-sekvenssistä] peptidisekvenssin määrityksessä #799 /8 phy Val-Leu-V ai* Asn-Asp-Arg [Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg] {-#248, edellä) #1081 /N-phy Leu-Ala-Val-Pro-Ala-Ser-(Arg)- [Leu-Ala-Val-Pro-Ala-Ser-Arg-Asn-

Asp-Gln-Ser-Thr-X-Asp-Thr Gln-Ser-Thr-Cys-Asp-Thr] C-terminal /C phy -(Arg)-Ser-Ala-OH [Cys-Ser-Ala-End] a peptidisekvenssi, X = aminohappo, jota ei voitu osoittaa; / = läsnä voi olla jompikumpi mainituista aminohapoista, määritys ei ollut yksiselitteinen, () - suluissa esitetyt aminohapot ovat kyseenalaisia PTH-aminohapon heikosta signaalista johtuen; fytaasipeptidit, joista on käytetty merkintää (phy), saatiin trypsiinillä pilkkomalla. b [] = DNA-sekvenssistä johdettu peptidisekvenssi; alla oleva esimerkki 21; ja # : peptidin numero.

pH2,5 fosfataasin sekvenssiä määritettäessä Aspergillus niger var. awamori-kannasta ALK0243 puhdistetun luonnollisen .···. proteiinin tai alkyloidun proteiinin aminoterminaalisesta ·*# •j. sekvenssistä ei saatu lainkaan tuloksia. Eräästä peptidistä (eli • »ti # 1107T/7Lpho, alla oleva taulukko 4) saatiin sekvenssi, joka ··· • oli samanlainen kuin se aminoterminaalinen sekvenssi, joka on iti · :T: esitetty A. ficuum:ista puhdistetulle fosfataasille (katso Ullah • — & Cummins, 1987, FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDG, SEQ ID NO:28). Puhdistetusta pH2,5 fosfataasista (ALK0243) saatu peptidi O #941C/10Lpho voi olla sekvenssin ##1107/7Lpho jatke, koska se näyttää sisältyvän A. ficuum:in terminaaliseen osaan. Peptidi #1112T/3Tpho näyttää olevan peptidin #943C/llLpho jatke, koska I*» \ sillä näyttää olevan osittain päällekkäin menevä sekvenssi (eli • · · Γ\ FSSG sekvenssissä 1112T/3Tpho). pH2,5 fosfataasipeptidi • «« 816C/lLpho sisältää mahdollisen aktiivisena kohtana toimivan konsenssi (concensus) sekvenssin ( RHGXRXP, SEQ ID NO:29).

117202 43

Taulukko 4 pH2y 5 fosfataasista trypsiinillä (T) ja lysylendopeptidaasilla (C) saatujen eristettyjen peptidien aminohapposekvenssi*

Peptidin Aminohappo- numero__sekvensointi** [DNA-sekvensointi 1 ° #81601 Lpho Arg-His-Gly-Glu-Arg-Tvr-Pro-Scr-Pro-Ser-Ala-Gly-Lys lArg-His-Glv-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ser-Pro-Ser-Ala-Glv-Lys] #817C ja #1107T/7 Phe-Ser-TyT-Glv-AJa-Ala-Ile-Pro-Gln-Ser-Thr-Gln-Glu-Lys

Lpho IPhe-Ser-Tvr-Glv-Ala-Ala-Ue-Pro-Gln-Ser-Thr-Gln-Glu-Lvs] #84705 Lpho Asp-Ue-Glu-Glu Ala-Leu-Ala-Lys | Asp-I le-Glu-Glu-Ala-Leu-Ala-Lys ] #826C (ei puhdas) Ser/Ala-Ile-Glu/Pro-(GIu) [vertaaminen DNA:han mahdotonta] #943 011 Lpho Ala-Arg-Tyr-Gly-His-Leu-Trp-Asn-Gly-Glu-Thr-Vai-Val-Pro-Phe-Phe-Ser-

Ser-Gly [Ala-Ajg-Tyr-Glv-His-Leu-Trp-Asn-Glv-Glu-Thr-VaJ-Val-Pro-Phe-Phe-Ser-

Ser-GIy] #938C (ei puhdas)/! Lpho {Ser/Arg)-Tyr/His-Gly-Gly/Glu-Asn/Arg-Gly/Tvr-Pro-Tvr/Ser-(Pro)-Glu/Ser- (Ala)-(Gly) [vain sekvenssin osaa voitiin verrata DNA-sekvenssiin] [Tyr -Gly- Gly - Asn - Gly -Pro- Tyi] #941C (ei puhdas)/10 Gln-Phe-Ser-Gln-Glu-Phe- X -Asp-Gly-Tyr-(Arg) {hallitsevat lajit)

Lpho [Gln-Phe-Ser-Gln-Glu-Phe-Arg-Asp-Gly-Tyr] (Thr/His)-Tyr-Gly-Gly-Asn-Gly-X-Tyr/Pro { =#938Ct edellä} {vähäiset lajit} ♦ · * * * « • * #1106T ja #1112T/3 Phe-Ser-Ser-Gly-Tyr-Gly-Arg

Tpho [Phe-Ser-Ser-Gly-Tyr-Gly-Arg] „;r #1108T (ei puhdas)/9 Val-Ala-Phe-Gly-Asn-Pro-fTyr) ja (Asp/Glu)-Leu-Asn-Ala-Ile-Leu-

Tpho Phe/Lys * > · * * edellä olevan sekvenssin perusteella johdettiin seuraavat sekvenssit* ; :*· Val-AJa-Phe-Gly-Asn-Pro-(Tyr) ja (Asp/Glu)-Leu-Asn-Ala-IIe-Leu- V* [Val-Ala-Phe-Gly-Asn-Pro-Tyri ja [ei todettu DNA-sekvenssissä] #1110T (ei puhdas)/6 Asp-Ile-Glu-Glu-Ala-Leu-Aia-Lvs {«#847, edellä} ja Gln-Leu-Pro-Gln-Tpho Phe-Lys [Gln-Leu-Pro-Gln-Phe-Lys] #111IT/4 Tpho__Val-Ser-Tvr-Glv-lle-Ala [Val-Ser-Tyr-Glv-He-Alal_ t · • ♦ · T = pilkkominen trypsiinillä; C = 4-vinyylipyridiinillä : : -käsitellyn pH2, 5-fosfataasin pilkkominen lysylenddpeptidaasi 11 ä; s'·’:1* peptidi sekvenssi, X « aminohappo, jota ei osoitettu;/ = \.I läsnä voi olla jompi kumpi mainituista aminohapoista, määritys \..;ei ollut yksiselitteinen, () = suluissa esitetyt aminohapot (;/ovat kyseenalaisia PTH-aminohapon heikosta signaalista johtu- • * • · ♦ et ·♦ t • « i t * « · 44 1 1 7 2 0 2 en; lysylendopeptidaasilla pilkkomalla saadut fosfataasin peptidit (pho) on merkitty symbolilla (L), trypsiinillä pilkkomalla saadut alkyloidun fosfataasin peptidit on merkitty symbolilla (T); ja ° [] = DNA-sekvenssistä johdettu peptidisekvenssi; alla oleva esimerkki 2J; ja # : peptidin numero.

Näistä aminohapposekvensseistä valittiin yksi fytaasista saatu peptidisekvenssi (eli #420, Leu Tyr Vai Glu Met Met Gin (Asn) Gin Ala (Glu) Gin (Thr) Pro Leu Vai, jossa kyseenalainen (Asn) on korjattu jäännökseksi Cys; Ullah, 1968; taulukko 3) sekä kaksi pH2,5 fosfataasista saatua peptidisekvenssiä (eli #816C; Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Ala Gly Lys ja #1110T; Gin Leu Pro Gin Phe Lys; taulukko 4), jotka katsottiin käyttökelpoisiksi ajatellen degeneroitujen oligonukleotidikoettimien valmistamista molekyylitason kloonausta varten alla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

Materiaalit ja menetelmät

Fytaasientsyymin ia pH2,5 happaman fosfataasientsyymin määritys: molybdaattiin perustuva osoitusjärjestelmä Molemmissa määrityksissä mitataan se epäorgaanisen fosfaatin ,··♦, määrä, joka vapautuu entsyymi vaikutuksen seurauksena, käyttäen # « - fosfomolybdaattikompleksin pelkistämiseen perustuvaa kolori-*··· metristä kvantitointia. Yksi fytaasi yksikkö (PU) on se entsyy-

Mi mimäärä, joka vapauttaa alla kuvatuissa olosuhteissa 1 nanomoo-Iin epäorgaanista fosfaattia Na-fytaatista yhdessä minuutissa * ♦ !,; ! 37 *C:ssa. Yksi pH2, 5 happaman fosfataasin yksikkö (HFU) on se V : entsyymimäärä, joka vapauttaa alla kuvatuissa olosuhteissa 1 nanomoolin epäorgaanista fosfaattia p-nitrofenyylifosfaatista | yhdessä minuutissa.

; ,· Fytaasiaktiivisuus määritettiin lisäämällä 1 ml substraattia • · ‘ .··*„ (1 % natriumfytaatti, joka valmistettiin päivittäin uudestaan f * *. . [Sigma #P3168] 0, 2 M sitraattipuskurissa, pH 5,0) 1 ml: aan ψψ ► i V laimennettua entsyymisupernatanttia ortofosfaatin hydrolyysin * * · ·... käynnistämiseksi. Täsmälleen 15 minuutin kuluttua 37 * C: saa, • · ,*·*. hydrolyysireaktio keskeytettiin lisäämällä 2 ml 15 % TCA: ta » * *·« e» * • f • * e « 117202 45 (tri kloori etikkahappo, Merck #807), mitä s euras i s ekoi tus, jäähdytys ja sentrifugointi mahdollisesti muodostuvan sakan poistamiseksi. Vapautunut ortofosfaatti mitattiin lisäämällä yhtä suuri tilavuus juuri valmistettua Reagenssia C [3 tilavuutta IM rikkihappoa, johon oli sekoitettu 1 tilavuus 2,5 % (p/til.) ammoniummolybdaattia (Merck #1182) sekä 1 tilavuus 10 % (p/til.) askorbiinihappoa (Merck #127)] siten, että hydrolyy-sireaktion seos (edellä) laimenee suhteessa 1: 10. Reagenssia C sisältänyttä seosta inkuboitiin 50 ’C:ssa 20 minuuttia. Absor-banssit mitattiin aallonpituudella 820 nm reagenssia sisältävää kontrollia ja tunnettuja standardeja (9,0 mM KHaPCU-liuoksen; Merck 4873; 1: 100 - 1: 400 laimennokset) vastaan, joiden standardien avulla muodostettiin standardikäyrä. Fytaasin vapauttaman fosfaattimäärän avulla laskettiin fytaasi seuraa-valla tavalla: fytaasilla saatua A<aao »m>-arvoa verrattiin fosfaatti standardi käyrän A<aao -arvoihin, ja mahdollisen laimennustekijän suhteen tehdyn korjauksen jälkeen fytaasiak-tiivisuus saatiin jakamalla fosforipitoisuus (nmol/ml) hydro-lyysiajalla (eli 15 min. ).

pH2,5 happaman fosfataasin aktiivisuus määritettiin samalla tavalla; eli 0, 1 ml laimennettua entsyymiä (laimennettu 0,2 M V glysiini-HCl-puskuriin, pH2, 5) lisättiin 1,9 ml; aan substraat- tia [eli 30 mM p-nitrofenyylifosfaatti (Boehringer Mannheim) liuotettuna 0,2 M glysiini-HC1-puskuriin], pH 2,5. Sen jäl-keen, kun reaktioseosta oli inkuboitu 15 minuuttia 37 *C:ssa, \ i*: reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen yhtä suuri tilavuus •V·. is % TCA: ta (kuten edellä). Vapautunut ortofosfaatti mitattiin e 1 käyttäen Reagenssia C (kuten edellä on kuvattu) ja aktiivisuus määritettiin vertaamalla tunnettuihin laimennettuihin fosfaatti standardeihin (kuten edellä) sekä laskemalla edellä kuvatul-, la tavalla.

• · * * -««e - **· V Peptidifragmenttien valmistus trypsiinillä aminohappoaekvens- ·*·’: sin määrittämiseksi * * ·*** Puhdistettu fytaasi (70 μg), joka oli sekoitettu 50 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7, 9, pilkottiin 2 % (p/p) trypsiinillä i *···* (TPCK-käsitelty, Sigma) 2 tunnin ajan 37 * C: ssa ja sitten f f ψ • · 117202 46 edelleen 2 % (p/p) trypsiinillä 21 tunnin ajan. Puhdistettu pH2, 5 hapan fosfataasi 100 mM Tris-HC1-puskurissa, pH 8, 0, käsiteltiin 2 % (p/p) trypsiinillä 20 tunnin ajan 37 1C:ssa ja sitten edelleen 2 % (p/p) trypsiinillä 6 tunnin ajan. Peptidit puhdistettiin jäljempänä kuvatulla tavalla.

Peptidifragmenttien valmistus lysylendopeptidaasi C: llä aminohapposekvenssin määrittämiseksi

Puhdistettu pH2, 5 hapan fosfataasi alkyloitiin käyttäen 4-vi-nyylipyridiiniä seuraavalla tavalla: lyofilisoituun pH2, 5 happamaan fosfataasiin (75 μ?) lisättiin 40 μΐ 0, 5M Tris-HCl-puskuria, pH7, 5, joka sisälsi 6M guanidinium-hydrokloridia, 2 mM EDTA ja 34 mM DTT. Reaktioseokseen lisättiin 1 μΐ 4-vinyy-lipyridiiniä (Sigma), minkä jälkeen reaktioseosta pidettiin huoneen lämpötilassa (22 ’C) 1 tunnin ajan. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 ml 1, 4M DTT: tä. Sitten alkyloitu fosfataasi puhdistettiin HPLC-menetelmällä, käyttäen C-l-käänteisfaasi-pylvästä (TSK TMS 250; 0,46 x 4 cm) sekä eluoimiseen gradient-tia 20 % --> 70 % ACN/0, 06 % TFA (80 % —> 30 % 0, 1 % TFA: ta) 30 minuuttia. Aallonpituudella 218 nm absorboivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin Speed-Vac-vakuumisentrifugissa. Sitten kuivattu näyte suspendoitiin uudestaan lisäämällä 60 μΐ · ♦ : 70 mM Tri s-HC1-puskuri a, pH 9, 1, ja pilkkomiseen käytettiin 2 % (P/P) lysylendopeptidaasi C: tä (Wako Chemicals) 2 tunnin ajan ··· 37 1C:ssa. Sen jälkeen, kun seokseen oli lisätty vielä 2 % * 4 « ♦ (P/P) lysylendopeptidaasi C: ta, inkubointia 37 ’C:ssa jatket- : .·. ti in vielä 26 tuntia. Peptidit puhdistettiin seuraavassa kuva-» « · I /·;·. tulla tavalla.

i · » ·

Peptidin puhdistaminen 1a aminoterminaalinen sekvensointi Entsyymidigestiolla (edellä) saadut peptidit erotettiin HPLC-menetelmällä, käyttäen C-18-käänteisfaasipylvästä (Vydac 218 • · : TP B5; 0, 46 x 25 cm), eluoiden 90 minuutin ajan gradientilla 0 --> 60 % ACN/0,06 % TFA (100 --> 40 % 0, 1 % TFA: ta). Peptidit osoitettiin määrittämällä absorbanssi aallonpituudella 218 nm.

* [·1·. Puhdistettujen peptidien sekä natiivien proteiinien aminotermi-***. naalinen sekvensointi toteutettiin hajottamalla ne kaasupulssi- 414 t 1 ♦ 4 • 1 · • · • · 47 1 1 7202 47 nestefaasisekvensaattorissa (Kalkkinen & Tilgmann, 1988). Vapautuneet PTH-aminohapot analysoitiin suoraan (on-line) käyttämällä kapeakanavaista käänteisfaasi HPLC: tä.

Fytaasin karboksiterminaalinen sekvensointi

Erä puhdistettua fytaasia (53 μ9) pilkottiin karboksipeptidaa-si Y: llä (Sigma, 0, 6 U) 50 mM natriumasetaatissa, pH 5,6, joka sisälsi 10 % ureaa ja 0,05 % yhdistettä SDS, huoneen lämpöti lassa (22 * C). Pilkkomisseoksesta otettiin näytteitä eri ajan-hetkillä. Ne kuivattiin Speed-Vac-tyhjäsentrifugissa ja niistä tehtiin johdannaiset fenyyli-isotiosyanaatilla (PITC) aminohap-poanalyysiin tarkoitetun reagenssipakkauksen Pico-Tag (Waters Association) mukaisesti. Näiden aminohappojohdannaisten analyysi toteutettiin käänteisfaasi-HPLC-menetelmällä, käyttäen

Pico-Tag C-18-pylvästä ja kvantitointi toteutettiin käyttäen samalla tavalla johdannaiseksi muutettuja aminohappostandar-deja.

Esimerkki 2

Fosfataasigeenien eristäminen ja karakterisointi (fytaasi ja pH2,5 hapan fosfataasi) [Yleiset materiaalit ja menetelmät on kuvattu tämän esimerkin lopussa olevassa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät". ] ♦ *

Fytaasigeenin ja pH2, 5 happaman fosfataasigeenin kloonaamisek- 9 si molekyylitasolla näistä entsyymeistä peräisin olevat sisäi- 9 * set peptidit (kuvattu edellä) valmistettiin A. niger var.

# * » · awamori-kannasta ALK0243. Fytaasia ja pH2, 5 hapanta fosfataa-' siä koodaava genoominen DNA kloonattiin ja samoin cDNA kloonattiin siten, että koko koodaava sekvenssi voitiin määrittää. Lopuksi muodostettiin ekpressiovektoreita (alla olevassa esimerkissä 3 kuvatulla tavalla), jotka erittivät kumpaakin ent-: syymiä toiminnallisessa muodossa, ja samoin valikoitiin kah- m * della geenillä transformoitu kanta, joka syntetisoi ja eritti e.V toivottua, kustannuksiltaan edullista ja "tasapainotettua" < i - • ·* entsyymi seosta, jossa pH2, 5 happaman fosfataasin ja fytaasin e » • * « · # * • · »« · 1 * 9 9* 9 9 9 * 117202 48 välinen suhde oli sellainen, että seoksella oli ominaisuutena yhteistoiminnallinen entsyymiaktiivisuus, joka on haluttu tietyssä kaupallisessa sovellutuksessa, esim. eläinrehuissa.

Oligonukleotidikoettimlen rakentaminen

Lukuisten, edellä esimerkissä 1 saadusta puhdistetusta fytaa-sista ja pH2,5 happamasta fosfataasista peräisin olevien sisäiset peptidifragmentit sekvensoitiin. Degeneroitu oligonuk-leotidi, joka oli komplementaarinen jokaiselle valitun alueen kahdeksalle kodonikombinaatiolle (suluissa, taulukko 3) eräässä fytaasin sisäisessä peptidissä, syntetisoitiin käyttäen laitetta Pharmacia Gene Assember Plus; eli kysymyksessä oli fytaasista peräisin oleva peptidi, jolla on sekvenssi Leu Tyr Vai Glu Met Met Gin Cys Gin Ala Glu Gin [eli peptidi #420, taulukko 3; jossa kyseenalainen (Asn) on korjattu Cysrllä; Ullah, 1988]. PHY-1, joka on esitetty taulukossa 5, on 17 emästä käsittävä oligonukleotidiseos, josta kahdeksasta kombinaatiosta yksi oligonukleotidi on täydellisesti vastaava.

17-meerinen degeneroitu oligonukleotidi PHY-31 valmistettiin happaman fosfataasin erään peptidin perusteella; kysymyksessä oli peptidi #816C pH2,5 fosfataasista (eli Arg His Gly Glu Arg :T: Tyr Pro Ser Pro Ser Ala Gly Lys). Neutraalin inosiinin sisäl- lyttämisen seurauksena yksi täydellinen vastaavuus 64 mahdolli-·;· sesta kombinaatiosta esiintyy PHY-31: ssä. Taulukossa 5 on esitetty oligo-PHY-31: n nukleoti di sekvenssi sekä vastaava

♦ M

: peptidisekvenssi. PHY-34 on 17-meerinen seos, jonka degeneroi- tuulinen on 128-kertainen ja joka on valmistettu pH2, 5 happamas- * 1 t ta fosfataasista peräisin olevaa peptidiä IHOT vastaavaksi koodaavan sekvenssin suhteen. PHY-35 on 17-meerinen seos, jossa degeneroituminen on 64-kertainen, ja joka on myös valmistettu peptidiä #1110T vastaavaksi koodaavan sekvenssin suh- • « r teen. Sekä PHY-34 että PHY-35 tarvitaan peptidin #1110T täy-: delliseksi esittämiseksi. Peptidi #1110T on saatu ' pilkkomalla :\v trypsiinillä puhdistettua, natiivia pH2, 5 hapanta fosfataasia \.I (edelläoleva taulukko 4).

* » 1 • · · m e e 1· • » m · • et i ♦ * 1 1 t ·» • · 117202 49 Λ o - ™ Ρ Ρ Ρ Ρ ^ ^ ρ » ~ ~ ""-“ 28 gggo ggig gggg q'S 2q q'q 9 S S 9 9 9 9 5 άα ry rv cy ", ά ό ό c/ ööoö ω u u ω ω iR ω ω ^ ω tutuuiuj c£ ^2, ' (Λ $ <Λ w w « w W 5Λ (Λ =? ih =? *~ *? _Γ? *7 Ο ρ otioci < < < < <<<< Ο Ο Ο § Ο π <<<< <<<< S li 1^1 ΐΐπ ΕΚΕΕ £ ο< -2-- <σ<< <o<< 0 -s << anoo uuou ouuu - g e~ u uf-uu o < H u o < h o .3 £ Hl· hhhh cjuRu uuuo 2 *§ o o uuuu o o ^ u uuao * S o h h -r a < a u vo<huw<o<< 3 9 1 T < < *? u υ o υ ^h^hf-^hhhr κ tg 3 >< O O >- U U U <J >-υυυυ^Ηί-ί-Η -3 O § 5 E- H £0<00 X<O<<X<O<< |

cg £> °"<< ^ H H H H £1-<<<<G'<<<< tS

« °uu °oaoo o u u o o o u o u a § ί Q — — .' _’ ' 1 ' := 1 1 ’ -g

Ci O in H O n H tn fn Ο^ΙτιΟ^ίπΟ^ΐΗιϊηίη > K 8 cl, .a rt c ^ 1 rt O jä ‘53 a O | rt O « g 3 _« < Si ^ c ö 3 w -3* W c

<U -= o S

e o £ •Γ3 « L. ^ a rt U .. u ? 1 en o ro e Tr o o λ ::. 3 or: z ^ ._. S -s

* 2 o . Q v) 4>S

··· tn O rt λ 2 Q !- ” r? u .3 ί· 10 8 % 5 £ "a O o ^ 3 : S a5. ti< 5o a. £T« ·:* 31 I s" ^ = «a I *::: 1 § I £0 f > 1 ♦ ^ do o — — o ^ zz o ri*s rt £ I 3 £ SS -£ §5 1 :.*. HO 1 ;ϊ ;; *5 a| :·: ! s sf g=i s-f ·2,| I Ί &5 8*2* 8*5 s s I . < Cl· — ex < S .2¾ 3 > | S 5 2 fee <s « ° 55 w .¾ — ^ ω ja

lii * I

·:·· II f ra »·· MJ (b *Λ ,«· ri * : : x * a.

* · «· · « · * • * • * * • · *»· * * *«· » ··· #· · * i « * » V · so 117202

Genomisen ALKQ243 DNA: n tutkiminen degeneroituneilla oliqo-nukleotidikoettimilla Näiden degeneroituneiden oligonukleotidien spesifisyyden arvioimiseksi ALK0243-kannan koko genominen DNA tutkittiin käyttäen koettimena PHY-l:ta, jonka pää on merkitty [V'-3aP]~ ATP: 11ä käyttäen E. coli Polynukleotidi T4-kinaasia [BRL] siten, että päästiin suureen omi nai s aktiivi s uute e n. Kuviosta 7 nähdään, että hyvin ankaraa pesua (high stringency wash) käyttäen vain yksi yksittäinen vyöhyke hybridisoitui fytaasin oli-go-PHY-1-sekvenssiin. Näissä ankarissa olosuhteissa degeneroitunut oligo tunnisti vain yhden vyöhykkeen, joten se oli sopiva ehdokas kirjaston seulomista ajatellen.

KUVIO 7. A. nicrer var. awamorl- kannan ALK0243 genomisen DNA: n tutkiminen käyttäen fytaasin oligonukleotidia PHY-1 koettimena. Genominen DNA eristettiin neutraaliin hajotukseen perustuvalla (neutralysis) menetelmällä. Lyhyesti, hienoksi jauhettu pakastettu kuiva rihmasto hajotettiin 4 % SDS-TE-puskuril la. Solukerrostuma poistettiin ja supernatantti erotettiin ja uutettiin kahdesti yhtä suurella tilavuudella Tris-kyllästettyä fenoli: kloroformi-seosta (1:1). Genominen DNA saostettiin NH^OAC: 11a ja EtOH:11a. Pelletoitu DNA puhdistettiin ultra- V sentrifugoimalla CsCl: n läpi ja se otettiin talteen Maniatisin > ** et ai. kuvaamalla tavalla. Hybridisaatio genomiseen DNA: hän ,,**’ ( ΐ 3aP) ATP-merkityillä, degeneroituneilla oligoilla (Maniatis et ai., 1982) suoritettiin 42 ‘C: ssa yön yli suodattimilla, • ·*; oligohybridisaatioliuoksessa (6x SSPE, 0, 5 % SDS, 3x ·*.·. Denhardts, 100 μg/ml tRNA). Epäspesifinen sitoutuminen pois- tettiin huuhtomalla suodattimia kahdesti 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa liuoksella 2x SSC, 0, 1 % SDS sekä kertaalleen 5 minuutin ajan 42 *C:ssa juuri valmistetussa liuoksessa. Kodak X-Omat AR-filmin valottaminen yön yli, voimistavia var- • · ••J jostimia käyttäen, paljasti positiivisesti hybridi s oi tuvat V vyöhykkeet, * * 1· 1 e 9 - ψ » *

Samoin, ALK0243-kannan genominen DNA tutkittiin käyttäen koet- «e* m\mw timena radioaktiivi s es ti leimattua, spesifistä, pH2, 5 hapanta ***** fosfataasia vastaavaa oligo-PHY-31: a (edellä kuvion 7 yhtey-* ·*-• * 117202 51 dessä kuvatuissa olosuhteissa). Autoradiogrammi on esitetty kuviossa 8. Vaikka PHY-31: n spesifisyys ei ollutkaan yhtä suuri kuin PHY-1: 11 ä, niin kuitenkin näytti ilmeiseltä, että tämä oligonukleotidikoetin tunnistaisi korkeintaan kaksi vyöhykettä.

Fytaasigeenin eristäminen ia karakterisointi

Genominen DNA pilkottiin osittain entsyymillä Sau3A 10-23 kb:n pituisten fragmenttien tuottamiseksi. Pilkottu DNA ligoitiin BamHI:llä leikatun defosforyloidun Lambda Dash II-vektorin päihin (Stratagene). Ligaatio pakattiin in vitro käyttäen Stratagenen Gigapack Gold-pakkausuutteita. Pakatulla faagilla infektoitiin E. coli-kanta P2392 plakkien saamiseksi. 5x10* plakkia muodostavaa yksikköä seulottiin fytaasioligolla PHY-1 seuraavissa olosuhteissa: eli, yli yön 42 *C:ssa suodattimilla oligonukleotidin hybridisaatioliuoksessa (6x SSPE, 0, 5 % SDS, 3x Denhardt: in liuos, 100 ^g/ml tRNA). Epäspesifinen sitoutuminen poistettiin pesemällä suodattimia kahdesti 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa liuoksella 2x SSC, 0, 1 % SDS, sekä kertaalleen 5 minuutin ajan 42 'C:ssa, juuri valmistetussa liuoksessa. Kodak X-Omat AR-filmin valottaminen yön yli, voimistavia varjostimia käyttäen, paljasti positiivisesti hybridi-

Ml V " soituvat plakit. Kaksitoista voimakkaasti hybridisoituvaa • * · ίφφφ: plakkia otettiin talteen niiden jatkokarakterisointia varten.

*5" Subkloonaukseen ja mahdolliseen nukleotidi sekvensointi! n välit- • · »v ;***: tiin lambda-f aagi, jossa olevat insertit hybridi soit uivat M« :PHY-1-koettimiin, jotka insertit olivat saman kokoisia kuin • it i ,V. genomisen DNA: n fragmentit 0, 8 % agaroosigeeliä elektroforee- • * * sissa. (kuten jäljempänä on kuvattu kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät").

Fytaasin genomisten kloonien subkloonaus ja sekvensointi \A Bakteriofaagi-DNA, joka oli eristetty olennaisesti Yamamoto: n ** V (1970) menetelmällä kustakin 12 ehdokkaasta, pilkottiin res- e « SV- triktioendonukleaaseilla ja kappaleet tutkittiin käyttäen koet- ’··*. timena PHY-1-oli gonukleotidi a. 1,8 kb: n BamHI/Xbal hybridisoi-♦ "Γ· va fragmentti, joka oli tunnistettu edeltäkäsin genomisessa Southern-määrityksissä, eristettiin kloonista numero CH7 ja se • e · i * ‘ • e * 117202 52 subkloonattiin faageihin Ml3rapl8 ja M13mpl9 [BRL]. Fytaasin oii gonukleoti dikoettimi en (siis FHY-1) kanssa positiivisesti reagoiva subklooni CH7 sekvensoitiin.

Tämän subkloonin nukleotidisekvenssissä todettiin olevan alueita, jotka vastasivat muille tunnetuille fytaasipeptidisekvensseille kuvattua nukleotidisekvenssiä, mikä varmistaa tämän kloonin olevan peräisin fytaasin genomisesta DNA: sta. Päällekkäin menevän 2, 6 kb: n suuruisen Sphl-kappaleen sekvenssin määrityksen jatkaminen paljasti 1409 bp: n suuruisen avoimen lukukehyksen, joka sisälsi 15 sisäistä peptidisekvenssiä sekä N-terminaalisen peptidisekvenssin. Ylävirran puoleisen sekvenssin analyysi yhtiön IntelliGeneticsin FC/GENE-ohj elmalla " SIGNAL" (joka perustuu Standen: in menetelmään, 1984), paljasti vahvan eukarioottisen Kozak-konsensussekvenssin, jota seurasi metioniinikäynnistyskodoni. Tämä ATG oli kuitenkin väärässä lukukehyksessä sekvenssin muuhun osaan nähden. Mahdollinen 102 bp: n introni, joka voidaan kuvata homeperäisen konsensus-donori-sekvenssin, lasso-(lariat)-sekvenssin ja vastaanottaja-(acceptor)-sekvenssin avulla (Rambosek ja Leach, 1987) tunnistettiin mahdollisen käynnistyskodonin ja N-terminaalisen peptidin välistä. Tämän oletetun intronin silmukointi palautti • tt ·„* ehdotetun ATG: n ja N-terminaalisen peptidin aminohapposekvens- • se sin välisen lukukehyksen. Kun tämä yksi ainoa oletettu introni sisällytettiin fytaasigeenin 5' -päähän, niin koko polypeptidiä kooditti 470 aminohappoa. Fytaasigeenin sekvenssi ja luenta on 5 esitetty kuviossa 9.

• ie * • e • t · • · « KUVIO 9. Nukleotidisekvenssi 2,6 kb: n Sphl-fragmentista, sisältäen fytaasigeenin ja siitä johdetun translaation. Ehdotetun introniluovuttaja- (GTRNGT), lasso- (RCTRAC) ja vastaanottaja-(YAG) konsensus-sekvenssien yläpuolelle on vedetty viiva.

* *

Peptidiä 420 (taulukko 3) vastaava nukleotidisekvenssi on M* V alleviivattu. Nukleotidisekvenssi määritettiin M13-dideoksi- e e ;·.· menetelmällä (Sanger et ai., 1977) päällekkäisistä subkloo- • « /•v neista käyttäen reagenssipakkausta United States Biochemical *·*· Sequenase II.

Ml ♦ * tee m · # e -1 • t 117202 53

Transloidun fytaasipolypeptidin suhteelliseksi molekyylimassak-si laskettiin noin 51400 daltonia. Fytaasille määritetty kodo-nien hyväksikäyttöanalyysi paljasti G+C-esiintymistiheydeksi koodittavien kodonien (sense codons) hiljaisessa kolmannessa asemassa (eli Trp- ja Met-kodoneja huomioon ottamatta) 68,3 %. Koko rakennegeeni ja ylävirran puoleinen sekvenssi subkloonat-tiin 2,6 kb: n Sphl-fragmenttina pUC-18-vektoriin ja siitä käytettiin lyhennettä pFF-1 (Kuvio 10).

KUVIO 10. Fytaasin rengasmaiset transformaatiovektorit. (A) pFF-1: 2,6 kb: n Sphl-fragmentti, joka sisältää fytaasigeenin sekä sen natiivin promoottorin, subkloonattiin positiivisesta lambda-klOonista pUC-18-vektoriin. Xbal-kohta istutettiin pFF-1: ssä fytaasia koodaavan alueen asemaan -26 kohdennetulla mutageneesillä, jolloin saatiin pSELFX. (B) pFF-2: fytaasi A.

niger β-tubuliinipromoottorin säätelyn alaisuudessa.

pSELFX: stä saatu 2,0 kb: n Xbal-fragmentti ligoitiin homepe-räisen ekspressiovektorin pTL-113 ainoaan Xbal-kohtaan, jolloin saatiin pFF-2. (C) pFF-3: fytaasi A. niger GAPDH-promoot-torin säätelyn alaisuudessa. pSELFX: stä saatu 2,0 kb: n Xbal-fragmentti ligoitiin pPRE-81: n ainoaan Xbal-kohtaan, jolloin saatiin pFF-3. (D) pFF-4: fytaasi A. niger GA-promoottorin »•e V: säätelyn alaisuudessa. pSELFX: stä saatu 2,0 kb: n Xbal-kappale 1 ligoitiin pGA: n ainoaan Xbal-kohtaan, jolloin saatiin pFF-4.

ψ ** · • »•f ····1 2 pH2, 5 happaman fosfataasigeenin eristäminen ia karakterisointi • •e : Sama lambda-kirjasto levitettiin uudestaan ja seulottiin pH2, 5 .·.1 happaman fosfataasin oligonukleotidillä PHY-31 olosuhteissa, * 1 - joita käytettiin edellä genomisissa hybridisaatioissa. Kaksitoista hybridisoivaa plakkia otettiin talteen karakterisoinnin jatkamiseksi. Kustakin ehdokkaasta eristetty bakteriofaagi-DNA pilkottiin restriktioendonukleaaseilla ja fragmentit tutkit- 1 tiin käyttäen koettimina joko PHY-31-oligo tai toinen oligo- *»1 V seos, PHY-34/35, joka oli peräisin itsenäisestä pH2,5 happa-* 1 »·,· masta f os f ataasipeptidistä (taulukko 5). Yksi klooneista, [···. AP99, sisälsi 2,1 kb: n Sphl-fragmentin, joka oli tunnistettu ψ 11 · edeltäkäsin genomin Southern-analyysillä, ja joka hybridi s oi- M· tui voimakkaasti kumpaankin oligonukleotidiin. Voimakas hybri- 2 e i · « e • e 54 1 1 7202 disoituminen kahteen oligonukleotidiin, jotka olivat peräisin kahdesta erillisestä peptidisekvenssistä, viittaa vahvasti siihen, että tämä klooni sisältää pH2,5 hapanta fosfataasia vastaavan sekvenssin. Tämä kappale subkloonattiin sekvenssin määrittämiseksi faageihin Ml3mpl8 ja Ml3mpl9. Tämän subkloonin nukleotidisekvenssissä todettiin 785 bp:n avoin lukukehys (ORF), jossa on mahdollinen 5' käynnistäjä-ATG (metioniini) , homeperäinen signaalisekvenssi sekä transloitu sekvenssi, joka on yhteensopiva N-terminaalisen peptidisekvenssin sekä muiden, edellä esimerkissä 1 {taulukko 4) määritettyjen sisäisten peptidisekvenssien kanssa. Avoimista lukukehyksistä (ORF) alavirtaan tunnistettiin lopetuskodonit kaikissa kolmessa lukukehyksessä nukleotidiin 1151 saakka, jonka jälkeen tunnistettiin ylimääräinen pH2,5 happaman fosfataasipeptidin sekvenssi. Nämä tulokset tekivät välttämättömäksi introni(e)n sisällyttämisen geenin 3'-päähän.

pH2,5 happaman fosfataasin cDNA-kloonien tunnistaminen

PolyA mRNA puhdistettiin {tavalla, joka on kuvattu jäljempänä kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät") ja sitä käytettiin polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvaan pH2,5 happaman fosfataasin cDNA:n kloonaamiseen. Lyhyesti, ensimmäisen juosteen synteesi .·♦·, suoritettiin oligonukleotidialukkeella AP273, joka oli kiinnitetty *·* · pH2,5 hapanta fosfataasia koodaavaan mRNA-alalajiin; AP273 5' - * 9 CTACCCCTCTGCATCTAG-3', SEQ ID NO:32. PCR:n oligonukleotidialukkeet *11* UPPHOS ja DOWNPHOS syntetisoitiin siten, että niitä reunusti • * /*· kulloinkin EcoRI-restriktiokohta; eli * · ft :·|β: UPPHOS 5 * -GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3 1 , SEQ ID NO: 30; ja, *·* * DOWNPHOS 5'-GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT-3', SEQ ID NO:31.

UPPHOS ja DOWNPHOS olivat vastakkaisen suuntaisia ja niitä erotti • · · toisistaan 978 emästä genomisissa klooneissa. cDNA-mRNA-kompleksin ** *...: PCR-monistus oligonukleotidialukkeiden UPPHOS ja DOWNPHOS avulla « tuotti noin 850 bp:n suuruisen spesifisen tuotteen. Tämä monistettu • * *« .***. tuote eristettiin agaroosigeeleistä ja se pilkottiin EcoRI:lla. Sitten * * * \ tämä fragmentti subkloonattiin EcoRI:lla pilkottuun pUC-18-vektoriin * * · *···’ kaksijuosteisen sekvenssin määrittämiseksi.

• * * • I» • ft 117202 PCR-monistetun cDNA: n, joka oli peräisin geenin 3"-osasta, sekvenssi määritettiin ja tällöin todettiin kolmen lyhyen introni n läsnäolo, joissa kussakin intronissa oli homeperäinen konsensusdonori, lasso- ja vastaanottajasekvenssi. Eksonin sekvenssi saatiin silmukoimalla nukleotidit 136-916, 971-1088, 1141-1245 sekä 1305-1740 (kuten kuviossa 11 on esitetty). Tuloksena oleva trans1oitu sekvenssi koodittaa 497 aminohapon proteiinia. Kuviossa 11 on esitetty koko sekvenssi translaati oi ne e n.

Johdetun pH2,5 happaman fosfataasipolypeptidin laskettu molekyylipa! no on noin 52700 daltonia. pH2, 5 happamane fosfataa-sille määritetty kodonien hyväksikäyttöanalyysi paljasti hyvin suuren eli 79, 3 % olevan G+C-esiintymistiheyden koodittavien kodonien hiljaisessa kolmannessa asemassa.

Tämä 2,1 kh: n Sphl-fragmentti sisälsi ainoastaan 135 bp pH2, 5 happaman fosfataasin ylävirran sekvenssiä. Koska tämän pituinen promoottorisekvenssi olisi saattanut olla riittämätön tehokkaaseen ilmentymiseen, niin suurempi fragmentti subkloo-nattiin lambda-kloonista. pAP-3 sisältää 5,1 kb: n Sall/Pstl- ... fragmentin lambda-kloonista AP99, ja tämä nukleotidi sekvenssi • » * on esitetty kuviossa 11.

• 9 « « * % * KUVIO 11. 2,1 kb: n Sphl-fragmentista peräisin oleva nukleotidi-sekvenssi, joka sisälsi pH2, 5 happaman fosfataasin geenin, : sekä tästä sekvenssistä johdetun aminohappotranslaation. Intro- niin kuuluvan luovuttaja-, lasso- ja vastaanottajasekvenssin, jotka on määritetty sekvensoimalla cDNA, yläpuolelle on vedetty viiva. Peptidiä #816 ja #1110 (taulukko 4) vastaava nukleotidi sekvenssi on alleviivattu. Genominen nukleotidisekvenssi . määritettiin M13-dideoksimenetelmällä (Sanger et ai., 1977), käyttämällä reagenssipakkausta United States Biochemical » « · '* ^ Sequenase II.

• · « « « * « * · ti» • * 9 * • · · * *

• M

• 9 « * 9 • * · · • • * 56 1 1 7 2 0 2

Materiaalit ja menetelmät

Entsyymit:

Restriktioentsyymit ostettiin yhtiöistä Bethesda Research Laboratories ja New England Biolabs (Beverly, MA, USA). T4 DNA-ligaasi, T4 DNA-polymeraasi, T4 kinaasi ja E. coli DNA- polymeraasi I:n Klenow-kappale ostettiin yhtiöstä BRL (Gaithersburg, MD, USA). Vasikan suoliston fosfataasi (CIP) hankittiin yhtiöstä Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA). Spheroplasteja tuottava entsyymi, Novozyme, ostettiin yhtiöstä Novo Biolabs (Bagsvaerd, Tanska). Kaikkia näitä entsyymejä käytettiin valmistajan suositusten mukaisesti. Entsyymimää-ritysten substraatit eli fytiinihappo ja para-nitrofenyyli-fosfaatti (PNPP) hankittiin yhtiöstä Sigma (St. Louis, MO, USA) ja BMB, vastaavasti.

Bakteeri- ja homekannat, plasmidit ja faagi: A. niqer var. awamori-kantaa ALK0243 (ATCC 38854) käytettiin fytaasigeenin ja pH2,5 happaman fosfataasin geenin eristämiseksi.

E. coli-kannat LE392 ia P2392 sekä faaqi Lambda Dash II, ioita «n *.* : käytettiin A. niger-geenipankin valmistamisessa, saatiin yhti- «»« *...· östä Stratagene (La Jolla, CA, USA). E. coli-kantaa JM109 ββ*Γ käytettiin isäntänä transformoitaessa plasmideista pUC18 ja pUCl9 peräisin olevilla konstrukteilla. Dideoksinukleotidisek- ** · : .v vensoinnissa käytetyt faagit M13mpl8 ja M13mpl9 saatiin yhtiös-* * * * :y; tä Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD, USA).

Phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaava vektori pLO-3, joka sisältää phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin (phleomysiiniä sitovan proteiinin geeni organismista Strepto- · alloteichus hindustanus) hiivan sytokromi Cl-terminaattoriin V kytkeytyneenä, saatiin plasmidista pUT713 ( CAYLä, Toulouse « 0

Cedex, Ranska). Homeessa sitä ilmennetään A. niqer: in 3-tubu-.*··. liinipromoottorin avulla.

• ψ *00 0 0 0 00 0 0 * 9 *0 0 09 0 *99 0 9 9 9 57 1 1 7202

Yleiset kasvualustat: E. coli JM109-kantaa kasvatettiin L-kasvuliemessä. Trans for-mantit valikoitiin L-maljoilla, joita oli täydennetty 1,5 %: 11a agaria, ja jotka sisälsivät 125 g/ml ampisilliinia. Sienten liuoskasvatuksessa käytetyn täydellisen alustan (CM) koostumus on: 50 ml 20x Clutterbuck: in suoloja (120 g NaNOs, 10,4 g KC1, 10,4 g MgSCU 7 HaO, 30,4 g KHaPCU), 2,0 ml

Vogeliin hivenaineita (0,3 M sitruunahappo, 0, 2 M ZnSO*, 25 mM Fe (NH<i) a (SO-4) 2 · 6HaO, 10 mM CuSCU, 3 mM MnSO*-HaO, S mM boori- happo, 2 mM NaaMoCU 2Ha0), 5,0 g tryptonia, 5,0 g hivauutetta, 10 g glukoosia yhdessä litrassa tislattua vettä. A. niger-kantoja ALK0243 ja ALKQ2268 kasvatettiin PD-agar vinopinnoilla [2,4 % Potato Dextrose Broth (Difco #0549); 1, 5 % Agar (Difco #0140)] 7-12 vuorokautta 28 *C: ssa.

Genomisen DNA: n eristäminen A. niqer var. awamori-kannasta AL-KQ243:

Yhdelle PD-agar vinopinnalle, jolla oli kasvatettu kanta ALK0243 5 vuorokautta 35 *C:ssa, lisättiin 5 ml NP-40 HaO: ta (0,005 % (til./til. ) Nonidet P40-detergenttiä]. Itiöt kaavit tiin vinopinnoilta ja ne hienonnettiin lasiputkissa käyttäen 3 mm: n lasihelmiä. 1x10® itiötä käytettiin siirrostamaan 500 ml * * * V * CM-aiustaa, joka oli laitettu 2 litran pulloon. Viljelmiä kasvatettiin 35 *C:ssa ravistellen nopeudella 200 kierr./min.

e 48 tunnin ajan. Rihmasto kerättiin mi ra-kankaalle, pakastet-: tiin nestemäisessä typessä ja lyofilisoitiin yön yli. Koko i pakastettu, kuivattu rihmasto (noin 2,0 grammaa) jauhettiin

Ml * •V* huhmareessa merihiekan avulla, nestemäisellä typellä jäähdyt-♦ täen. Jauhettu rihmasto siirrettiin 250 ml: n sentrifugipulloon ja suspendoitiin uudestaan 30 ml: aan 4 % SDS-TE-puskuria (10 mM Tris-emästä, 1 mM EDTA, 4 % SDS) ja annettiin hajota huo- . . neen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Solujäänteet poistettiin • * · sentrifugoimalla nopeudella 4000 x g 5 minuutin ajan ja super- i · * # natantti poistettiin 30 ml: n sentrifugiputkeen. Näytteet uutet-tiin kahdesti yhtä suurella tilavuudella Tri s -kyllästetyllä • · fenoli: kloroformi-seoksella (1:1), siirtäen kulloinkin vesi- * · faasi puhtaaseen putkeen. DNA saostettiin lisäämällä 10 % ♦ * * « 9Ψ # » I » Ψ · • · 117202 58 (til./til.) 5 M NfUOAc ja 2,5 tilavuutta EtOH ja inkuboimalla yön yli -80 *C: ssa. Preparaatti sulatettiin huoneen lämpötilassa "siirappimaiseksi" ja se sentrifugoitiin nopeudella 12000 x g 30 minuutin ajan 4 * C:ssa. Supernatantti poistettiin ja pelletti liuotettiin 19 ml: aan TE-puskuria (10 mM Tris-emästä, 1 mM EDTA) varovasti pipetoiden, ja tähän liuokseen lisättiin yhdistettä 19,0 g CsCl. Kaksi 11,5 ml: n ultrasentrifugiputkea täytettiin DNA: 11a TE+CsCl-liuoksessa, 0, 9 ml 10 mg/ml etidium-bromidia lisättiin ja tätä seosta sentrifugoitiin nopeudella 45000 kierr./min. (20 *C:ssa) 22 tuntia Sorvali T865. 1-rootto-rissa. Vyöhykkeenä oleva genominen DNA oli näkyvä UV-valossa ja se otettiin talteen 18 m-gauge suuruisella injektioneulalla. Etidium poistettiin uuttamalla NaCl: llä kyllästetyllä isopropanolilla. CsCl poistettiin TE-liuosta vastaan toteutetulla dialyysillä. DNA saostettiin etanolilla 0, 3 M NaOAc: ssa.

Perimän geenipankin valmistaminen: A. niger var. awamori-kannan ALK0243 genominen DNA pilkottiin entsyymillä Sau3A 10-23 kb:n pituisten fragmenttien tuottamiseksi. Pilkottu DNA ligoitiin ostettuun, BamHI: llä leikatun defosforyloidun Lambda Dash II-vektorin päihin (Stratagene). Ligaatiotuote pakattiin in vitro käyttäen yhtiön Stratagene v ' Gigapack Gold-pakkausuutteita. Pakatulla faagilla infektoitiin I »♦ ’···* E. coli-kanta P2392 plakkien saamiseksi.

♦ M 9

Geenipankin seulominen oligonukleotideillä: ; Plakit nostettiin Schleicher & Schuell NC (BA85) -nitrosellu-**· · loosakalvoille valmistajan suositusten mukaisesti. Kutakin proteiinia varten valmistettiin degeneroituneet oligonukleoti-dit fytaasista ja pH2,5 happamasta fosfataasista saatujen aminohapposekvenssien (esimerkki 1, edellä) avulla. Oligonuk-leotidiseos kutakin proteiinia varten oli peptidistä valitun » « < alueen kaikkien mahdollisten kodonikombinaatioiden kömpiement-ti. Oli go nukleotidit syntetisoitiin käyttäen yhtiön Pharmacia ♦ * laitetta Gene Assembler Plus, ja sekvenssit on esitetty edellä * * olevassa taulukossa 5.

ψ + ··· » * • ·» ♦ et *♦ i • « ♦ • * « * 117202 59

Lambda-DNA: n eristäminen:

Yksittäiset eristetyt hybridisoituvat plakit siirrettiin 500 ml: aan SM-liuosta (litrassa: 5, 8 g NaCl, 2,0 g MgS04, 50 ml IM

Tris-HCl, pH 7,5; 5 ml 2 % (p/til.) gelatiiniliuosta). 20 ml kloroformia lisättiin ja faagihiukkasia eluoitiin yön yli 4 *C:ssa. 220 ml: aan solulysaattia sekoitettiin 200 ml LE392-SO-luja, jotka oli kasvatettu Mg: n ja maltoosin läsnäollessa; sitten lisättiin 8 ml NZCYM-alustaa (10,0 g NZ-amiinia, 5,0 g NaCl, 5,0 g hiivauutetta, 2,0 g MgS04-7HaO, ja 1,0 g Casamino-happoja litrassa, pH säädetty arvoon 7,5); ja tätä viljelmää kasvatettiin ravistellen 37 1C:ssa niin kauan, että solut hajosivat (noin 6 tuntia). Sitten lisättiin 100 ml kloroformia ja inkubointia jatkettiin 15 minuutin ajan täydellisen hajoamisen takaamiseksi. Sitten näytettä sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 8000 x g ja supernatantti poistettiin puhtaaseen putkeen. RNAaasi A: ta ja DNAaasi I: tä lisättiin kulloinkin pitoisuudeksi 1 mg/ml; näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia 37 'C: ssa; ja sitten lisättiin yhtäsuuri tilavuus 20 % (p/til) PEG 8000-tuotetta, 2 M NaCl SM-liuoksessa faagin saostamisek-si. Näytteitä inkuboitiin vähintään yhden tunnin ajan jäissä. Saatu faagi pelletoitiin sentrifugoimalla nopeudella 10 000 x g 20 minuuttia 4 1C:ssa, supernatantti dekantoitiin; ja faagi-pelletti suspendoitiin uudestaan 0, 5 ml: aan SM-liuosta. DNA: ta •"V puhdistettiin edelleen lisäämällä yhdisteitä SDS, EDTA ja • e 9

Proteinaasi K: ta, mitä seurasi uuttaminen fenoli: kloroformi - e · ·« .···, seoksella ja saostaminen isopropanolin a. Tämän jälkeen tutkit- ·**’. tiin näiden lambda-DNA-inserttien kokoa 0, 8 % agaroosigeeleil-• · 1 | "V lä, DNA: n annettiin imeytyä nitroselluloosasuodattimelle ja * siihen hybridisoitiin radioaktiivisesti merkitty oligonukleoti-dikoetin PHY-1 tai PHY31. Subkloonaamista varten valittiin ne DNA-fragmentit, jotka hybridisortuivat koettimiin ja jotka olivat yhtäsuuria kuin genomista saadun DNA: n fragmentit.

* e c · * e ··· ;T Koko RNA: n eristäminen A. niger; istä ./.1 Kolmea A. niger var. awamori ALK0243-kannan 200 ml: n viljelmää f *..1t kasvatettiin RNA-kasvuliemessä [2 % maissitärkkelystä [Sigma], 1 % proteaasipeptonia (Difco), 30 g/1 glukoosia, 5 g/1 NH4N03, w0'5 g/1 MgS04 7HaO, 0,5 g/1 KC1, 0,183 g/1 FeS04-7H20] 48 M 1 • t · • 1 « 117202 60 tunnin ajan 30 * C: ssa, nopeudella 220 kierr./min sekoittaen.

Rihmasto suodatettiin Whatman suodatuspaperin no. 1 läpi ja huuhdottiin 10 ml: 11a DEPC-käsiteltyä HaO: ta (0, 1 % dietyy-lipyrokarbonaatti steriilissä tislatussa vedessä), sitten sitä lyofilisoitiin yön yli -80 * C: ssa. 1, 5 g (yhteensä 3 g) kuivattua rihmastoa murskattiin nestemäisessä typessä hienoksi jauheeksi, joka siirrettiin sitten sentrifugiputkeen, joka sisälsi 10 ml hajotuspuskuria (Breaking Buffer) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8, 5 % SDS) ja 10 ml fenol i / kl oroformi/i s oamyyli ai koholla (P/CIA: 50:48:2).

Seoksen annettiin sulaa 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten sitä sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 10 000 kierr./min. 4 * C: ssa. Vesikerros poistettiin käyttäen leveä- suista pipettiä puhtaaseen sentrifugiputkeen ja se uutettiin uudestaan p/CIA-seoksella, kunnes rajapinta saatiin kirkkaaksi. Lopulliseen vesikerrokseen lisättiin yhtäsuuri tilavuus 6M LiCl-liuosta RNA: n saostamiseksi ja seoksen annettiin olla kylmässä, -80 *C:ssa yön yli. Sitten seosta sentrifugoitiin 20 minuuttia nopeudella 10 000 x g, 4 *C:ssa ja pelletti suspen-doitiin uudestaan 2, 4 ml: aan GTC-liuosta (4M guanidiini-tio-syanaattia, 25 mM natriumsitraattia, pH 7, 5 % N-lauryylisar- kosiinia, 100 mM b-merkaptoetanolia). Yhtäsuuri tilavuus isop- · ropanolia lisättiin, sakkaa jäähdytettiin hiilihappojäässä 40 ϊ”.· minuuttia ja sitten se sentrifugoitiin 4 * C: ssa 30 minuutin •l· ajan. Pelletti huuhdottiin 80 % EtOH: 11a, lingottiin uudes- taan, kuivattiin tyhjössä ja suspendoitiin lopuksi uudestaan 1 *** : .·. ml: aan DEPC-HaO-liuosta. RNA: n pitoisuus määritettiin spektro-fotometrisesti aallonpituudella 260 nm.

t « ' m RNA: n eristäminen:

Polyadenyloitu lähetti-RNA (polyA mRNA) puhdistettiin affiniteettiin perustuen koko RNA: sta käyttäen oligo(dT)-selluloosani pylväitä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Pharmacia Pine Che- V mi cal s, Piscatawy, N. J. ). Lyhyesti, 1,25 mg koko' RNA: ta lai- • · ;\v tettiin kahteen erilliseen pylvääseen, jotka oli tätä ennen /··. sentrifugoitu ja tasapainotettu hyvin suolapitoisella pusku-rilla (High-salt buffer, Pharmacia). Sen jälkeen, kun pylväät oli pesty kolmeen kertaan niukasti suolaa sisältävällä pusku- · * : · : 9 * 117202 61 rilla {Low-salt buffer, Pharmacia), mRNA eluoitiin pylväästä 65 °C:ssa edeltäkäsin lämmitetyllä eluointipuskurilla (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, joka sisältää 1 mM EDTA); ja saostettiin lisäämällä 0,1 tilavuus 10 mg/ml glykogeenia ja 2,5 tilavuutta etanolia. Seos jäähdytettiin -80 °C:hen kahdeksi tunniksi, ja sitten sitä sentrifugoitiin 4 °C:ssa 30 minuuttia. Talteen saatu mRNA liuotettiin eluointipuskuriin 1,3 mg/ml olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi.

pH2,5 hapanta fosfataasia vastaavan CDNA:n PCR-eristäminen:

Ensimmäisen juosteen synteesi toteutettiin käyttäen yhtiön BMB cDNA-reagenssipakkausta valmistajan suositusten mukaisesti, käyttäen 1,0 mg mRNA:ta sekä oligonukleotidialuketta AP273, joka oli syntetisoitu pH2,5 fosfataasin 3'-nukleotidisekvenssin komplementiksi, eli AP273 on 5'-CTACCCCTCTGCATCTAG-3', SEQ ID NO:32. PCR:n oligonukleotidialukkeet UPPHOS ja DOWNPHOS syntetisoitiiin siten, että niitä reunusti kulloinkin EcoRl-restriktiokahta, eli: UPPHOS 5' - GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG - 3', SEQ ID NO:30; ja DOWNPHOS 5' - GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT - 3', SEQ ID NO:31, kuten edellä on kuvattu.

Fytaasia ja pH2,5 hapanta fosfataasia vastaavien kloonien subkloonaus ... ja sekvensointi: • · · ... Lambdan genomisten kloonien hybridisoituvat restriktiofragmentit • i • # geelipuhdistettiin käyttäen reagenssipakkausta "Glassmilk Purification •••| Kit", joka on saatavana kaupallisesti yhtiöstä GeneClean (Bio 101, La • * *···* Jolla, CA) . Nämä restriktiofragmentit subkloonattiin Ml3mp-18- ja • · · ί·2 5 M13mp-19-faagivektoreihin, jotka oli leikattu sopivilla entsyymeillä.

♦ #·# V: Fytaasille ja pH2,5 happamalle fosfataasille tarkoitettujen oligonukleotidikoettimien kanssa positiivisesti reagoivien kloonien *·:.· nukleotidisekvenssi määritettiin M13-dideoksinukleotidisekvenssin määritysmenetelmällä (Sanger et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467, 1977) käyttäen United States Biochemical Sequenase II- .·*·. reagenssipakkausta. cDNA:n sekvenssi määritettiin mahdollisia * * ·* introneja sisältävillä alueilla alkaliseen denaturointiin perustuvalla • * a kaksoissäiesekvensoinnilla. Fytaasigeeni sisältyi täy- ♦ · • · t • »» • i 117202 62 dellisesti 2,6 kb:n Sphl-fragmenttiin, joka subkloonattiin plasmidiin pUC-18 siten, että saatiin pFF-1. Täydellinen pH2,5 happaman fosfataasin geeni eristettiin 2,1 kb:n Sphl-fragmenttina, joka subkloonattiin plasmidiin pUC-18 siten, että saatiin pAP-1.

pSELFX on fytaasia vastaavan nukleotidisekvenssin sisältävä plasmidi, jossa Xbal-kohta on istutettu geenisekvenssiin muokkaamalla asemassa -26 ja -24 sijaitsevia nukleotidejä ATG-aloituskodonin suhteen. Nukleotidimuutokset saatiin aikaan 2,6 kb:n suuruisen, fytaasigeenin sisältävän Sphl-fragmentin kohdennetulla mutageneesillä käyttäen Promega Altered Sites Mutagenesis-reagenssipakkausta. Mutageneesin ohjaamiseen käytetty oligonukleotidi on esitetty seuraavassa:

Oligo PHY-40: 51-AGAAGAAATTTCTAGAACAGCAGCGATTGG-3' SEQ ID NO:33 {Xbal) pAP-lXba on pH2,5 hapanta fosfataasia vastaavan nukleotidisekvenssin sisältävä plasmidi, jossa Xbal-kohta on istutettu geenisekvenssiin muokkaamalla asemassa -24 ja -27 sijaitsevia nukleotidejä ATG-aloituskodonin suhteen. Nukleotidimuutokset on saatu aikaan PCR-mutageneesillä. PCR-mutageneesissä käytetyt alukkeet on esitetty seuraavassa: ... Oligo #271 5'-CGAGAGCACCTTCTCTAGATTTTGTCAAATGTACC-31 SEQ ID NO:34 • * * - (Xbal) • ♦ • « **: 3 a ·“[ Oligo #272 5'-ACCCTCACCGAACTTGCGGGCCG-3' SEQ ID NO:35.

* # *···' pAP-1 DNA:ta käytettiin templaattina PCR-monistuksessa. Tuloksena * ·*· ί.Ι ί saatu monistettu fragmentti pilkottiin entsyymeillä Xbal ja NruI ja • * * * V : fragmentti ligoitiin sitten Xbal/NruI-leikattuun plasmidiin pAP-1 plasmidin pAP-lXba aikaansaamiseksi. Plasmidin sekvenssi määritettiin, ·.*.· jotta voitaisiin varmistua siitä, ettei mutaatioita oltu aiheutettu • * · alueeseen, joka oli PCR-monistettu. pAP-2 muodostettiin ligoimalla Klenow-reagenssilla käsitelty BamHI/Hindlll-fragmentti plasmidista # *111' pAP-lXBA Smal:llä leikattuun plasmidiin pUC-18. Oikealla tavalla • * V suuntautuneen pAP-2:n sisältävät transformantit tunnistettiin » • » » analysoimalla restriktoendonukleaasifragmenttien koko.

4 a * « · • *· • 4 117202 63 pH2, 5 happaman fosfataasin koko rakennegeeni poistettiin plas-midista pAP-2 2,0 kb: n Xbal-fragmenttina transformaatiovekto-reiden muodostamiseksi pH2, 5 hapanta fosfataasia varten, jotka vektorit yli-ilmensivät kyseistä entsyymiä (alla oleva esimerkki 4). Myös pH2, 5 happaman fosfataasin täydellinen geeni eristettiin 5,0 kb: n Pstl/Sall-fragmenttina, joka subkloonat-tiin plasmidiin pUC-18, jolloin saatiin plasmidi pAP-3. Plas-midia pAP-3 käytettiin pH 2, 5 hapanta fosfataasia vastaavien ja tätä entsyymiä yli-ilmentävien transformaatiovektoreiden valmistamiseksi (alla oleva esimerkki 4).

Northern-blot-menetelmä: 10 ja 20 mg: n suuruiset määrät koko RNA: ta (eristetty edellä kuvatulla tavalla) laitettiin 1, 5 % agaroosi-formaldehydi- geelin kuoppiin ja erotettiin elektroforeettisesti. Geeliin lisättiin myös koon vertaamiseksi RNA: n molekyylipa!non mer-kitsimiä [0,24 - 9,5 kb " RNA-tikapuut" ("RNA Ladder", Bethesda Research Labs]. Geelistä siirrettiin täplät nitroselluloosalle (Schleicher ja Schuell; Keene, NH), sitä lämpökäsiteltiin yhden tunnin ajan 80 *C: ssa tyhjiöuunissa, se esihybridisoi-tiin 50 % formamidissa, joka sisälsi 5 x SSC, 0, 1 % SDS, 5x * e -

Denhardt ja 100 mg/ml vasikan kateenkorvan DNA, 37 * C: ssa 24 * tunnin ajan, ja hybridi s oi ti in sitten tässä samassa liuoksessa ·>.ΐ radioaktiivisesta leimattuun koettimeen 42 *C:ssa 24 tunnin m ·...' ajan. Suodatinta pestiin kahdesti 2x SSC/0, 1 % SDS-liuoksella * * • .S : huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan, sitten kertaalleen 0, lx :V: SSC/0,1 % SDS-liuoksella ja siitä tehtiin autoradiogrammi

Kodak S-Omat AR-filmille, voimistavia varjostimia käyttäen.

Esimerkki 3 . * Homologia muiden fosfataasien kanssa • e « e i · 9 IM « e . PH2/ 5 happaman fosfataasin ja fytaasin aminohapp'osekvenssejä ** · i ^ sekä muita julkaistuja happaman fosfataasin sekvenssejä ver-rattiin toisiinsa. Homologia (vastaavuuden pistemäärä on ,.t.# 17. 705) määritettiin käyttäen PC/GENE-matriisiohjelmaa 9 PCOMPARE (joka perustuu Neddleman: in ja Wunsch: in menetelmään, f i ' 9 9 9 · 117202 64 1970}. Merkittävää homologiaa todettiin pH2,5 happaman fosfataasin ja muiden happamien fosfataasientsyymien eli "PHO-3" (Bajwa et ai., 1984) ja "PHO-5" (Arima et ai., 1983) välillä, jotka kummatkin on eristetty aikaisemmin Saccharomyces cerevisiae-hiivasta. Suurimman homologian aluetta, R H 6 X R X P (aminohappoasemat 81-87) käytettiin etsimiseen 1991 muodostetusta EMBL CDPROT17-proteiinitiedostosta. Tämä RHGXRXP-sekvenssi löydettiin useista muista happamista fosfataaseista (kuten alla olevasta taulukosta 6 nähdään).

Taulukko 6

Fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin homologia muiden happamien fosfataasien kanssa3

Organismi Geenin nimib Aminohapposekvenssi SEQ ID NO: A. nieer Fvtaasi A Q VL SR, H G K 36 A. niger pH2.5 AP Ϊ..Μ. VmK R„H„S. E RY PJS 37 E. colt APPA VVIVSRHGVRAPTKATQL 38

Hiiva PHO-1 VHTLQRHGSRNPTGGNAA 39

Hiiva PHO-5 LQMVGRHGERYPTVSLAK 40

Hiiva PHO-3 LQMLARHGERYPTY SKGA 41

Rotta LAP VTLLYRHGDRSPVKAYPK 42

Rotta PAP VTLVFRHGDRGPIETFPN 43

Ihminen ACP2 VTLLYRHGDRSPVKTYPK 44

Ihminen ACPP_VTLVFRHGDRSPI DTFPT_45 ·· · * 3 Homologia muiden happamien fosfataasien kanssa, joka homologia • * löydettiin etsimällä kohdesekvenssiä RHGXRXP avulla, käyttäen yhtiön » ..ΙΓ IntelliGeneties PC/GENE-ohjelmaa QGSEARCH EMBL CDPROT17-

• M

*·..· proteiinitiedostosta, tavanomaisten hakuparametrien avulla. LIHAVOIDUT

• * ·.· ! jäännökset ovat samanlaisia; iV: b APPA « pH2, 5 hapan fosfataasi E._coli: sta (Touati ja Danchin, 1987); PHO-1 - hapan fosfataasi Scizosaccharomyces pombe-hiivasta • ·"· (Elliot et ai., 1986); PHO-5 = repressoituva hapan ;***. fosfataasi Saccharomyces cerevisiae-hiivasta (Arima et ai., **· *. 1983); PHO-3 = repressoitumaton hapan fosfataasi S. cerevisiae- »Il - *” hiivasta (Bajwa et ai., 1984); LAP « rotan lysosomaalinen * · ···* hapan fosfataasi (Himeno et ai., 1989); PAP = rotan eturauha sen hapan fosfataasi (Roiko et ai., 1990); ACP2 = ihmisen :\j lysosomaalinen hapan fosfataasi (Pohlmann et ai., 1988); ACPP ihmisen eturauhasen hapan fosfataasi (Tailor et ai., 1990).

117202 65 RHGXRXP-alue on säilynyt niinkin erilaisissa organismeissa kuin E. coli-bakteerissa ja ihmisissä. Tämä säilyminen viittaa toiminnalliseen merkitykseen ja näin ollen kysymyksessä voi olla näiden fosfataasien aktiivinen alue.

Esimerkki 4

Rekombinanttifytaasin ja rekombinantti pH2, 5 happaman fosfataa-sin yli-ilmentäminen Aspergillus niger-homeessa [Yleiset materiaalit ja menetelmät on kuvattu tämän esimerkin lopussa olevassa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät". 1

Fytaasin ekspressiovektoreiden valmistaminen:

Lukuisia vektoreita valmistettiin fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin siirtämiseksi uudestaan käyttäen sekä natiivisia että vaihtoehtoisia homepromoottoreita. Eräässä fytaasigeeniä sisältävässä vektoriryhmässä pFF-l-pFF-4 (kuvio 10) vektorit eivät sisältäneet lainkaan homeperäistä selektiomerkkiä ja ne siirrettiin kotransformaatiolla yhdessä plasmidin pL03 kanssa (katso "Materiaalit ja menetelmät”, jäljempänä).

Vektoreilla pFFl-2 saadut rekombinanttikannat sisälsivät vie- • » * *·* * raita DNA-sekvenssejä, jotka olivat peräisin E. coli: n selek- • s» tiomerkistä. Tästä syystä valmistettiin toinen vektori ryhmä, « ,/A josta käytettiin lyhenteitä pFF6-pFFll, näiden sekvenssien poistamiseksi. Viimeksimainitut vektorit sisälsivät homeperäi- : sen selektiomerkin sekä restriktiokohdat, joiden avulla voi- ··« · ;V: tiin eristää E. coli-sekvenssejä sisältämättömät lineaariset fragmentit (kuvio 12).

KUVIO 12. Fytaasin lineaariset transformaatiovektorit. (A) , . pFF-6A: fytaasi natiivin promoottorinsa säätelyn alaisuudessa.

• * * pFF-l:stä saatu 2,6 kb: n kokoinen Sphl-fragmentti kloonattiin * · ‘ pL03: n Sphl-kohtaan, jolloin saatiin pFF-6, joka ^ eristettiin :**v lineaarisena 4,9 kb: n kokoisena Hindlll-fragmenttina. (B) m m pFF-8: fytaasi GAPDH-promoottorin säätelyn alaisuudessa.

4 Λ «

Phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaava kasetti pL03: sta ]·*·’ eristettiin Hindlll (täytetty)/PstI-fragmenttina ja se subkloo- «44 • · 117202 66 nättiin Bglll(täytetty)/Pst-leikattuun plasmidiin pPRE-81, jolloin saatiin pPRE-82. Fytaasin sisältävä SELFX Xbal-fragmentti lisättiin plasmidiin pPRE-82, joka oli pilkottu osittain entsyymillä Xbal, jolloin saatiin pFF-8, joka eristettiin 6,7 kb: n Pstl-fragmenttina (C). pFF-9: fytaasi GA-promoottorin säätelyn alaisuudessa. pL03: sta peräisin oleva phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaava kasetti eristettiin Kpnl(täytetty)/-Hindlll-fragmenttina ja ligoitiin plasmidiin pFF-4, joka oli osittain leikattu entsyymillä Kpnl, päät tehty tylpiksi ja leikattu sitten entsyymillä Hindlll. pFF-9 eristettiin lineaarisena 7, 3 kb: n HindiII/Kpnl-fragmenttina. (D) pFF-11: fytaasi GA-promoottorin ja signaalisekvenssin säätelyn alaisuudessa. Oligot #260 ja #261 (katso "Materiaalit ja menetelmät", jäljempänä), kiinnitettiin ja ligoitiin Xbal/XhoI-pilkottuun plasmidiin pFF-1, GA-promoottori lisättiin Kpnl/Xbal-fragmenttina ja kasetti, joka sisälsi phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan merkin (Phleo*) lisättiin HindiII-fragmenttina, jolloin saatiin pFF-11. Lineaarinen DNA eristettiin 7,35 kb: n Kpnl - fragmenttina.

Fytaasia sisältävä tai ilman sitä oleva pH2, 5 happaman fosfa-taasin ekspressiovektoreiden valmistaminen pH2, 5 happaman fosfataasin transformaatio vektorit olivat line-"l aarisia vektoreita, joista käytettiin lyhenteitä pPH01-pPH04, "" ja jotka valmistettiin pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaavan 9 9 *'·* geenin siirtämiseksi (kuvio 13). Samoin valmistettiin kaksi ψ · * i vektoria eli pFIN-lA ja pFIN-lB, jotka sisälsivät sekä fytaa-' sigeenin että pH2, 5 happaman fosfataasin geenin, jotka geenit i1mentyi vät glykoamylaas ipromoottorin aiai suudes s a s amas s a plas mi di s s a (kuvi o 14).

ί KUVIO 13. Vektorit, joista voidaan eristää lineaariset fragmen-* « « ,*;v tit pH2, 5 happaman fosfataasin uudestaansiirtämiseksi. (A) • « >β*β· pPHO-1: pH2, 5 hapan fosfataasi natiivin promoottorinsa sää- • telyn alaisuudessa. Phleo^-kasetti eristettiin Hindlll-frag-menttina, päät tehtiin tylpiksi ja se ligoitiin plasmidiin * * .·**; pAP-3 [pH2, 5 happaman fosfataasin geeni 5,0 kb: n Pstl/Sall-** * fragmentissa, plasmidissa pUC-18 (5)], joka oli leikattu ent- • · • * 117202 67 syymillä EcoRI ja jonka päät oli myös tehty tylpiksi. Lineaarinen DNA eristettiin 6,3 kb: n Pstl-fragmenttina. (B) pPHO-2: pH2, 5 hapan fosfataasi b-tubuliinipromoottorin säätelyn alaisuudessa. pH2, 5 happaman fosfataasin geeni, joka sisältyi plas-midista pAP-lXba peräisin olevaan 2,0 kb: n Xbal-fragmenttiin ("Materiaalit ja menetelmät", jäljempänä), subkloonattiin plas-midiin pTL-113, joka leikattiin sitten osittain entsyymillä Sphl, täytettiin ja ligoitiin sellaiseen fragmenttiin kasetissa, joka sisälsi phleomysiinin vastustuskyvyn tuottavan merkin, jolloin saatiin pPHO-2. (C) pPHO-3: pH2, 5 hapan fosfataasi GAPDH-promoottorin säätelyn alaisuudessa. pPHO-2 pilkottiin osittain entsyymillä Xbal, jolloin saatiin 4, 3 kb: n Xbal-fragmentti, joka sisälsi pH2,5 happaman fosfataasin sekä phleo^-kasetin, ja joka ligoitiin sitten plasmidin pPRE-81 Xbal-kohtaan. (D) pPHO-4A: pH2, 5 hapan fosfataasi GA-promootto-rin säätelyn alaisuudessa. pAP-lXba: sta saatu 2,0 kb: n Xba-fragmentti subkloonattiin plasmidiin pGA ja GA-promoottorin ja pH2, 5 happaman fosfataasin sisältävä 5,5 kb: n Kpnl-fragmentti eristettiin ja täytettiin ja ligoitiin sitten plasmidiin pL03.

KUVIO 14. Kahden entsyymin transformaatiovektori valmistettiin :T: sekä fytaasin että pH2, 5 happaman fosfataasin yli-ilmentäisi- seksi yhden ainoan plasmidin avulla. (A) pFIN-lA ia (B) pFIN- M· * _1B: sekä fytaasin että pH2, 5 happaman fosfataasin sisältävät .*··. yhdistelmäplasmidit GA-promoottorin erillisten kopioiden sää-telyn alaisuudessa. pPHO-4A: sta eristettiin 8,1 kb: n Hindlll- * * · ’IV fragmentti ja se ligoitiin entsyymillä HindiXI-pilkottuun • * * * plasmidiin pFF-4.

Transformaatiovektorikonstruktit: yleinen tarkastelu:

Kuten edellä kuvioiden 12-15 yhteydessä esitetyn tarkastelun * * •J : perusteella todetaan, useita erilaisia homeperäisiä promootto- 5e! ' rekonstruktioita arvioitiin, ja nämä konstruktit olivat 8-tubu- j«X liinipromoottori, glyseraldehydi-3-fosfaatti-deHydrogenaasi- • VI promoottori (GAPDH) sekä glukoamylaasipromoottori (GA). Kaksi V* viimeksimainittua homeperäistä promoottoria eristettiin A;_ V.· niger-kannasta ATCC1015 (Tailor, P. et ai. , 1990). Vastaavat * • · ♦ e t • * 117202 68 promoottorit testattiin, jotta saataisiin määritetyksi niiden kyky ohjata fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin ilmentymistä.

Fytaasigeenin -26-asemaan valmistettiin kohdennetulla mutage-neesillä Xbal-restriktiokohta helpottamaan valinnaisten pro-moottoreiden sisällyttämistä näihin konstrukteihin. Samoin Xbal-kohta muodostettiin pH2,5 happaman fosfataasigeenin -28-asemaan PCR-mutageneesillä (katso "Materiaalit ja menetelmät", jäljempänä). Näitä räätälöityjä Xbal-kohtia käytettiin myöhemmin mahdollistamaan vaihtoehtoisten homeperäisten promoottorei-den sulauttamisen, joita promoottoreita oli muokattu tätä ennen siten, että ne oli saatu sisältämään tällaiset Xbal-kohdat 5' geenin säätelyalueiden suhteen.

Seuraavassa on esitetty ensin ne tulokset, jotka saatiin fy-taasivektorikonstrukteilla transformoiduilla soluilla, ja sitten ne tulokset, jotka on saatu pH2,5 happamalla fosfataa-silla.

A. niger-kantojen ALK0243 ia ALK02268 transformointi: A. niger var. awamori- kantaa ALK0243 sekä A. niqer var. awamo-.···. ri-kantaa ALK022 68, joka on ALK0243-kannasta UV-mutageneesin *!!. avulla saatu, enemmän fytaasia tuottava kanta, käytettiin isäntinä rekombinanttifytaasia ja rekombinantti pH2, 5 hapanta • « fosfataasia varten. A. niqer-kannat ALK0243 ja ALK02268 trans- e · formoitiin Tilburn: in et ai, (1983) esittämän menetelmän muun- > * “·' * noksella, käyttäen phleomysiinin vastustuskykyä lääkeaineselek-tion geneettisenä merkkinä. Koska kloonattu fytaasigeeni ja kloonattu pH2,5 happaman fosfataasin geenit säilyivät plasmi-deissa ilman selektiomerkkiä, niin sferoplastit transformoi- • tiin samanaikaisesti phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan vektorin, pLO-3 kanssa, joka vektori sisältää organismista Streptoal 1 oteichus hindustanus peräisin olevan, phleomysiiniä « · sitovan proteiinin geenin kytkettynä hiivan sytokromi Cl-ter- "·«' minaattoriin. pLO-3 saatiin plasmidista pUT713 [CAYLA,

Toulouse Cedex, Ranska], sen ilmentyessä homeessa A. nicrer: n «»· -- ;V. 0-tubuliinipromoottorin avulla. Trans formantit valikoitiin • e 117202 69 käyttäen yhtä suurta tilavuutta päällyskerrosta, joka sisälsi 50 μ9/ιη1 phleomysiiniä kannan ALK0243 tapauksessa, ja 195-200 μ9/π\1 kannan ALK02268 tapauksessa. (Sekä ALK0243- että ALK02268-kannat olivat herkkiä sferoplastien lyysille ja ne edellyttivät erilaisten osmoottisten puskuroivien olosuhteiden käyttämistä; katso "Materiaalit j a menetelmät, j älj empänä). Saatiin 30-45 itiöitä muodostavaa pesäkettä μg: aa DNA: ta kohden selektiomaljoilla. Kaikki phleomysiiniresistentit pesäkkeet sisälsivät phleomysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan merkin (Southern-analyysi; tuloksia ei ole esitetty).

Transformanttien seulonta fytaasin yli-ilmentämisen suhteen: Transformantit, jotka tuottivat suuremman fytaasiaktiivisuuden kuin A. niger-lähtökanta ALK0243, tunnistettiin fytaasimaljalla toteutetulla maljaseulontamaärityksellä, jossa mitataan ko-lorimetrisesti epäorgaanisen fosfaatin kerääntyminen fosfomolybdaattikompleksin pelkistymisenä ("Materiaalit ja menetelmät", jäljempänä). Tämän jälkeen niiden transformanttien, joilla todettiin suuri aktiivisuus tässä maljamäärityk-sessä, kyky tuottaa fytaasia testattiin määrittämällä fermen-tointiviljelmän kasvuliemeen vapautunut entsyymiaktiivisuus (kuten alla on kuvattu).

* • KUVIO 15 esittää maljamääritystä suurentuneen fytaasiaktiivi-*111 s uuden osoittamiseksi. A. niqer-fytaasi trans formant ei s ta GAD- • 9 10 - GAD-120 saatuja suvuttomia itiöitä (conidia) laitettiin • * · s maljamääritysalustalle, inkuboitiin kaksi vuorokautta 30 * * » I V C: ssa ja sitten ne peitettiin Reagent C-reagenssilla värin il maisemiseksi ("Materiaalit ja menetelmät", seuraavassa). Positiivisilla transformanteilla GAD 130(a4), GAD 112(e3) ja GAD 118 saatiin vastaavasti tiitterit 108000 PU/ml, 35600 PU/ml ja • ·*· 36700 PU/ml ravistelupullovil jelyssä, (eli nämä tiitterit ·*;· olivat jopa noin 126 kertaa suurempia kuin ALK0243-kannan * tapauksessa). Transformoimattoman ALK02268 (b5) -kannan tapauk- e · - • · sessa fytaasiaktiivisuus oli 4000 PU/ml.

*** s e • «e • · «*· ··· 41 · • · · e * • * 70 117202

Fytaasia ylituottavien transformanttien analyysi: Transformanttien tuottama fytaasimäärä analysoitiin kasvattamalla soluja ravistelupulloviljelmissa ja määrittämällä ent-syymimäärä kasvatusliemestä seuraavalla tavalla: lyhyesti, viljelmät siirrettiin ravistelupulloihin optimiolosuhteissa ("Materiaalit ja menetelmät", jäljempänä) ja niitä inkuboitiin 5 vuorokautta, minkä jälkeen solut poistettiin sentrifugoimal-la ja kasvuliemen supernatantista määritettiin fytaasiaktiivisuuden suuruus* [Sekä edellä kuvattu maljamääritys että kasvu-liuoksen tiitterimääritys mittasivat sitä epäorgaanisen fosfaatin määrää, joka vapautui substraattina toimineen natriumfytaa-tin entsymaattisessa hydrolyysissä, ja joka mitattiin kolori-metrisesti kvantitoimalla fosfomolybdaattikompleksin pelkistyminen. ]

Natiivia fytaasipromoottoria (plasmidista pFF-1, katso esimerkki 2, "Materiaalit ja menetelmät", edellä) käytettäessä 58 syntyneestä transformantista neljässä fytaasin tuotanto oli kasvanut siten, että se oli 6,5-7,0 kertaa suurempi kuin trans-formoimattoman ylituottavan kannan ALK02268 ("transformoima ton" alla olevassa taulukossa 7) tuottama määrä tai vertailuna ;*:*· käytettyjen, vertailuplasmidilla pLO-3, joka ei sisältänyt ·*··; lainkaan fytaasisekvenssejä, transformoitujen ALK02268-solujen e·· tuottama määrä.

« • «I* ««e •

Taulukko 7 : Fytaasin yli-ilmentyminen tuotantokannan ALK02268· trans f or- ,V mänteissä 9 > » 9

Akti i vi- Suure-

Kanta_P1 as mi di Promoottori s uus*»_neminen*8 ALKO2268 transfor- — natiivi 4,000 : : · moimaton GAD17 pFF-1 natiivi 26,000 6,5 V GAD33 pFF-1 natiivi 17, 500 4,4 ,.V GAD40 pFF-1 natiivi 10, 500 2/6 G AD 4 8 pFF-1 natiivi 28,000 7,0 • 91 • » Rekombinantti ALK02268 yli tuotti kumpaakin fytaasia ravi s te-,···. lupullovil j el minä: eli ferment oi mal la soijajauhoa sisältävässä *···' kasvualustassa, ravistellen 5 vuorokautta 28 *C:ssa. Solujen ja alustan komponentit poistettiin sentrifugoimalla. Entsyymi- * 71 1 1 7202

aktiivisuus määritettiin lisäämällä kasvuliemestä saadun super-natantin laimennoksia 1 % natriumfytaattiin (Sigma), O,2 M

sitraattipuskurissa, pH 5,0. Sen jälkeen, kun reaktioseosta oli seisotettu 15 minuuttia 37 1C: ssa, kunkin reaktio pysäytettiin lisäämällä 15 % TCA: ta [trikloorietikkahappoa (Merck)).

Vapautunut ortofosfaatti mitattiin lisäämällä yhtäsuuri tilavuus reagenssia C [suhteessa 3: 1: 1 IM rikkihappoa (Mallinckrodt), 2, 5 % ammoniummolybdaattia (Sigma), 10 % askor-biinihappoa (Sigma)) tämän hydrolyysireaktion 1: 10-laimennok-seen ja inkuboimalla 50 1C:ssa 20 minuuttia. Reaktioseoksen absorbanssi mitattiin pelkkää reagenssia ja tunnettuja fosfaat-tistandardeja vastaan (9,0 mM KHaPO1: n 1:100 - 1:400 laimennokset) aallonpituudella 820 nm;

Aktiivisuus on ilmoitettu fytaasiyksikköinä millilitrassa (eli PU/ml); ° Suureneminen esittää, kuinka moninkertaisesti aktiivisuus (siis yksikössä PU/ml) on kasvanut ALK02268: 11a saavutettuun aktiivisuuteen (PU/ml) verrattuna (siis transformantin aktiivisuus /ALK02268: n aktiivisuus).

Muissa tutkimuksissa käytettiin fytaasin ilmentymistä ohjaavia heterologisia promoottoreita. 1467 fytaasitransformanttia tutkittiin käyttäen maljamääritystä (157 oli peräisin kannasta ALK0243 ja 1310 oli peräisin kannasta ALK02268). Näistä trans-formanteista 302 tunnistettiin maljamäärityksessä fytaasin mahdollisiksi ylituottajiksi. Näistä fytaasia ylituottavista transformanteista 25: n (eli 1, 7 % tutkitusta 1467: sta) entsyy-·1Γ; miaktiivisuus PU/ml oli enemmän kuin 700 kertaa suurempi kuin ALK0243-kannalla saavutettu aktiivisuus. (Taulukossa 8 on 999 esitetty tulokset, jotka on saatu 18:11a näistä 25 transfor-mäntistä). Transformantti, joka tuotti kaikkein eniten fytaa-siä (eli GAI-6; 181000 PU; noin 2100 kertaa suurempi PU/ml "V kuin kannalla ALK0243), oli saatu transformoimalla pFF-9-kons- • 9 1 v ’ truktilla, joka sisälsi homeperäisen glykoamylaasi (GA) -pro moottorin. Tämän viimeksimainitun transformantin tapauksessa fytaasituotanto oli merkittävästi suurempi kantaan ALK02268 (ylituottaja) tai kantaan ALK0243 (villityypin kanta) verrattuja ' na (katso alla oleva taulukko 8).

9 99 9 9 9 9 9 * 1 1 «99 9 9 9 9 9 9 V 9 9 9 • 99 9 · • ·· 9 9 99· 9 · 9 9 1 • 1 < 9 117202 72

Taulukko 8 A. niger-fytaasitransformantlt, jotka tuottivat fytaasientsyymiä yli 700 kertaa enemmän kuin ALK0243 ravistelupulloviljeliitissä*

Trans- for- Promoot- Aktiivi- Suure- mäntti Kanta P1 as mi di tori_s uus*_neminen0 GAI-6 A.2268 pFF-4 GA 181,000 2129 GAL* 142 A.2268 pFF~3 GAPDH 174,000 2047 GAN-1 A.2268 pFF-8 GAPDH 170,000 2000 GAG-12 ALK0243 pFF-3 GAPDH 166,000 1953 GAO-248 A.2268 pFF-9 GA 164,000 1929 GAI-12 A.2268 pFF-4 GA 145,000 1706 GAK4-46 A.2268 pFF-4 GA 132,000 1553 GAI-2 A.2268 pFF-4 GA 131,000 1541 GAK4-52 A.2268 pFF-4 GA 131,000 1541 GAM-111 A.2268 pFF-6A NAT11VI 129,000 1518 GAK4-47 A.2268 pFF-4 GA 121,000 1424 GAM-225 A.2268 pFF-9 GA 112,000 1318 GAD-103 A.2268 pFF-3 GAPDH 108,000 1271 GAD-23 A.2268 pFF-3 GAPDH 108,000 1271 GAM-199 A.2268 pFF-9 GA 107,600 1266 GAE-32 A.2268 pFF-6A NATIIVI 72,600 854 GAL-65 A.2268 pFF-9 GA 72,200 849 GAE-3_A.2268_pFF-6A NATIIVI__67.500_794

Kontrolli ALK02268 ei mitään natiivi 3,800 45

Kontrolli_ALKQ243 ei mitään_natiivi__85_1 » Plasmideja pFF-9, pFF-8 ja pFF-6A käytettiin lineaarisessa '·* ' muodossa, joissa kaikki E. coli-sekvenssit oli poistettu.

***** Transformanttien merkintä: GA = glukoamylaasipromoottori; *" GAPDH = glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi-promoottori; „*·' NATIVE * natiivi fytaasipromoottori; .*·* Aktiivisuus ravistelupulloissa toteutetussa fermentointivil- **··' jeyissä; Entsyymiaktiivisuudet (yksikössä PU/ml) ovat kahden • 1· itsenäisen fermentoinnin keskiarvoja; ”V ° Suureneminen esittää, kuinka moninkertaisesti aktiivisuus ra- ί,! vistelupulloviljelmässä on kasvanut ALK0243:11a ravistelupullo- viljelmässä saavutettuun aktiivisuuteen verrattuna (siis trans-formantin aktiivisuus yksikössä PU/ml/ALK0243: n aktiivisuus yksikössä PU/ml).

* · ♦ a -a · • aa a a a · • • a ' ·· * a · a ♦ a aaa ♦ a • aa a « aaa a a aaa · a a * a a a 117202 73

Molekyylitason karakterisointi: fytaasitransformantit:

Southern- j a Northern-analyysit toteutettiin DNA: 11a j a mRNA: 11a (vastaavasti), jotka oli eristetty ravistelupullo-fermentointiviljelyissä fytaasia ylituottavista fytaasitrans-formanteista GAE 32, GAK 4-47; GAL 65, GAM 225 ja GAO 248 (taulukko 8). Genominen DNA eristettiin vastaavista trans formant ti kannoista, pilkottiin restriktioentsyymeillä ja tutkittiin radioaktiivisesti leimattua, kloonatulla, fytaasin DNA: ta vastaavalla restriktiokoettimella (joka on eristetty plasmidis-ta pFFl, edellä), transformanttien geenin kopiolukua sekä integroituna stapaa. Geenin kopioluvun suureneminen määritettiin vertaamalla 1, 3 kb: n kohdalla olevan täplän (eli trans-formaatiovektorikonstruktin DNA) tiheyttä fytaasigeenin endo-geenisellä kromosomikopiolla saatuun tiheyteen (kohdassa 2,4 kb) sekä vertailuna käytetyn kannan ALK02268 genomiseen DNA: hän. Kvantitointi tapahtui selausdensitometrillä (kuvio 16A). Transformanteista GAE 32, GAK 4-47, GAL-65, GAM-225 ja GAO-248 saatiin osoitetuksi kahdesta viiteen ylimääräistä fytaasivektorin geenikopiota, järjestäytyneenä useaksi erilaiseksi integraatiokuvioksi (tietoja ei esitetty).

·*:*: Fytaasin mRNA-tasojen esittäminen Northern-täplinä osoitti, * .··*; että transformanttien lähetti-RNA-tasot olivat aina 7-13 ker-täisiä transformoi mat torni in vertailuihin nähden (Kuvio 16B).

s [*** Todelliset tasot saattavat olla suurempia, sillä mRNA: n eris-* täminen tuotantoalustassa kasvatetuista soluista osoittautui * i vaikeaksi, ja tästä syystä näitä vertailuja ei voitu toteuttaa * * l solujen kasvatuksen ja fytaasin ilmentämisen kannalta optimi-olosuhteissa.

KUVIO 16A. Southern-blot-analyysi fytaasigeenin kopionluvusta ylituottavissa fytaasitransformanteissa: genominen DNA pilkot- :*·" tiin entsyymillä BamHI, täplä muodostettiin, käsiteltiin elek-« ..V troforeettisesti ja suodattimelle kiinnitettiin ' koettimeksi \,I pFF-1: n 5' -alueesta saatuja BamHI-fragmentteja. Geenin kopio- * *···' luku määritettiin vertaamalla geeni kopioiden tiheyttä (kohdas- • · 1 9 - • ti » « t i ♦ • » 117202 74 sa 1, 3 kb) transformanteissa endogeenisellä fytaasigeenillä saatuun täplän tiheyteen (kohdassa 2,4 kb) selausdensitometril-lä. Urat 1, 4, 7: Trans f ormoimaton vertailu ALK02268. Ura 2, 5, 8, 9, 10: ylituottavat fytaasitransformantit GAE-32, GAK-47, GAL-65, GAM-225, GAO-248, vastaavasti.

KUVIO 16B. Northern-blot-analyysi lähetti-RNA-tasoista fytaa-sia ylituottaviasa transformanteissa: kulloinkin 20 μg: n suu ruinen näyte koko RNA: sta käsiteltiin elektroforeettisesti formaldehydigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosalle. Kukin trans formantti tutkittiin käyttäen koettimena fytaasigeenin restriktiofragmentteja (eli pFF-1:stä saatuja BamHI-fragmentteja). Suurentunut fytaasia vastaava lähettitaso mitattiin mRNA: sta selausdensitometrillä. Perustasoa vastaavana vertailuna käytettiin kannasta ALK02268 saatua RNA: ta (ura 1). Urat 2-6: GAE-32, GAK-47, GAL-65, GAM-225, GAO-248, vastaavasti.

Alla olevaan taulukkoon 9 kootuista tuloksista nähdään yhteenvetona ne kvantitatiiviset tulokset, jotka saatiin selausdensitometrillä Southern- ja Northern-blot-analyyseistä kuvioissa 16A ja 16B.

*·« .·*·. Taulukko 9 *··;’ Fytaasigeenin kopioiden lukumäärän, mRNA-tasojen ja fytaasin Ψ ylituottajilla saavutetun entsyymituotannon vertaaminen • a m • « * : Kopio- Aktiivi- Suure-

Kanta_Plasmidi*_1 uku mRNAto s uus _neminen0 • » * * » * ALK0243 ei mitään 1,0 — 85 1 ALKQ22 68 ei mitään_ljJ)_l^J)_3, 800_45 GAO-248 pFF9 (GA, Iin) 6, 0 9, 2 164, 000 1, 929 GAK-47 pFF4 (GA, cir) 3, 0 13, 2 121, 400 1, 428 GAM-225 pFF9 (GA, Iin) 3, 0 7, 6 112, 000 1, 318 . . GAE-32 pFF6 (nat, cir) 6, 0 11, 3 72, 600 854 : GAL-65 pFF9 (GA, Iin) 3, 0 11, 8 72, 200 849 • · · * « · * « « \ . * nat = natiivi promoottori; cir = ympyränmuotoinen vektori;

Iin = lineaarinen DNA-fragmentti; GA = glukoamylaasipromoot-tori; : mRNA - lähetti-RNA: n monistumistasot (kuinka moninkertaises- *·** ti suurempi kuin ALK0243-kannalla saavutettu taso); • · m · «·· * - « • · • * 117202 75 ° Aktiivisuus = fytaasituotanto fermentointiviljely, muodossa fytaasiyksikköä/ml (PU/ml), olosuhteet kuvattu edellä taulukon 7 yhteydessä; β Suureneminen esittää sitä, kuinka moninkertaisesti aktiivisuus on suurempi ravistelupulloviljelyssä kannalla ALK0243 ra-vistelupulloviljelyssä saavutettuun aktiivisuuteen verrattuna-(siis transformantin aktiivisuus yksikössä P0/ml/ALK0243: n aktiivisuus yksikössä PU/ml).

pH2, 5 hapanta fosfataasia ylituottavien transformanttien analyysi: pH2,5 happamalle fosfataasille spesifistä maljaseulontamääri-tystä ei kyetty kehittämään; tästä syystä transformantit analysoitiin arvioimalla entsyymituotanto kasvuliemessä viiden vuorokauden pituisen, ravistelupullofermentoinnin jälkeen (kuten edellä taulukon 7 yhteydessä ja jäljempänä kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät" on kuvattu). Olosuhteet, joissa pH2, 5 happaman fosfataasin tuotanto ravistelupullofermentoin-nissa mitattiin, on kuvattu jäljempänä (taulukko 10), ja tässä mittauksessa para-nitrofenyylifosfaattia käytettiin substraattina (kuvattu myös jäljempänä kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät"). Kuten edellä taulukon 7 yhteydessä on kuvattu, entsyymipitoisuudet kasvuliemen supernatantissa määritettiin ja näitä entsyymimääriä verrattiin niihin määriin, jotka saa- « 4 t tiin yhtä pitkän eli viiden vuorokauden inkubointijakson *··; aikana vertailuvilj elyssä käytetyllä A. niqer-kannalla ALK0243.

19» • 1 2 « 1 * 1 1 + r i Niistä 55 transformantista, jotka oli tuotettu pH2,5 hapanta « ”1 « · fosfataasia ohjaavan natiivisen promoottorin sisältävällä plasmidilla pAP-3 (Esimerkki 2, "Materiaalit ja menetelmät", edellä) neljässä transformantissa todettiin pH2,5 happaman fosfataasin tuotannon suurenemista, joka suureneminen oli : 2 5-57-kertainen (taulukko 10) transformoimattoman ALK0243 * 1 · tuotantoon verrattuna. Eniten tuottavan transformantin (GAQ56) • n \ . tuotanto oli lähes 58 kertaa suurempi kuin .transformoimatto- fi · • V massa kannassa ALK02268 (taulukko 10) ja jopa 126 kertaa suu- 999· rempi tuotanto on esitetty taulukossa 11.

• ♦ • · · • · ♦ · »·« 2 · « ♦ · t i • · 117202 76

Taulukko 10 pH2, 5 happaman fosfataasin ylituotanto tuotautokannan ALK02268 trans formanteis s a

Aktiivi- Suure-

Kanta_P1 as mi di Promoottori suusto_neminen° transformoi mat on: A. 2268 ei mitään natiivi 2, 300 ---

Trans for-moitu: GAQ56 pAP-3 natiivi 133, 000 57,5 GA013 pAP-3 natiivi 102, 500 44, 5 GAQ66 pAP-3 natiivi 77, 800 33,8 GAQ62 pAP-3 natiivi 57, 600 25,0 Ä Olosuhteet, kuten edellä taulukon 7 yhteydessä on esitetty;

Aktiivisuus happaman fosfataasin yksikköinä/ml (HFU/ml); ° Suureneminen kuvaa sitä, kuinka moninkertainen aktiivisuus on ravistelupulloviljelyssä verrattuna kannalla ALK02268 ravis-telupulloviljelyssä saavutettuun aktiivisuuteen (eli transfor-mantilla saavutetun aktiivisuuden, yksikössä HFU/ml, ja kannalla ALK02268 saavutetun aktiivisuuden, yksikössä HFU/ml, välinen suhde).

Jatkotutkimuksissa arvioitiin niitä heterologisia promoottoreita, jotka ohjaavat pH2,5 happaman fosfataasin ilmentymistä. ,···,, 1181 transformanttia ylituotti pH2,5 hapanta fosfataasia (410 * 9 k I., oli saatu kannasta ALK0243 ja 771 oli saatu kannasta » · '·* ALK02268). Näistä trans formanteista löydettiin 32 sellaista «·· transformanttia (2,7 %), jotka tuottivat pH2, 5 hapanta fosfa- • * ’*··’ taas ia enemmän kuin 30 HFU/ml. Eniten tuottavan transformantin # · : (eli GAO-69) tuotanto oli 126 HFU/ml. Tällaiseen ilmentymiseen * * : päästiin transformoimalla sellaisella plasmidikonstruktilla, joka käsitti homeperäisen glukoamylaasi (GA) -promoottorin (taulukko 11).

• · • * * • · • ♦ e· * t * * e * * · * i* * * · 9 • « * · 9 ' • * • 9 · 4 * 999 • *

• I

999 1 % 9 9 9 9 · 9 9 117202 77

Taulukko 11 pH2, 5 hapanta fosfataasia tuottavat A. niger-transformantit, jotka ylituottavat tätä entsyymiä yli 40 kertaa enemmän kuin ALK0243 ravistelupullofermentointivilj elyssä

Trans - for- Promoot- Aktiivi- Suure- mäntti_Kanta Plasmidi tori_suusb_nemi nen° GAO-69 A.2268 pPREPHO-4 GA 693.000 126 GAW-131 A.2268 pPHO~4A GA 583,000 106 GBL-128 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 566,500* 103* GBL-97 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 533,500* 97* GAO-61 A.2268 pPREPHO-4 GA 451,000 82 GAW-89 A.2268 pPHO-3 GAPDH 412,500 75 GAW-130 A.2268 pPHO-4A GA 385,000 70 GAW-121 A.2268 pPHO-4A GA 379,500 69 GBL-87 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 346,500* 63* GBL-119 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 335,500* 61 * GAO-84 A.2268 pPREPHO-4 GA 330,000 60 GAW-54 A.2268 pPHO-3 GAPDH 280,500 51 GBL-129 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 264,000* 48* GAW-141 A.2268 pPHO-4A GA 258,500 47 GBL-103 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 242,000* 44* GAW-112 A.2268 pPHO-4A GA 236,500 43 GBL-92 ALK0243 pPHO-3 GAPDH 236,500* 43* GAW-114 A.2268 pPHO-4A G A 231,000 42 GAT-143_ALKQ243 pPHO-4A_GA 231.000_42

Kontrolli ALK02268 ei mitään natiivi 2,300 0.5

Kontrolli_ALKQ243 ei mitään_natiivi 5,500__1_ t Φ * » ♦ * • ·« ♦ · ♦ l«« i«« *;·' Ä Transformoidut, pH2# 5 hapanta fosfataasia ylituottavat AL-*··.* K02268- ja ALK0243 -kannat ravistelupullofermentointivil j el yi s - : sä (toteutettu edellä esimerkissä 7 kuvatulla tavalla). Ent- syymiaktiivisuus määritettiin lisäämällä kasvuliemen super-:*·*: natantin laimennoksia 30 mM p-nitrofenyylifosfaattiliuokseen (Boehringer Mannheim), joka oli tehty 0, 2 M glysiini-HCl-puskuriin, pH2, 5. Reaktio päätettiin ja ortofosfaatti määritettiin tavalla, joka on kuvattu taulukon 7 alaviitteessä. Entsyymiaktiivisuudet ovat keskiarvoja kahdesta itsenäisestä fermentoinnista paitsi (*):n tapauksessa, jolloin arvot on . ^ saatu vain yhdestä fermentoinnista. Plasmideja pFHO-3 ja ’ pPHO-4A käytettiin lineaarisessa muodossa, joissa E. coli-sekvenssit oli poistettu. Transformanteista käytetyt merkin-^ nät: GA = glukoamylaasipromoottori, GAPDH « glyseraldehydi-3 - f os f aatti -dehydrogenaasi -promoottori; ! < 13 Aktiivisuus happaman fosfataasin yksi kkönä/ml (HFU/ml); • * • · ··« * * • «« 9 Ϊ* ·· « » · » • t t 9 117202 78 ° Suureneminen kuvaa sitä, kunka moninkertainen aktiivisuus on ravistelupulloviljelyssä verrattuna kannalla ALK0243 ravistelu-puliovi1jelyssä saavutettuun aktiivisuuteen (eli transforman-tilla saavutetun aktiivisuuden, yksikössä HFU/ml, ja kannalla ALK0243 saavutetun aktiivisuuden, yksikössä HFU/ml, välinen suhde).

pH2, 5 hapanta fosfataasia tuottavien transformanttien karekte-ri s oi nti molekyylitas olla:

Kopioiden lukumäärä ja lähetti-RNA-tasot määritettiin Sout-thern- ja Northern-blot-analyysiä ja selausdensitometriaa käyttäen (edellä kuvatulla tavalla) niille viidelle pH2,5 hapanta fosfataasia eniten ylituottavalle kannalle, jotka kannat oli tunnistettu ravistelupullofermentointiviljelyissä (edellä oleva Taulukko 11). pH2, 5 hapanta fosfataasia tuottavista transformanteista GAT-143, GAW-54, GAW-89, GAW-121 ja GAW-130 saatu DNA pilkottiin restriktioentsyymeillä ja hybridi-soitiin radioaktiivisesti leimattuun, pH2, 5 happamalle fosfa-taasille spesifisen koettimen kanssa. Yleisesti, pH2,5 hapanta fosfataasia tuottavissa transformanteissa geenin kopioluvut olivat suuremmat (alla oleva taulukko 12) kuin edellä fytaasi-transformanteissa havaitut kopioluvut (Taulukko 9, edellä). Sitä vastoin, pH2,5 hapanta fosfataasia tuottavissa transfor- »· 1 V : mänteissä lähettitasot (Taulukko 12) eivät olleet niin korkei- :··2: ta kuin fytaasitransformanteilla todetut tasot (Taulukko 9).

ββ1|· Kuitenkin samoin kuin edellä fytaasi trans formanttien tapauk-:3: s es s a, pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaavien lähettien määriä • ♦f • ei mitattu optimaalisissa fermentoi nti olosuhteissa, johtuen :V: siitä, että RNA: n eristäminen soluista tuotantoviljelmän olo suhteissa oli vaikeata. Niinpä ilmentyminen tuotanto-olosuhteissa voi olla suurempaa kuin mitä ohessa on mitattu.

• 1 • 1 s » 1 «M ‘ ft * e i · * * · 1 2 ♦ ♦ 1 - e s »«« • ^ ··» • •e « · 3 ** 1 «et • 1 79 1 1 7202

Taulukko 12 pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaava geenin kopioluku ja mRNA-tasojen sekä entsyymituotannon vertaaminen yhdistelmä-DNA-tek-ni s es ti trans formoiduis sa kannois s aÄ pH2,5 hapan fosfataasi Kopio- Aktiivi- Suure-

Kanta_P1 as mi di*_luku mRNAto s uus13_nemi nena A. 2268 ei mitään_0_1^0_2, 300_0, 4 GAT-143 pPH04A (GA, Iin) 10, 0 5,6 231, 000 42,0 GAW-54 pPH03 (GAP, Iin) 7,0 5,7 280, 500 51,0 GAW-89 pPH03 (GAP, Iin) 12,0 3,0 412, 500 75,0 GAW-121 pPH04A (GA, Iin) 11, 0 3,0 379, 500 69,0 GAW-130 PPHQ4A (GA, Iin) 7,0 7,2 385,000 70,0 * GA = glukoamylaasipromoottori, GAP = glyseraldehydi-3-fosfaatti -dehydrogenaasi-promoottori; Iin = lineaarinen DNA-frag-mentti; mRNA = lähetti-RNA: n monistumistasot (kuinka moninkertainen ALK0243: ssa todettuihin tasoihin verrattuna); b pH2,5 happaman fosfataasin aktiivisuus ilmoitettuna happaman fosfataatin yksikköä/ml (HFU/ml); vertaaminen tehtiin raviste-lupulloviljelyissä kasvatetuilla soluilla; Aktiivisuus » entsyymiaktiivisuus, joka on mitattu edellä taulun 10 yhteydessä kuvatulla tavalla ° Suureneminen kuvaa sitä, kuinka moninkertainen aktiivisuus on ravistelupulloviljelyssä verrattuna kannalla ALK0243 ravis-telupulloviljelyssä saavutettuun aktiivisuuteen (eli transfor-mantilla saavutetun aktiivisuuden, yksikössä HFU/ml, ja kannalla ALK0243 saavutetun aktiivisuuden, yksikössä HFU/ml, välinen .·:· suhde).

• I ' • e v * **\ Materialit ia menetelmät

Mk I 1 e

Plasmidikonstruktit valmistettiin siten, että vektorin runko-/·* sekvenssit voitiin poistaa helposti ennen vastaavien geenien «at !*γ transformoi nti a homeisiin. Lineaarinen DNA eristettiin agaroo- , V: silta ja puhdistettiin GeneClean: illa mahdollisten kontaminoi- vien spesifisiteettien poistamiseksi. Fytaasigeeniä ja pH2,5 happaman fosfataasin geeniä ilmentävät konstruktit A-D ja konstruktit E-H, vastaavasti, eri säätelykontrollin alaisina, : .·» valmistettiin jäljempänä kuvatulla tavalla.

··· e t

Fytaasin la pH2, 5 happaman fosfataasin ilmentämispl-asmidit: • · * γ· Konstrukti A: pFF-6 eli fytaasi natiivin promoottorin säätelyn alaisena.

» * ;··ν Fytaasi geeni n sisältävä 2,6 kb: n Sphl-fragmentti kloonattiin ··· :\v pLO-3: n Sphl-kohtaan. Konstrukti valmistettiin kahdessa orien- e * 117202 80 taatiossa ja ja niistä käytettiin lyhenteitä pFF-6A ja pFF-6B. Lineaarinen DNA eristettiin kummastakin vektorista 4,9 kb:n Hi ndl11-fragmenttina.

Konstrukti B: pFF-8 eli fytaasi A. nicrer GAPDH-promoottorin säätelyn alaisena.

Homeperäinen ekspressiovektori pPRE8-l leikattiin entsyymillä Bglll ja päät tehtiin tylpiksi DNA-polymeraasi I: n Klenow-frag-mentilla; sitten plasmidi leikattiin täydellisesti PstI:llä. Phleomysiinin vastustuskyvyn (Phleo*·) aikaansaavaa merkkiä sisältävä ekspressiokasetti poistettiin pLO-3: sta (Hindlll(täytetty )/PstI-fragmenttina] ja ligoitiin leikattuun konstruktion pPRE8-l, jolloin saatiin pPRE8-2. Transformäntit tunnistettiin restriktioanalyysillä. Fytaasigeenin sisältävä 2,0 kb: n Xbal-fragmentti (esimerkki 2, "Materiaalit ja menetelmät" ) ligoitiin ainoaan Xbal-kohtaan, joka sijaitsee plasmidissa pPRE8-2 -GAPDH-promoottorista alavirtaan. Oikean suuntaiset pFF-8: n sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. Lineaarinen DNA eristettiin pFF-8: sta 6,7 kb: n PstI-fragmenttina.

«•e • e * 9 · ** e !*'\ Konstrukti C: pFF-9 eli fytaasi A. niger GA-promoottorin sää- M« ' - - - - " telyn alaisena.

»M» • e» : Fytaasigeenin sisältävä 2,0 kb: n Xbal-fragmentti (esimerkki 2, • * * ;:V "Materiaalit ja menetelmät", edellä), ligoitiin homeperäisen • ♦ ' * ekspressiovektorin pGA ainoaan Xbal-kohtaan, jolloin saatiin pFF-4. Oikean suuntaisen plasmidin sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. pFF-4 leikattiin osittain Kpnl:llä yhdestä kohdasta leikatun lineaarisen plasmidin tuot- • e tamiseksi. Päät tehtiin tylpiksi T4 DNA-polymeraasilla. Sitten I/·* tämä plasmidi leikattiin täydellisesti entsyymillä Hindlll.

;V pLO-3 leikattiin ensin entsyymillä Kpnl ja 'päät ‘tehtiin tyl- * *··· piksi T4 DNA-polymeraasilla, ja sitten se .leikattiin entsyy- rl\ millä Hindlll. Phleo^-ekspressiokasetin sisältävä 2, 1 kb: n «·♦ « • * *♦ i * t · • e i 81 1 1 7202 fragmentti puhdistettiin agaroosista GeneClean:ilia ja ligoitiin leikattuun pFF-4:ään. pFF-9:n sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. Lineaarinen DNA eristettiin pFF-9:stä 7,3 kb:n Hindlll/ Kpnl-fragmenttina.

Konstrukti D: pFF-11 eli fytaasi A. niger GA-promoottorin säätelyn alaisena, erittymisen tapahtuessa GA-signaalisekvenssin avulla.

Oligonukleotidit 260 ja 261 syntetisoitiin koodittamaan Xbal-kohtaa, joka sijaitsee translaation käynnistämisalueesta ylävirtaan ja glukoamylaasin signaalisekvenssi, joka sijaitsi puolestaan ylävirtaan fytaasin N-terminaalista päätä koodaavasta nukleotidisekvenssistä (SEQ ID NO 1). (Tämä konstrukti sisälsi myös natiivin Xhol-kohdan välittömästi alavirtaan tähän alueeseen nähden.) Tässä konstruktissa käytetyillä kahdella synteettisellä oligonukleotidillä oli seuraava nukleotidisekvenssi:

Oligo260; 5'-CTAGACACCTCAGCAATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCCCTGA GCGGCCTCGTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCC-31 (84 mer), SEQ ID NO:46; ja,

01igo261: 5'-TCGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGACGAGGC

CGCTCAGGGCGAGTAGAGATCGGAACGACATTGCTGAGGTGT-3' (84 mer), SEQ ID NO:47.

... Oligonukleotidit 260 ja 261 annettiin kiinnittyä ja ligoitiin sitten ! ! «

Xbal/XhoI-leikattuun konstruktiin, jolloin saatiin • i • * '** pFF-lGA. pGA:sta saatu glukoamylaasipromoottori ligoitiin konstruktiin ·*" pFF-lGA (KnpI/Xbal-fragmenttina), jolloin saatiin pPREFF-11. Lopuksi * *···* phleor-kasetti lisättiin Hindlll-fragmenttina tämän konstruktin ainoaan « · • · * : Hindlll-kohtaan. Oikean suuntaisen plasmidin sisältävät transformantit *« · V · tunnistettiin restriktioanalyysillä. Lineaarinen DNA eristettiin konstruktista pFF-11 7,35 kb:n Kpnl-fragmenttina.

• · * • · » • · ft ϊββ*ϊ Konstrukti E: pPHO-1 eli pH2,5 hapan fosfataasi (AP) natiivin *·. promoottorin säätelyn alaisena.

«

Konstrukti pAP-3 leikattiin entsyymillä EcoRI ja päät tehtiin tylpiksi * *** Klenow-fragmentin avulla. Phleor-kasetti poistettiin konstruktista « pLO-3 Hindlll-fragmenttina, päät tehtiin tylpiksi Klenow-fragmentin • « •/•S avulla, ja se ligoitiin leikattuun pAP-3- 117202 82 plasmidiin. Oikean suuntaisen pPHO-l-konstruktin sisältävät trans formantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. Lineaarinen DNA eristettiin konstruktista pPHO-1 6,3 kb: n Pstl-frag-menttina.

Konstrukti F: pPHO-2 eli pH2, 5 happaman fosfataasin geeni A. niger: in b-tubuliinipromoottorin säätelyn alaisena.

Homeperäinen ekspressionvektori pTL113 leikattiin entsyymillä XbaX ja se defosforyloitiin vasikan suoliston fosfataasilla. pH2, 5 fosfataasigeenin sisältävä 2,0 kb: n Xbal-fragmentti (esimerkki 2, "Materiaalit ja menetelmät", edellä) ligoitiin leikattuun konstruktiin pT1113, jolloin saatiin pPREPHO-2. Oikean suuntaiset plasmidit sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysin avulla. pPREPHO-2 leikattiin osittain Sphl: llä vain yhdestä kohdasta leikatun lineaarisen plasmidin saamiseksi. Tämän leikatun pPREPHO-2: n päät tehtiin tylpiksi T4 DNA-polymeraasilla. 2,7 kb: n tylppäpäinen HindiIX-fragmentti, joka sisälsi phleo^-ekspressiokasetin pLO-3: sta, ligoitiin leikattuun pPREPHO-2-vektoriin. Oikean suuntaiset pPHO-2-plasmidin sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysin avulla. Lineaarinen DNA eristettiin 6,0 kb: n Pstl-fragment- at * V : tina.

¥ »** ··- Konstrukti G: pPHO-3 eli pH2, 5 happaman fosfataasin qeeni A. ··** 1 niger: in GAPDH-promoottorin säätelyn alaisena.

: #v 4,3 kb: n Xbal-fragmentti, joka sisälsi pH2, 5 happaman fosfataa-* » "V sin geenin (esimerkki 2, edellä) sekä phleo^-ekspressiokase-* « • tin, poistettiin konstruktista pPho-2 osittaisella pilkkomisella. Fragmentti puhdistettiin agaroosista GeneClean: illa ja ligoitiin homeperäisen ekspressiovektorin pPRES8-l ainoaan Xbal-kohtaan. Oikean suuntaisen pPHO-3-plasmidin sisältävät e e UI - transformantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. Lineaari- • •e V nen DNA eristettiin 7,0 kb: n Ps tl-fragmenttina.

· • t e 9 ¥ 9 ^ [···. Konstrukti H: pPHO-4 eli pH2, 5 happaman fosfataasin geeni A^ • ; ’·*· niger: in GA-promoottorin säätelyn alaisena.

• e« pH2, 5 happaman fosfataasin geenin sisältävä 2,0 kb: n Xbal- * • V fragmentti (esimerkki 2, edellä) ligoitiin entsyymillä Xbal 117202 83 leikattuun homeperäiseen ekspressiovektoriin pGA, jolloin saatiin pPREPHO-4. Oikean suuntaisen plasmidin sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. GA-promoot-torin ja pH2, 5 happaman fosfataasin geenin sisältävä 5,5 kb: n Kpnl-fragmentti poistettiin konstruktista pPREPHO-4 osittaisella pilkkomisella. Tuloksena ollut plasmidi puhdistettiin aga-roosista GeneClean: illa ja päät tehtiin tylpiksi T4 DNA poly-meraasilla. Tylppäpäinen fragmentti ligoitiin PstI: llä leikattuun konstruktiin pLO-3 ja sitten DNA: n päät tehtiin tylpiksi, jolloin saatiin kahdella eri tavalla suuntautuneet plasmidit eli pPH04A ja pPHO-4B. Kummallakin tavalla suuntautuneen plas-midin sisältävät transformantit tunnistettiin restriktioanalyysillä. Lineaarinen DNA eristettiin 8,1 kb: n HindiII-fragmenttina.

A, nicrer-kantojen ALK0243 ja ALK02268 DNA-transformoi nti: Sferoplasteja saatiin lisäämällä ensin 0,5 - 1,0 ml PD-vino-pinnoilla kasvatetuista, suvuttomia itiöitä muodostavista viljelmistä saatujen sieni-itiöiden suspensiota 50 ml: aan CM-alustaa, joka oli laitettu 250 ml: n pulloihin. Kannan AL-K0243 tapauksessa viljelmiä kasvatettiin yön yli 35 *C:ssa, nopeudella 200 kierr. /min. sekoittaen, ennnen suodattamista. .**·. ALK02268-viljelmiä kasvatettiin 48 tuntia 30 *C:ssa, nopeudella 200 kierr. /min. sekoittaen. Tuloksena ollut rihmasto kerät- ·#« tiin kaksinkerroin taitetulle sideharsolle (cheese cloth), « ·

’·;* lisättiin 50 ml: aan KCM-puskuria (0,7 M KC1, 10 mM MOPS, pH

♦ · · ··* · 5,8), joka sisälsi 5 mg/ml entsyymiä Novozym 234 (Novo • · * r.: · BioLabs) ja inkuboitiin 30 * C: ssa, nopeudella 85 kierr. /min. sekoittaen, yön yli sferoplastien muodostamiseksi.

Sferoplastit otettiin talteen suodattamalla mira-kankaalla : täytetyn ja sideharsolla peitetyn suppilon läpi neljään 15 * * * ♦ ml: n kartiomaiseen sentrifugiputkeen, joita lingottiin sitten • * » β<·β· 10 minuuttia nopeudella 1500 kierr. /min. pöytäse'ntrifugissa.

• Λ 9 • .* Pelletit suspendoitiin varovasti uudestaan yhteensä 15 ml: aan • * · sorbitoli puskuri a (IM sorbitolia, 50 mM CaCla) ja sentrifugoi- * * .***; tiin uudestaan. Pelletti pestiin jälleen sorbitolipuskurilla • · · ·· · • » • « 84 117202 (SB), ja suependoitiin uudestaan SB-puskuriin tiheydeksi 5xl0v/ml, 200 μΐ: aan sferoplasteja lisättiin 5 μ9 lineaarista tai plas-midi-DNA:ta 20 μΐ: ssa TE-liuosta. Kotransformointia varten sferoplasteihin lisättiin samanaikaisesti 1 μ9 phleomysiinin vastustuskykyyn perustuvan selektiomerkin geeni-DNA; ta eli

konstrukti pLO-3. Tähän DNA-sferoplasti-seokseen pipetoitiin varovasti 50 μΐ PCM-liuosta (40 % PEG 8000, 10 mM MOPS, pH

5,8, 50 mM CaCla (CaCl2 lisättiin juuri ennen käyttöä)] ja seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia.

Transformointiseokseen lisättiin 1 ml PCM-liuosta, seos pipetoitiin 50 ml; aan regererointiagaria (MA; CM + 1, 3 M mannitoll, 3 % agari), ja tämä agar jaettiin viidelle petrimaljalle. Sferoplastien annettiin regeneroitua 3-5 tuntia 35 ‘C: ssa, ennenkuin niiden päälle valettiin yhtäsuuri määrä phleomysii-niä sisältävää OL-alustaa [Oli: 1 % peptonia, 1 % agaria; phleo- mysiiniä (CAYLA) 50 μg/ml kannan ALK0243 tapauksessa ja 195 μ9/πι1 kannan ALK02268 tapauksessa]. Oletetut transformantit siirrettiin PD + phleomysiini-vinopinnoille ja niitä kasvatet-tiin 28 ’ C: ssa.

p » · ♦ * • *

Fytaasin maljamääritvs: *;;; Suurehkoja fytaasisaantoj a tuottavat transformantit tunnistet- 9 * /·** tiin maljamäärityksellä, jossa mitataan kolorimetrisesti epä- p « · ··· ί orgaanisen fosfaatin kerääntymistä fosfomolybdaattikompleksin • · · ; pelkistymisellä. Oletetuista trans formant ei s ta saatuja suvutto-mia itiöitä (conidium) laitettiin määritysmaljoille ja maljoja inkuboitiin kaksi vuorokautta 30 *C:ssa. Alustan päälle laitettiin 20 ml reagenssia Reagent C [3: 1: 1-suhteessa IM rikki-: happoa (Mallinckrodt), 2,5 % ammoniummolybdaattia (Sigma), 10 % askorbiinihappoa (Sigma)) ja maljoja inkuboitiin 50 'C:ssa • ♦ '· * 15 minuuttia ennen värin voimakkuuden arvioimista. '[Maljamääri- ftl · : tysagar: 2 % maissitärkkelystä (Sigma S-4126), 1 % proteaasi- peptonia (Difco 0122-1), 30 g glukoosia/1, 5 g NH^NOa/l, 0, 5 g ./**! MgS04-7HaO/l, 0, 5 g KC1/1, 0,183 g FeSO* 7HaO/l, 3 % agaria, 3 % natriumfytaattia (Sigma P-3168). ] * * 85 1 1 7202

Fytaasientsyymin ja pH2,5 happaman fosfataasientsyymin määri-tys:

Entsyymimääritykset toteutettiin edellä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin tuottaminen transformoiduissa rekombinanttisoluissa:

Transformoituja, rekombinanttifytaasia ja pH2,5 hapanta fosfa-taasia ilmentäviä rihmasieniä viljeltiin samanlaisissa olosuhteissa, soijaan perustuvassa tuotantoaluetässä (50 g/1 soijajauhoa, 30 g/1 glukoosia, 5 g/1 NH4N03, 0,5 g/1 MgS04'7H20, 0,5 g/1 KC1, 0,183 g/1 FeS04 · 7H20, pH 5,0) viiden vuorokauden ajan ravistelijassa, nopeudella 200 kierr./min. ja 28 * C: ssa. Glukoamylaasipromoottoria hyväksikäyttäviä transformantteja kasvatettiin lisäksi soij a-glukoamylaasialustalla (soij a-alus-ta + 4 % maissitärkkelystä ja 6 % glukoosia). Entsyyminäytteitä saatiin sentrifugoimalla fermentointiviljelmästä otettua näytettä nopeudella 13000 kierr. /min. mikrosentrifugissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen tämä entsyymiä sisältävä super-natantti siirrettiin puhtaaseen putkeen entsyymimääritystä varten (alla).

ψ » * • * *!:. Esimerkki 5 m

Fytaasigeenin ja pH2, 5 happaman fosfataasigeenin tasapainossa W 4 oleva samanaikainen yli-ilmentyminen 9 9 9 9 · · • 9 · 9 ' 9 9 9* *·* * Sekä fytaasigeenin että pH2, 5 AP-geenin sisältävien kaksois -entsyymitransformanttien analyysi:

Koska fytiinihapon optimaaliseen hajotukseen tarvitaan sekä j Λ pH2,5 hapanta fosfataasia että fytaasia, niin erityisen edul-;«*: liseksi todettiin sellaisten kantojen valmistaminen, jotka ψ „V kannat ylituottavat kumpaakin entsyymiä. Koska'fytiini happo * · saadaan defosforyl oi tumaan kaikkein tehokkaimmin, kun fytaasi- ♦ ► '···] yksiköiden ja happaman fosfataasin yksiköiden väliset suhteet ;***; on räätälöity erityistä sovellutusta varten (esimerkki 1, edel- f ·« • e * 9 9 9 4 * 9 4 86 1 1 7202 lä), niin vieläkin toivottavampaa katsottiin olevan, että voitaisiin valikoida sellaiset trans formanttikannat, jotka yli-ilmentävät kumpaakin entsyymiä tällä toivotulla suhde-alueella.

A. niqer ALK0243-transformantit valikoitiin käyttämällä taulukossa 13 esitettyjen transformointivektoriplasmidien yhdistelmiä, ja kotransfektointia käyttäen phleomysiinin vastustuskykyyn perustuvaa selektiomerkkiä (kuten edellä esimerkkiin 4 kuuluvassa kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät" on esitetty). Fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin sisältävien plas-midien (taulukko 13) esitettyjen yhdistelmien kotransformoin-nin jälkeen transformantteja kasvatettiin ravistelupullovilje-lyssä (kuten edellä esimerkin 4 taulukossa 7 ja taulukossa 10 on esitetty) entsyymituotannon arvioimiseksi.

Kaikista kaksoisentsyymitransformanteista määritettiin ensin pH2, 5 happaman fosfataasin määrä; mikäli määrä oli merkittävästi suurentunut, niin määritettiin fytaasiaktiivisuus. [Koska fytaasilla on kaksi pH-optimia eli pH 2,5 ja pH 5,0 (edellä esimerkki 1), niin sen aktiivisuus voidaan määrittää käyttämäl-lä pH2, 5 happaman fosfataasin parametrejä. ] (Happaman fosfa-taasin arvoja korjattiin pH2, 5 happaman fosfataasin määrityk-'*** sessä ilmenevän prosentuaalisen fytaasiaktiivisuuden verran. ) ti» 425 transformantista yhdeksän todettiin ylituottävan sekä ti» fytaasia että pH2, 5 hapanta fosfataasia suhteessa, joka oli j.: · suurempi kuin 4: 1 HFU/PU (eli pH2, 5 happaman fosfataasin HFU ;Y; jaettuna fytaasi-PU: 11a).

9 f * v I · P 9 '

Ml

Ml * 9 * * · • ·

·· I

* i • * 9 9 ·* • * 9 9 • M a * € ««* »» t 9 9 9 9 9 9 9 87 1 1 7202

Taulukko 13 DNA-konstruktit, joiden avulla ALK0243-kannasta valmistettiin kaksoisentsyymitransformantit, jotka tuottivat suurentuneita määriä sekä pH2, 5 hapanta fosfataasia että fytaasia

Plasmidi-DNA-yhdistelmä_Analysoitu lukumäärä pPHOl/pFF4 3 pPH03/pFFl 108 pPHÖ3/pFF2 50 pPH03/pFF4 11 pPH03(\in)lpFF6(lm) 74 pPH03(lin)/pFF8(\iR) 7 pPH04A/pFFI 21 pPH04A/pFF2 22 pPH04A/pFF3 25 pPH04A/pFF4 22 pFF6/prepho2 2 pFIN-lA 84 pFIN-lB 46 yhteensä 475 475 yhdistelmätransformantista (taulukko 13) kahdeksassatoista (18) todettiin yli 20 kertaa suurempi pH2, 5 happaman fosfataa-sin HFU/ml-aktiivisuus kuin ALK0243-kannassa ja 250 kertaa suurempi fytaasin PU/ml-aktiivisuus kuin ALK0243-kannassa (taulukko 14).

* 4 «

» < I

» * 1 4 · 1»1· f it» * I 1♦1 4 ·« 4 ♦ 44 * 4 « I < * 4 · « »4 1 * - ir * · * 4 -f • 1 < 4 * · ' • 14 «44 » 4 - 4 4 4 41 1 4 4 ' f 4 4 4 44 « ; 4 · *44 • 1 44« 4 4 441 4 1 4 4 4 • 1 • 4 117202 88

Taulukko 14 A. nicrer ALK0243 kaksoisentsyymitransformantit, jotka ilmentävät sekä fytaasia että pH2, 5 hapanta fosfataasia (pH2,5 AP) siten, että saatu entsyymiaktiivisuuden taso on yli 20 kertaa suurempi pH2,5 happaman fosfataasin (AP) tapauksessa ja yli 250 kertaa suurempi fytaasin (Phy) tapauksessa kuin ALK0243: n alkuperäisillä soluilla saavutetut vastaavat aktiivisuudet»

Fytaasin

Aktiivisuus Activity Suhde AP:n suu- suurene-Transformantti Plasmidi(t)/promoottori AP/Fhy HFU/ml PU/ml HFU/PU reneminen minen GAX-11 pPH0~4A/pFF-4 (GA/GA) 280,500 53,000 5.3 51 624 GAX-12 pPHO-4A/pFF-4 (GA/GA) 176,000 29,000 6.1 32 342 GBE-14 pPHO-3/pFF-4 (GAPDH/GA) 147,300 29,400 5.0 27 346 GBH-134 pPHO-B/pFF-2 (GAPDH/β-Τ) 291,500 39,000 7.5 53 459 GBH-157 PPHO-3/pFF-2 (GAPDH/β-Τ) 247,500 54,000 4.6 45 635 GBJ-9 pFIN-JA (GA/GA) 212,400 38,800 5.5 391 456 GBJ-10 pFJN-lA (GA/GA) 241,000 38,100 5.6 441 448 GBJ-13 pFIN-IA (GA/GA) 259,800 25,300 10.2 471 299 GBJ-16 pFIN-lA (GA/GA) 280,600 23,200 12.1 511 273 GBJ-26 pFIN-IB (GA/GA) 328,100 45,700 7.2 601 538 GBJ-27 pFIN~lB (GA/GA) 218,100 39,700 5.5 401 467 GBJ-28 pFIN-IB (GA/GA) 372,300 23,600 15.8 681 278 GBJ-31 pFIN-IB (GA/GA) 299,000 30,400 9.8 541 358 GBJ-35 pFIN-IB (GA/GA) 255,300 28,400 9.0 461 334 GBJ-38 pFIN-IB (GA/GA) 277,500 25,600 10.8 501 301 GBJ-40 pFIN-4A (GA/GA) 401,000 38,200 10.5 73 449 GBJ-76 pPHO-4A/pFF-2 (GA/β-Τ) 201,600 46,100 4.4 371 542 GBJ-82_pPHO-4A/pFF~2 (GA/β-Τ) 309.800 40.100 7.7 561 472 ALKQ243_vertailu/natiivi (natiivi)_5.500_85_64,7_1_1_ ·«« a 4 « I I I m * 1 ♦ te1 i e» 1 » Entsyymiaktiivisuudet määritettiin ravistelupulloviljelmistä (kuten edellä esimerkkiin 4 kuuluvassa taulukossa 10 on esi-tetty). Tulokset on esitetty vähintään kahden itsenäisen fer-: ment oi nti viljely n keskiarvona lukuunottamatta (1) merkittyjä •V tapauksia, joissa tulos on saatu vain yhdestä fermentointivil-*’1 jelystä. pH2, 5 happaman fosfataasin (pH2, 5 AP) määristä on vähennetty fytaasientsyymistä johtuva tausta-aktiivisuus (eli se fytaasin prosentuaalinen määrä, joka voitiin ilmaista pH-arvossa 2,5 pH2, 5 happaman fosfataasin määritysolosuhteissa; "Materiaalit ja menetelmät"); « » • 1 * e ··· ♦ •f * e • e v ^ t e «e « « 1 -« • % 9 »e • 1 ψ « M» * e te· # ··· • t i • tv 117202 89

Kaikki näissä tutkimuksissa käytetyt plasmidit olivat rengasmaisia ja ne olivat kokonaisuudessaan rengasmaisessa muodossa. Plasmidit pFIN-lA ja pFIN-lB ovat yksinkertaisia plasmi-deja, jotka sisältävät sekä pH2, 5 hapanta fosfataasia (AP) vastaavan geenisekvenssin että fytaasia (Phy) vastaavan geeni-sekvenssin. Transformantti tarkoittaa transformaatista käytettyä lyhennettä; [promoottori hapanta fosfataasia varten (AP) / promoottori fytaasia varten (Phy)]; GA = glukoamylaasipromoottori; GAPDH = glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi-promoottori; β-Τ - β-tubuliinipromoottori; ° HFU/ml, happaman fosfataasin yksiköt; PU/ml, fytaasin yksiköt (katso edellä olevat taulukot 7-10); Λ HFU/PU-suhde = happaman fosfataasin aktiivisuuden (HFU/ml) ja fytaasiaktiivisuuden (PU/ml) välinen suhde; • Suureneminen tarkoittaa sitä, kuinka monta kertaa happaman fosfataasin aktiivisuus (HFU/ml) tai fytaasin aktiivisuus (PU/ml) on suurempi ravistelupulloviljelyissä verrattuna AL-K0243-kannalla saavutettuun aktiivisuuteen ravistelupulloviljelyssä (eli transformantilla saavutettu aktiivisuus joko HFU/ml tai PU/ml jaettuna ALK0243-kannalla saavutettuun aktiivisuuteen joko HFU/ml tai PU/ml, vastaavasti).

Molekyylitason karakterisointi:

Kannat GAX-7, GAX-11 ja GAX-12 karakterisoitiin, jotta niistä saataisiin määritetyksi suhteellinen geeniannos, lähettitaso sekä entsyymituotanto. Näissä kaikissa kolmessa transforman-tissa todetaan näyttöä tandem-integraatiosta, joka on peräisin fytaasin transformointivektorin pFF4 liittymisestä. Myös kah-des s a muussa kannassa GAX-7 ja GAX-11 todetaan näyttöä monin- t ;'M. kertaisista integraatiotapahtumista (kuvio 17A). Fytaasia vastaavan lähetti tason suureneminen ALK024 3-kannan mRNA-tasoi-hin verrattuna vaihteli 17,5-kertaisesta suurenemisesta 9 · (GAX-11: n tapauksessa) 34, 4-kertaiseen suurenemiseen (GAX-12: n i · i **V tapauksessa) (Kuvio 17B; taulukko 15).

• 9 9 · « 9 KUVIO 17A esittää kahdella geenillä transformoiduissa GAX-kannoissa läsnäolevien fytaasigeenien DNA-kopiolukujen

Southern-analyysiä. Kaksoisentsyymitransformanteista GAX-7, 11 * ja 12 saatu DNA pilkottiin entsyymeillä BamHI ja Xbal; erotet-tiin elektroforeesilla ja siirrettiin suodattimelle, minkä 9 ,.Y jälkeen suodatin tutkittiin käyttäen koettimena' BamHI/Xbal-5 * γ· fragmenttia konstruktista pFF-4. Ura 1: , pFF-4-plasmidista 9 * ; saatu vertailu-DNA, joka on pilkottu yhdistelmällä BamHI/Xbal.

Ura 2: ALK0243: sta saatu transformoimaton vertailu-DNA. Ura 3: |*« — 1 —— 1 *9 * • % 9 • · 117202 90

Transformantti GAX-7; n DNA, Ura 4: Transformantti GAX-ll:n DNA. Ura 5: Transformantti GAX-12: n DNA, p = trans formormaatio-vektoriplasmidin kopioluku; c = kromosomaalisen geenin kopio-luku.

KUVIO 17B esittää Northern-analyysiä fytaasia vastaavista mRNA-kopiotasöistä kuvion 17A mukaisissa GAX-kannoissa. 20 mg koko RNA: ta, johon oli lisätty 10 ng mpl8RF DNA: ta (mp), käsiteltiin elektroforeettisesti, siirrettiin nitroselluloosalle ja se tutkittiin koettimena pFF-1. Fytaasilähettikopio on merkitty nuolella kohdassa 1, 4 kb. Ura 1: ALK0243: sta saatu trans formoimaton vertailu-RNA, Ura 2: GAX-7 RNA, Ura 3: GAX-11 RNA, Ura 4: GAX-12 RNA.

Taulukko 15

Fytaasigeenin kopioluvun, mRNA-tasojen ja entsyymiaktiivisuuden vertaaminen kaksoisentsyymitransformanteissa

Vektorin kopio- Aktii- Suure-

Kanta P1 as midi_luku*» mRNA° visuus* neminen* ALK0243 ainoas- 1,0 1,0 85 1 taan 1 ... GAX-7 pFF4 (GA, cir) 2* 24, 4 38, 400 452 V* GAX-11 pFF4 (GA, cir) 6* 17,5 53, 000 624 GAX-12 pFF4 (GA, cir) 8 34, 4 29, 000 341 « [lii · GA = glukoamylaasipromoottori; cir = rengasmainen vektori;

Vektorin kopioluku - vektori nukleiinihapon kopioiden luku-j määrä transformoidun solun genomissa; + - läsnä on kvantitoi- *”/ mattomia ylimääräisiä fytaasikopioita; c) mRNA = lähetti-RNA: n ϊβί : monistumistasot (kertaisena nousuna verrattuna tasoihin AL- KQ243-kannassa); Λ Aktiivisuus = fytaasiaktiivisuus yksikössä PU/ml taulukossa 10 kuvatuissa ravistelupulloviljelmissä; • Suureneminen tarkoittaa sitä, kuinka moninkertainen fytaasi aktii visuus (PU/ml) oli ravistelupulloviljelyssä verrattuna ; kannalla ALK0243 saavutettuun aktiivisuuteen ravistelupullo-*·**· viljelyssä (eli transformantin aktiivisuus yksikössä PU/ml / ·*·’ kannan ALK0243 aktiivisuus yksikössä PU/ml).

9 * * ' 99 « * 9 9 9 9 999 9 9 »•e • e 999 9 999 99 9 9 9 9 9 * 9 · 9i 1 1 7202 pH 2, 5 happaman fosfataasin transformaatiovektorin geenisek-vensseihin liittyen näillä kolmella kannalla toteutetuista samankaltaisista Southern- ja Northern-blot analyyseistä saadut tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 16. Tuloksista nähdään, että GAX-7-transformantti, johon pPHO-3-konstrukti on integroitunut, sisälsi yhden ylimääräisen kopion pH2,5 happamasta fosfataasista (ainoana integraatiotapahtumana); kun taas GAX-11- ja -12-transformantit, joihin pPHO-4A-konstrukti on integroitunut, sisälsivät ylimääräisiä kopioita (tandem-integroinnin seurauksena; kuvio ISA). pH2,5 happaman fosfataasin lähettitasot olivat suurentuneet 2, 7-kertaisiksi (ALK0243-kannassa todettuihin tasoihin nähden) transformantissa GAX-7 j a 10-kertaiseksi j a 15-kertaiseksi vastaavasti trans forman-teissa GAX-11 ja GAX-12 (kuvio 18B; taulukko 16). Vain yhdellä pH2, 5 happaman fosfataasin geenillä transformoiduilla kannoilla saatiin (edellä oleva esimerkki 4), suuremmat kopioluvut transformointivektoriplasmidien integroinnissa kuin fytaasivektoreilla, mutta pH2,5 happaman fosfataasin lähettitasot eivät olleet vastaavasti niin korkeita kuin ne tasot, joita todettiin fytaaasivektoreiden tapauksessa (alla oleva taulukko 16).

KUVIO 18A esittää Southern-analyysiä pH2, 5 hapanta fosfataasia ,···. vastaavien sekvenssien DNA-kopioluvuista kahdella geenillä ♦ transformoiduissa GAX-kannoissa. Kaikki näytteet pilkottiin ”.ll entsyymillä Sali, käsiteltiin elektroforeettisesti, siirret-/·· tiin nitroselluloosalle ja tutkittiin käyttämällä koettimina < t 4 ·”· pH2,5 happaman fosfataasin geeniä, joka oli eristetty pAP-3-kappaleista (esimerkki 3, edellä). Ura 1, pPHO-3-plasmidista saatu DNA-kontrolli, joka on Sali-pilkottu. Ura 2. pPHO-4A-plasmidista saatu DNA-kontrolli, joka on Sali-pilkottu. Ura 3. Trans f ormoijnattoinasta ALK0243-kannasta saatu DNA-kontrolli.

; .· Ura 4. GAX-7 DNA. Ura 5. GAX-11 DNA. Ura 6. GAX-12 DNA.

te» - e 9 9 M 117202 KUVIO 18B esittää Northern-analyysiä pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaavan lähetin ilmentymisen mRNA-tasöistä kahdella entsyymillä transformoiduissa kannoissa. pH2, 5 hapanta fosfataasia vastaava RNA-kopio on merkitty nuolella. Ura 1, trans formoi-mattomasta ALK0243-kannasta saatu kontrolli-RNA. Ura 2. GAX-7 RNA. Ura 3. GAX-11 RNA. Ura 4. GAX-12 RNA.

999 • · 9 • e* ♦ e

««I

• I* e ···♦

Iti >99 • t f 4 « • 9 ' ·*♦ · e # • 9 ' 9 9 9 • · • « • · f·· • ta • · t · e • · ^ • e a • · ♦ 9 9 999 9 9 999 a 9 999 9 9 999 M * • * • t 117202 93

Taulukko 16 pH2, 5 happaman fosfataasin kopioluvun, mRNA-tasojen ja entsyymiaktiivisuuden vertaaminen kaksoisentsyymitransformanteissa®·

Vektorin kopio- Akti i- Suure-

Kanta Plasmidi_luku18 mRNAq_visuus** neminen- ALK024 3 -- -- 1,0 1 5, 500 1,0 GAX-7 pPH03 (GAP, cir) 1 2, 7 112,100 20 GAX-11 pPH04A (GA, cir) 16 10, 3 280, 500 51 GAX-12 pPH04A (GA, cir) 16 16, 0 176, 000 32 A GAP - glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi-promoottori; GA = glukoamylaasipromoottori; cir - rengasmainen vektori; te Vektorikopioiden lkm; katso edellä oleva taulukko 15; ° mRNA lähetti-RNA: n monistumistasot (kuinka moninkertainen ALK0243-kannan tasoihin verrattuna); ** Aktiivisuus = pH2, 5 happaman fosfataasin aktiivisuus yksikössä HFU/ml, mitaten ravistelupulloviljely edellä taulukossa 10 kuvatulla tavalla; * Suureneminen esittää sitä, kuinka moninkertainen happaman fosfataasin aktiivisuus (HFU/ml) on ravistelupulloviljelyssä verrattuna ALK0243-kannalla saavutettuun aktiivisuuteen ravistelupullovil j elyssä (siis transformant!n aktiivisuus yksikössä HFU/ml / ALK0243-kannan aktiivisuus yksikössä HFU/ml).

Materiaalit la menetelmät: Tässä käytetyt materiaalit ja menetelmät olivat samat kuin *·’: edellä (katso esimerkki 4).

«·«

»•I

Esimerkki 6

Fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin yli-ilmentymistasojen * .'*1 säätäminen kaksois trans formanteis s a • # ♦ · -e·· ♦ « a * * ; **’ Kuten edellä esimerkeissä 2-5 on kuvattu, fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin saantojen suureneminen teollisesti merkittävällä tavalla saavutetaan transformoimalla Aspergillus ni-ger-kanta (ALK02268) transformaatiovektorikonstrukteilla ja ; ;* selektoimalla ne transformantit, jotka yli-ilmentävät toivot- :*·' tua, entsymaattisesti aktiivista proteiinia. Ravistelupullo-* •V fermentoinneissa fytaasisaannot suurenivat 2000-kertaisiksi * · ALK0243-kannalla saavutettuihin entsyymituotantotasoihin ver- * * < *··-β rattuna (esimerkki 4; taulukko 8, edellä), ja pH2, 5 happaman fosfataasin saanto suureni yli 100-kertaiseksi (esimerkki 4; ;*·*; taulukko 11, edellä). Näiden saantojen suurenemisen katsottiin • a i 94 117202 johtuvan monista tekijoista, joista tärkeimmät olivat suuren- tunut geeniannos sekä tehokkaiden vaihtoehtoisten promootorei-den käyttö (jotka promoottorit olivat GA, GAP, GAPDH ja [3-tubu-liinipromoottori, katso esimerkit 4 ja 5, edellä). Ilmentymis-tasoja sääteleviä tekijöitä tarkasteltiin edelleen.

Geeniannoksen vaikutus fytaasin ja happaman fosfataasin fer-mentointitasoihi n:

Edellä esimerkeissä 4 ja 5 esitetyt tulokset viittaavat siihen, että fytaasiproteiinin määrän suhteellisen voimakas suureneminen oli seurausta geenin kopioluvun ja mRNA-transkripti-tasojen suhteellisen vaatimattomasta suurenemisesta. Todetut geenin kopioiukujen suurenemiset vaihtelivat kolmesta viiteen ylimääräiseen kopioon fytaasia ylituottavissa kannoissa. Näissä kannoissa eli GAE-32, GAK-47, GAL-65, GAM-225 sekä GAO-248 geenin kopioluvun suureneminen johtui ilmeisesti rekombinantti-transformaatiovektoriplasmidi-DNA: n moninkertaisesta integroitumisesta eikä tandem-integroitumisesta. Kolme näistä viidestä kannasta eli GAL-65, GAM-225 ja GAO-268 oli transformoitu lineaarisilla DNA-fragmenteina, joiden tapauksessa tandem-järjestäytyminen saattaa olla epätodennäköisempää. Kuitenkin .<·, GAE-32 ja GAK-47 olivat transformoituneet rengasmaisilla vek-« * · torikonstrukteilla, jotka johtavat usein tandemin tavoin jär-j estyneisiin geeni kopioihin. Koska transforraantit valikoitiin »li ·;;; entsyymi mal j amäärityksessä fytaasi aktiivi s uuden perusteella m * (eikä Southern- blot analyysillä, kuten asianlaita on yleen- · : sä), niin niiden transformanttien, joissa fytaasia vastaavat * · · *m· : DNA-sekvenssit olivat integroituneet optimaalisiin sijaintikoh- tiin, suhteellinen esiintymistiheys oli todennäköisesti suurempi. Kromosomaalisen integraation kohdalla (kohdilla) on ilmeisesti tärkeä merkitys fytaasigeenin ilmentymisessä ja tällä : .*. seulontamenetelmällä saatiin valituiksi optimoidut trans for-• * # • · · e ( ··* mäntit* • « « I f ♦ « · • t * • Runsaasti tuottavissa fytaasitransformanteissa lähetti-RNA- * m · 5../ tasot olivat 7-13 kertaa suurempia kuin ALK02268-kannassa, kun .···. taas näillä soluilla aikaansaadut fermentointitasot olivat suu- n 9 ;.”Ie rentuneet 50-kertaisiksi.

• t • « 117202 95 pH2,5 happaman fosfataasin transformanteissa todettu kopioluku (taulukko 12 esimerkissä 4, taulukko 16 esimerkissä 5, edellä) oli suurempi kuin fytaasitransformanteissa (taulukko 9 esimerkissä 4 sekä taulukko 15 esimerkissä 5, edellä), mutta pH2,5 hapanta fosfataasia vastaavan lähetin määrä oli olennaisesti pienempi kuin fytaasitransformanteissa. pH2, 5 hapanta fosfataasia runsaasti ylituottavat kannat GAT-143, GAW-54, GAW-89, GAW-121 ja GAW-130 oli transformoitu vektoreilla, jotka sisälsivät lineaarista DNA: ta joko konstrukteista pPHO-3 tai pPHO-4A. Näissä transformanteissa todettiin 7-12 ylimääräistä geenikopiota (eli vektorigeenin kopiota), mutta lähettitasot olivat kasvaneet vain noin 3-7-kertaiseksi.

Lineaarisen ja rengasmaisen DNA: n vaikutukset transformanttien tiittereihin: Tässä yhteydessä arvioitiin lineaaristen DNA-transformaatio-vektorikonstruktien ja rengasmaisten vektorikonstruktien vaikutuksia fytaasientsyymin tuotantoon. Yleisesti, rengasmaisten konstruktien tapauksessa niiden transformanttien, jotka tuottivat enemmän fytaasientsyymiä, esiintymistiheys on suurempi <<e (kuvio 19), mutta transformanttien tuottamat suurimmat entsyy-» * « * mitasot olivat samankaltaisia lineaaristen ja rengasmaisten i * konstruktien tapauksessa. Esimerkiksi, rengasmaisella vekto-rilla pFF3 saatiin 8/24 (33 %) sellaisia fytaasitransformant- • * · ! teja, joilla saavutettiin yli 750 PU oleva entsyymi tuotannon ; taso. Konstruktin pFF3 lineaarisella vastineella eli konstruk-•V: tiliä pFF8 saatiin kaksi kertaa vähemmän transformantteja (eli m joilla päästiin fytaasituotannon samaan kynnystasoon), mutta valikoiduilla transformanteilla saavutettu suurin tuotantotaso oli verrattavissa pFF8-transformanteilla saavutettuun tasoon.

. e.(Kun lineaariset fregmentit puhdistettiin ja ligoitiin uudesti/ taan, niin runsaasti tuottavien transformanttien esiintymis-♦ * - *** etiheys ei kasvanut.

M I * · · • -Λ 9 :“*:KUVI0 19. Lineaarisen ja rengasmaisen DNA: n vaikutus 25 satun- ti» .'/naisesti valikoidun fytaasitransformantin tiitteriin. Käytettä- essä rengasmaista vektoria pFF3 33 %: 11a fytaasi trans f orman-♦ · · * t 117202 96 teista saavutettiin suurempi kuin 750 PNU oleva entsyymituotannon taso. Sen lineaaristen vastineiden eli muodosteen pFF8 tapauksessa saatiin kaksi kertaa vähemmän transformantteja, joilla saavutettiin kuitenkin entsyymituotannon sama kynnysarvo. PNU = normalisoitu fytaasiyksikkö.

Homeperäisten promoottoreiden vaikutukset tuotetiittereihin: Geenien ilmentymistaso Aspergillus-homeessa saattaa riippua erityisesti valitusta, A. niger-rihmasienestä peräisin olevasta promoottorista. Edellä esimerkeissä 4 ja 5 esitetyt tulokset tukevat sitä havaintoa, että fytaasi ja pH2, 5 hapan fosfa-taasi voidaan ilmentää erilaisilla A. niger-promoottoreilla (joista voidaan mainita esimerkiksi GA-, GAPDH- ja β-tubuliini-promoottori) sekä natiivista promoottorielementeistä, jotka sijaitsevat kulloinkin fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasien geenin 5' säätelyalueissa. Näistä tuloksista nähdään kuitenkin myös, että transformanteilla entsyymituotannossa saavutettu suurin taso on erilainen, kun ilmentymistä ohjaa eri promoottori; eli promoottorin valinta määräsi ilmentymistason. Fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin natiivit promoottorit olivat tehokkaita, mutta glukoamylaasi- (GA-) ja GAPDH-promoottorit olivat kuitenkin merkittävästi parempia. Kuviossa 20 on esitet-, V 9 * ty fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin tuotantotaso fermen- » * ’··;* tointiviljelmissä GA- ja GAPDH-promoottoreiden säätelyn alai-

»VI

suudessa.

• · 9 • * « ♦ * * : kuvio 20. Transformoivissa plasmideissa käytetyt erilaiset i : : homeperäiset promoottorit vaikuttivat A. niger-transformant-tien tuottaman fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin tasoon. Kymmenen trans formantin tuottamista entsyymitasoista (eli suurimmista tällä tietyllä promoottorilla saavutetuista tasoista) ; laskettiin keskiarvo. (Näissä laskelmissa ei käytetty kaksoi-* * s entsyymi trans formanteilla saatuja tuloksia. ) GAPDH = glyse-raldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi; GA = glukoamylaasi • « ψ m *

Alalla on kuvattu, että Aspergillus-laiista peräisin olevaa .·*·* glukoamylaasipromoottoria on käytetty useiden proteiinien .1" ilmentymisen voimistamiseen (Ullah et ai., 1987). Tämän GA-• * · • * • * 97 1 1 7202 promoottorin lisäksi GA-sekvenssi sisältää glukoamylaasin signaalipeptidin sekä propeptidin, joita on yritetty käyttää ilmentymisen voimistamiseen, kuten alalla on esitetty (Yamamoto et ai., 1970).

Jotta voitaisiin määrittää fytaasin signaalisekvenssin vaikutukset tuotettuihin fytaasitasoihin, fytaasigeenissä läsnäoleva signaalisekvenssi korvattiin (konstruktissa pFF-11) synteettisellä oligonukleotidillä, joka sisälsi homeperäisen glukoamylaasin oletetun signaalisekvenssin. Yllättäen, sen sijaan, että tuotetut entsyymitasot olisivat suurentuneet, tämän GA-signaalisekvenssin sisällyttäminen itse asiassa pienensi tuotettuja fytaasitasoja verrattuna niihin tuotantotasoihin, jotka saavutettiin fytaasin natiivin signaalisekvenssin (eli fytaasin natiivissa geenisekvenssissä) käsittävillä transfor-! mänteillä. Nämä tulokset osoittavat fytaasin signaalisekvens sin mahdollisen tärkeyden fytaasin tuotantotasojen maksimointia ajatellen.

Glukoamylaasipromoottorin säätelyn alaisuudessa olevien geenien ilmentymistä voidaan kiihottaa (indusoida) tärkkelyksen läsnäollessa. Jotta tällaisen kiihottamisen vaikutukset fy- i · i taasituotannon tasoihin saataisiin selvitetyiksi, eräitä i s pFF-4- ja pFF-9 glukoamylaasipromoottorin sisältäviä fytaasi-transformantteja viljeltiin alustalla, jota oli täydennetty 4 m %: 11a maissi tärkkelystä. Entsyymi tuotanto kas voi keskimäärin I * \ 1, 4-kertaiseksi viimeksimainituissa viljelmissä, vaikka tällai-:V: siä tuotantotasoja ei todettukaan kaikissa viljelmissä. Näissä indusoivissa olosuhteissa todetut suurimmat fytaasisaannot olivat 3240-3370 PNU. Nämä tulokset viittaavat siihen, että fytaasin tuottamiseen käytetyn fermentointialustan optimointi . .saattaa johtaa merkittävästi suurempiin entsyymisaantoihin.

• · ·* « • « v * * , Alalla on esitetty, että glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydro-ίgenaasi (GAPDH) -promoottori on konstitutiivinen promoottori, :"\joka saa aikaan heterologisen geenituotteen voimakasta ilmenty-y,/ mistä. Keksijät kloonasivat itsenäisesti glyseraldehydi-fos- e »e* M · • « » • v • « 98 117202 faatti-dehydrogenaasi-A-geenin (gpdA) A. niger-kannasta ATCC-1015, jotta saataisiin selville sen vaikutus kullonkin fytaa-sin ja pH2,5 happaman fosfataasin geenin ilmentymiseen trans-formaatiovektorikonstruktissa, joka on siirretty niger-kantaan ALK0243 tai ALK02268. Entsyymituotannon tasot niissä transformanteissa, jotka käsittivät fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin ilmentymistä ohjaavan GAPDH-promoottorin, olivat lähes samanlaiset kuin edellä glukoamylaasipromootttorin avulla saavutetut tasot (kuvio 20). Näin ollen GAPDH-promoottoriin ei ilmeisesti liity mitään ainutlaatuisia mahdollisuuksia entsyymituotannon suurentamiseksi. Syyt tähän erityiseen käyttäytymiseen ovat tällä hetkellä epäselvät; ilmentymisen tällainen vaihtelevuus ALK0243- ja ALK02268-kantojen välillä saattaa kuitenkin liittyä siihen, että ALK02268 on saatu mu-tanttina ALK0243-kannasta, ja tässä suhteessa ALK02268 tuottaa vain noin puolet ALK0243-emäkannan tuottaman pH2,5 happaman fosfataasin määrästä. Näin ollen on mahdollista, että ALK02268 on puutteellinen joidenkin pH2,5 happaman fosfataasin ilmentymiseen liittyvien rajoittavien tekijöiden suhteen. (Tällaista kannasta riippuvia eroja promoottorin ohjaamassa ilmentymisessä ei todettu minkään muun promoottorin tapauksessa. ) ·«» I « 4 *** * Samoin alalla tiedetään, että 0-tubuliini-promoottori on sei-* * .·.* lainen promoottori, joka kykenee saamaan aikaan geenien kons- e .AY titutiivista ilmenemistä. Jotta saataisiin määritetyksi sen **« mahdolliset vaikutukset fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin \A\ 9eenin ilmentymiseen, tämä 0-tubuliinipromoottori eristettiin •V; A. niger-kannasta 1015. Tämä promoottori vietiin transformaa-* tiovektoreihin, jotta saataisiin selville sen vaikutukset fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin tuotantoon. Keksijöiden aikaisemmat tutkimukset viittasivat siihen, että homologisten . ^ homeperäisten geenien ilmentymistä voidaan voimistaa käyttä-mällä ilmentymisen ohjaamiseen 3 -tubuliini promoottori a, ja • ♦ * **'%tämä voimistuminen on olennaisesti suurempaa kuin' GAPDH- tai :***: GA-promoottoria (Panlabs, julkaisematon) käyttäen saavutettu ;***;ilmentymisen voimistuminen. Valitettavasti kuitenkin β-tubu-.1/liinipromoottorin sisällyttäminen fytaasia vastaavaan trans- • f e·· ·· · t * * • * • * i 117202 99 formaatiovektorikonstruktioon itse asiassa heikensi entsyymi-tuotantoa; ja pH2,5 happaman fosfataasin tapauksessa todettiin vain vähäistä tuotannon suurenemista verrattuna natiivin promoottorin välittämään tuotantoon (kuvio 20).

Mahdollisena pidettiin samoin sitä, että rekombinanttifytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin tuotanto voisi reagoida fosfaat-tivälitteiselle transkription repressiolle. Tässä tapauksessa entsyymituotantoa pitäisi voida suurentaa poistamalla tällaiset olosuhteet fermentointiviljelmästä. Tätä fosfaattivälitteistä repressiota tuki se havainto, että sekä ALK0243-kannan että ALK02268-kannan solut eivät tuottaneet ilmaistavia fytaa-simääriä, kun fermentointiviljelmän alustaan lisättiin ylimäärin fosfaattia. Tätä mahdollisuutta tarkasteltiin edelleen vertaamalla vaihtoehtoisia promoottoreita (eli GA, GAPDH tai (3-tubuliini) käsittävien fytaasitransformanttien tuottamia entsyymitasoja fytaasin ja pH2,5 happaman fosfataasin natiivin promoottorin käsittävillä trans formaatiovektorikonstrukteilla saavutettuihin entsyymitasoihin, jotta voitaisiin todeta, hävittääkö tällaisen vaihtoehtoisen promoottorin käyttö oletetun fosfaattivälitteisen repression. Oli mielenkiintoista ,,, todeta, ettei fytaasituotantoa esiintynyt fytaasipromoottorin • ti eikä pH2,5 happaman fosfataasipromoottorin tapauksessa, kun * ’·«·' trans f ormantte j a kasvatettiin fosfaatin läsnäollessa, mikä ··»: tukee sitä käsitystä, ettei fosfaatti välitteistä repressiota ·1· ·...· voida välttää käyttämällä eri kromosomi kohtaan integroitunutta • · •e$ j natiivia promoottoria. Näitä vaihtoehtoisia promoottoreita ;V: arvioitaessa yksi β-tubuliinipromoottorin käsittävä trans for-mantti kykeni tuottamaan fytaasia fosfaatin läsnäollessa, mutta tällöin fytaasin tuotanto oli pienentynyt noin puoleen. Sitä vastoin GAPDH-promoottorin ja GA-promoottorin käsittävät . . transformantit eivät olleet millään tavalla herkkiä fosfaatti- » e · m ft ’tl, välitteiselle inhibit! oli e, ja niillä saavutettiin samansuurui-* 1 ’•’.nen fytaasi tuotanto sekä ylimääräisen fosfaatin'läsnäollessa ·· · •"/että sen puuttuessa. Niinpä nämä tulokset viittaavat siihen, :1’/että fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin geenien 5' säätelyni.’alueessa läsnäolevat säätelevät elementit voivat olla käyttö-• ft·· ·· · i t 1 · 117202 100 kelpoisia geeni-ilmentymisen fosfaattivälitteisen repression ohjaamiseksi, ja että siirtämällä vaihtoehtoisia promoottorei- I ta näiden geenien 5' -alueisiin saatetaan päästä eroon näistä luontasista säätelyrajoitteista ja päästä tuotannossa suurempiin saantoihin.

Nopeutta rajoittavien tekijöiden, liittyivätpä ne sitten energiaan tai erittymiseen, tunnistaminen saattaa edelleen parantaa fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin saantoa. Myös muilla tekijöillä, joista voidaan mainita alustan optimointi, pH2, 5 happaman fosfataasin parantuneet tai stabiloituneet geenin transkriptiotasot tai voimakkaiden tuottajien perinteinen mutageneesiseulonta, saattaa olla lisävaikutusta tuotteen saantoon. Suuremmat geeniannokset ja vaihtoehtoisten promoottorei den käyttö ovat suurentaneet dramaattisesti tuotannon saantoa luontaisiin promoottoreihin verrattuna ja niiden avulla on vältetty negatiiviset säätelyrajoitteet. Fytaasin ja pH2, 5 happaman fosfataasin geenien kloonaaminen ja uudestaanvieminen , on johtanut näiden entsyymien kaupallisesti merkittäviin tasoihin ajatellen käyttöä eläinrehujen lisäaineena. Tarkoituksenmukaisesti suunniteltua homologisen geenin yli-ilmentämistä ... voidaan käyttää myös muiden homeperäisten teollisten tuottei-* · 1 den saannon parantamiseen ja sen avulla saatetaan ehkä oppia * '·*· ymmärtämään paremmin heterologiseen ilmentämiseen tarvittavia * ,,!Γ mekanismeja.

««« f * » ·

IH

5 ί ί Materiaalit ia menetelmät: ;V. Tässä esimerkissä käytetyt materiaalit ja menetelmät ovat t samat kuin edellä esimerkissä 4.

Vaikka ohessa onkin kuvattu ja havainnollistettu keksinnön , ^ edullista suoritusmuotoa, niin kuitenkin on selvää, että kek-"I. sintöön voidaan tehdä erilaisia muutoksia sen hengestä ja f · % tavoitteista tällöin kuitenkaan poikkeamatta.

O i • * 9 ’ · »e * » · ♦ ♦ • tt « e • I· f f ··· ·· · • · · « · 117202 101

Viitteet

Ahma, EC. et ai., "The nucleotide sequence of the yeast PH05 gene: a putative precursor of repressive acid phosphatase contains a signal peptide." Nucleic Acids Res. 11:1657-1672, 1983.

Bajwa, W. et al., "Structural analysis of the two tandemly repeated acid phosphatase genes in yeast," Nucleic Acids Res. 11:7721-7739, 1983.

Elliot, S. et al., "Isolation and characterization of the structural gene for secreted acid phosphatase from Schizosaccharomyces pombe," J. Biol. Chem. 261:2936-2941, 1986.

Touati, E. etal., "The structure of the promoter and amino terminal region of pH2.5 acid phosphatase structural gene (appA) of E. colt a negative control of transcription mediated by cyclic AMP," Biochemie 69:215-221, 1987.

Han, Y.W., et al., "Phosphatase production by Aspergillus ficuum," Journal of Industrial Microbiology 1:295-301, 1987.

Himeno, M. et al., "Isolation and Sequencing of a cDNA Clone Encoding Acid Phosphatase in Rat Liver Lvsosomes," Biochem. Biophys. Res. Comm. 162:1044-1053, 1989.

Kalkkinen, N. et al. "A Gas-Puised-Liquid-Phase Sequencer Constructed From a Beckman ti, 8900 By Using Applied Biosystems Delivery and Cartridge Blocks," J. Prot. Chem. v : 7:242-243, 1988.

Ml # * ♦ .••Lloyd, A.T- et al., "Codon usage in Aspergillus nidulansf Mol Gen Genet 230:288-294, *>>» ,*•*,1991.

* »·· * * ;McAda, P.C. etal., "A Yeast Mitochondrial Chelator-Sensitive Protease That Processes * * j v Cytoplasmically Synthesized Protein Precursors,” Isolation from Yeast and Assay in Methods I in Enzymology 97:33 7-344, 1983.

Needleman, S.B. et al., "General Method Applicable to the Search for Similarities in the # Amino Acid Sequence of Two Proteins," J. Mol Biol 48:443-453, 1970.

♦ « * • * *

Ml - •.'•'Pohlmann, R. et al., EMBO Journal 7:2343-2350, 1988.

• * ·: * • ’Jfcambosek, J. et al., "Recombinant DNA in Filamentous Fungi: / Progress and Prospects," :’I*CRC Critical Reviews in Biotechnology 6:357-393, 1987, * » ’..Roiko, L. et al., Gene 89:223-229, 1990.

:v : .

117202 102

Sanger et al., Proc. Nat. Acad Set USA 74:5463-5467, 1977.

Shieh, T.R. et al,, "Regulation of the Formation of Acid Phosphatase by Inorganic Phosphate in Aspergillus ficuum'' Journal of Bacteriology 100:1161 -1165, 1969.

Shieh, T.R. et al., "Survey of Microorganisms for the Production of Extracellular Phytase," Appi Microbiol 6:1348-1351, 1968.

Standen, R., Nucleic A aids Res. 12:505-519, 1984.

Tailor, P. et al., Nucleic Acids Research 18:4921-4928, 1990.

Tilbum, J. et al., Gene 26:205-221, 1983.

Ullah, H.J. et al., "Cyclohexanedione Modification Of Arginine at the Active Site of Aspergillus ficuum Phytase," Biochemical and Biophysical Research Communications 178(1):45-53, 1991.

Ullah, H.J., '"Aspergillus ficuum Phytase: Partial Primary Structure, Substrate Selectivity, and Kinetic Characterization," Preparative Biochemistry 18(4):459-471, 1988.

Ullah, H.J., et al., "Purification, N-terminal Amino Acid Sequence and Characterization of pH2.5 optimum acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2) from Aspergillus ficuumPreparative Biochemistry, 17(4):397-422, 1987.

m ·

Yamamoto, K.R. et al., "Rapid Bacteriophage Sedimentation in the Presence of Polyethylene *;1 Glycol and its Application to Large-Scale Virus Purification," Virology 40:734-744, 1970.

4 «« 4 ’1·; Shieh and Ware, U.S. Patent No. 3,297,548.

:: I · 1 Nelson, T.S. et al., J. Nutrition 101:1289-1294, 1971.

1 Sandberg, A-S. et al., Journal of Nutrition 117:2061-2065, 1987.

» « t 4 -Ψ 4 ' ·»· - • 14 4 » v * · 4 • · • 4 4 4 4 • • 4 • 4 4 ·· •4 • 4 · • 4 1 • • 1

Claims (20)

103 117202

1. Transformoitu rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on rihmasienen solu, joka on transformoitu vähintään kahdella nukleiinihapposekvenssillä, joista toinen on fytaasia koodaava nukleiinihapposekvenssi SEQ. ID .NO. 18 tai entsymaattisesti aktiivista fytaasia koodaava nukleiinihapposekvenssi, joka kykenee hybridisoitumaan nukleiinihapposekvenssin SEQ. ID. NO. 18 kanssa ankarissa olosuhteissa, joissa pesuolosuhteet ovat 0,lx SSC, 68°C ja 2 tuntia, ja toinen on pH 2,5 hapanta fosfataasia koodaava nukleiinihapposekvenssi SEQ. ID. NO. 20 tai entsymaattisesti aktiivista hapanta fosfataasia koodava nukleiinihapposekvenssi, joka kykenee hybridisoitumaan nukleiinihapposekvenssin SEQ. ID. NO. 20 kanssa ankarissa olosuhteissa, joissa pesuolosuhteet ovat 0,1 x SSC, 68°C ja 2 tuntia, ja joka kykenee syntetisoimaan ja erittämään rekombinanttifytaasia ja rekombinantti-hapanta fosfataasia entsymaattisesti aktiivisena seoksena, jossa hapan fosfataasientsyymin ja fytaasientsyymin aktiivisuuksien suhde on noin 3:1 - 16:1 ja määrät ovat vähintään noin 2 kertaa suurempia kuin ne entsyymimäärät, joita A. niger var. awamori ALK0243 * 1 1 V 1 (ATCC 38854, IFO4033) solut syntetisoivat ja erittävät samoissa olosuhteissa. * · ·«· » • i

· *··: 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, • · /·;1 että transformoitu rekombinantti-isäntäsolu on Aspergillus-, Trichoderma-, Penicillium-, « « « • 1 · , ·;;/ Cephalosporium-, tai Rhizopus-$o\u, • · 1 • · ♦ ♦ .

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, 9. ft • · · että transformoitu rekombinantti-isäntäsolu on Aspergillus-solu. « 1 9··

4, Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, • 1 ·;·1 että transformoitu rekombinantti-isäntäsolu on Aspergillus niger-solu. ··· • · * · 104 117202

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että transformoitu rekombinantti-isäntäsolu on Aspergillus niger var. awamori-solu.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu kykenee syntetisoimaan ja erittämään sekä rekombinanttifytaasia että rekombinantti-hapanta fosfataasia seoksena, jossa erittyneen fytaasientsyymin aktiivisuus millilitrassa on vähintään noin 2 kertaa suurempi kuin ALK0243-kannan (ATCC 38854, IFO4033) erittämä fytaasientsyymin aktiivisuus ja erittyneen happaman fosfataasientsyymin aktiivisuus millilitrassa on vähintään noin 10 kertaa suurempi kuin ALK0243-kannan (ATCC 38854, IFO4033) erittämä hapan fosfataasientsyymin aktiivisuus.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että erittyneen hapan fosfataasientsyymin aktiivisuus millilitrassa on vähintään noin 3-16 kertaa suurempi kuin erittyneen fytaasientsyymin aktiivisuus, ja seos tietyssä pH:ssa ja lämpötilassa kykenee hajottamaan fytaatin nopeasti, tehokkaasti ja täydellisesti vapaaksi inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi,

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu on transformoitu vähintään kahdella nukleiinihapolla, joista toinen koodaa happamissa *·* * fosfataaseissa esiintyvän konservoidun peptidialueen polypeptidin, jonka «f· • * *··-* aminohapposekvenssi on RHGXRXP, missä R on arginiini, H on histidiini, G on glysiini, Mt *··; X on mikä tahansa aminohappo ja P on proliini. • * • ♦ • · | » I :;i#:

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se erittää vähintään kahta • · · • · · * fytaattia hajottavaa rekombinanttientsyymiä, joista toinen on pH 2,5 hapan . fosfataasipolypeptidi, jonka molekyylipaino on noin 52,000 - 53,000 daltonia laskettuna * ! « IV.' ennustetusta aminohapposekvenssistä. * «

10, Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se erittää vähintään kahta ’·; * * fytaattia hajottavaa rekombinanttientsyymiä, joista toinen on pH 2,5 hapan fosfataasi, joka * * # denaturoimattomissa olosuhteissa on tetrameerinen entsyymi, jonka isoelektrinen piste on * * 105 117202 noin 4,0 - 4,25, ja jonka monomeerin molekyylipaino denaturoivissa olosuhteissa on noin 66,000 daltonia SDS-PAGE-määrityksellä, ja noin 46,000 - 49,000 daltonia hiilihydraatin poistamisen jälkeen.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se erittää vähintään kahta fytaattia hajottavaa rekombinanttientsyymiä, joista toinen on pH 2,5 hapan fosfataasi, jonka näennäinen Km on noin 0,7 mM kun substraattina on Na-fytaatti ja 4 mM kun substraattina on para-nitrofenyyli-fosfaatti, pH-optimin ollessa 37 °C:ssa alueella noin pH 2,0-2,5.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu vähintään kahdella nukleiinihapolla, jotka sisältyvät yhteen tai useampaan vektorikonstruktiin, jotka sisältävät fytaasia ja hapanta fosfataasia koodaavien nukleiinihappojen lisäksi promoottorin ja valinnaisen selektiomarkkerin.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että promoottori on β-tubuliini-, GA-, GAPHD-, natiivi fytaasi- tai natiivi pH 2,5 hapan fosfataasipromoottori.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu sisältää * · i ainakin yhden fytaasia koodaavan vektorikonstruktin, joka on esitetty kuvioissa 10A, # · '·” 10B, 10C, 10D, 12 A, 12B, 12C tai 12D. e • · · 9

» < · • * • ♦ .**! 15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu sisältää i * · *11·* ainakin yhden pH 2,5 hapanta fosfataasia koodaavan vektorikonstruktin, joka on esitetty • · « kuvioissa 13A, 13B, 13Cja 13D.

• * * .···. 16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että vektorikonstrukti koodaa • « * . sekä fytaasia että pH 2,5 hapanta fosfataasia, ja on esitetty kuvioissa 14A tai 14B. • a

« · « *** 17, Patenttivaatimuksen 1 mukaisen isäntäsolun käyttö sellaisen entsymaattisesti aktiivisen * * * *··· entsyymiseoksen valmistamiseksi, joka sisältää kasvualustaan syntetisoituneena ja * * 106 117202 erittyneenä sekä rekombinanttifytaasia että rekombinantti-hapanta fosfataasia määrinä, jotka ovat vähintään noin 2 kertaa suurempia kuin ne entsyymimäärät, joita A. niger var. awamori ALK0243 (ATCC 38854, IFO4033) solut syntetisoivat ja erittävät samoissa olosuhteissa.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsymaattisesti aktiivinen seos sisältää kasvualustaan syntetisoituna ja erittyneenä sekä rekombinanttifytaasia että rekombinantti-hapanta fosfataasia ja fytaasientsyymin aktiivisuus millilitrassa on vähintään noin 2 kertaa suurempi kuin ALK0243-kannan (ATCC 38854, IFO4033), ja happaman fosfataasientsyymin aktiivisuus millilitrassa on vähintään noin 10 kertaa suurempi kuin ALK0243-kannan (ATCC 38854, IFO4033) erittämä hapan fosfataasientsyymin aktiivisuus.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsymaattisesti aktiivinen seos sisältää kasvualustaan syntetisoituna ja erittyneenä rekombinanttifytaasia ja rekombinantti-hapanta fosfataasia, jolloin hapan fosfataasientsyymin aktiivisuuden ja fytaasientsyymin aktiivisuuden suhde on noin 3:1 - 16:1 ja erittyneen happaman fosfataasientsyymin aktiivisuus millilitrassa on vähintään noin 3-16 kertaa s uurempi kuin erittyneen fytaasientsyymin aktiivisuus. • 1 ϊ * ·«« J « "l

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, entsymaattisesti aktiivisessa 'HI seoksessa kasvualustaan syntetisoidun ja erittyneen rekombinanttifytaasin ja * 1 .1'! rekombinantti-hapan fosfataasin aktiivisuuden suhde on rehun laatua parantava. • i · *•4 1 ·♦· ♦ · · ♦ · · • ♦ · • · · ··· M· • · • · • ·· • · • M • · • · »M * IM • « • ♦ ·»· 107 117202