KR20150032440A

KR20150032440A - 식물에서 tev 프로테아제를 대량생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 tev 프로테아제

Info

Publication number: KR20150032440A
Application number: KR20130112138A
Authority: KR
Inventors: 신윤지; 권태호; 양지애; 임성근
Original assignee: 재단법인 전주생물소재연구소; (주)엔비엠
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2015-03-26
Also published as: KR101536963B1

Abstract

본 발명은 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 담배식각바이러스 유래의 프로테아제를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 TEV 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 TEV 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자, 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 세제 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 담배식각바이러스 유래의 프로테아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 TEV 프로테아제 대량생산용 조성물을 제공한다.

Description

식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 TEV 프로테아제{Method for mass producing TEV protease in plant and TEV protease produced by the same}

본 발명은 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 TEV 프로테아제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 담배식각바이러스 유래의 프로테아제를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 TEV 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 TEV 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자, 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 세제 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 담배식각바이러스 유래의 프로테아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 TEV 프로테아제 대량생산용 조성물을 제공한다.

효소는 오래전부터 식품, 의약품 및 다양한 산업분야에서 유용하게 이용되고 있다. 산업적으로 활용되는 효소 중에서도 단백질 분해효소는 제빵, 치즈 등의 식품산업, 소화제 소염제 등의 의약품과 향장 및 세제를 만드는 등 여러 분야에서 상업적으로 중요한 역할을 하고 있다. 특히 기질의 특정부위를 인식해 절단하는 엔도펩티다제 (endopeptidase)의 경우 고부가치의 단백질 의약품 및 산업용 효소를 고순도로 분리정제 하는데 있어서 산업적으로 중요한 효소이다. 하지만 이러한 단백질분해효소는 세포 외부로 분비되어 단백질성 기질을 분해하는 특성으로 인하여 세포 내에서 매우 낮은 농도로 존재하고, 생산수율이 낮다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 생산된 효소의 활성을 증가시키거나 안정성을 높이는 연구가 활발히 진행중이다.

TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제는 27kDa의 TEV에 의해 만들어지는 NIa(Nuclear Inclusion a) 단백질로서 Xa 인자, 트롬빈이나 엔테로키나제보다 훨씬 더 특이적으로 ENLYFQG(S)를 인식해 Q와 G(S)사이를 절단하는 단백질 분해 효소이다. TEV 프로테아제는 생산하고자 하는 단백질의 C-말단이나 N-말단에 TEV 프로테아제의 인식 서열을 넣고 His-taq이나 GST를 융합시켜 재조합 단백질을 제조한다. 이렇게 만들어진 재조합 단백질은 taq의 친화력으로 단백질을 고순도로 분리정제한 후 융합시켜준 taq을 제거하기 위해 TEV 프로테아제를 처리한다. 현재 대부분의 TEV 프로테아제는 대장균 (E. coli )나 피키아 (Pichia )에서 생산되고 있고 식물에서는 아직까지 생산되지 않았다. 따라서 본 발명은 담배(Havana) 식물로부터 TEV 프로테아제를 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

한국공개특허 제2012-0096872호에서는 신규 진균 프로테아제 및 이의 용도가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0120764호에서는 신규한 단백질 분해효소 및 세제에 있어서의 사용이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 TEV 프로테아제에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 담배식각바이러스 유래의 프로테아제를 코딩하는 유전자를 분석하여 야생형의 담배식각바이러스 유래의 프로테아제를 코딩하는 유전자와 41%가 상이한 담배에서의 코돈 사용을 최적화한 유전자 서열을 설계하였고, 이를 포함하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터를 제조하여 담배에서 발현시킨 결과, TEV 프로테아제가 담배 식물에서 성공적으로 대량생산되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 세제 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제 대량생산용 조성물을 제공한다.

본 발명은 TEV 프로테아제 코딩 유전자를 포함하는 특정한 담배 형질전환용 재조합 벡터를 구성하고, 이를 담배에 형질전환시켜 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법을 제공한다. 그에 따라, 본 발명의 담배 형질전환용 재조합 벡터는 담배에 형질전환되어 TEV 프로테아제를 생산할 수 있고, 본 발명의 담배 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 담배에서 매우 간단한 공정을 통해 TEV 프로테아제를 대량으로 생산할 수 있으며 활성 또한 높다. 따라서, 본 발명은 TEV 프로테아제를 식물에서 대량생산할 수 있게 하므로 바이오 산업에 대단히 유용하다.

도 1은 오버랩 PCR 방법을 이용한 본 발명의 TEV 엔도펩티다제 유전자 합성을 나타낸 모식도이다
도 2에서 (A)는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 담배 형질전환용 재조합 벡터 구조를 나타낸 모식도이고, (B)는 pJKF48의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3은 PCR을 통해 수득된 재조합 담배 캘러스의 TEV 프로테아제 유전자를 탐지하기 위한 전기영동분석 결과이다.
도 4는 형질전환 담배에서 발현된 TEV 프로테아제 유전자에 대한 노던 블롯 분석 결과이다.
도 5는 노던 블롯으로 선발한 형질전환 담배로부터 종자를 확보하여 TEV 프로테아제를 발현하는 호모라인 (homoline)을 선발한 그림이다.
도 6은 웨스턴 블롯으로 TEV 프로테아제의 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 야생형 TEV 프로테아제 유전자와 최적화된 TEV 프로테아제 (Opt. TEV) 유전자의 서열을 대비한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터에서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자는 진뱅크 등록번호가 NP_734212인 것으로, 본 발명에서는 상기 유전자를 식물에서 발현시키기 위해 코돈 최적화를 통해 식물 발현용 유전자를 설계한 것으로, 바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (A. tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지 (phage), 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서 (enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 유전자의 식물로의 도입은 본 발명의 유전자를 포함하는 적합한 벡터를 사용하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 벡터를 식물 숙주세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있으며, 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체는 고구마, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두, 애기장대 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 담배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 균질화물(homogenate) 또는 상기 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

본 발명의 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 상기 형질전환 식물체에서 프로테아제를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 식물체의 균질화물은 상기 식물체를 균질화 버퍼를 이용하여 강하게 볼텍스하여 현탁한 후 원심분리하여 얻은 상층액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체 (cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔 및/또는 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 상기와 같은 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 전분 다당류를 촉매 가수분해하여 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 및 콘택트 렌즈 세정 용액을 비롯한 세제 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 균질화물(homogenate) 또는 상기 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 식물체에서 분리한 프로테아제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 특히, 본 발명의 식품 조성물은 제빵, 치즈 등의 식품 가공 단계에서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물체 또는 이의 균질화물(homogenate) 또는 상기 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨 (catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물 (rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해 효소, 피틴산 (phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제 (phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합 (α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제 (phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 가축 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은 새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 조성물을 포함하는 사료에 포함되는 본 발명의 TEV 프로테아제의 양은 특별히 한정되지 않으나, 가축의 소화관에서 장기간 잔존하면서 단백질 또는 단백질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제 대량생산용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환함으로써 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: TEV 프로테아제 코딩 유전자의 합성

진뱅크 (등록번호 NP_734212)의 TEV 프로테아제 유전자의 염기서열을 바탕으로 하고, 컴퓨터 분석을 통하여 TEV 프로테아제 유전자 mRNA의 안정성에 영향을 주는 염기서열을 분석하였다. 그리고 이를 바탕으로 TEV 프로테아제 유전자의 코돈 사용을 최적화하였다. 유전자 분석프로그램인 DNASIS 프로그램을 이용하여 TEV 프로테아제 유전자의 코돈 사용을 분석하고 담배(Havana) 코돈 사용과 비교하였다. TEV 프로테아제 유전자의 242개의 코돈 중에서 담배에서 낮은 빈도로 사용되고 있는 코돈은 100개로서 약 41%의 코돈이 담배의 코돈으로서는 부적절한 것으로 확인되었으며, 이러한 컴퓨터 분석 결과를 바탕으로 최적의 TEV 프로테아제 유전자의 염기서열(이하, TEV 프로테아제 유전자: Opt. TEV, 서열번호 1)을 설계하였다. 이와 같이 수득된 본 발명의 TEV 프로테아제 유전자와 야생 TEV 프로테아제 유전자의 유전자 서열을 비교한 결과는 도 7에 도시된 바와 같다. 도 7에서, 최적화한 서열, Opt. TEV의 TEV 프로테아제 유전자에서 야생 TEV 프로테아제 유전자와 상이한 부분은 붉은색으로 표기하였다. 이 결과를 바탕으로 작성된 염기서열을 Oligo 4.0 프로그램을 이용하여 최적의 프라이머를 설계하고 합성하였다(표 1). 그리고 도 1에서 도시된 바와 같은 오버랩 PCR을 사용하여 TEV 프로테아제 유전자를 합성하였다.

TEV 엔도펩티다아제 유전자 합성을 위한 프라이머 세트

NO	Name	Length	Sequence (서열번호)
1	TEV(opt)Ｆ１	80mer	5'－GGAGAGAGCTTGTTCAAGGGACCAAGGGATTACAACCCAATTAGCTCCTCTATTTGCCATTTGACAAACGAGTCTGATGG－３＇(2)
2	TEV(opt)Ｆ２	80mer	５'－AAGCATTGGATTCAAACAAAGGATGGTCAATGTGGATCACCACTTGTGTCTACAAGAGATGGTTTTATCGTTGGTATTCA－３＇(3)
3	TEV(opt)Ｒ１	80mer	5'－AGATGCTTGTTGGTAATAATAAAAGGTCCGAATCCGATTCCGTACAGAGATGTGGTATGTCCATCAGACTCGTTTGTCAA－３＇(4)
4	TEV(opt)Ｒ２	80mer	５'－TTGACCTTGAACACACCATGCAAAGATTGCACGAGAAGTGTACCGTTATTTCTTCTGAACAGATGCTTGTTGGTAATAAT－３＇(5)
5	TEV(opt)Ｒ３	80mer	５'－ATTCTAATGATGATCATGTCTCTTCCATCAACAAGATGTTGTTGAAGTGTAGTTGTATCCTTGACCTTGAACACACCATG－３＇(6)
6	TEV(opt)Ｒ４	80mer	５'－TCTTCTCTTTGTGGCTCTCTGAATTTCAACTTCTGAGGAAAAGGTGGGAAATCCTTTGGCATTCTAATGATGATCATGTC－３＇(7)
7	TEV(opt)Ｒ５	80mer	５'－TCTGACACCATGCTAGACATAGACTTAGTTTGGAAGTTGGTTGTCACAAGGCAGATTCTCTCTTCTCTTTGTGGCTCTCT－３＇(8)
8	TEV(opt)Ｒ６	80mer	５'－TTTGTTTGAATCCAATGCTTCCAGAAGATACCATCAGATGAAGGGAATGTGCATGAAGTGTCTGACACCATGCTAGACAT－３＇(9)
9	TEV(opt)Ｒ７	80mer	５'－ATGAAGTTCTTTGGCACGCTTGTGAAGTAATTGTTTGTATTTGTGAAATTAGAAGCTGAATGAATACCAACGATAAAACC－３＇(10)
10	TEV(opt)Ｒ８	80mer	５'－TCAGCATTAAGTCTCCATCCAGAAACCCATTGTTGAGCCTCTTGATTTGTGAGCAGCTCCATGAAGTTCTTTGGCACGCT－３＇(11)
11	TEV(opt)Ｒ９	80mer	５'－GGTTGGAAAGGTTCCTCAGGCTTAACCATGAAAACCTTATGACCTCCCCACAACACTGAATCAGCATTAAGTCTCCATCC－３＇(12)
12	TEV(opt)R１０	72mer	５'－TCATCATTGAGAGTAAACCAACTCATTCATAAGTTGTGTAGCCTCCTTAACTGGTTGGAAAGGTTCCTCAGG－３＇(13)

실시예 2: 담배 형질전환용 재조합 벡터

실시예 1에서 합성한 TEV 프로테아제 코딩 유전자와 카나마이신에 내성을 나타내는 선발 마커인 카나마이신 포스포트랜스퍼라제를 포함하며, EI EI 35sΩ 프로모터와 3' UTR 터미네이터가 삽입되어(도 2A) 있는 식물발현 벡터 pBI121에 BamHI과 EcoRI 제한효소 자리를 이용하여 도입하여 도 2에 도시된 pJKF48(도 2B)를 수득하였다. 도 2B에서, EI EI 35sΩ은 프로모터, sTEV는 soluble TEV 프로테아제 유전자를, 3'UTR 는 3'비번역영역을, RB는 T-DNA 우측 보더(right border)를, Km은 카나마이신 포스포트랜스퍼라제를, LB는 T-DNA 좌측 보더(left border)를 각각 나타낸다.

실시예 3: TEV 엔도펩티다아제의 고생산 세포주의 확립

아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 통한 식물세포 형질전환은 TEV 유전자 발현벡터 (pJKF48)를 가진 아그로박테리아(토양균)을 사용하여 담배 잎에 형질전환을 수행하였다. 그리고 항생제 선발로부터 살아남은 캘러스는 키모트립신 유전자 도입 여부를 분자생물학적으로 확인하였다. TEV 유전자 발현벡터 (pJKF48)를 가진 아그로박테리아(토양균)를 2~3일간 암배양 후 수득하여 1ml의 MSO 액체 배지를 넣고 교반, 원심분리하여 상층액을 버리는 과정을 3번 반복하여 세포를 세척해 준 후 다시 MSO 액체 배지 1ml을 넣어 현탁하였다. 그리고 기내 배양한 담배(Havana) 잎을 따서 메스를 이용하여 적당한 크기(0.5mm x 0.5mm)로 잘라 준비하였다. MSO 액체 배지 약 20ml을 패트리디쉬에 붓고, 잎의 기공 면이 윗면을 향하도록 올려준 후 MSO 액체 배지 1ml에 현탁한 토양균을 넣고 15분간 감염시켰다. 새로운 패트리디쉬에 필터 페이퍼를 깔아 담배 잎을 닦은 후, 담배 잎을 건져 기공 면이 위로 향하도록 MS104 배지에 촘촘히 얹어 2일간 암배양을 하였다. 2일간 배양 뒤 MS 선별 배지에 잎을 올려 명배양을 해주었다. 25℃에서 2주 정도 키우며 관찰하고, 형질전환체가 나오기 시작하여 배지를 갈아 주었다. 슈팅 (shooting)된 형질전환체는 발근 배지에 옮겨주며, 포트 순화를 거쳐 종자를 얻게 되었다.

담배 배지 조성

MS media(100ml)
Reagents	MSO	MS104	MS selection 배지	rooting배지
MS salt	4.3 g/L	4.3 g/L	4.3 g/L	4.3 g/L
sucrose	30 g	30 g	30 g	30 g
plant agar	8 g	8 g	8 g	8 g
vitamin B5	1ml/L	1ml/L	1ml/L	1ml/L
BAP	.	1mg/L	1mg/L	.
NAA	.	0.1mg/L	0.1mg/L	.
cefotaxime	.	.	500mg/L	500mg/L
kanamycine	.	.	300mg/L	100mg/L

실시예 4: 토양균 아그로박테리움 튜머파시엔스를 이용하여 형질전환된 캘러스의 게놈 DNA 분석

항생제 선발로부터 살아남은 담배 캘러스는 pJKF48 발현벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스를 이용해 형질전환된 17개 세포주를 각각 확보하였다. 확보된 담배 세포주로부터 키모트립신 유전자 도입 여부를 분자생물학적으로 확인하기 위하여 각각의 MSR 배지에 배양하였다. pJKF48 (3Dsp/sTEV) 발현벡터의 형질전환 유무를 확인하기 위해 각각의 식물체로부터 담배 잎을 50 mg씩 각각 모아 액체 질소를 이용하여 균질화한 후 3Dsp(BamHI) F (5'- TTG GAT CCA TCA GTA GTG GTT AGC AGC ACC -3' : 서열번호 14)와 TEV(KpnI)R (5'-GGT ACC TCA TCA TTG AGA GTA AAC CAA CTC-3' : 서열번호 15) 프라이머를 사용하여 표 3의 PCR 조건으로 게놈 DNA PCR를 실시해 TEV 유전자(884bp)가 토양균을 통해 담배에 삽입되었는지 확인하였다.

95℃, 5분간	예비변성
95℃, 30초 변성	30 사이클
60℃ 30초 어닐링
72℃ 30초 연장
72℃ 3분	최종 연장
4℃	저장

pJKF48 (3Dsp/sTEV) 발현벡터를 토양균(Agrobacterium)을 통해 형질전환시킨 세포주 17개를 각각 게놈 DNA PCR한 후 아가로즈 겔로 분석하여 약 900bp에서 밴드를 확인하였다(도 3). 게놈 DNA PCR 결과 pJKF48(3Dsp/sTEV) 발현벡터를 토양균을 통해 형질전환시킨 경우 pJKF48 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a,10a, 11a, 12a, 13a, 14a, 15a, 16a와 17a 세포주 17개를 선발하였다.

실시예 5: 토양균 아그로박테리움 튜머파시엔스를 이용하여 형질전환된 담배의 노던 블럿 분석

토양균을 이용해 형질전환된 담배에서 TEV 유전자가 정상적으로 형질전환되어 mRNA가 합성되는지 조사하기 위해 노던 블럿 분석을 실시하였다. 담배 식물체를 배양 후 형질전환된 담배 잎을 1g씩 각각 모아 균질화한 후 전체 RNA를 추출(30 ㎍)하였다. 각각의 세포주의 RNA를 포름알데히드 겔에 로딩한 후 분석하고 NC 막에 붙인 후, α-32P-dCTP (동위원소)를 붙인 pJKF48 유전자를 프로브로 하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. pJKF48 발현벡터를 토양균을 통해 형질전환된 17개 세포주 중 게놈 DNA PCR를 통하여 17개 세포주를 선발하였고, 노던 블럿 분석을 통해 pJKF48 8a와 12a 세포주 2개를 선발하여 TEV 유전자의 단백질 발현 유무를 조사하기 위해 계대 유지 및 배양하였다(도 4).

실시예 6: TEV 프로테아제를 발현하는 담배( Havana )의 호모라인 ( homoline ) 선발

호모라인 선발을 위하여 수확한 종자를 항생제 저항성 선발 배지에 발아시켰다. EP 튜브에 종자 약 50 ㎕를 넣고 70% 에탄올 500 ㎕ 첨가하여 표면 소독한 후 1분간 원심분리하여 상층액은 버리고, 증류수로 세척하여 완전히 에탄올을 제거하였다. 세척된 종자에 1% 락스를 넣고 10분간 소독한 후 멸균 증류수로 3회 세척하고 1시간 정도 물에 담가 두었다가 표 4의 항생제 저항성 선발 배지에 발아시켰다. 이후 항생제 저항성 선발 배지에서 살아남은 개체를 선발하였다(도 5).

항생제 저항성 선발배지

항생제 저항성 선발배지
Reagents	1L 기준
MS salt	4.3 g
sucrose	30 g
plant agar	8 g
vitamin B5	1 ㎖
kanamycine	300ppm
pH	5.8

실시예 7: 담배( Havana )로부터 생산한 TEV 프로테아제의 활성을 측정하기 위한 웨스턴 블롯

호모라인을 선발한 후 pJKF48-8을 포트에 순화하여 배양하였다. 담배에서 발현한 TEV 프로테아제의 활성을 측정하기 위해 포트에서 순화중인 pJKF48-8 담배의 잎을 25g 따서 모은 후 액체질소를 이용하여 균질화하고, 담배잎 25g당 균질화 버퍼를 50㎖ 넣어 강하게 볼텍스하여 현탁하였다. 이후 8000rpm, 4℃, 30분 동안 원심분리해서 상층액만 취하였다. TEV 프로테아제의 활성을 측정하기 위해 표 5와 같이 반응액을 제조하였다.

TEV 프로테아제 활성을 측정하기 위한 반응액

	stock 농도	Working 농도	PC	TEV	단위
	stock 농도	Working 농도	TEV protease (Invitrogen)	pJKF48-8 sample	㎕
Substrate (EGFP-hFXa TEV-TNFa)	1.24 ㎍/㎕	1.24 ㎍/㎕	1	1	㎕
10X reaction buffer			4	4	㎕
TEV protease (Invitrogen)	1unit/㎕	1unit	1	-	㎕
Tobacco			-	80	㎕
DW	-	-	87.4	8.4	㎕
Final volume			100	100	㎕
10X reaction buffer : 250mM Tris-HCl(pH7.5), 750mM NaCl,10mM DTT, 5mM EDTA Positive control : AcTEV^TM protease (Invitrogen / cat. 12575-015)

12% 아크릴아마이드 겔에 각각의 샘플을 로딩한 후 웨스턴 블롯을 수행하여 TEV 프로테아제의 활성을 측정하였다. 1차 항체로 항-TNFa ascite fluid(전주생물소재연구소 제작)를 1:5000으로 첨가하여 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하고 2차 항체, 항-마우스 IgG(conjugated alkaline phosphatase, Sigma/Cat. A3562)를 1: 10,000의 비율로 첨가하여 반응시킨 후 NBT/BCIP로 발색하였다. 로딩 순서는 M은 사이즈 마커(PageRuler ^TM Protein Ladder Fermentas, MD, USA)이고, 레인 1은 양성 대조구로서 1 유닛의 AcTEV TM 프로테아제(Invitrogen, Cat No. 12575-015)를 사용하였다. 레인 2는 ㈜엔비엠의 TEV 프로테아제 기질 (EGFP-hFXa TEV-TNFa, 1.24 ug), 레인 3은 음성 대조구로서 TEV 프로테아제 코딩 유전자가 없는 pBI121 벡터가 형질전환된 담배(Havana) 잎을 25g 취하여 동일한 방법으로 균질화한 샘플이고, 레인 4는 pJKF48-8 샘플을 로딩하였다. 그 결과 PC와 레인 4의 pJKF48-8 샘플에서만 활성이 나와 TEV 프로테아제가 담배에서 정상적으로 발현되어 생산되는 것을 확인하였다(도 6).

<110> JEONJU BIOMATERIALS INSTITUTE NBM Co., Ltd <120> Method for mass producing TEV protease in plant and TEV protease produced by the same <130> PN13315 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease <400> 1 ggagagagct tgttcaaggg accaagggat tacaacccaa ttagctctac catttgccat 60 ttgacaaacg agtctgatgg acataccaca tctctgtacg gaatcggatt cggacctttt 120 attattacca acaagcatct gttcagaaga aataacggta cacttctcgt gcaatctttg 180 catggtgtgt tcaaggtcaa gaatacaact acacttcaac aacatcttat cgatggaaga 240 gacatgatca tcattagaat gccaaaggat ttcccacctt ttcctcagaa gttgaaattc 300 agagagccac aaagagaaga gagaatctgc cttgtgacaa ccaacttcca aactaagtct 360 atgtctagca tggtgtcaga cacttcatgc acattccctt catctgatgg tatcttctgg 420 aagcattgga ttcaaacaaa ggatggtcaa tgtggatcac cacttgtgtc tacaagagat 480 ggttttatcg ttggtattca ttcagcttct aatttcacaa atacaaacaa ttacttcaca 540 agcgtgccaa agaacttcat ggagctgctc acaaatcaag aggctcaaca atgggtttct 600 ggatggagac ttaatgctga ttcagtgttg tggggaggtc ataaggtttt catgagcaag 660 cctgaggaac cttttcaacc agttaaggag gctacacagc ttatgaatga gttggtttac 720 tctcaa 726 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggagagagct tgttcaaggg accaagggat tacaacccaa ttagctcctc tatttgccat 60 ttgacaaacg agtctgatgg 80 <210> 3 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aagcattgga ttcaaacaaa ggatggtcaa tgtggatcac cacttgtgtc tacaagagat 60 ggttttatcg ttggtattca 80 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agatgcttgt tggtaataat aaaaggtccg aatccgattc cgtacagaga tgtggtatgt 60 ccatcagact cgtttgtcaa 80 <210> 5 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgaccttga acacaccatg caaagattgc acgagaagtg taccgttatt tcttctgaac 60 agatgcttgt tggtaataat 80 <210> 6 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 attctaatga tgatcatgtc tcttccatca acaagatgtt gttgaagtgt agttgtatcc 60 ttgaccttga acacaccatg 80 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcttctcttt gtggctctct gaatttcaac ttctgaggaa aaggtgggaa atcctttggc 60 attctaatga tgatcatgtc 80 <210> 8 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tctgacacca tgctagacat agacttagtt tggaagttgg ttgtcacaag gcagattctc 60 tcttctcttt gtggctctct 80 <210> 9 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tttgtttgaa tccaatgctt ccagaagata ccatcagatg aagggaatgt gcatgaagtg 60 tctgacacca tgctagacat 80 <210> 10 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atgaagttct ttggcacgct tgtgaagtaa ttgtttgtat ttgtgaaatt agaagctgaa 60 tgaataccaa cgataaaacc 80 <210> 11 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcagcattaa gtctccatcc agaaacccat tgttgagcct cttgatttgt gagcagctcc 60 atgaagttct ttggcacgct 80 <210> 12 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggttggaaag gttcctcagg cttaaccatg aaaaccttat gacctcccca caacactgaa 60 tcagcattaa gtctccatcc 80 <210> 13 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcatcattga gagtaaacca actcattcat aagttgtgta gcctccttaa ctggttggaa 60 aggttcctca gg 72 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ttggatccat cagtagtggt tagcagcacc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggtacctcat cattgagagt aaaccaactc 30

Claims

담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 TEV 프로테아제 대량생산을 위한 식물 발현용 재조합 벡터.
제1항 또는 제2항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물에서 TEV 프로테아제를 대량생산하는 방법.
제1항 또는 제2항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항의 방법에 의해 제조된 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체.
제5항의 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제를 대량생산하는 형질전환 식물체의 종자.
제5항의 식물체의 균질화물(homogenate) 또는 제5항의 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 세제 조성물.
제5항의 식물체의 균질화물(homogenate) 또는 제5항의 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
제5항의 식물체 또는 이의 균질화물(homogenate) 또는 제5항의 식물체에서 분리한 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 사료 조성물.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래의 프로테아제(protease)를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 TEV(Tobacco etch virus) 프로테아제 대량생산용 조성물.