TWI759803B - 新穎絲胺酸蛋白酶變異體 - Google Patents
新穎絲胺酸蛋白酶變異體 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI759803B TWI759803B TW109125382A TW109125382A TWI759803B TW I759803 B TWI759803 B TW I759803B TW 109125382 A TW109125382 A TW 109125382A TW 109125382 A TW109125382 A TW 109125382A TW I759803 B TWI759803 B TW I759803B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- amino acid
- substituted
- serine protease
- seq
- serine
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21001—Chymotrypsin (3.4.21.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21014—Microbial serine proteases (3.4.21.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/04—Actinomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
本發明提供一新穎絲胺酸蛋白酶變異體。
Description
本發明係有關新穎絲胺酸蛋白酶變異體。
蛋白酶係涉及生物體(living organism)中的各種功能諸如消化、吸收及防禦,且根據活性部位的結構而被區分為絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天門冬胺酸蛋白酶以及金屬蛋白酶(metalloprotease)。在其等之中,絲胺酸蛋白酶(或是絲胺酸內肽酶(serine endopeptidases))為具有下列特徵的酵素(enzymes):通常在活性部位有將蛋白質中胜肽鍵切斷的一活性絲胺酸殘基(residue),其中絲胺酸作為在一蛋白酶之活性部位的親核胺基酸(Hedstrom,2002.Chem Rev 102:4501-4524)。
絲胺酸蛋白酶已被廣泛用於各種應用中。除了用以治療人類疾病之諸如血凝塊的溶解(lysis of blood clots)的治療應用,絲胺酸蛋白酶不僅作為衣物清潔劑以及隱形眼鏡清潔劑之組份,亦用於乳蛋白的改質、生絲精練(silk degumming)、皮革浸泡、去毛(unhairing)、寡肽類的合成、自肺部X射線底片回收銀、以及飼料及食物的生產及改良(韓國專利公開第10-2005-0068750號)等。然而,有需要研發具有經改善的熱穩定性、經增加之活性等的絲胺酸蛋白酶以獲得更高的工業成本效益及效率。
在這些情形下,本發明之發明人等已盡全力而研發出衍生自嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)的一絲胺酸蛋白酶的新穎變異體,且發現該
新穎絲胺酸蛋白酶變異體的活性遠比傳統的絲胺酸蛋白酶高得多,藉此完成本發明。
本發明的一目的係提供一絲胺酸蛋白酶變異體。
本發明的另一目的係提供編碼該絲胺酸蛋白酶變異體的多核苷酸以及包括其之載體。
本發明的再一目的係提供表現該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物。
本發明的再另一目的係提供包括該絲胺酸蛋白酶變異體及表現該絲胺酸蛋白酶變異體的該微生物之間的至少一者的飼料組成物。
以下將針對本發明進行詳細說明。同時,揭露於本發明中的各敘述及實施例在此可被應用於不同的敘述及實施例。換句話說,本發明中所揭露的各種組份的所有組合被包括於本發明的範圍內。再者,本發明的範圍不應被以下所提供的敘述所限制。
另外,所屬技術領域具有通常知識者可以在不使用多於常規之實驗內容之下認知或能夠確認對於本發明的具體實施例的許多均等實施方式。這些均等實施方式意欲被涵蓋於本發明中。
本發明的一個態樣提供一絲胺酸蛋白酶變異體。
如此處所使用的,「絲胺酸蛋白酶」之用語係指屬於蛋白酶的次群組且具有蛋白分解活性(proteolytic activity)的酵素。具體而言,該絲胺
酸蛋白酶可為藉由水解胜肽鍵而降解蛋白質且基本上在其活性位(active sites)具有活性絲胺酸殘基的酵素,且更具體而言,為具有組胺酸、天門冬胺酸及絲胺酸(此處可被稱為催化三元組(catalytic triad))之胺基酸殘基的空間排列(spatial arrangement)的酵素。
根據本發明之該絲胺酸蛋白酶可衍生自嗜高溫裂(Thermobifida)屬之微生物。特別是,在本發明中,該絲胺酸蛋白酶的野生種可為衍生自嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)的絲胺酸蛋白酶,具體而言,具有衍生自SEQ ID NO:40之胺基酸序列或是衍生自SEQ ID NO:2之胺基酸序列的多肽,且更具體而言,為包括如SEQ ID NO:31所述的胺基酸序列的多肽,但不限於此。SEQ ID NOS:2、31及40的胺基酸序列可自諸如生物資訊國家中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GenBank資料庫之已知資料庫獲得。
本發明之絲胺酸蛋白酶可具有任何具有與上述胺基酸序列相同活性的序列,而不受限制。另外,該絲胺酸蛋白酶可具有SEQ ID NO:31的胺基酸序列或是具有與該胺基酸序列80%同源性(homology)或與其相等(identity therewith)的胺基酸序列,且不限於此。具體而言,該絲胺酸蛋白酶可包括敘述於SEQ ID NO:31中之胺基酸或是具有與SEQ ID NO:31至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性的胺基酸,或與其相等的胺基酸。另外,顯見的是,只要一胺基酸序列具有上述同源性或相等性(identities)且具有與該絲胺酸蛋白酶同等之功效,任何具有包括刪去、修飾、取代或添加於該序列之部分中的該胺基酸序列之蛋白質皆落於本發明之範圍內。
換句話說,雖然本發明中使用「具有敘述於一預定SEQ ID NO:中之胺基酸序列的蛋白質或多肽」以及「包括敘述於一預定序列SEQ ID NO:
中之胺基酸序列的蛋白質或多肽」之表示方式,顯見的是,只要一蛋白質具有與由該對應之胺基酸序列所組成之多肽相同或相等活性,任何具有包括刪除、修飾、取代或添加於該序列中之部分的該胺基酸序列之蛋白質亦可被用於本發明中。例如,顯見的是「包括SEQ ID NO:31之胺基酸序列的多肽」屬於「由SEQ ID NO:31之胺基酸序列所組成的多肽」,只要前者具有與後者相同或相等的活性。
如此處所使用的,用語「同源性」或「相等性」係指兩個既定之胺基酸序列或核苷酸序列間的相關度(degree of relevance)且可以百分比表示。同源性與相等性之用語可彼此互換而使用。
保留(conserved)多核苷酸或多肽的序列同源性或相等性可由標準對位演算法(standard alignment algorithm)所決定,且藉由使用程式所建立的預設空位罰分(default gap penalties)可被一同使用。實質上,同源或相等序列可在中度或高度嚴密(stringent)條件下沿著整體序列的整體長度或至少約50%、60%、70%、80%或90%與彼此雜交(hybridize)。在經雜交的多核苷酸中,包括同義密碼子(degenerated codon)而不是密碼子的多核苷酸亦被考量。
在任何兩個既定之多核苷酸或多肽之間的序列同源性、相似性(similarity)或相等性可使用諸如「FASTA」程式之已知電腦演算法,運用由例如Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444]導入的預設參數而決定。或者是在歐洲分子生物開放軟體套件(European Molecular Biology Open Software Suite,EMBOSS)組合(Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0或更新之版本)之Needleman程式中執行的Needleman-Wunsch演算法(1970,J.Mol.Biol.48:443-453)可被用於決定上述同源性、相似性或相等性(包括GCG程式組合(Devereux,J.,et al,Nucleic Acids Research 12:387
(1984))、BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990);Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994,以及[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。舉例而言,該同源性、相似性或相等性可使用來自國家生物技術資訊中心資料庫(National Center for Biotechnology Information database)的BLAST,或ClustalW來決定。
多核苷酸或多肽之間的同源性、相似性或相等性可藉由使用GAP電腦程式比對序列資訊而決定,此種程式例如由Needleman et al.(1970,J Mol Biol.48:443)導入,於Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所敘述者。簡言之,該GAP程式將相似度界定為相似的經對齊之符號(亦即核苷酸或胺基酸)之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數。該GAP程式的預設參數可包括:(1)二進位比較矩陣(包含表示相同的數值1及表示不同的數值0)以及揭露於Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中的Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745之加權比較矩陣(或DNAFULL(NCBI NUC4.4之EMBOSS版本)取代矩陣);(2)對各空位(gap)之3.0的罰分(penalty)以及各空位中每個符號額外0.10的罰分(或是一個空位開啟10罰分,且一空位延伸0.5罰分);以及(3)對於終端空位無罰分。
另外,兩個既定之多核苷酸或多肽之間的序列同源性、相似性或相等性可藉由以南方雜交法(southern hybridization)於經界定之嚴密條件下比較其等的序列而確認,且經界定之適當的雜交條件是在本技術領域的範圍內且可由所屬技術領域具有通常知識者所熟知的方法決定。
本發明所提供的絲胺酸蛋白酶變異體可指其中特定位置之胺基酸被取代以在上述具有該絲胺酸蛋白酶活性的蛋白質中,具有相比於變異前之蛋白質超過100%的酵素活性的變異體。
如此處所使用的,「變異體」之用語係指由與所列舉之序列之胺基酸不同的至少一個胺基酸的保留取代(conservative substitution)及/或修飾所獲得的仍保留該蛋白質之功能或特性之一多肽。一變異體具有因數個胺基酸之取代、刪除或添加而與所辨識之序列不同的胺基酸序列。此種變異體一般可藉由修飾上述多肽序列之一者並評估經修飾之多肽的特性而辨認。即,相較於天然蛋白質(native protein),該變異體的能力可被增強、不變或縮減(diminished)。
除此之外,一些變異體可包括諸如一N端前導序列或跨膜區段(transmembrane domain)的其中至少一部分被移除的變異體。其他變異體可包括其中一部分自一成熟蛋白質之該N-及/或C-端移除或被添加至一成熟蛋白質之該N-及/或C-端的變異體。
該用語「變異體」亦可與其他用語為可互換使用的,諸如經修飾/突變(modified/mutate)蛋白質、修飾(modification)、經修飾之多肽、突變體(mutant)、突變蛋白質(mutein)及趨異體(divergent),且任何被用於表示變異體的用語亦可不受限地加以使用。
該變異體可具有相較於天然野生種或非經修飾蛋白質之經增強的活性,但不限於此。
如此處所使用的,該用語「保留取代(conservative substitution)」係指將一個胺基酸以具有相似結構及/或化學性質之不同的胺基酸取代。例如,該變異體在保有至少一個生物活性下具有至少一個保留取代。此種胺基酸取代一般可基於一殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親
水性及/或雙性本質而發生。例如,帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸;帶負電(酸性)胺基酸包括麩胺酸及天門冬胺酸;芳香族胺基酸包括苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸;且疏水性胺基酸包括丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸。另外,胺基酸可被分類為具有側鏈之帶電胺基酸與具有側鏈之不帶電胺基酸。具有側鏈之帶電胺基酸包括天門冬胺酸、谷胺酸、離胺酸、精胺酸及組胺酸,且具有側鏈之不帶電胺基酸被分類為非極性胺基酸或極性胺基酸。非極性胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及脯胺酸,且極性胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬胺酸及麩醯胺酸。一般而言,保留取代對於所製造的多肽的活性有很小的影響或沒有影響。
該變異體亦可包括對該多肽的特性及一次級結構具有最小影響之胺基酸的刪去或增加(deletion or addition)。舉例而言,該多肽可以與涉及蛋白質共轉譯(co-translational)或後轉譯(post-translationally)之轉化的蛋白質的N終端之訊號(或前導)序列共軛(conjugated)。該多肽亦可與用以辨識、純化或合成該多肽的一個不同序列或連接子(linker)共軛。
如此處所使用的,「絲胺酸蛋白變異體」之用語係指在具有該絲胺酸蛋白酶活性之多肽的胺基酸序列中包括至少一個胺基酸的取代之多肽。根據本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可包括其中對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列之自N端起算位置12及/或位置116的胺基酸各自以一不同的胺基酸取代的變異體。具體而言,該變異體可為其中對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列之自N端起算位置12的胺基酸或是位置116的胺基酸,或是位置12及116兩者的胺基酸各自以不同的胺基酸取代的蛋白質。該用語「不同的胺基
酸」意指與取代前之胺基酸不同的胺基酸,且與取代前之胺基酸不同的任何胺基酸可被使用而不受限制。
具體而言,根據本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可為其中於SEQ ID NO:31之胺基酸序列的位置12的苯丙胺酸是由甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、色胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸或蘇胺酸所取代;及/或位置116的天門冬醯胺是由甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸或蘇胺酸所取代,且不限制於此。
具體而言,該變異體可為其中對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列的位置12的胺基酸是由酪胺酸(Y)、絲胺酸(S)、丙胺酸(A)或精胺酸(R)取代;對應於該胺基酸序列的位置116的胺基酸是以天門冬胺酸(D)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、或甘胺酸(G)所取代,或其中對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列的位置12及116的胺基酸各自由酪胺酸(Y)及天門冬胺酸(D)、酪胺酸(Y)及絲胺酸(S)、絲胺酸(S)及天門冬胺酸(D)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T),或丙胺酸(A)及甘胺酸(G)所取代,但不限於此。顯見的是其中於SEQ ID NO:31之胺基酸序列位置12及/或116的胺基酸各自由一不同胺基酸所取代的該變異體包括其中對應於各該位置之胺基酸是分別由一不同胺基酸所取代的變異體。
另外,該變異體亦包括其中對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列之自N端起算第12(12th)及第116(116th)個位置上之胺基酸各自由敘述於胺基酸序列SEQ ID NO:31或是與該胺基酸序列SEQ ID NO:31具有至少
80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或相等性的胺基酸序列中的不同胺基酸所取代之變異體。
具體而言,在上述變異體中,其中對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列的第12及/或第116個胺基酸之位置的胺基酸各自由不同胺基酸所取代的變異體可由選自於SEQ ID NOs:32-39的胺基酸序列之任何胺基酸序列所組成,但不受限於此。這些變異體可為那些具有絲胺酸蛋白酶活性者,其中在對應於SEQ ID NO:31之胺基酸序列的第12及/或第116個位置的胺基酸各自由一不同的胺基酸所取代,且具有與SEQ ID NO:31的胺基酸序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%及少於100%之同源性。
本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可具有相較於修飾前之多肽、天然野生種多肽,或非改質多肽(但不受限於此)為經增強的活性。另外,顯見的是,任何具有具備經過刪除、改質、取代及添加於一胺基酸序列之一部分的該胺基酸序列的蛋白質係落於本發明的範圍中,只要該蛋白質具有上述同源性及與該絲胺酸蛋白酶等效的功效。
另外,顯見的是,除了提供一特定活性的第12及/或第116個胺基酸中之突變或在其對應位置之突變,在對應的SEQ ID NO之胺基酸序列的正向或反向中具有添加的序列,或是一天然發生的突變或一緘默突變(silence mutation)的任何變異體未被排除在本發明的範圍之外,只要該變異體具有與根據本發明之變異體相等或等效的活性。
同時,NCBI參考序列WP_016188200.1(SEQ ID NO:40)的一成熟區(mature region)對應於本發明的該SEQ ID NO:31之胺基酸序列,且自SEQ ID NO:40排除該訊號胜肽的序列對應於本發明之SEQ ID NO:2。
由上列敘述顯見的是本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可包括對於該絲胺酸蛋白酶的特性及次級結構具有最小影響的胺基酸之刪除或添加,
其中於對應於SEQ ID NO:31之第12及/或第116個胺基酸的位置之胺基酸各自由不同的胺基酸取代。另外,對於所屬技術領域具有通常知識者為顯見的是,透過在本領域中已知的序列比對(sequence alignment),根據本發明之SEQ ID NO:31的N終端起算第12及第116個位置對應於SEQ ID NO:40的第193及297個位置以及SEQ ID NO:2之第163及第267號位置,且SEQ ID NO:31是被包括於SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:2兩者中。
因此,對於各自包括SEQ ID NO:31之胺基酸序列的SEQ ID NOS:2及40的胺基酸序列,本發明的該絲胺酸蛋白酶變異體包括其中在對應於SEQ ID NO:31的第12及第116個胺基酸(SEQ ID NO:2之第163及/或267個胺基酸,以及SEQ ID NO:40之第193及/或297個胺基酸)的位置之胺基酸各自被取代的變異體。另外,以上對於SEQ ID NO:31及其第12及第116個胺基酸的敘述亦可適用於SEQ ID NO:2及其第163及267個胺基酸及SEQ ID NO:40及其第193及297個胺基酸。
根據一實施例,本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可為一變異體,其具有其中對應於SEQ ID NO:31之第12及/或116個位置的胺基酸各自以一不同胺基酸所取代,且具有與SEQ ID NO:2之該胺基酸序列至少80%且少於100%之同源性的胺基酸序列。根據另一實施例,本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可為其中SEQ ID NO:2之第163及/或267個胺基酸各自以一不同的胺基酸取代,且具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少80%且少於100%之同源性,以及具有與選自於SEQ ID NOS:3至10之胺基酸序列的任一胺基酸序列至少80%之同源性的變異體,但不限於此。
本發明的另一態樣提供編碼該絲胺酸蛋白酶變異體的一多核苷酸。
如此處所使用的,該用語「多核苷酸」係指其中核苷酸單體是藉由共價鍵而在長鍊形狀中彼此連接的核苷酸之聚合物,且通常是指具有一定最小長度的DNA或RNA股(DNA or RNA strand),且更具體而言,編碼該變異體的一多核苷酸片段。
編碼本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體的該多核苷酸可具有任何編碼根據本發明之具有增強活性的絲胺酸蛋白酶變異體的核苷酸序列而無限制。在本發明中,編碼一野生種絲胺酸蛋白酶的基因可衍生自嗜高溫屬(genus Thermobifida)的微生物,且特別是嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca),但不限於此。
基於密碼子的簡併性(Codon degeneracy)或是考量到其中多肽將被表現的生物體所偏好的密碼子,本發明之該多核苷酸可包括在該多肽的胺基酸序列中之編碼區中,在不改變該胺基酸序列之範圍內的各種修飾。具體而言,對其中對應於在SEQ ID NO:31自N終端起算第12及/或116個胺基酸的位置的該等胺基酸各自以不同的胺基酸所取代的變異體編碼的任何核苷酸序列可被包括於其中而無限制。
例如,本發明之該多核苷酸可為編碼本發明之該變異體的一多核苷酸序列,且具體而言,可為編碼由敘述於SEQ ID NOS:32至39的胺基酸序列之任一者所組成的多肽或與其具有同源性之多肽的多核苷酸序列,但不限於此。更具體而言,該多核苷酸可為由如敘述於選自SEQ ID NOS:41至48的任一SEQ ID NO之多核苷酸序列所組成者,但不限於此。另外,如上所述,由於本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體包括其中對應於SEQ ID NO:31之第12及/或116個胺基酸(SEQ ID NO:2中之第163及267個胺基酸,以及SEQ ID NO:40中之第193及/或297個胺基酸)的胺基酸各自被取代的該等變異體,其中SEQ ID NOS:2及40之胺基酸序列包括SEQ ID NO:31之胺基酸序
列,編碼該絲胺酸蛋白酶變異體的該多核苷酸序列亦在本發明的範圍內。例如,編碼該絲胺酸蛋白酶變異體的該多核苷酸序列可為編碼敘述於選自SEQ ID NOS:3至10的任一SEQ ID NO之一胺基酸序列的一者,且具體而言,可為由敘述於選自SEQ ID NOS:23至30之任一SEQ ID NO之多核苷酸序列所組成者,但不限於此。
另外,任何編碼具有該變異體之活性的蛋白質的序列可被包括而不受限制,其中在對應於SEQ ID NO:31之N終端起算第12及/或116個胺基酸的位置之胺基酸是通過以探子(probe)進行雜交而以不同的胺基酸取代,其可由已知基因序列(例如,與該核苷酸序列的全部或部分互補的序列)在嚴密條件下製備。
該用語「嚴密條件(stringent conditions)」係指允許多核苷酸之間特定雜交的條件。這些條件已詳細揭露於文獻中。例如,該等嚴密條件可包括在具有高度同源性,至少40%,特別是至少90%,更特別是至少95%,再更特別是至少97%,且最特別是至少99%同源性的基因之間進行雜交,而不是在具有低於上述同源性之同源性的基因之間進行雜交,或是在用於南方雜交法於60℃,1×SSC,及0.1% SDS,特別是在60℃,1×SSC,及0.1% SDS,且更特別是在68℃,0.1×SSC,及0.1% SDS的鹽類濃度及溫度下的傳統清洗條件進行清洗一次,特別是進行清洗兩次或三次。然而,嚴密條件並不限於此,但可由所屬技術領域具有通常知識者根據其等的目的而適當調整。
雜交需要兩個核苷酸具有互補的序列,雖然鹼基(bases)可以依據雜交的嚴密程度而不匹配(mismatch)。該用語「互補(complementary)」是用於敘述得以彼此雜交之核苷酸鹼基之間的關係。例如,在DNA的情形中,腺苷酸(adenosine)是與胸腺嘧啶(thymine)互補,
胞嘧啶(cytosine)是與鳥糞嘌呤(guanine)互補。因此,本發明可包括不只是實質上相似的多核苷酸序列,但也包括對該整個序列為互補之其分離的(isolated)多核苷酸片段。
具體而言,具有同源性的該多核苷酸可使用包括於55℃之Tm值下之雜交方法的上述雜交條件偵測。另外,該Tm值可為60℃、63℃,或65℃,但不限於此且可由所屬技術領域具有通常知識者依據其目的而適當調整。
對於多核苷酸之雜交的適當之嚴密程度可依據該等多核苷酸的長度與互補程度以及其等之參數而定,是所屬技術領域中所熟知的。
本發明的再另一個態樣提供包括編碼本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體的多核苷酸之載體。
此處所使用的用語「載體(vector)」係指一DNA構成(DNA construct),其包含目標蛋白編碼(protein-encoding)多核苷酸的核苷酸序列,該目標蛋白編碼多核苷酸係可操作地連結至合適的控制序列以能夠於合適的宿主細胞中表現該目標蛋白。該控制序列可包括能夠起始轉錄的啟動子(promoter)、任何用於調節該轉錄的操作序列(operator sequence)、編碼合適的mRNA核醣體結合位址的序列,以及用以調節轉錄及轉譯之終止的序列。一旦轉化成為合適的宿主細胞,該載體可無視該宿主基因組而複製或發生作用(function),或可整合至其基因組內。
如此處所使用的,「可操作地連結(operably linked)」之用語意指編碼本發明之該目標蛋白質的多核苷酸序列是功能性地連結至起始及調解(mediates)該多核苷酸之轉錄的啟動子序列(promoter sequence)。可操作的鏈結(operable linkage)可藉由本技術領域中已知的基因重組技術而製備,且特定位址之DNA切割及連接(site-specific DNA cleavage and ligation)
可以使用本技術領域中已知的限制酵素(restriction enzyme)、連接酶(ligase)等製備,但不限於此。
本發明中所使用的載體並未被特別限制,而可使用任何本技術領域中已知的載體。傳統載體的實例可包括質體(plasmid)、黏接質體(cosmid)、病毒及天然或重組狀態的噬菌體(bacteriophage)。舉例而言,pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A,及Charon21A可被用作為噬菌體載體(phage vector)或黏接質體載體,且基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET、pUB110等者可被用作為質體載體。具體而言,載體pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC,及pSM704等可被使用。可被用於本發明中的載體並未被特別限制,而任何已知的表現載體(expression vector)皆可被使用。
於一實施例中,編碼染色體中之目標變異體的該多核苷酸可使用用以進行染色體插入至細胞中的載體而以一突變多核苷酸取代。多核苷酸對該染色體的插入可藉由本領域中任何已知的方法進行,例如同源重組但不限於此。該載體可進一步包括一選擇標記(selection marker)以確認染色體插入。該選擇標記是用以選擇以該載體轉化的細胞,即,確認目標核酸分子是否被插入,且該選擇標記的實例可包括提供可選擇之表現型(selectable phenotypes),諸如抗藥性、營養缺陷性(auxotrophy)、對細胞毒性劑(cytotoxic agent)之抗性,或表面突變多肽之表現的標記。在其中選擇性試劑被處理的環境中,只有表現該選擇標記的細胞可以存活或顯現不同的表現型,且因此該等被轉化的細胞可被選擇。
本發明的再另一態樣提供表現本發明的該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物。
如此處所使用的,「將被表現/被表現/表現(to be expressed/being expressed/expressing)」一蛋白質之用語意指其中一目標蛋白被導入微生物中或是於微生物中被表現的狀態。基於本發明的目的,「目標蛋白質(target protein)」可為上述絲胺酸蛋白酶變異體。
具體而言,該用語「蛋白質的導入(introduction of a protein)」係指於一微生物中展現特定蛋白質的活性,而該微生物原先並未具有該蛋白質,或是展現該蛋白質之相較於該蛋白質的內生之活性或在改質前之活性的經增強之活性。舉例而言,蛋白質的導入係可指將編碼一特定蛋白質的多核苷酸導入微生物的染色體,或將包括該編碼特定蛋白質的多核苷酸的載體導入微生物中,藉此展現該蛋白質的活性。
表現該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物可包括本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體、編碼該變異體的多核苷酸,以及包括該多核苷酸的載體的其中至少一者。
具體而言,包括該絲胺酸蛋白酶變異體、編碼該變異體的多核苷酸,以及包括該多核苷酸的載體的其中至少一者的微生物可為藉由以包括編碼該變異體之多核苷酸的載體進行轉化而製備的微生物,但不限於此。
該微生物可為重組微生物,且該重組可藉由諸如轉化作用的基因改造(genetic modification)而達成。
如此處所使用的,「轉化作用(transformation)」之用語係指導入包括編碼目標蛋白之多核苷酸的載體至宿主細胞中,使得由該多核苷酸所編碼的蛋白質被表現於該宿主細胞中的方法。無論該經轉化的多核苷酸是呈插入宿主細胞之染色體中的形式,或呈位於染色體外的形式,只要該蛋白質是被表現於該宿主細胞中,兩種形式的經轉化的多核苷酸都在本發明的範圍內。另外,該多核苷酸包括編碼該目標蛋白的DNA及RNA。只要該多核苷
酸可被導入至該宿主細胞並於其中被表現,該多核苷酸可以任何形式被導入宿主細胞。舉例而言,該多核苷酸可以表現匣(expression cassette)的形式被導入至宿主細胞中,其是包括對於自我複製為必須的所有必要元素的基因建構(gene construct)。該表現匣一般可包括可操作地連結至該多核苷酸的啟動子、轉錄終止訊號、核醣體結合位置,以及轉譯終止信號。該表現匣可呈自我複製表現載體的形式。另外,該多核苷酸可以其原始形式被導入至宿主細胞並可操作地連結至對於宿主細胞中之表現所需的序列,但不限於此。用於轉化作用的方法包括用於將多核苷酸導入細胞中的任何方法且可藉由本領域中所熟知的合適標準技術進行。舉例而言,轉化方法包括電穿孔法(electroporation)、磷酸鈣(Ca(H2PO4)2,CaHPO4,或Ca3(PO4)2)沉澱法、氯化鈣(CaCl2)沉澱法、顯微注射法(microinjection)、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-聚葡萄糖法(DEAE-dextran method)、陽離子型脂質體方法、自然轉型作用(natural competence,例如,請參Perry and Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297),以及醋酸鋰-DMSO方法,但不限於此。
該重組微生物可為其中本發明之該絲胺酸蛋白酶的活性被增強的微生物。
該「活性增強」可意指相較於原生活性或改質之前的活性,微生物的特定蛋白質活性被增強。該用語「原生活性(endogenous activity)」係可指當微生物藉由因自然或人工因素所致之基因突變而被轉化時,在轉化作用之前,由微生物的母菌株所具有的特定蛋白質的活性。
具體而言,本發明中之蛋白質變異體的活性增強可藉由包括下列方法的至少一者所達成:增加編碼該蛋白質變異體的基因之細胞內拷貝數(intracellular copy number)的方法、導入突變至編碼該蛋白質變異體的基因之表現控制序列中的方法、以具有較強活性的序列取代編碼該蛋白質變異體
之基因的表現控制序列的方法、以編碼該蛋白質變異體之基因取代編碼具有該絲胺酸蛋白酶活性的野生種蛋白質的染色體基因的方法,以及進一步將突變導入編碼該蛋白質變異體的基因中以增強該蛋白質變異體的活性的方法,但不限於此。
接著,對該表現控制序列進行修飾以增加多核苷酸之表現可藉由透過刪除、插入、非保留取代、保留取代,或其等之組合而於該核酸序列中誘發突變,以進一步增強該表現控制序列的活性,或藉由以一具有較強活性之核酸序列取代該核酸序列而進行,但不限於此。該表現控制序列可包括啟動子、操作子序列、核醣體結合位編碼序列、用於調節轉錄及轉譯的序列等,但不限於此。
強的(strong)啟動子,而不是原生啟動子,可被連結於該多核苷酸表現單元的上游(upstream),但本發明不限於此。強的啟動子的實例可包括CJ1至CJ7啟動子(韓國專利第10-0620092號)、乳糖啟動子(lac promoter)、色胺酸啟動子(trp promoter)、trc啟動子(trc promoter)、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子(lambda phage PR promoter)、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL7啟動子、SPL13(sm3)啟動子(韓國專利第10-1783170號)、O2啟動子(韓國專利第10-1632642號)、tkt啟動子、yccA啟動子等,但不限於此。
另外,染色體上之多核苷酸序列的修飾可藉由透過刪除、插入、非保留取代、保留取代,或其等之組合而誘發該表現控制序列中的突變,以進一步增強該多核苷酸序列之活性,或藉由以一具有較強活性之核酸序列取代該核酸序列而進行,但不限於此。
一般而言,相較自野生種或未修飾之微生物菌株的活性或濃度,蛋白質活性的導入及增強可增加該蛋白質活性或濃度1%、10%、25%、
50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%,至最大值1,000%或2,000%,但不限於此。
根據本發明之宿主細胞或微生物可為藉由包括本發明之該多核苷酸或本發明之該載體而表現該絲胺酸蛋白酶變異體的任何微生物。具體而言,宿主細胞或微生物的範例可包括屬於艾氏菌屬(Escherichia)、鋸桿菌屬(Serratia)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacteria)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙氏桿菌屬(Salmonella)、鏈絲菌屬(Streptomyces)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium),或芽孢桿菌屬(Bacillus)等之微生物的菌株,具體而言,可為枯草桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、維爾茲芽孢桿菌(Bacillus velezensis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterum glutamicum)或米麴菌(Aspergillus oryzae)之菌株,且更具體而言,可為枯草桿菌之菌株,但不限於此。
本發明的再另一態樣提供一種飼料組成物,其包含本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體及表現該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物之間的至少一者。
被包括於本發明之該飼料組成物中的該絲胺酸蛋白酶變異體可以以下方式被包括於該飼料組成物中:表現該絲胺酸蛋白酶變異體的該微生物被包括於其中,或透過自表現該絲胺酸蛋白酶變異體之微生物分離且被純化的形式,但本發明不限制於此。
此處所使用的用語「飼料組成物」係指供動物食用、攝取及消化或是適合供其使用的任何天然或人工膳食(diet)、粉料(meal)等,或是
該粉料的組分的任何製備物,且該飼料可以本技術領域中已知的各種形式製備。
該飼料組成物可為一飼料添加物。
該飼料的種類並未被特別限制,且常用於本技術領域中的飼料可被使用。該飼料的非限制性實例可包括:蔬菜飼料,諸如穀物、根莖/水果、食物處理副產物、藻類、纖維、藥學副產物、油類及脂肪、澱粉、瓜果類及穀物副產物,及動物飼料,諸如蛋白質、無機材料、油類及脂肪、礦物質、單細胞蛋白質、動物骨骼,或食物。這些飼料可單獨使用或組合至少兩者使用。
本發明之該飼料組成物可進一步包括選自於下列的至少一者:有機酸,諸如檸檬酸、反丁烯二酸(fumaric acid)、己二酸(adipic acid)、乳酸及蘋果酸(malic acid);磷酸鹽,諸如磷酸鈉、磷酸鉀、酸式焦磷酸鹽(acid pyrophosphate)及多磷酸鹽(polyphosphate,聚合之磷酸鹽);及天然抗氧化劑,諸如多酚(polyphenol)、兒茶素(catechin)、α生殖酚(alpha-tocopherol)、迷迭香萃取物(rosemary extract)、維生素C、綠茶萃取物、甘草萃取(licorice root extract)、幾丁聚醣(chitosan)、單寧酸(tannic acid)及植酸(phytic acid)。
本發明之該飼料組成物可進一步包括選自於下列的至少一者:輔助物質(auxiliary substance),諸如胺基酸、礦物質、維生素、抗生素、抗菌物質、抗氧化物、抗真菌酵素,及呈不同益生菌形式的微生物製劑;穀物(例如,粉化或壓碎的小麥、燕麥、大麥、玉米及稻米);包括油菜、豆類及向日葵作為主要成分的蔬菜蛋白質飼料;動物蛋白質飼料,諸如血、肉、骨頭及魚類粉末;糖及乳製品(例如,由各種種類的乾燥乳品及乳清粉所形成的乾燥組分);脂質(例如,諸如藉由加熱而液化的任何動物脂肪及植物
油的活性成分);及諸如營養補給品、消化及吸收促進劑、生長促進劑及預防用藥劑的添加劑。
本發明之該飼料組成物可呈乾燥或液體製劑的形式,且可進一步包括用於飼料的賦形劑。該用於飼料的賦形劑可為例如沸石(zeolite)、玉米粉、米糠(rice bran)等,但不限制於此。
除了該絲胺酸蛋白酶變異體,本發明之該飼料組成物可進一步包括酵素製劑。例如,飼料組成物可進一步包括選自於諸如脂酶(lipase)的脂質降解酵素、植酸酶(phytase,其將植物酸降解為磷酸鹽及酸肌醇)、澱粉酶(amylase,其是催化澱粉、肝醣等中所包括的α-1,4-醣苷鍵之水解的酵素)、磷酸酶(phosphatase,其是催化有機磷酯之水解的酵素)、麥芽糖酶(maltase,其催化麥芽糖轉化為兩個葡萄糖分子),以及催化蔗糖水解成葡萄糖-果糖混合物的轉化酵素的至少一者。然而,本發明不限定於此。
本發明之該飼料組成物可單獨施用於動物或是與其他包括於可食用載體中的添加劑組合而施用於動物。另外,該飼料組成物可作為飼料添加劑或表面添加物(top dressing)而易於直接投用於牲畜飼料中或與飼料分離,或於分離的口服調配物中或與其他成分組合。另外,每日劑量可採用由本發明所屬技術領域中一般所週知的一次性每日劑量或分別多次(multiple-divided)每日劑量。
本發明之飼料組成物可應用的動物的實例可包括諸如肉牛(beef cattle)、奶牛(dairy cattle)、小牛(calves)、豬、小豬(piglets)、綿羊、山羊、馬、兔、犬及貓的家畜;以及諸如雛雞(chick)、母雞、人工飼養雞(domestic chicken)、公雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉(quails)及小型鳥類之禽鳥,但不限於此。
包括於本發明之飼料組成物中的該絲胺酸蛋白酶變異體的量未特別限制,且可根據其目的而適當調整。於一實施例中,如本發明所屬技術領域中一般所週知的,該絲胺酸蛋白酶變異體可被包括適當的量以降解蛋白質來源材料同時於牲口的消化道中存活長時間,但本發明不限於此。
本發明的再另一態樣提供包括本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體及表現該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物之間的至少一者的食物組成物。該絲胺酸蛋白酶變異體可被用於液態或固體食物組成物中。另外,該食物可為粉末、丸劑(pills)、飲品、茶,或用於一般食物的添加劑。
於一實施例中,該食物可為需要蛋白酶的食物之群組,諸如乳製品、用於改善腸胃蠕動及減重的健康機能食品,及用於預防高血壓的健康機能食品。
於另一實施例中,該絲胺酸蛋白酶變異體可作為食物溶解劑(food solubilizer)、食品軟化劑(food softening agent)及肉類修飾劑(meat modifier)而被包括於各種食物組成物中。於各種其他實施例中,該絲胺酸蛋白酶變異體可以在一步驟中被添加至烘焙混合物用以進行麩質網路的裂解。或者是,該絲胺酸蛋白酶變異體可被用於催化食物蛋白(例如奶類蛋白)的水解。或者是,該絲胺酸蛋白酶變異體可被包括於各種食物組成物中,以達到熬油(rendering)、製備調味劑、降低苦味、改變乳化特性、製造生物活性胜肽、降低蛋白質中導致過敏源之抗原的目的。然而,此僅為例示性的實施例,而該絲胺酸蛋白酶變異體的用途並不限於此。
包括於本發明之該食物組成物中的該絲胺酸蛋白酶變異體的量可由所屬技術領域具有通常知識者根據其目的而適當地調整。
本發明的再另一態樣提供包括本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體及表現該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物之間之至少一者的清潔劑組成物。
本發明之該清潔劑組成物可呈第一及第二水性清潔劑組成物、非水性液體清潔劑組成物、鑄造固體(cast solid)、顆粒(granules)、粒子(particles)、壓縮錠、膠體、糊劑或漿體的形式。該清潔劑組成物可被用於移除頑固的食物污漬、食物殘留膜,及其他小量的食物組成物。
根據本發明的清潔劑組成物可以用於清潔硬質表面的清潔劑組成物、用於清潔織物的清潔劑組成物、用於清洗碗盤的清潔劑組成物、用於清潔口腔的清潔劑組成物、用於清潔假牙的清潔劑組成物,或隱形眼鏡清潔溶液的形式被提供。然而,本發明不限制於此。
本發明的再另一態樣提供包括本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體及表現該絲胺酸蛋白酶變異體之微生物之間之至少一者的藥學組成物。
本發明之該藥學組成物可使用作為用於改良消化疾病(digestive diseases)、消化失調(digestive disorder),及消化手術後之異常的消化酵素的藥學組成物、直接施用於血凝塊以溶解纖維蛋白(fibrin)的溶血栓或抗血栓組成物、作為活體內防禦系統以移除發炎物質或壞死組織的抗發炎藥,或在手術或創傷後減輕浮腫(edema)的抗發炎藥。
根據使用方法或目的,該藥學組成物可進一步包括藥學可接受的載體(carrier)、賦形劑、稀釋劑、或輔助成分(accessory ingredient)。該載體、賦形劑或稀釋劑可包括選自於由下列所組成之群組的至少一者:乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇(erythritol)、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基丙基丙酯苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油、糊精、碳酸鈣、丙二醇、液體石蠟和鹽水,但不限於此。
除了上述目的,本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體或表現該絲胺酸蛋白酶變異體的微生物亦可被用於製造化妝品、處理皮革、製備藥品、製備診斷劑,及管理廢棄物、製備用於學術研究的化學品的目的。然而,該等目的為例示性地被敘述而該絲胺酸蛋白酶變異體亦可被用於變性(denaturing)、降解或移除蛋白質材料等本領域中已知的其他目的。
由於與傳統絲胺酸蛋白酶相比之增強的活性,以及在高溫下之活性及耐熱性,本發明的該絲胺酸蛋白酶變異體可被有效地用於各種工業領域中。
圖1為顯示衍生自嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)之絲胺酸蛋白酶變異體之三級結構中突變分別被導入的殘基位置。
此後,本發明將參照下列實例及實驗例而被更詳細地敘述。然而,這些實例及實驗例僅用於例示目的而非意欲限制本發明之範圍。
實例1.衍生自嗜高溫放線菌的絲胺酸蛋白酶變異體的選擇
實例1-1:製備衍生自嗜高溫放線菌的絲胺酸蛋白酶庫(Serine Protease Library)
隨機突變藉由易誤PCR(error-prone PCR)被導入編碼一對應於衍生自嗜高溫放線菌的絲胺酸蛋白酶的一成熟區段之胺基酸(SEQ ID NO:31)的基因。該易誤PCR是使用DiversifyTM PCR隨機突變套組(DiversifyTM
PCR Random Mutagenesis Kit,Clontech,Cat No.630703)而進行,且所使用的該PCR條件是描述於以下表1中。被確認的是該突變是以6.2突變/kb的頻率被導入。
於以上過程中所獲得的PCR片段各自使用In-FusionR HD複製套組(In-FusionR HD cloning kit,Clonetech)而接合(ligated)至使用顯示於
下表2中的引子所擴增的載體,並轉化成DH5α細胞以獲得菌落。所獲得之菌落中的質體被純化以獲得尺寸約5×104的蛋白酶庫。
實例1-2:篩分衍生自嗜高溫放線菌的絲胺酸蛋白酶庫
容易釋放蛋白質的枯草桿菌(Bacillus subtilis)LB700菌株以實例1-1中所製備的該蛋白酶庫轉化並被篩分(screened)。該篩分過程是藉由兩階段方法進行。在第一階段中,以該蛋白酶庫轉化的枯草桿菌菌株被放置於2%脫脂乳盤上,且所欲的菌落是基於暈圈尺寸(halo size)而被選擇。枯草桿菌的轉化是根據格羅寧根法(Groningen method)進行,而用於篩分過程的脫脂乳的組成顯示於下表3中。
(每1升(per 1L))
第二階段是關於藉由偶氮酪蛋白顯色法(azocasein color development)再次選擇(re-selecting)在第一階段已被選擇之菌落的方法。包含康黴素抗生素(kanamycin antibiotic)的腦心浸液(BHI,bd,Cat.No.53286)液體基質被添加至96孔深孔盤(96 deep well plate),且於第一階段中被選擇的該等菌落被接種於其中,接著在37℃下培養20至24小時。在培養後,包括一酵素的上澄液藉由離心而獲得,且該上澄液是與等量的2%(w/v)偶氮酪蛋白混合,作為基材,接著在37℃下反應1小時。該反應藉由添加3倍體積(3-fold volume)的10%三氯乙酸(TCA,trichloro acetic acid)至酵素反應溶液而終止,且凝固之蛋白質藉由離心移除。該顯色反應藉由將所得產物與等量的NaOH混合而進行,且接著吸收度於440nm下量測以比較顯色程度。經由此方法,與該野生種絲胺酸蛋白酶相比具有150%或更高的吸收增加之菌落被選擇。
實例2.經選擇之變異體的製備及活性評估
實例2-1:變異體的製備
基於分析由篩分而選擇之變異體序列的結果,經確認的是SEQ ID NO:31之第12個胺基酸(苯丙胺酸,Phe)及第116個胺基酸(天門冬胺酸,Asn)是分別以酪胺酸(Tyr)及天門冬胺酸鹽(Asp)取代。於圖1中,突變的位置被指出。在兩個被選擇之變異體(F12及N116)藉由基因定位突變(site directed mutagenesis)而以單突變的形式被再次導入pBE-S-TAP質體中後,具有雙突變及單突變的菌株的活性分別與該野生種菌株的活性進行比較。用於製備變異體的引子如下表4所示。
實例2-2:活性評估
在枯草桿菌LB700菌株以經製備的質體轉化後,該轉化體的活性評估使用N-SUCCINYL-ALA-ALA-PRO-PHE-P-NITROANILIDE(Sigma,cat#S7388,此後稱為SUC-AAPF-pNA)胜肽作為基材而進行。該經轉化的枯草桿菌菌株被接種至包含康黴素抗生素的腦心浸液(BHI,bd,Cat.No.53286)液體基質中並於37℃下培養20至24小時,且該培養溶液的一部分(細胞除外)與25mM Tris-HCL(pH 7.5)緩衝劑及1mM Suc-AAPF-pNA混合,接著在37℃下反應30分鐘。該反應溶液的吸收率於410nm下量測。已知於文獻中的由該酵素產生的4-硝基苯胺之消光係數在410nm下為8,800M-1 cm-1,且該酵素的單元(unit)是基於此計算(Barrett,A.J.,Cathepsin G.Methods Enzymol.,80,Pt.C,561-565,(1981))。所量測的活性顯示於下表5。
基於量測結果,經確認的是F12Y及F12YN116D變異體的活性在pH 7.5及37℃的條件下分別增加約2.1及3.9倍。
實例2-3:熱穩定性評估
由於熱穩定性為酵素之非常重要的特性,進行以下敘述的實驗以確認導入變異體對於熱穩定性的影響。
具體而言,用於實例2-2中以供活性評估的樣品之酵素活性在將該等樣品於室溫下、70℃下、80℃下及90℃下放置5分鐘後分別量測。所量測的活性顯示於下表6中。
基於量測結果,經確認的是相較於該野生種菌株,該F12Y及F12YN116D突變即使在80℃下,分別展現約2及4倍之更高的酵素活性。由於已確認的是本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體的高活性即使在高溫下也被維持,該絲胺酸蛋白酶變異體可有效地利用於產業中。
實例3.飽和突變庫(Saturation Mutagenesis Library)的製備及選擇
實例3-1.F12及N116殘基之飽和突變庫的製備
為了辨識以酪胺酸及天門冬胺酸鹽之外的殘基取代各該等殘基F12及N116(即,先前選擇的變異體)對於其活性的效應,飽和突變庫是針對該兩種殘基製備。
兩個PCR片段分別使用pBE-S-TAP質體作為模板以及使用SEQ ID NOS:11及12,以及SEQ ID NOS:13及14的引子對而獲得。該等片段各自使用該In-Fusion HD複製套組被接合,且接著轉化成DH5α細胞,藉此獲得菌落。在所獲得之菌落中的該等質體被純化以獲得具有尺寸為約4×103的飽和突變庫。
實例3-2:飽和突變庫的篩分及活性評估
於實例3-1中製備的飽和突變庫受到實例1-2中相同方式的篩分。具有相較於該F12YN116D變異體為相同或增加之活性的變異體藉由篩分被選擇,且藉由使用Suc-AAPF-pNA作為基材之序列分析而對此等變異體進行活性評估。
結果,發現F12及N116變異體即使在其等的殘基各自以除了實例2中所確認之酪胺酸及天門冬胺酸鹽之外的不同的胺基酸(例如,F12S、F12A、F12R、N116S、N116T、N116G等)取代時,其等的活性增加。
由以上結果確認的是,F12及N116殘基對於展現該絲胺酸蛋白酶之活性而言為重要的殘基,且該絲胺酸蛋白酶的酵素活性可藉由將這些殘基各自以不同胺基酸取代而增加。因此,具有經增加之酵素活性的本發明之該絲胺酸蛋白酶變異體可有效地使用於產業中。
由前述內容,本發明所屬技術領域具有通常知識者將能夠了解本發明可在不修改本發明之技術概念或是必要特徵之下以其他具體形式實施。就此點而言,本文揭露的示例性實施例僅用於說明目的,並且不應被解釋為限制本發明的範圍。相對地,本發明意欲涵蓋不僅是例示性實施例,而亦涵蓋可被包括於如所附之申請專利範圍所界定之本發明的精神及範圍內之各種替代方案、修改、等效內容及其他實施例。
<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CHEILJEDANG CORPORATION)
<120> 新穎絲胺酸蛋白酶變異體
<130> OPA20086
<150> KR 10-2019-0157400
<151> 2019-11-29
<160> 48
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 6922
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBE-S-TFP
<210> 2
<211> 338
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)
<210> 3
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163Y)
<210> 4
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163Y_N267D)
<210> 5
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163Y_N267S)
<210> 6
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163S_N267D)
<210> 7
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163S_N267T)
<210> 8
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163A_N267G)
<210> 9
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163A)
<210> 10
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163R)
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP_成熟區_F
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP_成熟區_R
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBE-S-載體-F
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBE-S-載體-R
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP_F12Y_F
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP_F12Y_R
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP_N116D_F
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP_N116D_R
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 飽和突變_F_1
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 飽和突變_R_1
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 飽和突變_F_2
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 飽和突變_R_2
<210> 23
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F12Y)
<210> 24
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163Y_N267D)
<210> 25
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163Y_N267S)
<210> 26
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163S_N267D)
<210> 27
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163S_N267T)
<210> 28
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163A_N267G)
<210> 29
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163A)
<210> 30
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)(F163R)
<210> 31
<211> 187
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區
<210> 32
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12Y)
<210> 33
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12Y_N116D)
<210> 34
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12Y_N116S)
<210> 35
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12S_N116D)
<210> 36
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12S_N116T)
<210> 37
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12A_N116G)
<210> 38
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12A)
<210> 39
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12R)
<210> 40
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌
<210> 41
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12Y)
<210> 42
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12Y_N116D)
<210> 43
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12Y_N116S)
<210> 44
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12S_N116D)
<210> 45
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12S_N116T)
<210> 46
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12A_N116G)
<210> 47
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12A)
<210> 48
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嗜高溫放線菌_成熟區(F12R)
Claims (14)
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其具有與SEQ ID NO:31之一胺基酸序列至少80%且少於100%的序列同源性,其中選自於SEQ ID NO:31之該胺基酸序列的對應於第12個位置的一胺基酸及對應於第116個位置的一胺基酸的至少一個胺基酸是以一不同的胺基酸所取代,其中(i)對應於第12個位置的該胺基酸是以酪胺酸(Y)所取代;且對應於第116個位置的該胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或絲胺酸(S)所取代;(ii)對應於第12個位置的該胺基酸是以絲胺酸(S)所取代;且對應於第116個位置的該胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或蘇胺酸(T)所取代;(iii)對應於第12個位置的該胺基酸是以丙胺酸(A)所取代;且對應於第116個位置的該胺基酸是以甘胺酸(G)所取代;或(iv)對應於第12個位置的該胺基酸是以酪胺酸(Y)、丙胺酸(A)或精胺酸(R)所取代。
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其中在SEQ ID NO:2之一胺基酸序列中,(i)對應於第163個位置的一胺基酸是以酪胺酸(Y)所取代;且對應於第267個位置的一胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或絲胺酸(S)所取代;(ii)對應於第163個位置的一胺基酸是以絲胺酸(S)所取代;且對應於第267個位置的一胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或蘇胺酸(T)所取代;(iii)對應於第163個位置的一胺基酸是以丙胺酸(A)所取代;且對應於第267個位置的一胺基酸是以甘胺酸(G)所取代;或(iv)對應於第163個位置的一胺基酸是以酪胺酸(Y)、丙胺酸(A),或精胺酸(R)所取代。
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其中在SEQ ID NO:40之一胺基酸序列中, (i)對應於第193個位置的一胺基酸是以酪胺酸(Y)所取代;且對應於第297個位置的一胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或絲胺酸(S)所取代;(ii)對應於第193個位置的一胺基酸是以絲胺酸(S)所取代;且對應於第297個位置的一胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或蘇胺酸(T)所取代;(iii)對應於第193個位置的一胺基酸是以丙胺酸(A)所取代;且對應於第297個位置的一胺基酸是以甘胺酸(G)所取代;或(iv)對應於第193個位置的一胺基酸是以酪胺酸(Y)、丙胺酸(A),或精胺酸(R)所取代。
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其中在SEQ ID NO:31之一胺基酸序列中,(i)對應於第12個位置的一胺基酸是以酪胺酸(Y)所取代;且對應於第116個位置的一胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或絲胺酸(S)所取代;(ii)對應於第12個位置的一胺基酸是以絲胺酸(S)所取代;且對應於第116個位置的一胺基酸是以天門冬胺酸鹽(D)或蘇胺酸(T)所取代;(iii)對應於第12個位置的一胺基酸是以丙胺酸(A)所取代;且對應於第116個位置的一胺基酸是以甘胺酸(G)所取代;或(iv)對應於第12個位置的一胺基酸是以酪胺酸(Y)、丙胺酸(A),或精胺酸(R)所取代。
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其具有與SEQ ID NO:31之一胺基酸序列至少80%且少於100%的序列同源性,其中SEQ ID NO:31之該胺基酸序列的對應於第12個位置的一胺基酸是以絲胺酸(S)所取代。
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其中SEQ ID NO:2之一胺基酸序列中對應於第163個位置之一胺基酸是以絲胺酸(S)所取代。
- 一種絲胺酸蛋白酶變異體,其中SEQ ID NO:40之一胺基酸序列中對應於第193個位置之一胺基酸是以絲胺酸(S)所取代。
- 如請求項1所述之絲胺酸蛋白酶變異體,其中該絲胺酸蛋白酶變異體包含敘述於選自於由SEQ ID NOS:3至10及SEQ ID NOS:32至39所組成之群組的任一者的胺基酸序列。
- 一種多核苷酸,其編碼如請求項1至8之任一項所述的絲胺酸蛋白酶變異體。
- 一種載體,其包含如請求項9所述之多核苷酸。
- 一種微生物,其表現如請求項1至8之任一項所述的絲胺酸蛋白酶變異體。
- 如請求項11所述之微生物,其中該微生物屬於芽孢桿菌(Bacillus)屬。
- 如請求項12所述之微生物,其中該微生物為枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
- 一種飼料組成物,其包含如請求項1至8之任一項所述之絲胺酸蛋白酶變異體及表現該絲胺酸蛋白酶變異體的一微生物之間的至少一者。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2019-0157400 | 2019-11-29 | ||
KR1020190157400A KR102316445B1 (ko) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 신규 세린 프로테아제 변이체 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202120527A TW202120527A (zh) | 2021-06-01 |
TWI759803B true TWI759803B (zh) | 2022-04-01 |
Family
ID=76128852
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW109125382A TWI759803B (zh) | 2019-11-29 | 2020-07-28 | 新穎絲胺酸蛋白酶變異體 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220411774A1 (zh) |
EP (1) | EP4053272A4 (zh) |
JP (2) | JP2023504807A (zh) |
KR (2) | KR102316445B1 (zh) |
CN (1) | CN114761552B (zh) |
CA (1) | CA3159396A1 (zh) |
TW (1) | TWI759803B (zh) |
WO (1) | WO2021107588A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102613549B1 (ko) * | 2021-03-12 | 2023-12-13 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 세린 프로테아제 변이체 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103421760A (zh) * | 2003-11-19 | 2013-12-04 | 金克克国际有限公司 | 丝氨酸蛋白酶、编码丝氨酸酶的核酸以及包含它们的载体和宿主细胞 |
WO2018118815A1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Methods of using thermostable serine proteases |
US20190032102A1 (en) * | 2014-12-01 | 2019-01-31 | Novozymes A/S | Method for Producing a Protein Hydrolysate |
US20190256799A1 (en) * | 2013-06-24 | 2019-08-22 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MA24811A1 (fr) * | 1997-10-23 | 1999-12-31 | Procter & Gamble | Compositions de lavage contenant des variantes de proteases multisubstituees |
US7985569B2 (en) * | 2003-11-19 | 2011-07-26 | Danisco Us Inc. | Cellulomonas 69B4 serine protease variants |
KR100534660B1 (ko) | 2003-12-30 | 2005-12-08 | 주식회사 해찬들 | 단백질 분해효소 생성량이 증가된 메주의 제조방법 및 된장 |
KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
CN103667323B (zh) * | 2007-03-12 | 2016-02-03 | 丹尼斯科美国公司 | 经修饰的蛋白酶 |
US20100192985A1 (en) * | 2008-11-11 | 2010-08-05 | Wolfgang Aehle | Compositions and methods comprising serine protease variants |
WO2014122161A2 (en) * | 2013-02-06 | 2014-08-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity |
KR101632642B1 (ko) | 2015-01-29 | 2016-06-22 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 프로모터 및 그의 용도 |
CA2995423A1 (en) * | 2015-09-25 | 2017-03-30 | Novozymes A/S | Use of serine proteases for improving ethanol yield |
WO2017219011A1 (en) * | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Danisco Us Inc | Protease variants and uses thereof |
CA3029479A1 (en) * | 2016-07-21 | 2018-01-25 | Novozymes A/S | Serine protease variants and polynucleotides encoding same |
EP3487996B1 (en) * | 2016-07-21 | 2024-04-10 | Novozymes A/S | Serine protease variants and polynucleotides encoding same |
JP6679803B2 (ja) | 2016-08-31 | 2020-04-15 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規プロモーター及びその用途 |
JP2019536879A (ja) * | 2016-12-01 | 2019-12-19 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 組成物中の酵素の安定化 |
-
2019
- 2019-11-29 KR KR1020190157400A patent/KR102316445B1/ko active IP Right Grant
-
2020
- 2020-07-28 TW TW109125382A patent/TWI759803B/zh active
- 2020-11-25 CA CA3159396A patent/CA3159396A1/en active Pending
- 2020-11-25 US US17/780,239 patent/US20220411774A1/en active Pending
- 2020-11-25 EP EP20894823.2A patent/EP4053272A4/en active Pending
- 2020-11-25 WO PCT/KR2020/016775 patent/WO2021107588A1/ko unknown
- 2020-11-25 CN CN202080082417.0A patent/CN114761552B/zh active Active
- 2020-11-25 JP JP2022531627A patent/JP2023504807A/ja active Pending
-
2021
- 2021-10-18 KR KR1020210138501A patent/KR102402604B1/ko active IP Right Grant
-
2024
- 2024-03-27 JP JP2024050755A patent/JP2024096719A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103421760A (zh) * | 2003-11-19 | 2013-12-04 | 金克克国际有限公司 | 丝氨酸蛋白酶、编码丝氨酸酶的核酸以及包含它们的载体和宿主细胞 |
US20190256799A1 (en) * | 2013-06-24 | 2019-08-22 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
US20190032102A1 (en) * | 2014-12-01 | 2019-01-31 | Novozymes A/S | Method for Producing a Protein Hydrolysate |
WO2018118815A1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Methods of using thermostable serine proteases |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20220411774A1 (en) | 2022-12-29 |
WO2021107588A1 (ko) | 2021-06-03 |
KR102402604B1 (ko) | 2022-05-26 |
KR20210128992A (ko) | 2021-10-27 |
TW202120527A (zh) | 2021-06-01 |
EP4053272A4 (en) | 2023-06-28 |
EP4053272A1 (en) | 2022-09-07 |
CA3159396A1 (en) | 2021-06-03 |
JP2023504807A (ja) | 2023-02-07 |
KR20210067600A (ko) | 2021-06-08 |
JP2024096719A (ja) | 2024-07-17 |
KR102316445B1 (ko) | 2021-10-26 |
CN114761552A (zh) | 2022-07-15 |
CN114761552B (zh) | 2024-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kumar et al. | β-Propeller phytases: diversity, catalytic attributes, current developments and potential biotechnological applications | |
TWI535385B (zh) | 具增進發酵豆粉之產率的桿菌屬菌株及使用該菌株製造發酵豆粉的方法 | |
JP3769289B2 (ja) | 新規蛋白質脱アミド酵素、それを生産する微生物、それをコードする遺伝子、その製造法及び用途 | |
ES2694765T3 (es) | Polipéptidos con actividad de proteasa | |
US10932481B2 (en) | Thermostable protease and methods of making and using the same | |
JP2024096719A (ja) | 新規セリンプロテアーゼ変異体 | |
WO2022244875A1 (ja) | 加工オート飲食品又は食品素材の製造方法 | |
JP6086614B2 (ja) | 生理活性分子の融合 | |
CN107208077A (zh) | 裂解镰孢毒素的多肽变体、包含所述多肽变体的添加剂和所述添加剂的用途,以及用于裂解镰孢毒素的方法 | |
CN108251405A (zh) | 复合酶和添加剂及它们的应用以及脱除真菌毒素的方法 | |
TW201504259A (zh) | 植酸酶 | |
KR20210149775A (ko) | 동물 사료 조성물에서의 산화환원 효소 | |
US20210120845A1 (en) | Method for producing a protein hydrolysate employing an aspergillus fumigatus tripeptidyl peptidase | |
EP4116416A1 (en) | Novel serine protease variant | |
KR20030036621A (ko) | 복합 혼합물 중의 갈락토스-함유 올리고사카라이드의 고온가수분해 방법 | |
CN107475222B (zh) | 基因工程改造的耐热人溶菌酶 | |
US20060127982A1 (en) | Development of an asporogenic bacillus licheniformis and production of keratinase therefrom | |
MX2007011479A (es) | Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican a los mismos. | |
KR101536963B1 (ko) | 식물에서 tev 프로테아제를 대량생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 tev 프로테아제 | |
JPWO2022191653A5 (zh) | ||
WO2022107885A1 (ja) | 耐熱性プロテイングルタミナーゼ | |
KR102010839B1 (ko) | 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제-kg01 유전자 및 이의 용도 | |
CN117529554A (zh) | 包含转谷氨酰胺酶的酶剂及其用途 | |
KR20220161225A (ko) | 점액질 생성능이 저감된 미생물 및 이를 이용한 대두 발효물 | |
KR20130068010A (ko) | 흑염소 반추위 미생물 유래의 셀룰라아제 유전자 cel-KG52 및 이의 용도 |