TWI535385B - 具增進發酵豆粉之產率的桿菌屬菌株及使用該菌株製造發酵豆粉的方法 - Google Patents

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Description

具增進發酵豆粉之產率的桿菌屬菌株及使用該菌株製造發酵豆粉的方法
本發明係關於具增進發酵豆粉之產率的新穎桿菌屬菌株及使用該菌株製造發酵豆粉的方法。更特定而言，本發明係關於具增進發酵豆粉之產率的新穎液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，該液化澱粉芽孢桿菌菌株在抗營養因子之移除及蛋白酶活性方面極佳，且展示抵抗病原體之高抗微生物活性及在發酵期間降低的黏性物質產率；使用該菌株製造發酵豆粉的方法；由該方法製造的發酵豆粉；以及包括該菌株的飼料組成物。
因為已成為對人類致命的諸如牛海綿狀腦病變之疾病經證明係歸因於向飼料添加的動物蛋白質組分，所以存在用植物蛋白質替換添加至飼料中之動物蛋白質的快速全球趨勢。
脫脂豆粉(在下文稱為「豆粉」)為作為諸如魚粉、肉骨粉或漿之動物蛋白質的替代品用於飼料市場中的植物蛋白質之最普遍來源。豆粉亦稱為豆油粕，其為由 豆油之提取產生的固體副產物。在韓國，用作植物蛋白質來源之豆粉佔總粉料供應之60%，每年達2百萬噸(韓國飼料成分協會(Korea Feed Ingredients Association)，2004)。
豆粉含有以乾重計55~56重量%之蛋白質、13~14重量%之可溶性碳水化合物及21~22重量%之不可溶碳水化合物。另外，豆粉含有約1重量%之粗脂肪及約4~6重量%之石灰(In-Kyu Han,Vegetable protein feed,Food Processing,Sun-Jin Publishing Co.,67-107,1998)。
同時，豆粉含有各種抗營養因子(ANF)，該等抗營養因子可在豆粉用作飼料時有問題地折損消化率(Li等人，J.Anim.Sci,.68：1790,1990)。在該等抗營養因子中，胰蛋白酶抑制劑(TI)為代表性的，且在陸生動物中，已知膳食性TI干擾胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶之適當酶促功能，從而導致總蛋白質之可利用性的減小。詳言之，因為此等抗營養因子大大地影響幼年牲畜，所以豆粉於用於幼年牲畜之飼料中的使用受限制。另外，已知紅血球凝集物質血、球凝集素、在牲畜中引起腹瀉及腹痛的寡醣(諸如棉子糖、水蘇糖等等)，抑制營養吸收之多醣。其中一些受熱處理破壞。然而，在此過程期間，大豆蛋白質變性且因此其溶解度減小，且諸如離胺酸等等之基本蛋白質可遭破壞。最近，為達大豆蛋白質之更有效使用，已開發藉由移除抗營養因子來增進效率之加工方法。
諸如大豆蛋白質濃縮物、分離大豆蛋白質或水解大豆蛋白質之當前加工大豆產品通常係化學處理或酶 促處理來製造。然而，化學加工方法為昂貴的，且引起降低蛋白質溶解度之問題，因為蛋白質之變性或可溶性胺基酸之損失由於熱處理、化學處理或在製造過程期間之加熱乾燥而發生。出於此原因，執行熱處理，但不在化學加工方法期間引起廣泛蛋白質變性，且因此，抗營養因素、胰蛋白酶抑制劑顯著地存在於大豆磨粉中。
作為用於解決化學加工方法之問題的手段，已開發藉由使用桿菌細菌或真菌之生物學加工方法來製備的發酵豆粉產品(韓國專利第10-0645284號、第10-0459240號及第10-0925173號)。此發酵處理加工方法係用於移除複數種抗營養因子，以及使蛋白質或碳水化合物在發酵過程期間降解成可消化低分子形式，進而製造用於飼料的在消化及吸收率方面極佳的高品質蛋白質材料。
然而，固態發酵通常用於發酵處理加工方法中，且固態發酵具有的缺點為連續地供應空氣以便維持好氣條件，且移除在發酵過程期間產生的發酵熱量。另外，發酵處理加工方法需要48小時或更長的長發酵時間以用於移除高於最佳含量之抗營養因子。此種長發酵時間減小發酵槽之轉變率，且引起總製造成本之增加。
因此，本發明人已開發出藉由使用枯草桿菌(Bacillus subtilis)TP6菌株(KFCC11343P，寄存編號KCCM11438P)之固態發酵來製造發酵豆粉的方法，該枯草桿菌TP6菌株具有發酵豆粉之製造所需的極佳特性，以便在發酵豆粉之製造期間顯著地縮短發酵時間(韓國專利公 開案第10-2011-0027535)。憑藉此方法，藉由使用在抗營養因子之移除及蛋白酶活性方面極佳的枯草桿菌TP6菌株，可甚至以較短發酵時間製造出品質相當於或高於習知發酵豆粉之發酵豆粉。
然而，此方法為有問題的，原因在於：枯草桿菌TP6菌株具有低的抑制病原體之增殖的能力，且因此病原體亦在發酵期間，在豆粉於發酵期間由大腸桿菌(E.coli)或沙門氏菌(Salmonella)污染時增殖。
因此，本發明人已做出大量努力來選擇具有適用於豆粉之固態發酵的改良特性的發酵菌株。因此，發明人已開發出液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株，其在抗營養因子之移除、蛋白酶活性及抵抗病原體之抗微生物活性方面極佳，且具有在發酵期間降低的黏性物質產率。另外，本發明人發現：當該菌株係用於執行豆粉之固態發酵時，具有改良消化及吸收率及飼料效率之高品質發酵豆粉可由於以下原因甚至歷時相較於習知方法的短發酵時間而得以製造：藉由大豆蛋白質之水解的低分子化，及粗蛋白質之含量增加、胰蛋白酶抑制劑之鈍化，或諸如非消化性多醣之抗營養因子之含量減少，進而完成本發明。
本發明之一目標為提供具增進發酵豆粉之產率的新穎液化澱粉芽孢桿菌菌株。
在一較佳實施例中，本發明之新穎菌株為寄存編號KCCM11471P之液化澱粉芽孢桿菌菌株。
本發明之另一目標為提供藉由使用液化澱粉芽孢桿菌菌株之固態發酵來製造發酵豆粉的方法。
在一較佳實施例中，本發明之方法之特徵為包含以下步驟：a)添加水至豆粉以執行熱處理；b)冷卻經熱處理之豆粉且將液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株接種於該豆粉中；以及c)藉由接種於豆粉中之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之固態培養獲得發酵豆粉。
在另一較佳實施例中，本發明之方法的特徵在於：步驟a)中之添加水的豆粉具有30%至80%(v/w)之水含量。
在又一較佳實施例中，本發明之方法的特徵在於：步驟a)之熱處理係藉由在70℃至130℃之溫度下加熱豆粉10分鐘至30分鐘來進行。
在另一較佳實施例中，本發明之方法的特徵在於：步驟b)中之豆粉係冷卻至30℃至50℃之溫度。
在另一較佳實施例中，本發明之方法的特徵在於：在步驟b)中接種之後即刻的液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之數量在1×105CFU/g至1×109CFU/g範圍內。
在另一較佳實施例中，本發明之方法的特徵在於：步驟c)中之固態培養係於30℃至45℃之溫度下執 行12小時至48小時。
在又一較佳實施例中，本發明之方法之特徵為進一步包含以下步驟：乾燥及磨碎步驟c)中獲得的發酵豆粉。
本發明之又一目標為提供藉由該方法製造的發酵豆粉。
本發明之又一目標為提供包括發酵豆粉之飼料組成物。
根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株(KCCM11471P)在抗營養因子之移除活性、蛋白酶活性及抵抗病原體之抗微生物活性方面極佳，且具有在發酵期間降低的黏性物質產率。因此，當菌株係用作種子微生物來執行豆粉之固態發酵時，具有改良消化及吸收率及飼料效率之高品質發酵豆粉可由於以下原因得以製造：藉由大豆蛋白質之水解的低分子化，及粗蛋白質之含量增加、胰蛋白酶抑制劑之鈍化，或諸如非消化性多醣之抗營養因子之含量減少。
圖1展示實例1的用於選擇根據本發明之具高蛋白酶產率的菌株之結果；圖2展示量測實例1中選擇的具高蛋白酶產率之菌株抵抗大腸桿菌及沙門氏菌之菌株的生長抑制活性之結果； 圖3展示自根據本發明之具高蛋白酶產率的菌株選擇具降低的黏性物質產率之突變株的流程圖；圖4展示在根據本發明之突變株之選擇過程期間用於γ-PGA含量之定性分析的濃度-梯度SDS-PAGE之結果，其中：泳道M：分子量標記泳道1：1g/L γ-PGA標準泳道2：0.5g/L γ-PGA標準泳道3：0.25g/L γ-PGA標準泳道4：CJ823菌株泳道5：U304突變株泳道6：U305突變株泳道7：U306突變株泳道8：U307突變株；圖5為展示根據以上程序選擇的突變株液化澱粉芽孢桿菌K2G之親緣關係之親緣關係樹；以及圖6展示對藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G之固態發酵獲得的發酵豆粉之水解度的SDS-PAGE之結果，泳道M：分子量標記泳道1：原料(原豆粉)泳道2：20小時之TP6發酵泳道3：16小時之K2G發酵泳道4：20小時之K2G發酵。
在用以達成以上目標之一態樣中，本發明提供適用於藉由固態發酵製造發酵豆粉之新穎液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株(KCCM11471P)。
根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株的特徵在於：其在抗營養因子之移除活性、蛋白酶活性及抵抗病原體之抗微生物活性方面極佳，且具有在發酵期間降低的黏性物質產率，進而藉由固態發酵製造高品質發酵豆粉。
確切言之，根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株產生具強活性之蛋白酶，以便鈍化各種多醣抗營養因子，諸如豆粉之胰蛋白酶抑制劑(TI)抑制消化，且將高分子量大豆蛋白質水解成低分子量蛋白質，進而明顯地改良發酵豆粉之消化及吸收率。
另外，當根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株藉由利用豆粉之組分中的碳水化合物生長時，其將碳水化合物轉化成構成細胞之蛋白質。因此，發酵豆粉中粗蛋白質之相對含量增加，此為製造高品質飼料中之重要因素。
在一個較佳實施例中，本發明人自各種傳統發酵食品分離14種具極佳蛋白酶產率之菌株(參見表1)，以便選擇可用於藉由固態發酵製造發酵豆粉之發酵菌株(參見表1)。
自分離的14種菌株，選擇CJ823菌株，其中 該菌株展示抵抗大腸桿菌及沙門氏菌之最佳抗微生物活性，該大腸桿菌及沙門氏菌為在牲畜中引起食物中毒之代表性病原體。
相較於枯草桿菌TP6菌株(KFCC 11343P；韓國專利公開案第10-2011-0027535號)而言，所選CJ823菌株展示抵抗大腸桿菌及沙門氏菌之明顯極佳的抗微生物活性，該枯草桿菌TP6菌株已用作發酵豆粉藉由固態發酵之習知製造方法中的發酵菌株(參見表2)。
另外，據確認：CJ823菌株有效地在實際發酵過程期間抑制沙門氏菌之生長，且因此適合於高品質發酵豆粉之製造(參見表3)。
因而，CJ823菌株產生高濃度之蛋白酶且展示抵抗病原體之極佳抗微生物活性，但產生黏著黏性物質，此係歸因於藉由在發酵過程期間產生的酶而衍生自原始大豆之糖及蛋白質的左聚糖形式的聚果糖及聚麩胺酸之聚合。黏性物質之產生可在發酵過程之控制及在發酵豆粉之大量製造之後發酵產品之轉移方面引起問題。
因此，本發明人使CJ823菌株引起UV誘導突變，以便開發具有降低的黏性物質產率同時維持其自身酶促/生理學特性之突變株(參見圖3)。
首先，使CJ823菌株暴露於254nm UV，且隨後取決於菌落之形狀及由於黏性物質於含脫脂乳選擇培養基中之產生的透明帶之形成，選擇16種突變株。使所選16種突變株經受固態培養，且隨後分析蛋白酶活性及 γ-PGA(聚-γ-麩胺酸)含量以最終選擇展示最高蛋白酶活性及相對低γ-PGAA含量之U304突變株(參見表4)。
對最終選擇的U304突變株之鑑定而言，主要分析其糖同化作用。因此，據發現：就生物化學特性而言，U304突變株具有與枯草桿菌及液化澱粉芽孢桿菌98%之相似性(參見表5)。
另外，16S rRNA序列分析之結果展示：U304突變株具有SEQ ID NO.1之16S rRNA序列。基於此序列，分析此菌株與已知菌株之間的序列同源性及親緣關係。因此，U304突變株展示與液化澱粉芽孢桿菌99.92%之相似性，及在親緣關係樹中與該液化澱粉芽孢桿菌之最高親緣關係(參見表5)。
當一起獲得生物化學特性、序列同源性及親緣關係時，將根據本發明之U304突變株指定為液化澱粉芽孢桿菌K2G，且根據布達佩斯條約以寄存編號KCCM11471P於2013年11月7日寄存於韓國微生物培養中心(KCCM)。
根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株為改良菌株，其藉由明顯地降低諸如聚-γ-麩胺酸之聚合物的產率而具有降低的黏性物質產率，同時維持親本菌株之特性，包括高蛋白酶產率及抵抗諸如大腸桿菌或沙門氏菌之病原體的極佳抗微生物活性。因此，其可極有效地用於藉由固態發酵製造發酵豆粉。
為確認適用性，檢查粗蛋白質含量藉由根據 本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之固態發酵的變化。因此，據發現：藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株發酵的豆粉展示：在24小時發酵之後，粗蛋白質含量相當於或高於藉由枯草桿菌TP6菌株發酵的豆粉之粗蛋白質含量(參見表6)，該枯草桿菌TP6菌株已知為習知豆粉發酵菌株。
另外，檢查豆粉中之胰蛋白酶抑制劑(TI)藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之發酵的變化。因此，據發現：藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株發酵16小時之豆粉中的TI含量相當於藉由枯草桿菌TP6菌株發酵24小時之豆粉中的TI含量，從而暗示抗營養因子之減少可在相當含量下藉由僅16小時發酵而達成(參見表7)。
此等結果指示：相較於習知菌株，在藉由固態發酵製造發酵豆粉之後，根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株能夠歷時短發酵時間來製造發酵豆粉，該發酵豆粉具有作為高品質蛋白質飼料的高含量之粗蛋白質及低含量之抗營養因子。本發明在以下方面極佳：減少的發酵時間增加發酵槽之轉變率以增加每年可製造的批料之數量，且因此可以較低成本向消費者提供高品質發酵豆粉。
因此，本發明人根據布達佩斯條約以寄存編號KCCM11471P於2013年11月7日將液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株寄存於韓國微生物培養中心(KCCM)，該液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株在抗營養因子之移除活性、蛋白酶活 性及抵抗病原體之抗微生物活性方面極佳，且具有降低的黏性物質產率以便適用於藉由固態發酵製造高品質發酵豆粉。
在另一態樣中，本發明提供藉由使用液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之固態發酵製造發酵豆粉的方法。
確切言之，根據本發明之製備方法之特徵為包括以下步驟：a)添加水至豆粉以執行熱處理；b)冷卻經熱處理之豆粉且隨後將該液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株接種於該豆粉中；以及c)藉由接種於豆粉中之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之固態培養獲取發酵豆粉。
步驟a)為以下步驟：添加水至作為原料之豆粉以執行熱處理。在固態發酵之前，將適當量之水直接噴灑於原豆粉上，且將其混合以控制水分含量，接著熱處理預定時間。
根據本發明之一個較佳實施例，步驟a)中之水經添加以便豆粉中之水含量為30%至80%(v/w)、更佳30%至70%(v/w)，且更佳40%至60%(v/w)。具有在以上範圍內之水含量之豆粉就以下方面而言為較佳的：防止由於低水分之發酵延遲，豆粉之轉移及發酵之後的乾燥製程所需的高成本之節省，以及加熱效率。
隨後，使添加水的豆粉經受熱處理。熱處理係執行來達到以下目的：殺死原豆粉中之各種胚菌 (germs)，大豆細胞壁之破壞，及蛋白質之變性，進而提供用於所要微生物之活性生長之環境。熱處理製程可藉由此項技術中已知的各種方法來執行，但較佳使用蒸汽或過熱蒸汽。
根據本發明之較佳實施例，步驟a)之熱處理係使用70℃至130℃之蒸汽執行10分鐘至60分鐘，或使用200℃至300℃之過熱蒸汽執行數秒至數分鐘之短時間，更佳使用70℃至130℃之蒸汽執行10分鐘至30分鐘，且最佳使用80℃至121.1℃之蒸汽執行10分鐘至30分鐘。
若熱處理之溫度低或處理時間短，則存在的問題是：對各種胚菌之殺菌效應不足，或後續發酵過程進行不順利。若熱處理之溫度高或處理時間長，則在豆粉中發生蛋白質變性，從而減小消化率，進而導致最終產品之品質的劣化。因此，較佳的是：採用在可接受範圍內之溫度及熱處理時間來避免此等問題。
經由熱處理，可預期的是：存在於豆粉中之污染物幾乎完全移除，形成適用於後續固態發酵之化學環境，且諸如胰蛋白酶抑制劑(TI)的抑制消化率之抗營養因子得以輕微減少。
步驟b)為以下步驟：冷卻經熱處理之豆粉至適用於固態發酵之溫度，且隨後將液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株接種於該豆粉中。在本發明中，豆粉之冷卻通常係於熱處理之後執行，其中冷卻製程可易於經由使用冷卻運送機之轉移製程來執行，以便防止過熱且藉由增加冷卻速率 來均勻地冷卻。
根據本發明之較佳實施例，步驟b)中之豆粉係冷卻至30℃至50℃、更佳35℃至45℃且更佳37℃。
在冷卻經熱處理之豆粉之後，較佳的是：將根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之預培養基均勻地接種於所製備的原樣豆粉培養基中，或藉由殺菌水來稀釋。
接種於經熱處理之豆粉中之發酵菌株的數量為影響豆粉之固態發酵的重要因素。在接種於經熱處理之豆粉中之後即刻的發酵菌株之數量較佳為1×105至1×109CFU/g。
若接種量小於1×105CFU/g，則需要小量的種子發酵液，而存在的缺點在於：需要更多時間用於豆粉之發酵，從而增加製造所需的發酵時間及污染之可能性。對比而言，若接種量大於1×109CFU/g，則發酵時間可顯著地減少，而存在的缺點在於：用於接種之種子微生物之製造成為困擾的問題。詳言之，因為發酵效能大大地受發酵菌株之生長特性及發酵槽之類型的影響，所以較佳的是：考慮製造步驟中之菌株之特性來適當地決定接種量。
步驟c)為以下步驟：藉由接種於豆粉中之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之固態發酵來獲取發酵豆粉。例如，發酵係使用填充床發酵槽來執行。
填充床發酵槽分成各種類型，諸如分批、封閉及連續攪拌槽反應器。本發明之方法不限於其中任一 種，只要其適用於豆粉之固態發酵即刻。較佳地，其可取決於製造規模來選擇。
根據本發明之較佳實施例，將液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株接種之豆粉以5cm至50cm之厚度應用於填充床發酵槽，且在20℃至50℃下發酵12小時至72小時。此時，較佳的是：豆粉填充床較厚，且在30℃至45℃下執行發酵12小時至48小時。最佳地，發酵係於37℃下執行24小時。
本發明之方法可進一步包括以下步驟：在步驟c)之後，在低溫及濕氣下乾燥及磨碎發酵豆粉。
豆粉中之水在發酵過程期間部分地蒸發，但在發酵之後即刻的殘餘水含量顯著地高達20%至50%(v/w)。然而，發酵豆粉產品之較佳最終水含量為10%至12%(v/w)，且因此需要乾燥製程。
當使用根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株執行固態發酵時，發酵豆粉處於極好條件下，但輕微形成團聚物(conglomerate)。因此，在乾燥製程之後，需要磨碎發酵豆粉之製程以形成均勻粒度。
乾燥及磨碎製程可藉由此項技術中已知的各種方法來執行。然而，當乾燥製程在高溫下執行過度時，可能殺死發酵豆粉中之許多活細菌，且因此應小心地執行。較佳地，乾燥製程係於低溫下執行而不殺死活細菌。最佳地，乾燥製程係於低溫及濕度下利用熱空氣來執行。在磨碎製程中，可取決於使用目的且較佳地藉助於錘碎機 將發酵豆粉磨碎至各種大小。
當使用液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株根據本發明之上述方法執行豆粉之固態發酵時，豆粉中包括TI之各種抗營養因子得以減少，消化率及吸收藉由蛋白質之水解及低分子化而改良，且粗蛋白質之含量亦增加，進而改良作為飼料之絕對價值。因此，作為成為動物蛋白質之替代物的高品質蛋白質飼料材料，其具有高價值。
在另一態樣中，本發明提供飼料組成物，其包括藉由以上方法製造的發酵豆粉。
根據本發明之飼料組成物中發酵豆粉之含量可取決於欲應用的牲畜之種類及年齡、應用形式、所要效果等等來適當地控制。例如，含量可為1重量%至99重量%、較佳10重量%至90重量%且更佳20重量%至80重量%，但不限於此。
對投與而言，本發明之飼料組成物除發酵豆粉之外可進一步包括以下一或多者之混合物：有機酸，諸如檸檬酸、反丁烯二酸、己二酸、乳酸等等；磷酸鹽，諸如磷酸鉀、磷酸鈉、多磷酸鹽等等；天然抗氧化劑，諸如多酚、兒茶酸、生育酚、維生素C、綠茶提取物、聚葡萄胺糖、單寧酸等等。必要時，可添加其他典型添加劑，諸如抗流行性感冒劑、緩衝劑、抑菌劑等等。另外，可另外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、黏合劑或潤滑劑來將組成物調配成諸如水溶液、懸浮液、乳液等等之可注射製劑，膠囊，顆粒或錠劑。
另外，除包括植物蛋白質飼料(諸如磨碎或粉碎小麥、大麥、玉米等等)、動物蛋白質飼料(諸如血粉、肉粉、魚粉等等)、動物脂及植物油之主要成分之外，本發明之飼料組成物可與以下者一起使用：各種助劑，諸如胺基酸、無機鹽、維生素、抗氧化劑、抗真菌劑、抗微生物劑等等；營養補充物；生長加速劑；消化-吸收加速劑；以及預防劑。
當本發明之飼料組成物係用作飼料添加劑時，飼料組成物可根據典型方法原樣添加或與其他組分一起使用。飼料組成物可以立即釋放調配物或持續釋放調配物之投與形式與無毒性醫藥學上可接受之載劑組合製備。食用載劑可為玉米澱粉、乳糖、蔗糖或丙二醇。固體載劑可呈錠劑、粉末、片劑等等之投與形式，且液體載劑可呈糖漿、液體懸浮液、乳液、溶液等等之投與形式。另外，投與劑可包括防腐劑、潤滑劑、溶解加速劑或穩定劑、用於改良發炎性疾病之其他藥劑及適用於防止病毒之物質。
本發明之飼料組成物可應用於動物之膳食中，亦即，應用於包括哺乳動物、家禽、魚類及甲殼動物之許多動物的飼料中。其可用於：商業上重要的哺乳動物，諸如豬、牛、山羊等等；動物園動物，諸如大象、駱駝等等；牲畜，諸如犬、貓等等。亦可包括商業上重要的家禽可包括雞、鴨、鵝等等，且商業上養殖的魚類及甲殼動物，諸如鱒魚及蝦類。
根據本發明之飼料組成物可以牲畜飼料之乾 重計，以每1kg大致10g至500g、較佳10g至100g之量加以混合。在完全混合之後，飼料組成物可作為粉料提供，或可較佳進一步經受造粒、粗放化(extensification)或擠出製程。
[實施例]
下文中，本發明將參考實例來更詳細描述。然而，對熟習本發明所屬技術之技藝人士明顯的是，此等實例僅係出於說明性目的，且不意欲藉由此等實例限制本發明之範疇。
實例1：具有高蛋白酶產率之菌株之選擇
為分離具有極佳蛋白酶產率之菌株，本發明人自各種傳統發酵食品(韓國泡菜、發酵豆瓣醬、傳統民俗酒、鹹魚等等)分離大致3000種微生物，且鑑定該等微生物之大致1300種飼料可接受(韓國飼料成分協會，益生菌)桿菌菌株。自菌株，意欲發現具有高蛋白酶表現、抗微生物活性及快速生長率之多功能菌株。
詳言之，具有高蛋白酶產率之菌株之選擇係藉由比較透明帶之大小來執行，該透明帶係由於含2%(w/v)脫脂乳(Difco,USA)YM瓊脂平板(酵母萃3.0g、麥芽精3.0g、蛋白腖10.0g、瓊脂20.0g)上基質之降解而形成(圖1)。
將由此選擇的具有高蛋白酶產率之菌株分別接種於TSB培養基(酪蛋白之酶促消化物17.0g、豆粉之酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、右旋糖2.5g，最終pH：7.3±0.2，25℃)中，接著在37℃及200rpm 下培養12小時。將各為1.0μl培養液點塗於含脫脂乳YM瓊脂平板上。在37℃下將瓊脂平板孵育16小時，且量測形成於平板上之透明帶之直徑。
此時，將已在習知方法中用作用於藉由固態發酵製造發酵豆粉之發酵菌株的枯草桿菌TP6(KFCC 11343P)用作對照組(韓國專利公開案第10-2011-0027535號)。
如表1所示，選擇14種菌株作為具有高蛋白酶產率之菌株，且其全部展示比枯草桿菌TP6更高的蛋白酶活性。
實例2：具有對病原體之增殖的抑制活性的菌株之分離
為分離能夠抑制作為在牲畜中引起食物中毒的代表性病原體之大腸桿菌及沙門氏菌之生長或增殖的菌株，且藉由在發酵豆粉之製造中應用菌株來開發無沙門氏菌無毒產品，使實例1中分離的14種具有高蛋白酶產率之菌株經受對抵抗病原體之抗微生物活性之量測。
抵抗病原體之抗微生物活性係藉由對鼠傷寒 沙門氏桿菌(Salmonella typhymurium)(ATCC14028)及大腸桿菌(KCCM11835)之菌苔點樣試驗(spot-on-the-lawn test)量測。
詳言之，將14種具有高蛋白酶產率之菌株分別接種於GYP培養基(葡萄糖10.0g、酵母萃8.0g、多蛋白腖2.0g，pH 7.0)中，接著在37℃及180rpm下液體培養12小時。將具有高蛋白酶產率之菌株之各為1.5μl的培養液點塗於GYP瓊脂平板(葡萄糖10.0g、酵母萃8.0g、多蛋白腖2.0g、瓊脂15.0g，pH 7.0)上，向該GYP瓊脂平板添加各為1×105CFU/ml之鼠傷寒沙門氏桿菌ATCC14028及大腸桿菌ATCC11835，接著在37℃下靜態培養15小時。檢查形成於點塗在平板上的具有高蛋白酶產率之菌株之菌落周圍的抑制帶之大小，以測定活性效價。結果展示於以下表2中。此時，枯草桿菌TP6係用作對照組。
在表2中，『-』或『+』為基於活細菌之抑制帶之直徑來測定活性效價，且，『-』指示無抗微生物性或抗微生物活性，『+』指示抑制帶之直徑為10.05mm或更小，『++』指示抑制帶之直徑為10.05mm至14.05mm，『+++』指示抑制帶之直徑為14.05mm至17.05mm，且『++++』指示抑制帶之直徑為17.05mm或更大。
檢查14種具有高蛋白酶產率之菌株抵抗作為牲畜中胃腸疾病之最普遍病因的沙門氏菌及大腸桿菌之抗微生物譜。結果，CJ823展示最佳抗微生物能力。相較於對照組枯草桿菌TP6而言，所選CJ823展示抵抗大腸桿菌(++++對+)及沙門氏菌(++++對++)之明顯高的抗微生物活性。
實例3：對沙門氏菌增殖抑制豆粉之應用之試驗
根據實例2之結果，瓊脂平板上之CJ823展示抵抗沙門氏菌之極佳抗微生物活性。然而，執行以下實驗以便確認菌株是否亦在豆粉之實際發酵期間展現抵抗沙門氏菌之增殖抑制能力。
詳言之，將CJ823及鼠傷寒沙門氏桿菌ATCC14028分別以4.5×107CFU/g及1.0×103CFU/g之密度接種於豆粉(45%之水分含量)中，將該豆粉於100℃下蒸汽處理30分鐘，且檢查在37℃及恆定濕度下歷時24小時 之細胞數量之變化。此時，將鼠傷寒沙門氏桿菌單獨接種於豆粉中，其係用作對照組。將鼠傷寒沙門氏桿菌及枯草桿菌TP6之混合物接種於豆粉中，其係用作比較組。
將菌株接種，且在發酵之前及發酵12、16及20小時之後取出預定量之豆粉。將豆粉稀釋於0.8% NaCl無菌溶液中，且隨後將其各自以100μl塗覆於XLD瓊脂平板(酵母萃3g、乳糖7.5g、蔗糖7.5g、木糖3.5g、L-離胺酸5g、檸檬酸鐵銨0.8g、酚紅0.08g、NaCl 5g、脫氧膽酸鈉2.5g、硫代硫酸鈉6.8g、瓊脂13.5g，最終pH：7.4±0.2，25℃)以計數鼠傷寒沙門氏桿菌菌落之數量，且結果展示於以下表3中。
假設鼠傷寒沙門氏桿菌污染發生在蒸汽處理豆粉中主發酵菌株CJ823之增殖期間來量測兩種菌株之間的比率。實際污染比率可取決於發酵豆粉之製造的環境條件而不同。
如表3所示，在僅利用鼠傷寒沙門氏桿菌接種之對照組中，隨著培養時間增加，細菌之數量在20小時發酵之後穩定增加至3.1×107CFU/g。對比而言，在利用枯 草桿菌TP6接種之比較組中，鼠傷寒沙門氏桿菌之數量受抑制至2.2×104CFU/g。在利用根據本發明之CJ823以混合物接種之實驗組中，鼠傷寒沙門氏桿菌之數量進一步減小至3.5×102CFU/g。
此等結果指示：根據本發明之CJ823有效地抑制沙門氏菌在實際發酵過程期間之生長，且因此其適合於高品質發酵豆粉之製造。
實例4：突變株之選擇
實例1至3中選擇的CJ823製造高濃度之蛋白酶且展示抵抗病原體之極佳抗微生物活性，但產生黏著黏性物質，此係歸因於藉由在發酵過程期間產生的酶而衍生自原始大豆之糖及蛋白質的左聚糖形式的聚果糖及聚麩胺酸之聚合。在大規模工業製程中黏性物質之過量產生阻礙攪拌，且存在對發酵產品中之溶解氧及溫度及轉移的控制困難。
因此，本發明人如下使CJ823菌株引起UV誘導突變，以便開發具有降低的黏性物質產率同時維持或改良其自身酶促/生理學特性之突變株。突變株之選擇過程如圖3所示。
首先，將CJ823塗佈於TSB瓊脂平板(酪蛋白之酶促消化物17.0g、豆粉之酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、右旋糖2.5g、瓊脂15.0g，最終pH：7.3±0.2，25℃)中，且在37℃下培養12小時以活化菌株。
在此培養物，將種子微生物之1%懸浮液接種 於預先製備的TSB培養基(酪蛋白之酶促消化物17.0g、豆粉之酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、右旋糖2.5g，最終pH：7.3±0.2，25℃)中，且在37℃及180rpm下搖動培養。在培養之後，在25℃及8000rpm下離心培養液10分鐘，以分離細胞團塊及上清液。僅取出細胞團塊，且用0.8% NaCl無菌溶液洗滌。在洗滌之後，藉由使用UV燈(VIBER LOURMAT,115V,60Hz)對所回收細胞團塊UV照射(254nm)來誘導人工突變。
將細胞塗佈於作為選擇培養基之2%含脫脂乳TSA瓊脂平板(酪蛋白之酶促消化物15g、豆粉之酶促消化物3.0g、NaCl 5g、瓊脂15g，最終pH：7.3±0.2，25℃)上，且在37℃下培養20小時。在培養之後，使用卡尺(CD-20CPX,Mitutoyo,Kanagawa,Japan)測定所形成透明帶之大小(直徑，mm)，且主要選擇16種具有高蛋白質分解活性之突變株。
隨後，將由此選擇的16種突變株中每一種接種於熱處理豆粉中，且培養20小時，且在25℃及8000rpm下將由其獲得的培養液離心10分鐘，以分離細胞團塊及上清液。藉由量測γ-PGA之重量來測定上清液中之γ-PGA含量，該γ-PGA係根據文件(Goto等人Biosci.Biotechnol.Biochem,.56：1031-1035.,1992)中所揭示的方法、於分離及純化及凍乾之後回收。
根據實例1中所述的方法量測蛋白酶活性，且藉由以下定性及定量分析兩種方法來量測γ-PGA含量。
首先，對γ-PGA活性之定性分析而言，將40μl之分離上清液與10μl之5×染色緩衝溶液混合，且隨後裝載於5%至20%梯度SDS-聚醯胺凝膠上以執行濃度梯度SDS-PAGE。在電泳之後，利用考馬斯染料試劑染色標準蛋白質，接著去染。隨後，利用亞甲藍染色聚-γ-麩胺酸以執行定性分析。
如圖4所示，在泳道4之CJ823(親本菌株)之上清液中偵測到聚-γ-麩胺酸，但聚合物產生能力大大減小，且在泳道5之U304突變株之上清液中觀察到高蛋白酶活性。
同時，對γ-PGA含量之定量分析而言，用相等量之蒸餾水稀釋固態發酵之上清液，且隨後在20,000×g下離心20分鐘。使用6M HCl將所獲得的上清液之pH調整至3.0，且在4℃下保留一天。此後，在25,000×g下將上清液離心30分鐘，且隨後回收團塊。將團塊完全溶於100~200倍體積之蒸餾水中，且在25,000×g下離心30分鐘以移除雜質。藉由在4℃下透析一天來移除鹽。將所得物冷凍乾燥以回收γ-PGA，且由其獲得的結果展示於以下4中。
如表4所示，相較於CJ823而言，大多數突變株展示低的γ-PGA含量。在該等突變株中，最終選擇展示最高蛋白酶活性及相對低γ-PGA含量之U304突變株。詳言之，U304突變株展示比對照組枯草桿菌TP6更低的γ-PGA含量及高三倍或更大的蛋白酶活性。
最終選擇的U304突變株的特徵在於：由於諸如聚-γ-麩胺酸之聚合物的明顯減少產生，同時維持親本菌株之特性，該突變株具有降低的黏性物質產率，該等特性包括高濃度蛋白酶之產生及抵抗病原體之極佳抗微生物活性。
實例5：U304突變株(K2G)之16S rRNA序列之測定及親緣關係分析
為鑑定具有降低的黏性物質產率之U304突變株，將菌株接種於新的NA瓊脂平板中，且在37℃下培養16小時。用0.8% NaCl無菌溶液稀釋所形成的菌落，且隨後注入至由63種乾燥培養基及生物化學反應物組成之BCL ID卡(bioMNitek Inc.Hazewood,USA)中，且每15分鐘將結果整體地儲存於VITEK 2 Compact軟體(bioMVitek)中，且在14小時之後完成鑑定。
作為用於藉由16S rRNA序列分析之細菌鑑定之通用引子，使用SEQ ID NOs.2及3之518F(5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’)及800R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)，且在藉由PCR在16s rRNA之擴增之後，使用BigDye Terminator v3.1循環測序套組(Applied Biosystems Inc.,USA)來翻譯含有在鑑定中為重要的50~900bp之鹼基序列的1,333bp。16S rRNA序列分析之結果展示：U304突變株具有SEQ ID NO.1之16S rRNA序列。
藉由Blast相似性搜索程式(National Institute of Biotechnology Information)測定序列相似性，且在多重序列比對之後，在親緣關係樹中判定位置(圖5)。
藉由Vitec 2 Compact軟體分析63種生物化學試驗之結果。結果，將菌株分成枯草桿菌/液化澱粉芽孢桿菌類，98%之機率。如圖5所示，親緣關係分析之結果展示：U304突變株具有與標準菌株液化澱粉芽孢桿菌植物亞種FZB42T(CP000560)最接近關係，且16S rDNA序列同源性為99.92%(1332bp/1333bp)。
因此，當一起獲得生物化學特性及親緣關係分析之結果時，將根據本發明之U304突變株指定為液化澱粉芽孢桿菌K2G，且根據布達佩斯條約以寄存編號KCCM11471P於2013年11月7日寄存於韓國微生物培養中心(KCCM)。
實例6：在使用液化澱粉芽孢桿菌K2G之豆粉發酵時粗蛋白質含量根據發酵時間之變化
為檢查在使用根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G之豆粉發酵時粗蛋白質含量根據發酵時間之變化，執行以下實驗。
首先，將400g之豆粉製備成具有45%之水含量，且在100℃下蒸汽處理30分鐘，且隨後冷卻至40℃或更低。隨後，將液化澱粉芽孢桿菌K2G塗佈於TSB瓊 脂平板(酪蛋白之酶促消化物17.0g、豆粉之酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、右旋糖2.5g、瓊脂15.0g，最終pH：7.3±0.2，25℃)上，且在37℃下培養12小時以活化菌株。將大致2圈活化菌株懸浮於9ml之0.8% NaCl無菌溶液(以A660nm稀釋至0.2)中，且此懸浮液係用作種子微生物。在此培養物，將種子微生物之1%懸浮液接種於預先製備的40ml TSB培養基(酪蛋白之酶促消化物17.0g、豆粉之酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、右旋糖2.5g，最終pH：7.3±0.2，25℃)中，且在37℃及180rpm下搖動培養。
將液化澱粉芽孢桿菌K2G之40ml培養液製備成具有45%之水含量，將其添加至蒸汽處理豆粉，且充分混合，接著在37℃及恆定濕度下靜態培養20小時。在60℃乾燥器中乾燥培養物樣本直至水含量達到10%或更小，且隨後使用Kjeldahl系統(Kjltec 2100)量測每一樣本中之粗蛋白質含量。此時，在發酵之前及發酵12、16及20小時之後量測粗蛋白質含量，且枯草桿菌TP6係用作對照組。由其量測的粗蛋白質含量(%，改正至10%水分)展示於以下表6中。此時，枯草桿菌TP6係用作對照組。
如表6所示，基於24小時發酵，藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G發酵的豆粉展示：粗蛋白質含量相當於或高於藉由枯草桿菌TP6發酵的豆粉之粗蛋白質含量，該枯草桿菌TP6菌株已知為習知豆粉發酵菌株。
此等結果指示：根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G可有效地用於作為高品質蛋白質飼料之發酵豆粉之製造。
實例7：在使用液化澱粉芽孢桿菌K2G之豆粉發酵時TI含量根據發酵時間之變化
為檢查在使用根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G之豆粉發酵時胰蛋白酶抑制劑(TI)含量根據發酵時間之變化，執行以下實驗。
確切言之，如實例6，將400g豆粉製備成具有45%之水含量，且在100℃下蒸汽處理30分鐘，且隨後將液化澱粉芽孢桿菌K2G以4.5×107CFU/ml之密度接種於蒸汽處理豆粉中，接著在37℃及恆定濕度下培養24小時。根據AACC-71-10(American association of cereal chemists,1995)，在發酵之前及發酵16、20及24小時之後量測TI含量，且由其量測的TI含量(mg/g)展示於以下表7中。此時，枯草桿菌TP6係用作對照組。
[表7]
如表7所示，藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G發酵的豆粉展示：在16小時發酵之後為0.39mg/g之TI含量，其相應於在藉由枯草桿菌TP6(已知為習知豆粉發酵菌株)發酵24小時之豆粉中的TI含量，從而暗示抗營養因子之減少可在相當含量下藉由僅16小時發酵而達成。
本發明在以下方面極佳：減少的發酵時間增加發酵槽之轉變率以增加每年可製造的批料之數量，且因此以較低成本可向消費者提供高品質發酵豆粉。
實例8：對在使用液化澱粉芽孢桿菌K2G之豆粉發酵時大豆蛋白質之水解度及其於KOH中之溶解度的量測
豆粉為具有高含量蛋白質之植物飼料原材料，但具有的缺點在於：其由於抗營養因子及具有低消化及吸收率之蛋白質而尤其不足以用於幼年牲畜。用於改良此缺點之一種方法為製備呈水解肽形式之蛋白質，或使其降解成易於藉由使用微生物之發酵而消化的低分子量蛋白質。根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G為具有高蛋白酶產率之菌株，且因此預期藉由使用該液化澱粉芽孢桿菌K2G製備的發酵豆粉中之大豆蛋白質可藉由自菌株分泌的 蛋白酶降解。
為確認此點，首先量測根據本發明之發酵豆粉之水解度。如實例6，將400g豆粉製備成具有45%之水含量，且在100℃下蒸汽處理30分鐘，且隨後將液化澱粉芽孢桿菌K2G以4.5×107CFU/ml之密度接種於蒸汽處理豆粉中，接著在37℃及恆定濕度下培養24小時。在25℃及8000rpm下離心由其獲得的培養液10分鐘，以分離細胞團塊及上清液。將40μl之分離上清液與10μl之5×染色緩衝溶液混合，且隨後執行SDS-PAGE(10%)來根據蛋白質之分子量檢查蛋白質之遷移。在電泳之後，利用考馬斯Brilliant R250染色聚醯胺凝膠以檢查蛋白質之組成及分子量，且結果展示於圖6中。此時，原始豆粉及藉由枯草桿菌TP6製備的發酵豆粉係用作對照組。
如圖6所示，據發現：相較於原始豆粉及藉由另一菌株製備的發酵豆粉而言，藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G製備的發酵豆粉展示低分子量區域中之高蛋白質密度。在SDS-聚醯胺凝膠上，上方帶指示高分子量蛋白質，且下方帶指示低分子量蛋白質。此等結果指示：在具有相同分子量之豆粉的狀況下，藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G發酵的豆粉中之高分子量蛋白質水解成低分子量蛋白質。
根據以上報告，使用展示80%之KOH(氫氧化鉀)溶解度及展示較低溶解度(55%至68%)之豆粉執行四次肉仔雞之膳食性增補。結果，相較於利用展示80%之 KOH溶解度餵食的肉仔雞而言，由展示低KOH溶解度之豆粉餵食的肉仔雞之重量、採食量及飼料效率明顯較低或減小(Abulto等人J.Appl.Poult.Res.7：189-195,1998b)。
因此，根據文件(Parsons等人J Anim Sci.,69：2918-24,1991)中揭示的方法量測根據本發明之發酵豆粉之KOH溶解度。簡言之，將由此製備的1.0g發酵豆粉添加至0.2% KOH溶液，且混合20分鐘，接著過濾。使用Kjeldahl系統量測濾液中之氮含量，且轉化成溶解度。結果展示於表8中。
如表8所示，蒸汽處理豆粉之KOH溶解度自80%減少至70%，但在藉由根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G固態發酵期間，KOH溶解度增加至85%。此等結果暗示：KOH由於大豆蛋白質之降解而增加，該降解係藉由自根據本發明之液化澱粉芽孢桿菌K2G分泌的蛋白酶達成。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.財團法人食品工業發展研究所、2015.04.28、BCRC910675
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.韓國、韓國微生物保存中心、2013.11.07、KCCM11471P
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<213> 液化澱粉芽孢桿菌K2G 16s rRNA
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引子518F
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引子800R
<400> 3

Claims (10)

  1. 一種藉由固態發酵製造發酵豆粉之方法，該方法包含將寄存編號為BCRC910675之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株接種於豆粉中。
  2. 如請求項1之方法，該方法包含以下步驟：a)添加30%至80%(v/w)之水至豆粉以執行熱處理，該熱處理係使用70℃至130℃之蒸汽執行10分鐘至60分鐘，或使用200℃至300℃之過熱蒸汽執行數秒至數分鐘；b)冷卻該經熱處理之豆粉至30℃至50℃之溫度，且將數量在1×105CFU/g至1×109CFU/g範圍之該液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株接種於該豆粉中；以及c)藉由接種於該豆粉中之該液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株之固態培養獲得發酵豆粉，該固態培養係於20℃至50℃之溫度下執行12小時至72小時。
  3. 如請求項2之方法，其中步驟a)中之該添加水的豆粉具有30%至70%(v/w)之水含量。
  4. 如請求項2之方法，其中步驟a)之該熱處理係使用70℃至130℃之蒸汽加熱豆粉10分鐘至30分鐘來進行。
  5. 如請求項2之方法，其中步驟b)中之該豆粉係冷卻至35℃至45℃之溫度。
  6. 如請求項2之方法，其中步驟c)中之該固態培養係於30℃至45℃之溫度下執行12小時至48小時。
  7. 如請求項2之方法，其進一步包含以下步驟：乾燥及磨碎步驟c)中獲得的該發酵豆粉。
  8. 一種寄存編號為BCRC910675之液化澱粉芽孢桿菌K2G菌株。
  9. 一種藉由如請求項1、5、7及8中任一項之方法製備的發酵豆粉。
  10. 一種飼料組成物，其包含如請求項9之發酵豆粉。
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