CN109679859B - 一种稳定高效水解油料粕的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种稳定高效水解油料粕的菌株及其应用。该菌株于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中，简称CCTCC，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018794。本发明所述提供的菌株，通过液体发酵高效稳定水解油料粕，不仅时间短、步骤简单、过程可控和监测，同时所产生的水解液组成成分更加稳定，适用于市场需求和后续应用。

Description

一种稳定高效水解油料粕的菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种稳定高效水解油料粕的菌株及其应用。

背景技术

多年来，我国在粮油作物种植、加工一直位居世界首位。油料粕资源不仅种类多样，产量丰富，还富含多种营养物质，尤其是蛋白质含量约为40％～50％，还含有2～3％的淀粉、 7～8％的蔗糖以及一定量的残余油脂，还是磷、钙、镁、铜、锌、锰等多种有益微量元素的良好来源。但是，在传统农业中，由于一些抗营养因子的存在，以及不同物质相互结合作用的物理化学结构，极大的限制了植物或者动物对其中营养物质的利用，如被植酸螯合的矿物元素、与纤维素和植酸结合的蛋白质等。因此，利用物理、化学或者生物的方法对油料粕中的营养物质进行释放，对油料粕进一步在动物和植物中的高效利用具有重要意义。而相对于物理、化学方法而言，生物处理更加经济环保和安全。

迄今为止，国内外水解油料粕的方法主要为利用霉菌进行固体发酵，然后在适当的温度下进行震荡水解，该方法具有发酵周期长、步骤繁琐、过程不可控和监测并造成水解液组成成分不稳定等缺点，极大的限制了油料粕水解液的产业化和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种稳定高效水解油料粕的菌株及其应用。该菌株能通过进行液体发酵能够高效稳定水解油料粕，时间短、步骤简单、过程可控和易于监测，同时所产生的水解液组成成分稳定。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种稳定高效水解油料粕的解淀粉芽孢杆菌CX-20(Bacillusamyloliquefaciens CX- 20)，简称：菌株CX-20，已于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中，简称 CCTCC，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018794。

本发明所述菌株CX-20在水解油料粕方面的应用。具体的应用方法可以为：将油料粕和水进行混合，灭菌后加入菌株CX-20进行发酵，即可得到油料粕水解液。

优选地，本发明还提供另一种所述菌株CX-20水解油料粕的具体应用方法，可以为：将油料粕和水、少量的碳源进行混合，灭菌后加入菌株CX-20进行发酵，即可得到油料粕水解液和菌株CX-20菌液。其中，所述碳源可以为葡萄糖、糖蜜、甘油、蔗糖或者玉米淀粉等，碳源在水中浓度为0-80g/L。

按上述方案，两种应用方法中，发酵条件为：利用气升式发酵罐在28-37℃进行搅拌并发酵36-72小时，期间无需补料，也无需改变发酵条件。

按上述方案，两种应用方法中，所述的油料粕主要包括菜粕、豆粕或者花生粕等。

按上述方案，两种应用方法中，所述的油料粕在水中的浓度为30-150g/L。

按上述方案，两种应用方法中，灭菌的条件为：121℃灭菌20-30分钟。

按上述方案，两种应用方法中，菌株CX-20的添加量为发酵液总体积的4-6％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种稳定高效水解油料粕的菌株和方法，以油料粕作为全营养物质，利用菌株CX-20进行液体发酵，在发酵过程中可以持续产生蛋白酶、纤维素酶、植酸酶等胞外酶，这些酶能够在发酵的过程中持续释放油料粕中的营养物质，包括蛋白质和矿物元素，为菌株CX-20的生长和代谢提供营养物质；同时由于菌株CX-20对营养要求比较低、对环境的适应性和耐受性强，所以在不添加其他任何其它营养物质的前提下，仅仅是油料粕与水按比例混合，该解淀粉芽孢杆菌也能生长并完成对油料粕的水解，当然添加碳源能够加快发酵速度、减少发酵周期，需要24h就能进入稳定生长期，只需36h就可以完成对油料粕的水解。

(2)本发明所提供的稳定高效水解油料粕的方法，利用菌株CX-20进行液体发酵，除了利用其中部分营养物质进行生长和代谢以外，还能够释放大多数营养物质并使之以水溶的形式存在于发酵液中。利用该方法不仅能够生产出淀粉芽孢杆菌菌液，同时还能够将油料粕中不溶的营养物质水解为可溶状态并释放到溶液中，更利于施用和微生物、动、植物吸收利用；相较于利用霉菌进行固体发酵而言，本发明采用液体发酵，整个过程中条件可以监控和调控，这样就能保证在原料稳定的前提下，发酵产生的水解液组成成分稳定，不仅步骤简单、可控，更加节约时间和成本、减少油料粕中营养物质的浪费。

(3)本发明所提供的稳定高效水解油料粕的方法，发酵液中还存在大量的解淀粉芽孢杆菌和芽孢杆菌代谢产物(包括脂肽等各种抑菌物质)，它们对其他微生物具有抑制作用，因此可以增加水解液的保存时间和被杂菌污染的风险。

因此，本发明所述提供的菌株，通过液体发酵高效稳定水解油料粕，不仅时间短、步骤简单、过程可控和监测，同时所产生的水解液组成成分更加稳定，适用于市场需求和后续应用。

附图说明

图1A-图C是本发明实施例解淀粉芽孢杆菌对三种油料粕(菜粕、豆粕和花生粕)在不同初始浓度下进行发酵，游离铵态氮随时间的变化曲线，图中，A为不同浓度菜粕中游离铵态氮的释放曲线，B为不同浓度豆粕中游离铵态氮的释放曲线；C为不同浓度花生粕中游离铵态氮的释放曲线。

图2是在添加不同初始浓度葡萄糖的条件下，经过本发明实施例解淀粉芽孢杆菌发酵 72h后，初始油料粕浓度为90g/L的水解液中游离铵态氮的浓度变化。图中，A为不同初始浓度葡萄糖对菜粕水解液中游离铵态氮的影响；B为不同初始浓度葡萄糖对豆粕水解液中游离铵态氮的影响；C为不同初始浓度葡萄糖对花生粕水解液中游离铵态氮的影响。

图3是在分别添加最适初始浓度葡萄糖的条件下，经过本发明实施例解淀粉芽孢杆菌发酵72h后，90g/L初始油料粕(菜粕、豆粕和花生粕)浓度的水解液中游离铵态氮的浓度变化。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所采用的菌株CX-20已于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中，简称CCTCC，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018794。

下述实施例中，所用的发酵温度为28℃，以300L发酵罐发酵150L发酵液为例：转速为180rpm/min；前24h，由于菌株处在对数生长时期，需要大量的氧气，通气速度为8 m³/h；24h后，菌株处于稳定期，次级代谢产物伊枯草菌素A大量积累，过大的通气量会产生大量的泡沫，同时还会使残存的碳源快速消耗，而减少伊枯草菌素A的累积量，因此将通气量调整至2m³/h。

实施例1

一种稳定高效水解油料粕的方法，该方法具体为：将油料粕、葡萄糖和水按照比例进行混合，121℃灭菌20分钟，待冷却后，按照发酵液体积5％的比例向其中加入解菌株CX-20，然后利用气升式发酵罐在28℃进行搅拌发酵72小时，期间无需补料，也无需改变发酵条件，得到油料粕水解液。

该实施例中，油料粕分别采用菜粕、豆粕和花生粕进行试验；其中，对于每一种油料粕在水中的添加浓度均在30-150g/L范围内，分别选择30、60、90、120、150g/L进行试验；葡萄糖在水中的添加浓度均为20g/L。随着油料粕浓度的增加，水解的时间也会逐渐增加，而添加碳源可以促进解淀粉芽孢杆菌的生长，进而缩短发酵周期，但是并不会对最终水解液中的组成有太大的影响。

本实施例中，在最开始所用的初始葡萄糖浓度为20g/L，在不同的油料粕培养基中，自发酵起始，就开始对油料粕进行水解。测定本发明解淀粉芽孢杆菌对三种油料粕(菜粕、豆粕和花生粕)在不同初始浓度下进行发酵，游离铵态氮随时间的变化曲线，其图谱如图1所示，A为不同浓度菜粕中游离铵态氮的释放曲线，B为不同浓度豆粕中游离铵态氮的释放曲线；C为不同浓度花生粕中游离铵态氮的释放曲线。游离氨基氮含量以甘氨酸作为标准，采用茚三酮法进行测定。

当油料粕的浓度较低，为30-90g/L时，发酵72h后，发酵液中的游离铵态氮浓度就达到了稳定；但是当油料粕的浓度较高，为90-150g/L时，即使发酵72h，发酵液中游离铵态氮的浓度依旧还在增加，但是游离铵态氮释放的速度明显降低，且发酵完成的时间随油料粕浓度的增加而增加；但是由于解淀粉芽孢杆菌为兼性好养细菌，所以72h后为了节约成本，可以采用静置发酵的方法完成后续的营养物质释放。由于花生粕蛋白质含量最多，豆粕次之，而菜粕蛋白质含量最少，所以经过解淀粉芽孢杆菌发酵水解之后，游离铵态氮的浓度明显高于菜粕，以150g/L的不同油料粕为例，最终豆粕和花生粕能够释放出的游离铵态氮的浓度在2000mg/L以上，而菜粕能够释放出的游离铵态氮的浓度在1800mg/L以下。

实施例2

一种稳定高效水解油料粕的方法，该方法具体为：将油料粕、葡萄糖和水按照比例进行混合，121℃灭菌20分钟，待冷却后，按照发酵液体积5％的比例向其中加入解淀粉芽孢杆菌CX-20，然后利用气升式发酵罐在28℃进行搅拌发酵72小时，期间无需补料，也无需改变发酵条件，得到油料粕水解液。

该实施例中，研究了不同浓度碳源的添加对油料粕水解液中组成成分的影响。油料粕分别采用菜粕、豆粕和花生粕进行试验；其中，对于每一种油料粕在水中的添加浓度均在90 g/L范围内；葡萄糖在水中的添加浓度为0-100g/L g/L，分别选择0、20、40、60、80、100g/L进行试验。

在添加不同初始浓度葡萄糖的条件下，经过本发明实施例解淀粉芽孢杆菌发酵72h 后，初始菜粕、豆粕和花生粕的浓度都为90g/L的水解液中游离铵态氮的浓度变化，其图谱如图2所示，随着葡萄糖浓度的增加会使游离铵态氮的浓度略有降低，但是可以忽略不计。最终花生粕水解液中的游离铵态氮浓度最大，在1400mg/L左右；菜粕和豆粕水解液中的游离铵态氮浓度次之，在1000mg/L左右。

本实施例中，同样也研究了不同浓度碳源的添加对油料粕水解时间的影响，以各种油料粕的初始浓度90g/L为例，其中菜粕、豆粕和花生粕对应的最适葡萄糖浓度分别为80g/L、 40g/L和60g/L。

在分别添加最适初始浓度葡萄糖的条件下，其中菜粕、豆粕和花生粕对应的最适葡萄糖浓度分别为80g/L、40g/L和60g/L，经过本发明实施例解淀粉芽孢杆菌发酵72h后，90g/L初始菜粕浓度的水解液中游离铵态氮浓度随时间的变化，其图谱如图3所示，相对于初始葡萄糖浓度为20g/L而言，仅仅只需36h各种油料粕发酵液中游离铵态氮的浓度就达到了稳定，发酵周期缩短了一半，大大节省了发酵时间可成本。

实施例3

一种稳定高效水解菜粕的方法，该方法具体为：将菜粕、葡萄糖和水按照比例进行混合，121℃灭菌20分钟，待冷却后，按照发酵液体积5％的比例向其中加入解淀粉芽孢杆菌CX-20，然后利用气升式发酵罐在28℃进行搅拌发酵72小时，期间无需补料，也无需改变发酵条件，得到油料粕水解液。其中，菜粕的初始浓度90g/L，葡萄糖的初始浓度为80 g/L。

对比例

为了进一步确认本发明所述菌株和方法对于从油料粕(以菜粕为例)中释放营养物质的优势，选取了两株常用的真菌Aspergillus oryzae 92011(标记为对比例1)、Aspergillus niger 93298(标记为对比例2)通过传统的固体发酵、然后再水解的方法(称取500g菜粕和500g 水，向其中添加按照106～107个孢子/g的接种量向菜粕中加入真菌于28℃下发酵72h，按照 90g/L的浓度将发酵后的菜粕在55℃的水溶液中水解2h)进行比较，结果表1所示。可知：无论是游离铵态氮的浓度，还是其它部分矿物质元素的浓度，尤其是K、P、Si，本发明实施例所用的方法都有明显的优势。

表1.不同微生物的菜粕水解液组成成分分析

注：所有水解液中菜粕的初始浓度都是90g/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种稳定高效水解油料粕的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其特征在于所述菌株已于2018年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中，简称CCTCC，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC M2018794。

2.权利要求1所述菌株在水解油料粕方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于应用方法为：将油料粕和水进行混合，灭菌后加入权利要求1所述菌株进行发酵，即可得到油料粕水解液。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于应用方法为：将油料粕和水、碳源进行混合，灭菌后加入权利要求1所述菌株进行发酵，即可得到油料粕水解液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述碳源为葡萄糖、糖蜜、甘油、蔗糖或者玉米淀粉。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述碳源相对于水的添加浓度为0-80 g/L。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述发酵的条件为：利用气升式发酵罐在28-37℃进行搅拌并发酵36-72小时，期间无需补料，无需改变发酵条件。

8.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的油料粕相对于水的添加浓度为30-150 g/L。

9.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述菌株的添加量为油料粕和水、碳源总体积的4-6%。

10.一种稳定高效水解油料粕的方法，其特征在于将油料粕、水进行混合，灭菌后加入权利要求1所述的菌株，即可得到油料粕水解液；或者，将油料粕、水、碳源进行混合，灭菌后加入权利要求1所述的菌株，即可得到油料粕水解液。

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