KR20220057464A - 점액질 생성능이 저감된 미생물 및 이를 이용한 대두 발효물 - Google Patents

점액질 생성능이 저감된 미생물 및 이를 이용한 대두 발효물 Download PDF

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Abstract

점액질 생성능이 저감된 미생물, 이를 이용하여 대두 발효물을 제조하는 방법, 및 이와 같이 제조된 대두 발효물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

점액질 생성능이 저감된 미생물 및 이를 이용한 대두 발효물{Microorganism with reduced viscous production ability and fermented soy product obtained by the same}
점액질 생성능이 저감된 미생물, 이를 이용하여 대두 발효물을 제조하는 방법, 및 이와 같이 제조된 대두 발효물 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간에게 치명적인 광우병 등의 질병이 사료에 첨가되는 동물성 단백질 성분에 기인한 결과로 판정되면서 전 세계적으로 사료에 첨가되는 동물성 단백질을 식물성 단백질로 대체하려는 움직임이 지속적으로 진행되고 있다.
사료 시장에서 어분, 육골분 또는 혈장과 같은 동물성 단백질의 대체품으로 사용 중인 식물성 단백질 원료 중에서 가장 큰 비중을 차지하는 것이 탈지대두박 (이하, “대두박”이라 함)이다. 대두박은 콩기름을 짜고 남은 찌꺼기를 의미하는 것으로, 콩깻묵이라고도 한다. 대두박은 건조물 기준으로 단백질이 55~56 중량%, 가용성 탄수화물이 13~14 중량%, 불용성 탄수화물이 21~22 중량%가 함유되어 있다
종래의 대두 발효물은, 발효 과정 중에 생산되는 효소에 의하여 원료 대두의 당질, 단백질에서 유래된 레반형의 프락탄 (levan form fructan)과 폴리 글루타메이트 (polyglutamate)의 중합으로 인하여 끈적끈적한 점액질이 생성된다는 문제점이 있었다. 이러한 점액질의 생성은 대두 발효물을 덩어리로 뭉치게 하여, 교반을 어렵게 하고 발효물 내의 용존 산소, 온도의 제어와 이송을 어렵게 하여 대량 생산 공정 상에서 많은 문제점을 야기하였다.
따라서, 대두 발효물에서 점액질 생성을 감소시키는 기술의 개발이 요구된다.
국제특허공개 제WO2011-031020호 (2011.03.17)
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 83번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다. 본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 포함하는 대두 발효물 생산용 조성물 또는 대두산물 (soy product) 발효용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 대두산물을 상기 미생물로 발효시킨 대두 발효물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 대두산물에 접종하는 단계; 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 대두 발효물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 대두산물에 접종하는 단계; 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 대두 발효시 점액질 생성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 대두 발효물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서는 대두박과 같은 대두산물의 고체 발효에 유용한 개량된 특성을 갖는 발효 균주 및 이의 용도를 제공한다. 일 실시에서, 야생형 균주의 특정 영역에 유전적 변형이 도입됨으로써, 야생형 균주 대비, 발효 과정 중에 점액질 생성능이 저감되어 발효물 내 끈적끈적한 점액질의 함유량이 감소하고, 덩어리로 뭉치는 현상이 거의 없어, 발효물의 통기량 증대 및/또는 생산성 향상뿐만 아니라, 단백분해효소 활성 및 단백 증가량이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)균주가 제공된다. 상기 균주를 이용하여 대두박과 같은 대두산물을 고체 발효시키면, 종래에 비해 단축된 발효시간 내에 대두 단백질의 가수분해에 의한 저분자화 및 조단백 함량의 증가, 비소화성 다당류와 같은 항영양인자의 함량 감소 등으로 인해, 소화 흡수율과 사료 효율이 증가된 고품질의 대두 발효물을 제조할 수 있음을 제안한다.
본 명세서에서, "대두산물"은 대두의 가공(예컨대, 착유 등)시에 얻어지는 부산물을 총칭하는 것으로, 예컨대, 대두박, 대두 단백 농축물, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에서, "대두 발효물"은 대두 산물 (대두 단백 농축물 및/또는 대두박)에 발효 균주를 접종 발효하여 수득한 산물을 의미하는 것으로, 예컨대, 발효 대두박, 발효 대두 단백 농축물, 또는 이들의 조합을을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, "대두박(soybean meal)"은 콩깻묵 또는 유박 (press cake 또는 oil cake)이라고도 하며, 대두로부터 착유 후 생기는 산물로, 가장 많이 사용되는 식물성 단백질 사료 원료이다.
본 명세서에서, "대두단백 농축물(Soy Protein Concentrate; SPC)"은 탈지 대두에서 가용성의 비단백성 물질을 제거함으로써 대두 유래의 단백질 함량을 농축시킨 것을 의미한다. 대두단백 농축물은 콩으로 식용유를 만들고 남은 부산물인 대두박을 원료로 단백질 함량을 높인 고단백 사료 원료를 의미할 수 있다. 발효 대두박과 함께 대표적인 식물성 고단백 소재로 분류되며 기존 주요 단백질원으로 사용되던 어분의 대체 소재로도 가능하다. 예를 들면, 대두단백 농축물은 탈지대두를 등전점에 가까운 물(pH 4 내지 5)이나 20 내지 80%의 에탄올로 용출하고 수용성 및 탄수화물과 같은 비단백성 물질을 제거하여, 주로 글로불린성의 단백질을 농축하여 제조될 수 있고, 대두단백 농축물은 수분을 제거한 건물을 기준으로 50내지 90 중량%의 단백질을 포함하는 대두 단백질 함유물일 수 있다.
본 명세서에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포", "균주" 등과 혼용될 수 있다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 무의미한 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 무의미한 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 출원의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 변이가 도입된 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 폴리펩타이드 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 83번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에서, 다르게 언급되지 않는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 변이가 도입된 "폴리펩타이드 변이체" 또는 "폴리펩타이드"는 본 명세서에 설명된 바와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열에서 변이가 도입된 폴리펩타이드 변이체를 의미하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 83번째 아미노산 (아스파르트산; D)이 발린(V), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K), 또는 아르기닌(R), 예컨대, 발린으로 치환된 폴리펩타이드일 수 있다. 또는, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 83번째 위치에 발린(V), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K), 또는 아르기닌(R), 예컨대, 발린을 가지는 폴리펩타이드일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 변이체는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 83번 위치에 상응하는 아미노산은 발린이고, 상기 서열번호 3로 기재된 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.2% 이상, 98.4% 이상, 98.6% 이상, 98.9% 이상, 99.1% 이상, 99.3% 이상, 99.6% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.2% 이상, 98.4% 이상, 98.6% 이상, 98.9% 이상, 99.1% 이상, 99.3% 이상, 99.6% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩타이드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩타이드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩타이드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 “변이체”는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩타이드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 83번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 발린으로 치환된, 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩타이드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 GTPase ObgE(NCBI Reference Sequence: WP_003229675.1) 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 GTPase ObgE 활성을 갖는 야생형 폴리펩타이드에 비해 점액질 생산이 감소된 특성을 가질 수 있다. 본 출원에서 상기 GTPase ObgE는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 ObgE에 의해 코딩되는 GTPase ObgE 활성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 3과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 구체예에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.68% 이상, 98.76% 이상, 98.83% 이상, 98.91% 이상, 98.99% 이상, 99.07% 이상, 99.15% 이상, 99.22% 이상, 99.3% 이상, 99.38% 이상, 99.46% 이상, 99.53% 이상, 99.61% 이상, 99.69% 이상, 99.77% 이상, 99.84% 이상, 또는 99.92% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.68% 이상, 98.76% 이상, 98.83% 이상, 98.91% 이상, 98.99% 이상, 99.07% 이상, 99.15% 이상, 99.22% 이상, 99.3% 이상, 99.38% 이상, 99.46% 이상, 99.53% 이상, 99.61% 이상, 99.69% 이상, 99.77% 이상, 99.84% 이상, 또는 99.92% 이상 인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 3의 83번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 발린을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건(stringent condition)”이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오타이드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.68% 이상, 98.76% 이상, 98.83% 이상, 98.91% 이상, 98.99% 이상, 99.07% 이상, 99.15% 이상, 99.22% 이상, 99.3% 이상, 99.38% 이상, 99.46% 이상, 99.53% 이상, 99.61% 이상, 99.69% 이상, 99.77% 이상, 99.84% 이상, 또는 99.92% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오타이드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 유전체에 삽입 또는 숙주 세포 유전체의 대응 유전자를 대체하기 위한 것일 수 있다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pTop33ori 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩타이드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 코딩하는 폴리펩타이드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 전분, 단백질, 및 셀룰로오스 분해효소 생성능을 가지는 발효 균주일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물은 대두산물의 발효균주일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 바실러스 속에 속하는 균일 수 있다. 상기 바실러스 속에 속하는 균은 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis), 바실러스 세레우수(Bacilluscereus), 바실러스 메가테리움(Bacillusmegaterium) 또는 바실러스 클라우시(Bacillusclausii) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 바실러스 서브틸리스 균주일 수 있다. 예컨대, 상기 미생물은 수탁번호 KCCM12814P의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CR01-0016 균주일 수 있다.
본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 GTPase ObgE 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다.
일 예에서, 상기 미생물은 야생형 ObgE 단백질을 대신하여 상기 폴리펩타이드를 발현하거나, 및/또는 또는 야생형 ObgE 유전자를 대체하여 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물이 바실러스 속에 속하는 미생물, 예컨대, 바실러스 서브틸리스 균주인 경우, 상기 미생물에서 야생형 ObgE 단백질 (예컨대, 서열번호 1)을 암호화하는 내재의 ObgE 유전자 (예컨대, 서열번호 2)가 앞서 설명한 바와 같이 서열번호 1의 83번째 아미노산이 변이된 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 3)를 암호화하도록 (예컨대, 서열번호 4의 핵산 서열을 가지도록) 변이된 것일 수 있다.
상기 미생물은 대두산물 발효에 사용시, 점액질 생성을 감소시키거나 점액질이 생성되지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 야생형 균주 (예컨대, 야생형 바실러스 서브틸리스 균주) 대비 점액질 생성능이 감소된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물은 야생형 ObgE 단백질 (예컨대, 야생형 바실러스 서브틸리스 균주의 ObgE 단백질; 서열번호 1)을 발현하거나, 및/또는 야생형 ObgE 유전자 (예컨대, 야생형 바실러스 서브틸리스 균주의 ObgE 유전자; 서열번호 2)를 포함하는 미생물과 비교하여, 점액질 생성능이 감소된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 미생물을 포함하는 대두 발효물 생산용 조성물 또는 대두산물 (soy product) 발효용 조성물을 제공한다.
다른 예는 대두산물을 상기 미생물로 발효시킨 대두 발효물을 제공한다. 상기 대두 발효물은, 대두산물을 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물로 발효시킨 발효물과 비교하여, 점액질 함량이 낮은 것일 수 있다.
본 명세서에서, 점액질은 대두 발효물의 점성(점도)를 증가시키는 물질을 의미하는 것으로, 대두의 당질, 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 레반형의 프락탄 (levan form fructan)과 폴리글루타메이트 (polyglutamate)의 중합에 의하여 생성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 대두 발효물은, 수분함량이, 중량 기준으로, 30 내지 60%, 30 내지 55%, 30 내지 50%, 30 내지 45%, 30 내지 40%, 30 내지 38%, 32 내지 60%, 32 내지 55%, 32 내지 50%, 32 내지 45%, 32 내지 40%, 32 내지 38%, 35 내지 60%, 35 내지 55%, 35 내지 50%, 35 내지 45%, 35 내지 40%, 또는 35 내지 38%일 수 있고; 단백질 총 함량 (건조물 중량 기준)이 40% 이상, 45% 이상, 또는 50% 이상, 예컨대, 40 내지 70%, 40 내지 65%, 40 내지 60%, 45 내지 70%, 45 내지 65%, 45 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 65%, 또는 50 내지 60%일 수 있고; pH가 7 이상, 7.2 이상, 7.5 이상, 7.7 이상 또는 8 이상 (상한값은 pH 9 또는 8.5일 수 있음)일 수 있고; 생균수가 1x105~12 CFU/g, 1x106~12 CFU/g, 1x107~12 CFU/g, 또는 1x108~12 CFU/g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 미생물을 대두산물에 접종하는 단계; 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 대두 발효물의 제조 방법을 제공한다. 이와 같이 제조된 대두 발효물은, 야생형 미생물을 사용하는 경우와 비교하여, 발효물 내 점액질 함량이 감소된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 미생물을 대두산물에 접종하는 단계; 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 대두 발효시 점액질 생성을 감소시키는 방법 (또는 대두 발효물 내 점액질 함량을 감소시키는 방법)을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: (a) 대두산물에 수분을 첨가하고 열처리하는 단계; (b) 상기 열처리된 대두산물을 냉각한 후 발효균을 접종하는 단계; (c) 상기 대두산물에 접종된 균을 고체 배양하여 대두 발효물을 수득하는 단계. 상기 발효균은 앞서 설명한 미생물을 의미한다.
(a)　대두산물에　수분 첨가 및 열처리
원료인 대두산물을 열처리하기 이전에 가수하는 공정이 필요할 수 있다. 이를 위하여, 원료 대두산물은 고체 발효하기 전에 적당량의 물을 직접 분무 또는 혼합하여 수분함량을 조절한 다음 일정한 시간 동안 열처리할 수 있다. 이때 열처리의 목적은 원료 대두산물 중의 잡균을 사멸 및/또는 대두 세포벽을 파괴하고 단백질을 변성시킴으로써 목적하는 미생물이 활발히 생육할 수 있는 화학조성을 제공해 주기 위한 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계 (a)에 수분이 첨가된 대두산물은 수분함량이 30 내지 80%(v/w), 30 내지 70%(v/w), 또는 40 내지 60%(v/w)일 수 있다. 상기 수분함량 범위는 저 수분으로 인한 발효속도의 지연을 방지하고 대두산물의 이송 및 발효 후 건조 공정에서 많은 비용이 드는 문제점의 개선 그리고 열효율 측면에서 바람직한 범위이다.
상기 수분이 첨가된 대두산물을 열처리할 수 있다. 이러한 열 처리 공정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 스팀(steam) 또는 과열수증기(superheated steam)를 이용하여 열처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (a)의 열처리는 온도 70 내지 130℃의 스팀으로 10 내지 60분 동안 증자하거나 200 내지 300℃의 과열수증기로 수초 내지 수분 간 단시간 열처리하는 것일 수 있고, 예를 들어, 온도 70 내지 130℃의 스팀으로 10 내지 30분 동안 증자하거나, 80 내지 121.1℃의 스팀으로 10 내지 30분 동안 증자하는 것일 수 있다.
상기 열처리 과정을 통하여, 대두산물에 존재하는 오염균이 거의 사멸되고 다음 공정인 고체발효가 원활하게 진행되는 화학적 환경이 조성되는 효과가 있을 뿐만 아니라 소화율을 저해하는 TI가 감소하는 효과도 있다.
일 예에서, 상기 단계 (a)의 이전 또는 이후 (단계 (b) 이전)에 발효균을 통상적인 방법으로 전배양하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 발효균은 앞서 설명한 미생물일 수 있다. 예컨대, 이와 같이 얻어진 종균 배양액의 최종 생균수는 (1~5)x109　cfu/mL 범위가 되게 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(b)　상기 열처리된　대두산물의 냉각 및 발효균 접종
상기 단계 (a)에서 열처리된 대두산물을 고체발효가 가능한 온도로 냉각한 다음 발효균을 접종한다.
상기 냉각은 증자가 끝난 다음 자연적으로 진행할 수 있고, 냉각 속도를 높여 과열을 방지하고 균일하게 냉각하기 위하여 컨베이어(conveyor)식 방냉기를 이용한 이송과정을 거치면서 진행할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 단계에서 냉각된 대두산물의 온도는 30 내지 50℃, 35 내지 45℃, 또는 37℃일 수 있다.
상기 발효균의 접종은 준비된 대두산물 배지에 발효균을 배양한 전배양액을 그대로 또는 살균수로 적절히 희석하여 가능한 균일하게 접종할 수 있다.
상기 접종되는 발효균의 양은 대두산물의 고체 발효를 좌우하는 중요한 요인이 될 수 있다. 일 예에서, 상기 발효균의 접종량은 접종 직후의 균수가 105　내지 109　CFU/g이 되게 하는 양일 수 있다.
(c)　상기　대두산물에　접종된 발효균을 배양 및　대두 발효물의　수득
본 단계에서의 배양은 고체배양일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "고체 발효(배양)"는 콩으로부터 지방(대두유)를 분리하고 남은 탈지 대두박 및/또는 대두 단백 농축물을 사용하여 미생물을 배양하는 것을 의미하며, 대두박의 추출물의 이용하는 "액체 배양 또는 액체 발효"와 구별되는 방법일 수 있다.
상기 발효는 통상적인 방법으로 진행할 수 있으며, 예컨대, 충진층 발효기(packed-bed fermentor)에서 진행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 충진층 발효기에는 회분식 통기배양장치, 밀폐식 배양장치, 연속식 통기배양장치 등 여러 가지 형식이 있으며, 생산규모에 따라 적절한 장치를 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다.
상기 발효는 온도 20 내지 50℃에서 12 내지 72시간 동안, 온도 30 내지 45℃에서 12 내지 48시간 동안, 또는 35 내지 40℃에서 12 내지 24시간 동안 수행할 수 있다.
(d)　상기　수득된　발효　대두박의　건조 및 분쇄
일 예에서, 상기 단계 (c) 이후에, (d) 상기 대두 발효물을 저온 저습 건조 및/또는 분쇄하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
발효과정에서 대두산물 중의 수분은 일부 증발하지만 발효 종료 직후 잔존 수분함량은 20 내지 50%(v/w)로 상당히 높다. 대두 발효물 제품의 최종수분 함량이 10 내지 12%(v/w)로 조절되어야 하는 경우, 건조공정이 필요하다.
또한, 대두산물 발효시 부분적으로 약하게 엉긴 덩어리가 형성될 수 있으므로, 이 경우, 건조 후 대두 발효물을 균일한 입자 크기로 분쇄할 수 있다.
상기 건조 및 분쇄는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 생균이 사멸되지 않는 저온에서 건조할 수 있고, 저온 저습도의 열풍으로 건조할 수 있다. 분쇄 과정은 대두 발효물을 이용하고자 하는 목적에 따라 다양한 크기로 분쇄할 수 있으며, 분쇄 방법으로서 햄머 밀(hammer mill)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 따라 대두산물을 발효함으로서 대두산물에 함유된 각종 항영양인자가 감소되고 단백질의 가수분해로 소화 흡수율이 향상되며, 단백질 함량이 증가됨으로써 사료로서의 절대적인 가치가 개선되므로 동물성 단백질을 대체할 수 있는 고품질 단백질 사료원료로서 유용한 대두 발효물을 얻을 수 있다. 또한, 상기 대두 발효물은 유통 중에도 생존력이 강한 바실러스 균이 함유되어 있어 사료를 섭취한 동물의 정장작용을 돕는 기능을 보유하는 장점을 갖는다.
다른 예는 상기 대두 발효물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 사료 조성물은 사료, 사료 제조에 사용하기 위한 사료 원료, 사료 첨가제를 모두 포괄하는 의미로 사용된다.
상기 사료는 포유류, 가금류, 어류 및/또는 갑각류에 적용하기 위한 것일 수 있다. 상기 포유류는 돼지, 소, 말, 사슴, 염소, 개, 고양이, 및/또는 토끼를 포함하고, 상기 가금류는 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조를 포함하며, 상기 어류 및 갑각류는 송어, 연어, 및/또는 새우를 포함할 수 있다.
상기 사료 조성물은, 상기 대두 발효물 이외에, 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 비타민; 미네랄; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제 등의 적절한 형태로 제형화할 수 있다.
상기 사료 조성물은 상기 대두 발효물을 건조 중량 기준으로 1 ㎏당 약 10 내지 500 g, 또는 10 내지 100 g의 양으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) C27 균주(KCCM12814P)는 발효 과정 중에 저감된 점액질 생성능을 나타내고, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 활성이 우수하기 때문에, 이를 종균으로 이용하여 대두박을 고체 발효시키면 대두 단백질의 가수분해에 의한 저분자화 및 조단백 함량의 증가, 비소화성 다당류와 같은 항영양인자의 함량 감소 등으로 인해 소화 흡수율과 사료 효율이 증가된 고품질의 발효 대두박을 제조할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 C27 균주를 사용하여 얻어진 발효 대두박의 점도를 모균주(CJ2042 균주)를 사용하여 얻어진 발효 대두박의 점도와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 2는 일 실시예에 따른 C27 균주를 사용하여 얻어진 발효 대두박과 모균주(CJ2042 균주)를 사용하여 얻어진 발효 대두박의 사진이다.
도 3은 일 실시예에 따른 BS_obgE 균주를 사용하여 얻어진 발효 대두박의 점도를 모균주(BS3135 균주)를 사용하여 얻어진 발효 대두박의 점도와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 4는 일 실시예에 따른 BS_obgE 균주를 사용하여 얻어진 발효 대두박과 모균주(BS3135 균주)를 사용하여 얻어진 발효 대두박의 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 참고예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 전분, 단백질 및 셀룰로오스 분해효소 고활성 균주의 선별
본 실시예에서는 전분, 단백질, 및 셀룰로오스 분해효소 생성능이 우수한 균주를 분리하기 위해, 다양한 전통 발효식품(김치, 장류, 전통민속주, 젓갈 등)으로부터 약 3000 종의 미생물을 분리하고, 이들 중에서 동정을 통해 확인된 약 450 여종의 식품 적합성 바실러스 서브틸리스 속 균주들 중에서 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소의 발현이 높은 균주를 선별하였다.
구체적으로, 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 고활성 균주의 선별은 각각 1%(w/v) soluble starch(Difco, USA), 2%(w/v) skim milk(Difco, USA), 또는 1%(w/v) CMC(carboxymethyl cellulose)가 함유된 YM 한천배지(yeast extract 3.0 g, malt extract 3.0 g, peptone 10.0 g, agar 20.0 g)에서 균주 배양시의 기질이 분해되어 생기는 투명환의 크기를 비교하여 수행하였다.
이와 같이 선별된 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 고생산 균주를 각각 TSB 배지(enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3 ± 0.2 at 25℃)에 접종한 후, 37℃, 200 rpm 조건에서 12시간 동안 배양하고, 배양액을 soluble starch, skim milk, 또는 CMC 함유 YM 한천배지에 1.0 ㎕씩 점적(spotting)하였다. 상기 한천배지를 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 배지 위에 형성된 투명환의 지름을 측정하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
균주명 균주번호 2%(w/v) skim milk 배지 1%(w/v) soluble starch 배지 1%(w/v) CMC 배지
투명환 직경 (mm) 투명환 직경 (mm) 투명환 직경 (mm)
Bacillus subtilis CJ2042 11.8 8.8 10.2
CJ2047 10.0 5.8 7.4
CJ2066 9.4 2.4 8.0
CJ2127 2.4 5.7 7.4
CJ2233 6.0 6.0 9.0
CJ2282 7.6 2.4 4.4
CJ2292 9.8 6.4 6.0
CJ2315 9.0 4.8 5.6
상기 표 1에 나타난 8종의 균주를 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 고생산 균주로 선별하였으며, 이들 중, 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 활성이 모두 우수한 CJ2042 균주를 최종적으로 선별하였다.
실시예 2: 변이 균주의 선발
상기 실시예 1에서 선별된 CJ2042 균주는 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소를 고활성을 나타내지만, CJ2042 균주 특성상 점액질을 함유하고 있다. 이러한 점액질의 생성은 차후 고체 배양시 교반을 어렵게 하여 발효물 내의 용존 산소, 온도 등을 제어하는데 문제가 되고 이송을 어렵게 하는 등의 문제가 발생하게 된다.
이에, 본 실시예에서는 CJ2042 균주(야생형 ObgE 유전자를 가짐)의 효소적/생리적 특성은 그대로 유지하거나 향상되면서 점액질의 생성능이 저감된 변이 균주를 개발하기 위하여, 하기와 같이 CJ2042 균주에 UV를 조사하여 돌연변이를 유발하였다.
먼저, CJ2042 균주를 TSB 한천배지(enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, agar 15.0 g, final pH: 7.3 ± 0.2 at 25℃)에 도말하여 37℃에서 12시간 동안 배양하여 균주를 활성화하였다.
본배양은 미리 준비한 TSB 배지(enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3 ± 0.2 at 25℃)에 종균 현탁액을 1% 접종하고 37℃에서 180 rpm으로 진탕 배양하여 수행하였다. 배양 후 배양액을 25℃에서 8000 rpm의 조건으로 10분간 원심분리하여 균체와 상층액을 분리한 후 균체만 취하여 0.8% NaCl 살균용액으로 세척하였다. 세척 후 회수된 균체를 UV 램프(VIBER LOURMAT, 115 V, 60 Hz)를 이용하여 254nm 파장의 자외선을 조사하여 돌연변이를 유도하였다.
이어서, 상기 UV 조사된 혼합물 0.1 mL을 TSA 평판배지 (tryptic soy agar, enzymatic digest of casein 15 g, enzymatic digest of soybean meal 5 g, NaCl 5 g, agar 15 g, 25℃에서의 최종 pH 7.3±0.2)에서, 37℃, 12시간 배양하고, 모균주인 CJ2042 균주와 비교하여, 육안상으로 점질을 함유하지 않는 콜로니를 형성한 UV 조사된 변이 균주들을 분리하였다.
실시예 3: 변이 균주의 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소능력 측정
상기 실시예 2로부터 분리된 각 변이 균주들의 효소 능력을 확인하였다. 대조군으로는 실시예 1에서 선별된 바실러스 서브틸리스 CJ2042 균주를 사용하였다.
상기 변이 균주들 중 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 고활성 균주를 선별하기 위하여, 각각 1%(w/v) soluble starch(Difco, USA), 2%(w/v) skim milk(Difco, USA), 또는 1%(w/v) CMC(carboxymethyl cellulose)가 함유된 YM 한천배지(yeast extract 3.0 g, malt extract 3.0 g, peptone 10.0 g, agar 20.0 g)에서 균주 배양시에 기질이 분해되어 생기는 투명환의 크기를 비교하여 선별하였다
보다 구체적으로, 상기 각 변이 균주를 TSB 배지 (배지 조성: enzymatic digest of casein 17.0g, enzymatic digest of soybean meal 3.0g, NaCl 5.0g, dipotassium phosphate 2.5g, dextrose 2.5g, final pH 7.3±0.2 at 25°C)에서 37°C, 200rpm에서 12시간 동안 배양하였다. 각 변이 균주의 배양액을 soluble starch, skim milk, 또는 CMC 함유 YM 한천배지에 1.0 ㎕씩 점적(spotting)하였다. 상기 한천배지를 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 배지 위에 형성된 투명환의 지름을 측정하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
균주명 균주번호 2%(w/v) skim milk 배지 1%(w/v) soluble starch 배지 1%(w/v) CMC 배지
투명환 직경 (mm) 투명환 직경 (mm) 투명환 직경 (mm)
바실러스 속 CJ2042 (대조군) 12.3 9.5 10.1
C3 13.1 9.1 12.5
C15 11.0 7.5 13.1
C25 12.8 5.5 14.1
C27 14.6 10.1 15.5
C31 8.1 11.1 8.7
C34 13.8 10.5 9.7
상기 표 2에서 변이 균주 6종 중 C27이 가장 우수한 단백 및 셀룰로오스 분해활성을 보이는 것으로 조사되었다.
이후 선별된 변이 균주 바실러스 서브틸리스 C27 균주와 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJ2042 균주, 바실러스 서브틸리스 TP6 균주(KCCM11438P) 간의 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 활성능력을 비교하였다. 측정방법은 위와 동일하다. 얻어진 결과 (투명환의 지름)를 표 3에 나타내었다.
균주명 균주번호 2%(w/v) skim milk 배지 1%(w/v) soluble starch 배지 1%(w/v) CMC 배지
투명환 직경 (mm) 투명환 직경 (mm) 투명환 직경 (mm)
바실러스 속 TP6 7.3 6.5 6.1
CJ2042 12.5 9.2 10.2
C27 15.1 9.5 15.1
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJ2042 균주 및 바실러스 서브틸리스 TP6 균주보다 변이 균주 C27 균주가 전분, 단백 및 셀룰로오스 분해효소 능력이 우수한 것으로 조사되었다.
실시예 4 : 변이 균주의 대두박에서의 발효능확인
실시예 3에서 선별된 변이 균주 C27 균주의 대두박 발효능을 확인하였다. 비교를 위하여, 실시예 2에서 언급한 모균주인 CJ2042 균주 및 대조군 바실러스 서브틸리스 TP6 (KCCM11438P)를 사용하였다.
상기 C27 균주를 GYP 배지 (glucose 10g/L, yeast extract 8g/L, soy pepton 2g/L)에서 전배양하고, 전배양을 통해 얻은 배양액을 다시 GYP 배지에 1% 접종하여 A660nm 6 이상이 될 때까지 배양하였다.
대두박을 준비하여 수분 함량을 약 43%로 조절하고, 100 ℃에서 30분 동안 열처리한 후 냉각하였다. 상기 C27 균주의 배양액을 대두박 중량 대비 10중량%의 양으로 상기 전처리된 대두박에 접종하고, 수분 함량을 약 46%로 조절하였다. 상기 C27 균주 접종된 대두박을 37 ℃와 습도 95%가 유지되는 항온항습기에서 16시간 동안 발효시켰다. 발효 전, 상기 대두박의 pH는 약 6.6 이었으며, 각 균주들은 약 10^7 CFU/g의 양으로 접종하였다.
발효가 종료된 후, 발효물의 수분, 생균수, pH를 다시 측정하였으며, 발효물을 건조한 시료(건물)로 단백질 함량을 분석하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
균주 시간(hr) 수분 (%) 생균수 (CFU/g) pH 단백질 함량 (%, 건물기준) 단백질 증가량 (%, 건물기준)
TP6 0 46.0 7.E+07 6.6 51.6
8 44.7 5.E+09 7.1 55.2 3.7
12 42.4 2.E+10 7.4 55.9 4.3
16 38.4 1.E+10 8.0 56.6 5.1
CJ2042 0 46.4 7.E+07 6.6 51.6
8 43.2 8.E+09 7.2 55.5 3.9
12 40.0 1.E+10 7.5 57.1 5.5
16 35.3 1.E+10 8.0 57.9 6.3
C27 0 46.2 8.E+07 6.6 51.6
8 43.6 5.E+09 7.2 55.4 3.8
12 39.2 4.E+09 7.6 57.3 5.7
16 35.1 5.E+09 8.0 58.2 6.7
표 4에 나타난 바와 같이, 16시간 발효 후 각 균주의 발효물은 약 35% 내지 38%의 수분함량을 포함하고 있었으며, pH는 8 이상이었고, 생균수 약 10^9CFU/g 이상을 포함하고 있었다. 단백질 함량은 원료의 단백 함량 대비 약 4~6% 이상 상승하였다.
실시예 5: 변이 균주의 점질 생성량 확인
실시예 4에서 얻어진 발효물을 Anton Paar RheoCompass를 이용하여 점질의 정도를 측정하여 (6 kPa), 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 고체발효 결과, C27 균주의 경우 점도 측정 최대값이 8.8387 kPa로, 모균주인 CJ2042 균주 (10.238 kPa) 에 비해, 발효물의 점도가 낮아진 것을 확인하였다.
실시예 6: 변이 균주의 16S rRNA 유전자 핵산서열 및 계통수 분석
상기 실시예 5에서 변이된 C27 균주의 동정을 위하여, 상기 균주의 16S rRNA 유전자 핵산서열을 분석하였다.
16S rRNA 유전자의 핵산서열에 의한 균주 동정을 위해, 범용 프라이머(universal primer)로서 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'; 서열번호 8)와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'; 서열번호 9)을 이용하여 PCR로 증폭한 후 정제하였다. 핵산서열 결정을 위해서는 785F(5'-GGA TTA GAT ACC CTG GTA-3'; 서열번호 10)와 907R(5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3'; 서열번호 11)을 이용하여 1,491 bp의 핵산서열을 분석하여, 서열번호 7에 나타내었다.
핵산서열은 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 시퀀싱을 하여 확인하였고, ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, 3.850 Lincoln Centre Drive Foster City, CA 94404 USA)로 분석하였다. 분석된 핵산서열을 EzTaxon server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)와 GenBank/EMBL/DDBJ로부터 등록된 핵산서열과 비교하여 다른 유전자 핵산서열과의 유사성을 확인하였다. 핵산서열에 대하여 다중 서열 정렬을 진행한 후 MEGA 6 program을 이용하여 계통수(phylogenic tree)를 작성하고 분류학적 위치를 분석하였다.
상기 변이 균주 C27 균주는, 바실러스 서브틸리스 CR01-0016로 명명되었고, 부다페스트 조약 하에 2020년 10월 26일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture of Microorganisms, KCCM)에 수탁번호 KCCM12814P로 기탁되었다.
실시예 7: 점질 생성능 저감 변이주의 유전체 완전장 분석
바실러스 서브틸리스 C27 균주의 변이 유전자 서열을 확인하기 위하여, ㈜디엔에이링크에 의뢰하여 유전체 완전장 분석을 수행하였다. Novaseq6000(혹은 Hiseq2500)을 이용하여 1G mate의 데이터량은 filtered total base 기준으로 1 Gbase 이상을 확보하였으며, 그 결과 ObgE 유전자 변이가 발견되었다 (A248T; 코딩 아미노산 서열의 D83V 유발).
실시예 8 : 점질 생성능 저감을 위한 변이 도입 및 변이가 도입된 균주의 점질 생성량 확인
실시예 8-1. 변이가 도입된 벡터 제작
바실러스 서브틸리스 균주에서 C27의 ObgE 유전자 변이와 같은 변이 발생시 점질 생성능 저감 효과를 확인하기 위하여, 야생형의 바실러스 서브틸리스 균주에 ObgE 유전자가 변이된 균주를 제작하였다. 구체적으로, 유전자 치환을 위한 기본 플라스미드 벡터는 pTOP Blunt V2 플라스미드 벡터(Enzynomics)로부터 제작된 pTop33ori를 사용하였고, 플라스미드의 BamHI 제한효소 위치에 삽입하였다. 먼저 서열번호 1로 표시되는 ObgE 아미노산 서열의 83번째 아미노산을 발린으로 치환하기 위하여 서열번호 2의 ObgE 폴리뉴클레오타이드 서열의 248번째 뉴클레오타이드를 티미딘으로 치환시키기 위한 치환 벡터를 제작하였다.
치환벡터를 제작하기 위한 유전자 단편은 ObgE가 변이된 C27의 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다.
ObgE 유전자 치환 벡터를 제작하기 위한 PCR의 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 50℃ 15초 어닐링, 68℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 68℃에서 5분간 중합반응을 수행. 상기의 벡터 제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 5에 나타내었다.
서열번호 프라이머명 핵산 서열 (5’→ 3’)
5 obgE_F CCATGATTACGCCAAGCTGGATATGTTCCCCAAGC
6 obgE_R GGCCGTTACTAGTGGATCTAACCGCTCAAGGCTG
이와 같이 증폭된 약 2 kb의 PCR 산물을 BamHI 제한효소가 처리된 pTop33ori와 혼합하고 인퓨전 효소를 이용하여, pTOP33ori_obgE 치환벡터를 제작하였다.
실시예 8-2. 변이가 도입된 BS_obgE 균주의 제작 및 점질 생성능 저감 확인
상기 실시예 8-1을 통해 제작한 obgE 유전자 치환 벡터인 pTOP33ori_obgE를 바실러스 서브틸리스 KCTC 3135T 균주에 도입하여 변이가 도입된 변이 균주 BS_obgE를 제작하였다. 상기 KCTC 3135T 균주는 KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)로부터 분양받아 사용하였다.
구체적으로, natural competence를 유도해 치환 벡터인 pTOP33ori_obgE를 혼합하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주를 클로람페니콜 (chloramphenicol) 7.5 mg/L를 함유한 한천 영양배지에서 선별하였다. 선별한 1차 균주를 다시 클로람페니콜 항생제가 없는 LB 배지에 16시간 진탕배양 후 LB agar 평판배지에 희석 도말 후 자라나온 콜로니를 대상으로 클로람페니콜 항생제에 대한 감수성 균주를 각각 선별하고, 염기서열 확인 통하여, 변이주를 획득였다. 최종 형질전환된 균주의 변이 여부는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 시퀀싱을 통해 확인하였다.
이와 같이 얻어진 변이주의 대두박 발효능을 확인하기 위하여, 상기 변이주(BS_obgE 균주) 콜로니를 영양배지에서 계대 배양한 후, GYP 배지 (glucose 10g/L, yeast extract 8g/L, soy pepton 2g/L)에서 전배양하고, 전배양을 통해 얻은 배양액을 다시 GYP 배지에 1% 양으로 접종하여 A660nm 6 이상이 될 때까지 배양하여 BS_obgE 균주의 배양을 준비하였다.
대두박을 준비하여 수분 함량을 약 43%로 조절하고, 100 ℃에서 30분 동안 열처리한 후 냉각하였다. 상기 준비된 BS_obgE 균주의 배양액을 대두박 중량 대비 10중량%의 양으로 상기 전처리된 대두박에 접종하고, 수분 함량을 약 46%로 조절하였다. 상기 BS_obgE 균주 접종된 대두박을 37℃와 습도 95%가 유지되는 항온항습기에서 12시간 동안 발효하였다. 얻어진 발효물은 Anton Paar Rheo Compass를 이용하여 점질의 정도를 측정하였다. 측정은 6 Kpa로 수행하였다. 그 결과, BS3135 균주 (9.9514 kPa)에 비해 BS_obgE 균주 (8.8779 kPa)로 발효하였을 때 점질의 정도가 낮아진 것을 확인하였다. 이러한 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 얻어진 결과로부터, 모균주인 야생형 바실러스 균주(BS3135 균주)에 비해, 변이가 도입된 바실러스 서브틸리스 균주(BS_obgE)의 고체 발효에 의한 발효물의 점도가 낮아진 것을 확인하였다 (도 3, 도 4).
한국미생물보존센터 KCCM12814P 20201026
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism with reduced viscous production ability and fermented soy product obtained by the same <130> DPP20213994KR <150> KR 10-2020-0142298 <151> 2020-10-29 <160> 11 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ObgE (wild type) <400> 1 Met Phe Val Asp Gln Val Lys Val Tyr Val Lys Gly Gly Asp Gly Gly 1 5 10 15 Asn Gly Met Val Ala Phe Arg Arg Glu Lys Tyr Val Pro Lys Gly Gly 20 25 30 Pro Ala Gly Gly Asp Gly Gly Lys Gly Gly Asp Val Val Phe Glu Val 35 40 45 Asp Glu Gly Leu Arg Thr Leu Met Asp Phe Arg Tyr Lys Lys His Phe 50 55 60 Lys Ala Ile Arg Gly Glu His Gly Met Ser Lys Asn Gln His Gly Arg 65 70 75 80 Asn Ala Asp Asp Met Val Ile Lys Val Pro Pro Gly Thr Val Val Thr 85 90 95 Asp Asp Asp Thr Lys Gln Val Ile Ala Asp Leu Thr Glu His Gly Gln 100 105 110 Arg Ala Val Ile Ala Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Asn Ser Arg 115 120 125 Phe Ala Thr Pro Ala Asn Pro Ala Pro Gln Leu Ser Glu Asn Gly Glu 130 135 140 Pro Gly Lys Glu Arg Tyr Ile Val Leu Glu Leu Lys Val Leu Ala Asp 145 150 155 160 Val Gly Leu Val Gly Phe Pro Ser Val Gly Lys Ser Thr Leu Leu Ser 165 170 175 Val Val Ser Ser Ala Lys Pro Lys Ile Ala Asp Tyr His Phe Thr Thr 180 185 190 Leu Val Pro Asn Leu Gly Met Val Glu Thr Asp Asp Gly Arg Ser Phe 195 200 205 Val Met Ala Asp Leu Pro Gly Leu Ile Glu Gly Ala His Gln Gly Val 210 215 220 Gly Leu Gly His Gln Phe Leu Arg His Ile Glu Arg Thr Arg Val Ile 225 230 235 240 Val His Val Ile Asp Met Ser Gly Leu Glu Gly Arg Asp Pro Tyr Glu 245 250 255 Asp Tyr Leu Thr Ile Asn Gln Glu Leu Ser Glu Tyr Asn Leu Arg Leu 260 265 270 Thr Glu Arg Pro Gln Ile Ile Val Ala Asn Lys Met Asp Met Pro Glu 275 280 285 Ala Ala Glu Asn Leu Glu Ala Phe Lys Glu Lys Leu Thr Asp Asp Tyr 290 295 300 Pro Val Phe Pro Ile Ser Ala Val Thr Arg Glu Gly Leu Arg Glu Leu 305 310 315 320 Leu Phe Glu Val Ala Asn Gln Leu Glu Asn Thr Pro Glu Phe Pro Leu 325 330 335 Tyr Asp Glu Glu Glu Leu Thr Gln Asn Arg Val Met Tyr Thr Met Glu 340 345 350 Asn Glu Glu Val Pro Phe Asn Ile Thr Arg Asp Pro Asp Gly Val Phe 355 360 365 Val Leu Ser Gly Asp Ser Leu Glu Arg Leu Phe Lys Met Thr Asp Phe 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Ser Val Lys Arg Phe Ala Arg Gln Met Arg Gly Met 385 390 395 400 Gly Val Asp Glu Ala Leu Arg Glu Arg Gly Ala Lys Asp Gly Asp Ile 405 410 415 Ile Arg Leu Leu Glu Phe Glu Phe Glu Phe Ile Asp 420 425 <210> 2 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ObgE gene encoding ObgE (wild type) <400> 2 atgtttgtag atcaggtcaa agtatatgta aaaggcggcg acggcggcaa cggtatggtt 60 gcgtttcgcc gtgaaaaata tgtgccgaaa ggcggccctg ccggcggtga cggaggaaag 120 ggaggagacg tcgtttttga agtagatgaa ggtctccgca ccctgatgga ttttagatac 180 aaaaaacact ttaaagcgat tcgcggcgag catggcatgt ccaaaaacca gcacgggcga 240 aatgctgatg atatggtcat taaagttccg ccgggcaccg ttgtgacaga cgatgataca 300 aaacaggtca tcgctgattt aacagagcac ggacagcggg ctgtcattgc aagaggcgga 360 agaggaggaa gagggaatag ccgctttgct acaccggcca atcccgcgcc tcagctttca 420 gaaaacggcg agccgggaaa agaacgctac attgttcttg aattaaaagt gcttgcagat 480 gtcggacttg tcgggtttcc aagtgtggga aaatctactt tgctgtctgt tgtctcatct 540 gcaaaaccga aaattgcgga ctatcacttt acaacgcttg tcccgaatct cggcatggtt 600 gaaacggatg acggacgcag ctttgtcatg gctgatttgc cggggctgat tgaaggcgca 660 caccaaggcg tcggacttgg ccaccagttt ttgcgccata ttgaacggac gagggttatt 720 gttcacgtca ttgacatgtc aggcttagaa ggccgcgatc cgtatgagga ttatcttacg 780 attaaccagg agctgagcga gtacaatctg cgtctcactg agcgtccgca aattatcgtt 840 gcaaataaaa tggacatgcc ggaggctgcg gaaaatctcg aagcctttaa agaaaaactg 900 acggatgatt atccggtatt cccgatcagt gcggtgacaa gagaaggtct gcgtgagctt 960 ctgtttgagg ttgccaatca gcttgagaac acaccggaat tcccgctgta tgacgaggaa 1020 gagcttacac aaaaccgtgt catgtacacg atggaaaatg aagaagtgcc atttaacatt 1080 acacgcgatc cagacggtgt atttgtgctt tcaggagaca gccttgagcg gttattcaag 1140 atgactgatt tctcacgtga tgaatcggtt aaacggtttg caagacagat gcgcggaatg 1200 ggtgttgatg aagcactcag agaacgcgga gccaaggatg gagatataat caggcttctg 1260 gaatttgaat ttgaatttat tgattaa 1287 <210> 3 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ObgE (D83V variant) <400> 3 Met Phe Val Asp Gln Val Lys Val Tyr Val Lys Gly Gly Asp Gly Gly 1 5 10 15 Asn Gly Met Val Ala Phe Arg Arg Glu Lys Tyr Val Pro Lys Gly Gly 20 25 30 Pro Ala Gly Gly Asp Gly Gly Lys Gly Gly Asp Val Val Phe Glu Val 35 40 45 Asp Glu Gly Leu Arg Thr Leu Met Asp Phe Arg Tyr Lys Lys His Phe 50 55 60 Lys Ala Ile Arg Gly Glu His Gly Met Ser Lys Asn Gln His Gly Arg 65 70 75 80 Asn Ala Val Asp Met Val Ile Lys Val Pro Pro Gly Thr Val Val Thr 85 90 95 Asp Asp Asp Thr Lys Gln Val Ile Ala Asp Leu Thr Glu His Gly Gln 100 105 110 Arg Ala Val Ile Ala Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Asn Ser Arg 115 120 125 Phe Ala Thr Pro Ala Asn Pro Ala Pro Gln Leu Ser Glu Asn Gly Glu 130 135 140 Pro Gly Lys Glu Arg Tyr Ile Val Leu Glu Leu Lys Val Leu Ala Asp 145 150 155 160 Val Gly Leu Val Gly Phe Pro Ser Val Gly Lys Ser Thr Leu Leu Ser 165 170 175 Val Val Ser Ser Ala Lys Pro Lys Ile Ala Asp Tyr His Phe Thr Thr 180 185 190 Leu Val Pro Asn Leu Gly Met Val Glu Thr Asp Asp Gly Arg Ser Phe 195 200 205 Val Met Ala Asp Leu Pro Gly Leu Ile Glu Gly Ala His Gln Gly Val 210 215 220 Gly Leu Gly His Gln Phe Leu Arg His Ile Glu Arg Thr Arg Val Ile 225 230 235 240 Val His Val Ile Asp Met Ser Gly Leu Glu Gly Arg Asp Pro Tyr Glu 245 250 255 Asp Tyr Leu Thr Ile Asn Gln Glu Leu Ser Glu Tyr Asn Leu Arg Leu 260 265 270 Thr Glu Arg Pro Gln Ile Ile Val Ala Asn Lys Met Asp Met Pro Glu 275 280 285 Ala Ala Glu Asn Leu Glu Ala Phe Lys Glu Lys Leu Thr Asp Asp Tyr 290 295 300 Pro Val Phe Pro Ile Ser Ala Val Thr Arg Glu Gly Leu Arg Glu Leu 305 310 315 320 Leu Phe Glu Val Ala Asn Gln Leu Glu Asn Thr Pro Glu Phe Pro Leu 325 330 335 Tyr Asp Glu Glu Glu Leu Thr Gln Asn Arg Val Met Tyr Thr Met Glu 340 345 350 Asn Glu Glu Val Pro Phe Asn Ile Thr Arg Asp Pro Asp Gly Val Phe 355 360 365 Val Leu Ser Gly Asp Ser Leu Glu Arg Leu Phe Lys Met Thr Asp Phe 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Ser Val Lys Arg Phe Ala Arg Gln Met Arg Gly Met 385 390 395 400 Gly Val Asp Glu Ala Leu Arg Glu Arg Gly Ala Lys Asp Gly Asp Ile 405 410 415 Ile Arg Leu Leu Glu Phe Glu Phe Glu Phe Ile Asp 420 425 <210> 4 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ObgE gene (A248T) encoding ObgE (D83V variant) <400> 4 atgtttgtag atcaggtcaa agtatatgta aaaggcggcg acggcggcaa cggtatggtt 60 gcgtttcgcc gtgaaaaata tgtgccgaaa ggcggccctg ccggcggtga cggaggaaag 120 ggaggagacg tcgtttttga agtagatgaa ggtctccgca ccctgatgga ttttagatac 180 aaaaaacact ttaaagcgat tcgcggcgag catggcatgt ccaaaaacca gcacgggcga 240 aatgctgttg atatggtcat taaagttccg ccgggcaccg ttgtgacaga cgatgataca 300 aaacaggtca tcgctgattt aacagagcac ggacagcggg ctgtcattgc aagaggcgga 360 agaggaggaa gagggaatag ccgctttgct acaccggcca atcccgcgcc tcagctttca 420 gaaaacggcg agccgggaaa agaacgctac attgttcttg aattaaaagt gcttgcagat 480 gtcggacttg tcgggtttcc aagtgtggga aaatctactt tgctgtctgt tgtctcatct 540 gcaaaaccga aaattgcgga ctatcacttt acaacgcttg tcccgaatct cggcatggtt 600 gaaacggatg acggacgcag ctttgtcatg gctgatttgc cggggctgat tgaaggcgca 660 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<210> 7 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of C27 strain <400> 7 ctctcagacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc 60 ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 120 tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa 180 acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240 tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360 ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 420 ctgttgttag ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc 480 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540 ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 600 cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg 660 aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga 720 ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca 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Artificial Sequence <220> <223> 1492R_primer <400> 9 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 785F_primer <400> 10 ggattagata ccctggta 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 907R_primer <400> 11 ccgtcaattc mtttragttt 20

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 83번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 83번째 아미노산이 발린(V), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K), 또는 아르기닌(R)으로 치환된, 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표현되는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합 벡터.
  6. 제1항의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하고,
    전분, 단백질, 및 셀룰로오스 분해효소 생성능을 가지는, 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인, 미생물.
  8. 점액질 생성능이 감소된 수탁번호 KCCM12814P의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주인, 미생물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물과 비교하여, 점액질 생성능이 감소된, 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 점액질은 대두의 당질, 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 레반형의 프락탄 (levan form fructan)과 폴리글루타메이트 (polyglutamate)의 중합에 의하여 생성되는 것인, 미생물.
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 포함하는, 대두 발효물 생산용 조성물.
  12. 대두산물을 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물로 발효시킨, 대두 발효물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 대두산물은 대두박, 대두 단백 농축물, 또는 이들의 조합인, 대두 발효물.
  14. 제12항에 있어서, 대두산물을 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물로 발효시킨 발효물과 비교하여 점액질 함량이 낮은, 대두 발효물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 점액질은 대두의 당질, 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 레반형의 프락탄 (levan form fructan)과 폴리글루타메이트 (polyglutamate)의 중합에 의하여 생성되는 것인, 대두 발효물.
  16. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 대두 산물에 접종하는 단계; 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 대두 발효물의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 대두산물은 대두박 또는 대두 단백 농축물인, 대두 발효물의 제조 방법.
  18. 제12항의 대두 발효물을 포함하는, 사료 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 사료 조성물은 사료 또는 사료 첨가제인, 사료 조성물.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011031020A2 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Cj Cheiljedang Corporation Method for preparing a fermented soybean meal using bacillus strains

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4649244B2 (ja) * 2004-06-15 2011-03-09 株式会社ミツカングループ本社 糸引性低下納豆菌、該納豆菌を用いて製造された糸引性低下納豆
KR101139027B1 (ko) * 2009-09-09 2012-04-27 씨제이제일제당 (주) 바실러스균을 이용한 발효 대두박의 제조방법
KR101517326B1 (ko) * 2014-01-28 2015-05-04 씨제이제일제당 (주) 발효 대두박 생산능이 향상된 바실러스 속 균주 및 이를 이용하여 발효 대두박을 제조하는 방법
JP5754009B1 (ja) * 2014-04-24 2015-07-22 茨城県 糸引性低下納豆菌株及び該納豆菌株による納豆の製造方法と納豆
US11976266B2 (en) * 2018-04-24 2024-05-07 Danisco Us Inc. Filamentous fungal strains comprising reduced viscosity phenotypes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011031020A2 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Cj Cheiljedang Corporation Method for preparing a fermented soybean meal using bacillus strains

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