KR20210131184A - 메주에서 유래한 미생물 군집으로부터 적응진화에 의해 수득된 헴철 생산 미생물 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 빠른 생장 속도 및 그에 따른 증가된 생합성 능력을 갖는 균주를 선별하기 위한 적응진화 배양에 의해 유전자 조작 없이(non-GMO) 수득된, 메주로부터 유래된 미생물 군집의 모집단에 비해 증가된 생장 속도 및 헴철 생산능을 갖는 균주, 그를 이용한 헴철 생산 방법, 및 철분 공급용 조성물에 관한 것이다.

Description

메주에서 유래한 미생물 군집으로부터 적응진화에 의해 수득된 헴철 생산 미생물 및 그의 용도 {Heme-iron producing microorganism obtained from microbiome of fermented soybeans via adaptive evolution and use thereof}
본 발명은 메주에서 유래한 미생물 군집으로부터 빠른 생장 속도 및 그에 따른 증가된 생합성 능력을 갖는 균주를 선별하기 위한 적응진화 배양에 의해 유전자 조작 없이(non-GMO) 수득된, 모집단에 비해 증가된 생장 속도 및 헴철 생산능을 갖는 균주 및 그를 이용한 헴철 생산 방법에 관한 것이다.
동물에서 철은 식이에 의해 공급되어야 필수 미네랄이다. 곡류에 주로 포함된 비-헴철(non-heme iron)은 위장장애 부작용과 더불어 생체이용률이 높지 않은 반면에 육류에 포함된 헴철(heme-iron)은 생산원가가 높으나 부작용이 없고 생체이용률이 높다. 헴철이 풍부한 혈액이나 육류를 이용한 식품이나 색소가 다양한 문화권에서 철의 공급원으로 이용되어 왔으나, 바이러스와 같은 인수 공동 감염 질환 유발원의 오염 위험이 대규모 정제 과정에 위협이 되어 왔다.
헴철의 공급원으로서, 세균을 포함한 미생물에 의해 생산된 헴철이 다양하게 연구되고 있다. 권 등은 세균에 포함된 헴철은 동물의 헴철과 동일한 화학적 구조를 가지며, 동물 바이러스에 의한 오염 위험이 원천적으로 없으므로 세균에 의해 생산된 헴철이 잠재적인 우수한 철분 공급원이 될 수 있다는 연구 결과를 보고하였다(J. Microbiol Biotechnol. 2009;19(6):604-9). 원핵 세균과 진핵 동물 간에 공통의 질병 유발원이 없기 때문에 미생물이 합성한 헴철은 보다 안전한 철 공급원이 될 수 있다. 그러나, 권 등의 연구에서 사용된 원핵 세균은 재조합 대장균이고 외막에 내독소인 리포폴리사카라이드(LPS)를 포함하므로, 대장균-유래 헴철이 철분 공급원으로 사용되기 위해 LPS로부터 분리되어야 하고, 이는 상업적 적용에 대한 비용 장애 요인이 된다. 이를 해결하기 위해, 최 등은 내독소를 원천적으로 포함하지 않아 GRAS(generally recognized as safe) 숙주이고 산업용 균주로서 다양하게 이용되고 있는 토양 유래 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 유전형질을 재조합하여 헴철 생합성을 유도하고, 그의 배양물이 내독소의 정제과정 없이 사균체 형태로 돼지 사료첨가제나 유산균의 보존 증가제로 활용될 수 있다는 것을 제시하였다 (J Microbiol. Biotechnol. 27 (3), 500-506). 그러나, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 인위적인 유전자 재조합에 의해 헴철 생합성능을 갖도록 유도된 것이고, 유전자 조작에 의해 수득된 산물에 대한 소비자의 우려와 부정적인 인식이 높기 때문에 여전히 유전자 조작과정 없이(non-GMO) 미생물에 의해 효과적으로 헴철 공급할 수 있는 방법에 대한 요구가 존재한다.
유전자 조작 없이 헴철 생산능이 높은 미생물을 얻기 위한 연구를 수행하여, 본 발명자들은 건강한 돼지와 소의 분변에서 유래한 미생물 군집으로부터 생장속도 증가 유도 연속배양과정을 통해 헴철이 관련된 호흡에 의한 에너지 발생이 증가된 후손 미생물을 적응진화에 의해 분리하고, 그로부터 헴철 생산량이 높은 미생물을 유전자 조작 과정 없이(non-GMO) 수득하였다(특허출원 제2018-0140294호 및 제2018-0140295호).
또한, 본 발명자들은 철분 결핍 예방 및 성장 촉진을 위한 철분보충용 식품첨가제의 개발을 위한 연구를 수행하여, 감염의 위험 및 고비용 정제 과정 없이, 증가된 양의 헴철을 생산할 수 있으면서 동시에 소비자들의 유전자 재조합에 대한 불안감을 해소하기 위해 발효된 메주에 포함된 식품 미생물 군집으로부터 적응진화를 통해 유전자 조작 없이(non-GMO) 헴철 생합성능이 유도되거나 개선된 미생물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 메주로부터 유전자 조작 없이 적응진화에 의해 수득된, 모집단에 비해 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 메주로부터 적응진화에 의해 수득된 미생물을 이용하여 헴철을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 메주로부터 적응진화에 의해 수득된 미생물의 배양에 의해 생산된 헴철 추출물을 포함하는 철분 공급용 조성물로 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 메주로부터 유전자 조작 없이 적응진화에 의해 수득된, 모집단에 비해 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된, 수탁번호 KCTC14156BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HEMO-S 균주를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "모집단"은 적응진화를 거치기 이전의 미생물 군집 또는 미생물을 의미하고, 예를 들면, 전통적 방법에 의해 제조된 메주에서 유래하여 재조합 방법이나 자연적인 돌연변이를 포함한 진화에 의해 변형되기 이전의 원래의 미생물 군집 또는 미생물을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 유전자 조작 없이 적응진화에 의해 수득된 균주이다.
원하는 특성을 갖는 균주를 개발하기 위해, 형질전환 등을 통한 유전자 조작이 활발하게 이용되나, 인간의 건강이나 생활에 영향을 미치는 영역에서 유전자 조작 균주를 포함한 유전자 조작 개체가 이용되는 것에 대한 우려나 제한이 존재한다. 인위적인 유전자 조작 없이, 원하는 특성이나 활성을 갖는 균주를 수득하기 위해 자연적으로 발생하는 진화과정을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "적응진화(adaptive evolution)"는 자연적인 진화 과정의 유도를 통해, 즉, 유전자 조작 없이, 원하는 특성이나 형질을 갖는 개체의 선택에 유리한 조건에서 배양하여 진화를 유도하는 방식에 의해 원하는 특성을 갖는 개체를 선별하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는 균주이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 모집단에 비해 증가된 헴철 생산능을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 그람 양성 세균의 지표 미생물인 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 비해 증가된 헴철 생산능을 가질 수 있다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HEMO-S 균주는 생장속도가 빠른 균주를 선별하기 위해, 메주로부터 수득된 미생물 군집을 연속배양 장치에서 최소 배지의 공급 속도를 증가시키면서 배양하여, 생장속도가 빠른 균주로 진화하도록 유도하는 것에 의해 수득되고, 헴철 생산능의 증가에 근거하여 선별된 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "헴철"은 포르피린의 철 착염을 의미하며, 헴(heme)과 호환적으로 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태는 빠른 생장속도를 갖도록 유도하는 적응진화에 의해 선별된 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 헴철을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주를 배양하는 단계는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 배지를 이용하여 수행될 수 있다. 배양 방법 및 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 헴철을 생산하는 방법은 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주의 배양물로부터 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균체를 회수하는 단계, 상기 균체를 재현탁시키고 파쇄하는 단계, 수득된 파쇄물로부터 헴철을 포함하는 상층액을 수득하는 단계, 및 상기 상층액으로부터 가열에 의한 침전, 추출 및 동결건조에 의해 헴철을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴철은 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주의 배양물 또는 균체, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물, 또는 상기 배양물로부터 정제된 헴철 추출물의 형태일 수 있다. 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주의 배양에 의해 수득된 배양물은 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주에 의해 생산된 헴철을 포함하므로, 그 자체로 헴철의 공급원으로 이용되거나, 또는 그로부터 헴철을 추출하는 단계를 더 수행하여 수득된 헴철 추출물로 이용되거나, 또는 추출 후 정제단계를 거쳐 수득된 헴철로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 헴철은 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주 배양물로부터 수득된 상층액을 산-아세톤 혼합물로 추출하는 것에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주의 배양물, 또는 그로부터 분리된 헴철을 포함하는, 철분 공급용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 철분 공급용 조성물은 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주의 배양을 통해 생산된 헴철을 철분 공급원으로 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 일 구체예에 따라 메주에서 유래된 미생물 군집으로부터 적응진화를 통해, 유전자 조작 없이 선별된, 모집단에 비해 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된 균주는 유전자 조작에 대한 거부감 없이 안전하게 이용될 수 있는 헴철의 제조를 가능하게 하여, 철분 공급용 조성물을 경제적으로 생산할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 균주를 선별하기 위한 적응진화 배양기의 모식도를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 균주를 선별하기 위한 적응진화 배양에따른, 메주에서 유래된 미생물 군집의 세포 농도와 생장 속도를 보여준다. 청색은 세포 농도, 주황색은 비생장속도(specific growth rate)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 선별된 바실러스 서브틸리스 HEMO-S 균주의 균체로부터 추출된 수용성 추출물의 헴철 스펙트럼을 보여준다.
실시예 1. 메주로부터 유래된 식품 미생물 군집으로부터 생장속도 증가 적응 진화에 의한 균주의 선별
1-1. 식품 미생물 군집의 확보
강원도 홍천지역에서 지역민에 의해 전통방법으로 생산된 메주 1kg을 홍천 중앙시장에서 구입하였다.
메주 시료 50g을 400mL의 생리적 식염수(0.8%)에 분산시켜 블렌딩한 후 고형분을 제외한 상등액 30mL를 시료로 채취하고, 이를 점진형 연속배양을 이용한 적응진화 배양의 접종물로 사용하였다.
메주로부터 유래된 미생물 군집을 포함하는 상등액 10 mL를 50 mL의 LB (Luria Broth) 배지 50ml에 분산시키고 30℃, 200rpm으로 엘렌마이어 플라스크(Erlenmyer flask)에서 진탕 배양을 통해 24시간 동안 전배양(preculture)을 수행하여 배양물을 수득하였다.
1-2. 생장속도 증가 유도 적응진화
1-1에서 준비된 배양액 10 mL을 YSGM9 배지(50 mL 배지 중 효모 추출물 0.25g, 소이톤(soytone) 0.5g, 글루코오스 0.5g, Na2HPO4 0.339g, KH2PO4 0.15g, NH4Cl 50mg, NaCl 25mg) 40 mL을 담은 플라스크에 첨가하고, 도 1에 도시된 바와 같은 연속식 진화 배양기에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 정량 펌프(peristaltic pump)를 이용하여, 신선한 YSGM9 배지를 연속식 배양기에 공급하고, 오버플로우(overflow)되는 배양액은 동일 속도로 제거하여 플라스크 내의 배양액 부피를 상시 50 mL로 유지하는 연속배양을 수행하였다. 연속배양 초기의 배지 공급속도는 20 ml/h의 유속이었고, 공급되는 배지와 동일 부피의 배양액은 오버플로우로 배양기에서 배출되었고, 이는 배양기 내의 미생물 군집의 평균 생장속도=0.4h-1에 해당하였다. 이때 초기 공급속도 (20 mL/h)는 예비 실험을 통해 메주로부터 유래된 미생물 군집 배양액이 동일 배지와 동일 플라스크에서 회분(batch) 배양시 생장하는 속도로 사전에 결정하였다. 플라스크 내의 배양액을 수시 점검하며 30℃, 150rpm 조건을 유지하는 연속배양을 수행하였다. 배지의 공급속도를 오버플로우되는 배양액의 흡광도(OD)가 2시간 이내에 감소하지 않는 경우에 한하여 전단계 공급 속도보다 1%씩 상승하도록 유속을 점진적으로 증가시키면서 1400 시간(2개월) 동안 운전하였다. 적응진화 배양기 내의 미생물 군집 농도는 오버플로우되는 배양액의 600nm OD(optical density)로 측정하였다.
1-3. 생장속도 증가 유도 적응진화 이후 미생물 군집의 생장속도와 세포에너지(ATP)
생장속도 증가 유도 적응진화를 위해 연속 배양기에서 배지의 공급속도를 배양기 내의 미생물 군집의 생장속도를 고려하여 점진적으로 증가시키면서 배양을 수행하여, 증가된 배지의 공급속도 및 배양액의 오버플로우에 적응하여 생장속도가 증가된 미생물만 배양기 중 배양액에서 유지시켰다. 1400시간의 연속 배양 후 수득된 미생물 군집의 생장속도 및 세포에너지(ATP)를 측정했다.
도 2는 연속식 적응진화 배양 동안 측정된 OD600 및 비생장속도(specific growth rate)를 보여준다. 접종시 0.4 h-1였던 생장속도는 점진적으로 증가된 유속에서도 워시아웃 (wash-out) 되지 않도록 증가하여 1400시간 배양 시 배양기 내 미생물의 생장속도는 1.31 h-1로 초기 대비 3.3배 증가되었고, OD는 3.86였다.
또한, 생장속도 증가 유도 적응진화 배양에 따라 배양액 내 미생물 군집의 세포내 에너지를 비교하기 위하여, 적응진화 연속 배양의 초기 배양액과 최종 배양액 시료 내의 ATP 농도를 측정하였다. ATP 농도는 ATP determination kit(FL-AA; Sigma Chemical, St. Louis, MO) 및 루미노미터(luminometer)(20/20n Luminometer System, Turner Biosystems, Sunnyvale, CA)와 ATP 표준을 이용하여 나 등의 방법에 따라 측정하였다(J Ind. Microbiol. Biotechnol. 42 (6), 915-924). 메주에서 유래된 미생물 군집의 초기 배양액에 포함된 세포내 평균 ATP량은 0.432 μmole/g-DCW이었고 1400 시간의 적응진화 연속 배양 후 최종 배양액에 포함된 세포내 평균 ATP량은 1.298 μmole/g-DCW로, 적응진화 이전보다 3배 정도 증가된 세포내 에너지량을 보였다. 세포내 에너지량은 헴철이 관련된 호흡에 의한 에너지 생성을 통해 헴철 생산능을 반영한다. 헴철은 구체적으로 시토크롬c, 전자전달효소복합체 III, 전자전달효소복합체 IV (시토크롬c 산화효소) 등을 통해 호흡에 의한 에너지 생성에 관여한다. 하기 표 1에 결과가 표시된다.
메주 유래 미생물 군집의
적응진화 이전		 메주 유래 미생물군집의
적응진화 이후
연속배양기 희석률 (=미생물군집 생장속도) 0.4 h-1 0.131 h-1
세포당 ATP 농도 0.612 ± 0.051
μmole/g-DCW		 1.327 ± 0.155
μmole/g-DCW
실시예 2. 헴철 생산능에 의한 단일 균주의 선별
실시예 1-2에서 1400시간의 적응진화 완료 후 수득된 생장속도 증가 유도 적응진화 연속배양기의 오버플로우 배양액 0.01 mL을 고체형 YSGM9-agar 평판배지 20 mL (조성: YSGM9배지 + 18 g agar)를 포함하는 플레이트에 도말한 후 30℃에서 24시간 동안 정치배양하였다. 평판배지에 생장한 콜로니들 중 크기가 큰 콜로니 5개를 선별하고, 선별된 5개의 콜로니를 각각 15 mL의 YSGM9 배지를 포함하는 테스트 튜브에 접종하고 24시간 동안 30℃에서 250 rpm으로 진탕 배양한 후, 배양액에 생성된 헴철 농도를 정량하였다. 대조군으로, 그람음성 박테리아의 지표 균주인 야생형 대장균 ATCC 27325과 그람양성 박테리아의 지표 균주인 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 동일한 조건에서 배양하였다.
구체적으로, 테스트 튜브 배양에 의해 수득된 선별된 콜로니의 배양물과 대조군의 배양물을 각각 4℃에서 3,000g로 15분 동안 원심분리하여 적색으로 착색된 균체를 회수하고, 증류수로 2회 세척하였다. 수득된 균체를 15 ml의 증류수에 현탁시키고, 1초 간격의 30W로 설정된 초음파 파쇄기(sonicator)(UP200S, Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany)를 이용하여, 얼음 상에서 20분 동안 파쇄시켰다. 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리를 수행하여 세포 파쇄물을 제거하고, 상층액을 65℃ 수조에서 30분 동안 보관하였다. 그 후, 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리를 수행하여 단백질 침전물을 제거하고 그 상층액을 이용하여 헴철 추출물을 수득하였다. 적색의 색소인 헴철을 차가운 산-아세톤 추출 방법(Di Iorio, E.E., Methods Enzymol, 1981. 76: p. 57-72)을 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 수득된 세포 추출물의 상층액을 -20℃에서 교반 하에 100 ml의 산-아세톤(99.8 ml의 아세 톤 + 0.2 ml의 10 N HCl)에 소량씩 적가하였다. 그 후, 상기 용액을 -20℃에서 30 분간 10,000g로 원심분리하였다. 침전물에서 적색을 완전히 제거하기 위해 상기 추출 과정을 반복하였다. 그 후, 수득된 산-아세톤을 10N NaOH를 첨가하여 중화시키고 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 증발시켰다. 증발 후 잔류된 용액을 동결건조시켜 정제된 헴철 추출물을 수득하였다. 철의 양은 [Fe(NH4)2(SO4·6H2O]를 표준으로 이용한 오르토-페난트롤린 비색법(Volkova, T.N.and N.V. Patrina, Lab Delo, 1967. 2: 97-8)을 이용하여 결정하였고, 헴철 농도는 C18 컬럼(Xbridge, Waters Co.) 및 400 nm에서의 UV 검출기가 구비된 HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA)을 이용하여 측정했다(J Microbiol Biotechnol. 2015;25(6):880-6). HPLC 분석은 1M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.16)을 메탄올과 14:86(v/v)으로 혼합한 용액을 이동상으로 이용하여 1 mL/분의 등속 조건에서 수행하였다. 헤민 클로라이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 정량 표준 곡선을 작성하기 위해 이용했다. 1400시간의 생장속도 증가 유도 적응진화의 연속배양을 통해 선별된, 생장속도가 증가된 미생물의 배양에서 수득된 헴철의 정량 결과가 하기 표 2에 표시된다.
콜로니 헴철 함량(μM/g-DCW)
대장균(그람음성 대조군) 0.040
코리네박테리움 글루타미쿰 (그람양성 대조군) 0.039
콜로니 #1 0.075
콜로니 #2 0.094
콜로니 #3 0.124
콜로니 #4 0.077
콜로니 #5 0.108
적응진화의 연속배양을 통해 수득된 미생물 군집 중에서 헴철 생산능이 가장 우수한 콜로니 #3 균주를 메주 유래 미생물 군집으로부터 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된 균주로 선별하고 HEMO-S 균주(S는 Soy 유래를 의미)로 명명하였다.
실시예 3. 선별 균주의 동정
실시예 2에서 선별된 HEMO-S 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 분석법을 사용하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 전문기관인 (주)바이오닉스에 의뢰하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 서열은 서열번호 1로 확인되었고, GenBank 데이터베이스를 이용한 BALSTn 상동성 분석을 통해 Bacillus subtilis 균주와 가장 높은 일치율(일치율 99.45 %)을 보였다. 이에 16S rRNA 서열에 근거하여, 메주로부터 유래된 미생물 군집에서 분리된 HEMO-S 균주를 바실러스 서브틸리스 HEMO-S로 명명하고, 2020년 03월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC14156BP로 기탁하였다.
실시예 4. 선별된 균주를 이용한 헴철 생산
메주로부터 유래된 미생물 군집으로부터 적응진화를 통해 선별되고 동정된 바실러스 서브틸리스 HEMO-S의 헴철 생산 및 그에 의해 수득된 헴철 추출물을 분석하였다.
바실러스 서브틸리스 HEMO-S의 균체 증식을 위해 균주를 1 L의 YSGM9 배지를 포함하는 대용량 삼각플라스크 (2.8 L)에 접종하고 2일간 30℃에서 200 rpm으로 진탕배양하여 균체를 증식시켰다. 2일 후 배양액의 흡광도 OD=12.0이었고, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정된 배양액 중 헴철 함량은 0.0133 μM/g-DCW으로 분석되었다.
1 L의 배양액을 원심분리(10 min, 4℃, 4000 rpm)하여 균체(펠렛)와 상층액을 얻었다. 상층액 제거 후 펠렛은 60℃의 대류형 오븐에서 24시간 동안 완전히 건조하였다. 건조 균체 1g을 증류수 100 mL에 재현탁하여 건조 균체의 농도를 10 g/L의 농도로 맞추었다. 10 g/L의 건조 균체 현탁액 중 10 mL를 121℃에서 15분간 살균하여 a 시료를 준비하고, 동일한 현탁액 10 mL은 살균과정 없이 b 시료로 준비하였다. 그 후, 시료 a 및 b를 각각 10분간 진탕하여 가용 성분을 추출하고, 원심분리(10 min, 4℃, 13000 rpm)로 세포 파편을 제거한 후 수용액에 포함된 가용 단백질 회수율과 헴철 흡광도를 측정하였다. 결과가 하기 표 3 및 도 3에 표시된다.
균체 농도 (mg/mL) 균체 중
총 단백질 (mg/mL) 		가용 단백질
농도 (mg/mL) 		총 단백질 중
가용 단백질 비율 		추출에 의한
가용 단백질
회수율
멸균 시료(a) 10 4.26 0.460 10.91% 4.60%
비멸균 시료(b) 10 4.27 0.317 7.41% 3.17%
바실러스 서브틸리스 HEMO-S의 건조균체에서 멸균처리 및 비멸균처리 시료로부터 각각 4.6 %, 3.2 %의 수용성 단백질이 회수되었다. 흡광도 측정 결과 멸균처리 및 비멸균처리 시료 모두에서 헴철의 407 nm의 파장을 흡수하였다. 따라서 추출된 가용성분은 헴철을 포함하는 단백질임을 확인하였다. 멸균처리된 건조균체 시료에서 비멸균처리 건조균체 시료 대비 가용 단백질의 비율이 높아서, 헴철을 포함하는 헴단백질의 비율이 더 높다는 것을 보여준다.
<110> Hemolab Ltd. Co. <120> {Heme-iron producing microorganism obtained from microbiome of fermented soybeans via adaptive evolution and use thereof <130> PN200096 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1448 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 tttagagttt tggattatgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt 60 cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120 ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg 180 tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct accacttaca gatggacccg 240 cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 420 gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc 480 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 540 cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta 600 agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga 660 gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 720 acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaaagcgtgk 780 skmgcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 840 agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 900 ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 960 gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag 1020 agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1080 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1140 ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1200 caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg 1260 gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc 1320 tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1380 atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1440 gtcggtga 1448

Claims (6)

  1. KCTC14156BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HEMO-S 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 유전자 조작 없이 적응진화에 의해 수득된 것인 균주.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는 것인 균주.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 그람 양성 세균의 지표 미생물인 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 비해 증가된 헴철 생산능을 갖는 것인 균주.
  5. 청구항 1의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HEMO-S 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 헴철을 생산하는 방법.
  6. 청구항 1의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HEMO-S 균주의 배양물, 또는 그로부터 분리된 헴철을 포함하는, 철분 공급용 조성물.
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