CN115103901A - 用于培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了关于培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。

Description

用于培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月2日提交的美国临时申请号62/882,021；2019年9月10日提交的美国临时申请号US 62/898,372；以及2020年2月7日提交的美国临时申请号62/971,391的权益；所述申请的每一者的全部内容通过此引用以其全文并入本文。
背景技术
人的微生物群系的组成在其健康和幸福中可以起着重要作用。实际上，破坏个体的微生物群系与多种疾病(包括炎性肠病、免疫障碍、2型糖尿病、神经退行性障碍、心血管疾病和癌症)有关。因此，微生物群系调节是用于此类疾病的有吸引力的治疗策略。
一种调节人的微生物群系的方式是向其口服施用一种或多种有益细菌的菌株。然而，已经证明许多细菌菌株的大规模生产具有挑战性，特别是对于需要血红蛋白(或其衍生物例如氯化血红素)用于生长的细菌菌株的事实，已经阻碍了这种疗法的发展。
血红蛋白是红细胞中的含铁金属蛋白，其可捕获肺中的大气中的氧气并将其运送到身体的其他部位。铁是几乎所有生命形式(包括细菌)的必需营养素。由于血红蛋白是人体内最丰富的铁储库，因此构成人类微生物群系的许多细菌都将血红蛋白或其衍生物用作铁的主要来源。通常，此类血红蛋白依赖性细菌需要存在血红蛋白或氯化血红素用于最佳的体外生长。然而，商业血红蛋白及其衍生物典型地从动物来源(例如从猪血)进行纯化，这使得经纯化的血红蛋白很昂贵。此外，血红蛋白的动物来源可能在某些群体中引发伦理和/或宗教反对。最后，不容易获得GMP(优质生产规范)级的血红蛋白，这使得大规模用于制药目的的血红蛋白依赖性细菌的生产特别具有挑战性。
因此，非常需要在没有血红蛋白、其衍生物或任何其他动物来源的组分的情况下能够使血红蛋白依赖性细菌最佳生长的组合物和方法。
发明内容
如本文所证明的，可以使用某些血红蛋白替代品(例如蓝藻细菌(包括含蓝藻细菌的生物质)和/或蓝藻细菌衍生的组分)代替血红蛋白以促进血红蛋白依赖性细菌在培养物中的生长。在不存在血红蛋白或其衍生物和/或使用减少量的血红蛋白或其衍生物的情况下，本文提供的血红蛋白替代品支持血红蛋白依赖性细菌的生长。
例如，如本文所证明的，螺旋藻属和/或某些螺旋藻属衍生的组分(例如，可溶性螺旋藻属组分)可以代替血红蛋白在生长培养基中使用，以促进其他血红蛋白依赖性细菌(包括普雷沃菌属细菌(例如栖组织普雷沃菌)、粪杆菌属细菌、Fournierella细菌、副拟杆菌属细菌、拟杆菌属细菌和Allistipes属细菌)的体外培养。螺旋藻属是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻蓝藻细菌的生物质，其在墨西哥和一些非洲国家已经被人类食用了几个世纪。最近，螺旋藻属被认为是蛋白质和许多营养素的丰富来源，因此通常作为营养补品食用。由于螺旋藻属相对便宜、素的、按犹太教规供应的(Kosher)且易于获得GMP级，因此它在细菌细胞培养应用中是血红蛋白的有吸引力的替代品。
在某些方面，本文提供了允许在不存在血红蛋白、血红蛋白衍生物和/或(在某些实施例中)任何动物产品的情况下培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。在不存在血红蛋白的情况下，血红蛋白依赖性细菌的生长是通过在细胞培养基中包含本文提供的某些血红蛋白替代品来完成的。在某些实施例中，该血红蛋白替代品是蓝藻细菌(例如，节旋藻属(例如钝顶节旋藻和/或极大节旋藻)的蓝藻细菌)，其能够代替血红蛋白以支持血红蛋白依赖性细菌的生长。在某些实施例中，该血红蛋白替代品是蓝藻细菌(例如，螺旋藻属)的生物质，其能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长。在某些实施例中，该血红蛋白替代品是蓝藻细菌的组分(例如，节旋藻属(例如钝顶节旋藻和/或极大节旋藻)的蓝藻细菌的组分)(例如，其可溶性组分)，其能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长。在一些实施例中，该血红蛋白替代品是绿藻，其能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长。在某些实施例中，该血红蛋白替代品是绿藻的组分(例如，可溶性组分)，其能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长。
因此，在某些方面，本文提供了用于在生长培养基(包括本文提供的血红蛋白替代品)中培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。在一些方面，本文提供了包含本文提供的可用于在无血红蛋白或其衍生物的条件下培养血红蛋白依赖性细菌的血红蛋白替代品的组合物(例如，生长培养基)，以及制造和/或使用此类组合物的方法。
在一些实施例中，在本文提供的方法和组合物中使用的血红蛋白替代品是螺旋藻属或其组分(即，能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长的螺旋藻属组分，例如可溶性螺旋藻属组分)。例如，本文提供了用于在生长培养基(包括螺旋藻属或其组分(例如，其可溶性组分))中培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。在一些方面，本文提供了包含可用于在无血红蛋白或其衍生物的条件下培养血红蛋白依赖性细菌的螺旋藻属或其组分的组合物(例如，生长培养基)，以及制造和/或使用此类组合物的方法。在一些实施例中，该螺旋藻属的组分包含叶绿素A。
在某些方面，本文提供了用于在培养血红蛋白依赖性细菌中使用的生长培养基，该生长培养基包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)。在一些实施例中，该生长培养基包含血红蛋白依赖性细菌。在某些实施例中，本文提供了本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)，该血红蛋白替代品用于作为在生长培养基中用于血红蛋白依赖性细菌的血红蛋白或衍生物的替代品使用。
在某些方面，本文提供了培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括在包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中孵育血红蛋白依赖性细菌(例如，在不存在血红蛋白或其衍生物的情况下)。在一些方面，本文提供了培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括(a)向生长培养基中添加本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)和血红蛋白依赖性细菌；以及(b)在生长培养基中孵育该血红蛋白依赖性细菌。
在某些方面，本文提供了包含生长培养基的细菌组合物，该生长培养基包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)和血红蛋白依赖性细菌。
在某些方面，本文提供了在生长培养基中包含血红蛋白依赖性细菌的生物反应器，该生长培养基包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)。在一些实施例中，本文提供了培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括包括在本文提供的生物反应器中孵育血红蛋白依赖性细菌。
在一些实施例中，该生长培养基包含螺旋藻属。在一些实施例中，该生长培养基包含至少0.5g/L、至少0.75g/L、至少1g/L、至少1.25g/L、至少1.5g/L、至少1.75g/L、至少2g/L、至少2.25g/L、至少2.5g/L、至少2.75g/L、至少3g/L、至少3.25g/L、至少3.5g/L、至少3.75g/L、至少4g/L、或至少4.25g/L的螺旋藻属。在一些实施例中，该生长培养基包含至少1g/L并且不超过2g/L的螺旋藻属。在一些实施例中，该生长培养基包含约1g/L的螺旋藻属。在一些实施例中，该生长培养基包含约2g/L的螺旋藻属。在一些实施例中，该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex 21D、和/或葡萄糖。在一些实施例中，该生长培养基包含约5g/L葡萄糖、约10g/L酵母提取物19512、约10g/L大豆蛋白胨A2 SC 19649、约10g/L大豆蛋白胨E110 19885、约2.5g/L磷酸氢二钾K2HPO4、和约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。在一些实施例中，该生长培养基在5.5至7.5的pH下。在某些实施例中，该生长培养基在约6.5的pH下。在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。在某些实施例中，该生长培养基不包含动物产品。
在一些实施例中，在本文提供的方法和组合物中使用的血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、和/或蓝藻细菌组分(即，能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长的蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、和/或蓝藻细菌组分)。在某些实施例中，任何能够作为血红蛋白替代品发挥作用的蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分均可以在本文提供的方法和组合物中使用。在某些实施例中，该蓝藻细菌是颤藻目。在一些实施例中，该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属(Arthrospira)、Blennothrix、发毛针藻属(Crinalium)、吉特勒氏线状蓝细菌属(Geitlerinema)、Halomicronema、盐螺旋藻属(Halospirulina)、水鞘藻属(Hydrocoleum)、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮鞘丝藻属(Planktolyngbya)、拟浮丝藻属(Planktothricoides)、浮游蓝丝藻属(Planktothrix)、织线藻属(Plectonema)、Pseudonabaena、绮藻属(Pseudophormidium)、裂须藻属(Schizothrix)、螺旋藻属(Spirulina)、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、束藻属(Symploca)、Trichocoleus、束毛藻属(Trichodesmium)、或常丝藻属(Tychonema)。在一些实施例中，该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。在一些实施例中，该蓝藻细菌是螺旋藻属。
在一些实施例中，在本文提供的方法和组合物中使用的血红蛋白替代品是绿藻、绿藻生物质、和/或绿藻组分(即，能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长的绿藻、绿藻生物质、和/或绿藻组分)。在某些实施例中，任何能够作为血红蛋白替代品发挥作用的绿藻、绿藻生物质、或绿藻组分均可以在本文提供的方法和组合物中使用。在某些实施例中，该绿藻是小球藻目。在一些实施例中，该绿藻是以下属：粗刺藻属(Acanthosphaera)、星藻属(Actinastrum)、虚幻球藻属(Apatococcus)、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属(Chlorella)、绿微藻属(Chloroparva)、拟新月藻属(Closteriopsis)、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属(Diacanthos)、双细胞藻属(Dicellula)、双月藻属(Dicloster)、胶网藻属(Dictyosphaerium)、对囊藻属(Didymogenes)、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属(Geminella)、胶丝藻属(Gloeotila)、拟多芒藻属(Golenkiniopsis)、黑氏球藻属(Hegewaldia)、旋孢藻属(Helicosporidium)、海尼球藻属(Heynigia)、亨氏球藻属(Hindakia)、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属(Keratococcus)、Kermatia、微小球藻属(Leptochlorella)、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属(Meyerella)、微芒藻属(Micractinium)、霉球藻属(Mucidosphaerium)、Muriella、微球藻属(Nannochloris)、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属(Parachlorella)、浮小球藻属(Planktochlorella)、Podohedra、无绿藻属(Prototheca)、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属(Siderocelis)、Siderocelopsis、或虫绿藻属(Zoochlorella)。
在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌可以是任何需要存在血红蛋白或血红蛋白衍生物用于最佳生长的细菌(即，在不存在本文提供的螺旋藻属或其组分用于最佳生长)。在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属(Alistipes)、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)、真杆菌属(Eubacteriumc)/艰难杆菌属(Mogibacterium)、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属(Veillonella)。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是不明显另枝菌(Alistipes indistinctus)、沙氏另枝菌(Alistipes shahii)、替莫另枝菌(Alistipes timonensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)、解纤维拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、肠拟杆菌(Bacteroides intestinalis)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、Cloacibacillusevryensis、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、耳蜗形梭菌(Clostridium cocleatum)、Cutibacterium acnes、Eisenbergiella物种、韦荣球菌科物种、霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)/Anaerobutyricum halii、娇弱真杆菌(Eubacterium infirmum)、微核巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、泪腺嗜胨菌(Peptoniphilus lacrimalis)、Rarimicrobium hominis、Shuttleworthia satelles、或Turicibacter sanguinis。
在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种的菌株。在一些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株B 50329的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、CRISPR序列)包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株B50329(NRRL登录号B 50329)的基因组序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)的16S序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)。
在一些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株C(ATCC保藏号PTA-126140，保藏于2019年9月10日)的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、CRISPR序列)包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株C(PTA-126140)的基因组序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株C(PTA-126140)的16S序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该栖组织普雷沃菌菌株是普雷沃菌属菌株C(PTA-126140)。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是包含表1中所列的一种或多种蛋白质的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌来自基本上不含表2中所列的一种或多种蛋白质的普雷沃菌属的菌株。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Fournierella属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Fournierella菌株A。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性Fournierella菌株是与Fournierella菌株B(ATCC保藏号PTA-126696，保藏于2020年3月5日)的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、CRISPR序列)包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该Fournierella菌株是与Fournierella菌株B(PTA-126696)的基因组序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该Fournierella菌株是与Fournierella菌株B(PTA-126696)的16S序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，该Fournierella菌株是Fournierella菌株B(PTA-126696)。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株A。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株B。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是拟杆菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是拟杆菌属菌株A。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Allistipes属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Allistipes菌株A。
在一些实施例中，该生长培养基包含至少0.5g/L、至少0.75g/L、至少1g/L、至少1.25g/L、至少1.5g/L、至少1.75g/L、至少2g/L、至少2.25g/L、至少2.5g/L、至少2.75g/L、至少3g/L、至少3.25g/L、至少3.5g/L、至少3.75g/L、至少4g/L、或至少4.25g/L的本文提供的血红蛋白替代品。在一些实施例中，该生长培养基包含至少1g/L并且不超过2g/L的本文提供的血红蛋白替代品。在一些实施例中，该生长培养基包含约1g/L的本文提供的血红蛋白替代品。在一些实施例中，该生长培养基包含约2g/L的本文提供的血红蛋白替代品。在一些实施例中，该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC19649、大豆蛋白胨E110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex 21D、和/或葡萄糖。在一些实施例中，该生长培养基包含约5g/L葡萄糖、约10g/L酵母提取物19512、约10g/L大豆蛋白胨A2 SC 19649、约10g/L大豆蛋白胨E110 19885、约2.5g/L磷酸氢二钾K2HPO4、和约0.5g/LL-半胱氨酸-HCl。在一些实施例中，该生长培养基在5.5至7.5的pH下。在某些实施例中，该生长培养基在约6.5的pH下。
在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。在某些实施例中，该生长培养基不包含动物产品。
在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，与不含血红蛋白替代品的生长培养基(例如，不存在血红蛋白)中的生长速率相比，血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中以增长的速率生长。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌在包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、或至少400％。在一些实施例中，该生长速率增加200％至400％。
在本文提供的方法和组合物的某些实施例中，与不含血红蛋白替代品的生长培养基(例如，不存在血红蛋白)中的细胞密度相比，血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中生长至更高的细胞密度。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌在包含本文提供的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、或至少400％。在一些实施例中，该细菌细胞密度增高200％至400％。
在某些方面，本文提供了包含本文披露的血红蛋白依赖性细菌和本文披露的血红蛋白替代品的细菌组合物(例如，药物组合物)。
附图说明
图1示出了维生素B12和/或FeCl2不能替代血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。图1在补充有0.02g/L或0.2g/L维生素B12、FeCl2、或两者的组合的生长培养基(与没有任何补充剂的生长培养基相比)中培养的血红蛋白依赖性细菌栖组织普雷沃菌的生长曲线。
图2示出了螺旋藻属(但非叶绿酸)在不存在血红蛋白的情况下支持血红蛋白依赖性细菌的生长。图2示出了在补充有0.02g/L或0.2g/L螺旋藻属或叶绿酸的生长培养基(与没有任何补充剂的生长培养基相比)中培养的栖组织普雷沃菌的生长曲线。
图3示出了溶解于水中的螺旋藻属比溶解于0.01M NaOH中的螺旋藻属表现更好。图3示出了在补充有溶解于水中或0.01M NaOH的0.02g/L或0.2g/L螺旋藻属并且不存在血红蛋白的生长培养基中培养的栖组织普雷沃菌的生长曲线。
图4示出了螺旋藻属及其可溶性组分可以替代血红蛋白来支持血红蛋白依赖性细菌的生长。图4示出了与补充有血红蛋白或阴性对照的生长培养基相比，在补充有0.2g/L、或2g/L螺旋藻属(经过滤的或未经过滤的)或0.05g/L或0.1g/L叶绿酸的生长培养基中培养的栖组织普雷沃菌的生长曲线。
图5示出了与螺旋藻属一起培养的血红蛋白依赖性细菌(不存在血红蛋白)在功能上等同于与血红蛋白一起培养的那些。散点图示出了在不同培养基中生长的栖组织普雷沃菌对小鼠模型中的迟发型超敏反应(DTH)的功效。给小鼠的每个组群(每个组群5只小鼠)施用媒剂；1mg/kg地塞米松；1x109CFU的在包含1g/L螺旋藻属(V3)的BM1培养基(不含B12)中培养的栖组织普雷沃菌生物质；1x109CFU的在包含1g/L螺旋藻属(V4)的BM1培养基中培养的栖组织普雷沃菌生物质；1x109CFU的在包含1g/L螺旋藻属(V1)的SPYG1培养基中培养的栖组织普雷沃菌生物质；或10mg在包含血红蛋白的生长培养基中培养的栖组织普雷沃菌的粉末。散点图上的条形表示中位数和标准偏差。星号(***和****)指出与对照相比时具有统计学意义的值。
图6示出了螺旋藻属可以替代血红蛋白来支持血红蛋白依赖性细菌的生长。图6示出了在补充有1g/L螺旋藻属的SPY生长培养基(包含5g/L的N-乙酰基-葡糖胺(NAG))(与补充有0.02g/L血红蛋白、FeCl2或阴性对照的生长培养基相比)中培养的Fournierella菌株A的生长曲线。
图7示出了螺旋藻属可以替代血红蛋白来支持血红蛋白依赖性细菌的生长。图7示出了在补充有1g/L螺旋藻属的SPY生长培养基(包含5g/L的N-乙酰基-葡糖胺(NAG))(与补充有0.02g/L血红蛋白、FeCl2或阴性对照的生长培养基相比)中培养的Fournierella菌株B(PTA-126696)的生长曲线。NAG是指N-乙酰基-葡糖胺。
图8示出了螺旋藻属可以替代血红蛋白来支持血红蛋白依赖性细菌的生长。图8示出了在补充有1g/L螺旋藻属的SPYG5生长培养基(与补充有0.02g/L血红蛋白、FeCl2或阴性对照的生长培养基相比)中培养的副拟杆菌属菌株A的生长曲线。SPYG5是指补充有5g/L葡萄糖的SPY生长培养基(表6)。
图9示出了通过添加螺旋藻属(与血红蛋白相比)部分恢复了副拟杆菌属菌株B的生长。在不添加血红蛋白或螺旋藻属的情况下未观察到生长。
图10示出了在螺旋藻属存在下粪杆菌属菌株A的生长(与相同菌株在含有血红蛋白的培养基或缺乏螺旋藻属或血红蛋白的培养基的生长相比)。
图11示出了螺旋藻属的存在支持了拟杆菌属菌株A在其生长培养基中的生长。没有向培养基中添加螺旋藻属的菌株未生长。
图12示出了在含有螺旋藻属的培养基(与含有血红蛋白的培养基或不含螺旋藻属或血红蛋白的培养基相比)中Alistipes菌株A的生长。
具体实施方式
在某些方面，本文提供了允许在不存在血红蛋白、血红蛋白衍生物和/或(在某些实施例中)任何动物产品的情况下培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。特别地，本文披露了血红蛋白替代品，其可以在培养基中替代血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。在某些实施例中，该血红蛋白替代品可以是蓝藻细菌(例如，节旋藻(例如钝顶节旋藻和/或极大节旋藻)属的蓝藻细菌)、蓝藻细菌(例如，螺旋藻属)的生物质、蓝藻细菌的组分(例如，节旋藻(例如钝顶节旋藻和/或极大节旋藻)属的蓝藻细菌的组分和/或螺旋藻属的组分)、绿藻和或绿藻的组分。
因此，在某些方面，本文提供了用于在生长培养基(包括本文提供的血红蛋白替代品)中培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。在一些方面，本文提供了包含本文提供的可用于在无血红蛋白或其衍生物的条件下培养血红蛋白依赖性细菌的血红蛋白替代品的组合物(例如，生长培养基)，以及制造和/或使用此类组合物的方法。
定义
如本文所使用的，“厌氧条件”是与正常大气条件相比具有降低的氧水平的条件。例如，在一些实施例中，厌氧条件是其中氧水平是氧分压(pO2)不超过8％的条件。在一些情况下，厌氧条件是其中pO2不超过2％的条件。在一些情况下，厌氧条件是其中pO2不超过0.5％的条件。在某些实施例中，厌氧条件可以通过用除了氧以外的气体(例如，氮气和/或二氧化碳(CO2))吹扫生物反应器和/或培养瓶来实现。
如本文所使用的，血红蛋白的“衍生物”包括衍生自可以促进血红蛋白依赖性细菌的生长的血红蛋白的化合物。血红蛋白的衍生物的实例包括氯化血红素和原卟啉。
术语“基因”在广义上用于指与生物功能有关的任一核酸。术语“基因”适用于特定基因组序列以及由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。
两种核酸分子的核酸序列之间“同一性”可使用已知计算机算法(例如“FASTA”程序)使用例如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA“微生物群系”广泛地指栖居于受试者或患者的身体部位上或中的微生物。微生物群系中的微生物可包括细菌、病毒、真核微生物和/或病毒。微生物群系中的个别微生物可以是代谢活性、休眠、潜伏或作为孢子存在，可以浮游形式存在或存在于生物膜中，或可以可持续或短暂的方式存在于该微生物群系中。该微生物群系可以是共生或健康状态微生物群系或疾病状态微生物群系。该微生物群系对受试者或患者而言可以是天然的，或该微生物群系的组分可因健康状态(例如，癌前状态或癌状态)或处理条件(例如，抗生素治疗、暴露于不同微生物)的变化而经调整、引入或消耗。在一些方面中，该微生物群系出现于黏膜表面。在一些方面中，该微生物群系是肠道微生物群系。在一些方面中，该微生物群系是肿瘤微生物群系。
“菌株”是指具有基因签名的细菌物种的成员，从而其可与相同细菌物种的密切相关成员区分开来。基因签名可为不存在至少一种基因的全部或一部分、不存在至少一个调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)的全部或一部分、不存在(“消除”)至少一种天然质粒、存在至少一种重组基因、存在至少一种突变基因、存在至少一种外来基因(衍生自另一物种的基因)、存在至少一种突变调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)、存在至少一种非天然质粒、存在至少一种抗生素抗性盒或其组合。可通过PCR扩增且任选地随后进行一个或多个目的基因组区域或全基因组的DNA测序来鉴别不同菌株之间的基因签名。如果一种菌株(与相同物种的另一种菌株相比)已获得或失去抗生素抗性或获得或失去生物合成能力(例如营养缺陷型菌株)，则可通过选择或反选择分别使用抗生素或营养物/代谢物来区分菌株。
血红蛋白依赖性细菌
在一些方面，本文提供了用于培养血红蛋白依赖性细菌的方法和组合物。如本文所使用的，“血红蛋白依赖性细菌”是指当在缺乏血红蛋白、血红蛋白衍生物或螺旋藻属的生长培养基中培养时(与含有血红蛋白、血红蛋白衍生物或螺旋藻属的培养基相比)，其生长速率减慢和/或最大细胞密度降低的细菌。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌选自以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Fournierella属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Fournierella菌株A。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性Fournierella菌株是Fournierella菌株B(ATCC保藏号PTA-126696)。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性Fournierella菌株是与Fournierella菌株B(PTA-126696)的核苷酸序列(例如基因组序列、16S序列、CRISPR序列)包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株A。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株B。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是粪杆菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是粪杆菌属菌株A。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是拟杆菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是拟杆菌属菌株A。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Allistipes属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是Allistipes菌株A。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是以下物种：阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、产黑色素普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是不明显另枝菌、沙氏另枝菌、替莫另枝菌、凝结芽孢杆菌、产酸拟杆菌、解纤维拟杆菌、埃氏拟杆菌、肠拟杆菌、单形拟杆菌、产气柯林斯菌、Cloacibacillus evryensis、尸毒梭菌、耳蜗形梭菌、Cutibacterium acnes、Eisenbergiella物种、韦荣球菌科物种、霍氏真杆菌/Anaerobutyricum halii、娇弱真杆菌、微核巨球形菌、狄氏副拟杆菌、泪腺嗜胨菌、Rarimicrobium hominis、Shuttleworthiasatelles、或Turicibacter sanguinis。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株为普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是与普雷沃菌属菌株B 50329的核苷酸序列(例如基因组序列、16S序列、CRISPR序列)包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是普雷沃菌属菌株C(ATCC保藏号PTA-126140)。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是与普雷沃菌属菌株C(PTA-126140)的核苷酸序列(例如基因组序列、16S序列、CRISPR序列)包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多种)表1中所列的蛋白质和/或一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多种)编码表1中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌包含表1中所列的所有蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的所有基因。
表1：示例性普雷沃菌属蛋白
Figure BDA0003492191510000191
Figure BDA0003492191510000201
Figure BDA0003492191510000211
Figure BDA0003492191510000221
Figure BDA0003492191510000231
Figure BDA0003492191510000241
Figure BDA0003492191510000251
Figure BDA0003492191510000261
Figure BDA0003492191510000271
Figure BDA0003492191510000281
Figure BDA0003492191510000291
Figure BDA0003492191510000301
Figure BDA0003492191510000311
在一些实施例中，该普雷沃菌属细菌是不含或基本上不含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种)表2中所列的蛋白质和/或一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种)编码表2中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌不含表2中所列的所有蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的所有基因。
表2：其他普雷沃菌蛋白
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在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是包含表1中所列的蛋白质中的一种或多种且不含或基本上不含表2中所列的一种或多种蛋白质的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是包含表1中所列的所有蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的所有基因，且不含表2中所列的所有蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的所有基因的普雷沃菌属细菌的菌株。
血红蛋白替代品
如本文所披露的，某些藻类、藻类生物质和藻类衍生的组分能够在培养基中代替血红蛋白使用来促进其他血红蛋白依赖性细菌的生长。
本文提供的血红蛋白替代品在不存在血红蛋白或其衍生物的情况下，支持了血红蛋白依赖性细菌的生长。本文提供的血红蛋白替代品还可以与使用减少量的血红蛋白或其衍生物一起来支持的血红蛋白依赖性细菌的生长。例如，培养物含有较低量的血红蛋白(例如，少于约0.02g/L血红蛋白；例如，约0.01g/L或约0.005g/L或更少血红蛋白)与本文所述的血红蛋白替代品的组合，与相同的细菌在含有典型量的血红蛋白的培养基中的生长相比，还可实现血红蛋白依赖性细菌的相当的生长。
在一些实施例中，在本文提供的方法和组合物中使用的血红蛋白替代品是螺旋藻属或其组分(即，能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长的螺旋藻属组分，例如可溶性螺旋藻属组分)。如本文所披露的，螺旋藻属组分能够在过滤后促进血红蛋白依赖性细菌的生长，这表明螺旋藻属的可溶性组分是血红蛋白替代品。
在一些实施例中，在本文提供的方法和组合物中使用的血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、和/或蓝藻细菌组分(即，能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长的蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、和/或蓝藻细菌组分)。在某些实施例中，任何能够作为血红蛋白替代品发挥作用的蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分均可以在本文提供的方法和组合物中使用。在某些实施例中，该蓝藻细菌是颤藻目。在一些实施例中，该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。在一些实施例中，该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
在一些实施例中，在本文提供的方法和组合物中使用的血红蛋白替代品是绿藻、绿藻生物质、和/或绿藻组分(即，能够代替血红蛋白以支持其他血红蛋白依赖性细菌的生长的绿藻、绿藻生物质、和/或绿藻组分)。在某些实施例中，任何能够作为血红蛋白替代品发挥作用的绿藻、绿藻生物质、或绿藻组分均可以在本文提供的方法和组合物中使用。在某些实施例中，该绿藻是小球藻目。在一些实施例中，该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
在一些实施例中，例如在与生长培养基的其他组分合并之前，将血红蛋白替代品灭菌。可以通过超高温(UHT)处理、高压蒸汽灭菌或过滤进行灭菌。在一些实施例中，将血红蛋白替代品高压灭菌。在一些实施例中，将血红蛋白替代品过滤。
生长培养基
在一些实施例中，本文提供了包含本文披露的血红蛋白替代品的生长培养基。在某些实施例中，该生长培养基包含本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分(例如，可溶性组分))的量足以支持血红蛋白依赖性细菌的生长。在某些实施例中，该生长培养基包含至少0.5g/L、至少0.75g/L、至少1g/L、至少1.25g/L、至少1.5g/L、至少1.75g/L、至少2g/L、至少2.25g/L、至少2.5g/L、至少2.75g/L、至少3g/L、至少3.25g/L、至少3.5g/L、至少3.75g/L、至少4g/L、或至少4.25g/L的本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)。在一些实施例中，该生长培养基包含约1g/L的本文披露的血红蛋白替代品。在一些实施例中，该生长培养基包含约2g/L的本文披露的血红蛋白替代品。在一些实施例中，该本文提供的生长培养基包含至少1g/L并且不超过3g/L的本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)。在一些实施例中，该生长培养基包含至少1g/L并且不超过2g/L的本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)。在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。在一些实施例中，该生长培养基不包含动物产品。
在一些实施例中，该生长培养基含有螺旋藻属、蓝藻细菌或绿藻的组分，例如本文披露的螺旋藻属、蓝藻细菌或绿藻的可溶性组分。在一些实施例中，该生长培养基含有本文披露的螺旋藻属、蓝藻细菌或绿藻的可溶性组分。例如，从螺旋藻属溶液(例如，可以在生长培养基中使用重悬螺旋藻属溶液(例如，来自冻干的生物质的液体混合物))获得的上清液也可以用在生长培养基中(例如，在将螺旋藻属溶液过滤或离心后获得的上清液)。
在一些实施例中，该生长培养基可含有糖、酵母提取物、基于植物的蛋白胨、缓冲液、盐、微量元素、表面活性剂、消泡剂和/或维生素。
在一些实施例中，该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex 21D、和/或葡萄糖。
在一些实施例中，该生长培养基包含5g/L至15g/L酵母提取物19512。在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L酵母提取物19512。
在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。在一些实施例中，该生长培养基包含12.5g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨E110 19885。在一些实施例中，该生长培养基包含12.5g/L大豆蛋白胨E110 19885。在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L大豆蛋白胨E110 19885。
在一些实施例中，该生长培养基包含1g/L至3g/L磷酸氢二钾。在一些实施例中，该生长培养基包含1.59g/L磷酸氢二钾。在一些实施例中，该生长培养基包含2.5g/L磷酸氢二钾。
在一些实施例中，该生长培养基包含0g/L至1.5g/L磷酸二氢钾。在一些实施例中，该生长培养基包含0.91g/L磷酸二氢钾。在一些实施例中，该生长培养基不包含磷酸二氢钾。
在一些实施例中，该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L L-半胱氨酸-HCl。在一些实施例中，该生长培养基包含0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。
在一些实施例中，该生长培养基包含0g/L至1.0g/L氯化铵。在一些实施例中，该生长培养基包含0.5g/L氯化铵。在一些实施例中，该生长培养基不包含氯化铵。
在一些实施例中，该生长培养基包含0g/L至30g/L glucidex 21D。在一些实施例中，该生长培养基包含25g/L glucidex 21D。在一些实施例中，该生长培养基不包含glucidex 21D。
在一些实施例中，该生长培养基包含5g/L至15g/L葡萄糖。在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L葡萄糖。在一些实施例中，该生长培养基包含5g/L葡萄糖。
在一些实施例中，该生长培养基包含5g/L至15g/L N-乙酰基-葡糖胺(NAG)。在一些实施例中，该生长培养基包含10g/L NAG。在一些实施例中，该生长培养基包含5g/L NAG。
在某些实施例中，该生长培养基包含本文提供的血红蛋白替代品、约10g/L酵母提取物19512、约12.5g/L大豆蛋白胨A2SC 19649、约12.5g/L大豆蛋白胨E110 19885、约1.59g/L磷酸氢二钾、约0.91g/L磷酸二氢钾、约0.5g/L氯化铵、约25g/L glucidex 21D、和/或约10g/L葡萄糖。在一些实施例中，该生长培养基是表3的生长培养基。
在某些实施例中，该生长培养基包含本文提供的血红蛋白替代品、约10g/L酵母提取物19512、约10g/L大豆蛋白胨A2SC 19649、约10g/L大豆蛋白胨E110 19885、约2.5g/L磷酸氢二钾、约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl、和/或约5g/L葡萄糖。在一些实施例中，该生长培养基是表4的生长培养基。
在某些实施例中，该生长培养基在5.5至7.5的pH下。在一些实施例中，该生长培养基在约6.5的pH下。
在一些实施例中，在将蓝藻细菌、或其生物质(例如，螺旋藻属)添加至生长培养基之前，将其从冻干的生物质制备成液体混合物并通过高压蒸汽灭菌或过滤进行灭菌。在一些实施例中，将冻干的螺旋藻属的生物质添加至生长培养基，然后将其如下所述进行灭菌。
在一些实施例中，将培养基灭菌。可以通过超高温(UHT)处理、高压蒸汽灭菌或过滤进行灭菌。在极高温下实施短时间段的UHT处理。UHT范围可为135℃-180℃。例如，可在135℃下将培养基灭菌10至30秒。
培养方法
在某些方面，本文提供了促进血红蛋白依赖性细菌的生长的方法和/或组合物。此类方法可包括在本文提供的生长培养基中孵育血红蛋白依赖性细菌。该方法可包括保持如本文披露的生长培养基的温度和pH。可以在相对小体积的生长培养基(例如，1L)开始培养，其中允许细菌达到对数生长期。可以将这种培养物转移至较大体积的生长培养基(例如，20L)中用于进一步生长以达到更大生物质。根据生物质的最终量的需求，可以将这种转移重复超过一次。该方法可以包括在生物反应器中孵育血红蛋白依赖性细菌。
在某些方面，将血红蛋白依赖性细菌在35℃至39℃的温度下孵育。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌在约37℃的温度下孵育。
在某些实施例中，与不含本文披露的血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率相比，本文提供的方法和/或组合物增长了血红蛋白依赖性细菌的生长速率，使得血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中以增长的速率生长。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌在包含本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含本文披露的血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、或至少400％。在一些实施例中，该生长速率增加约200％至约400％。可以将速率测量为在给定量的时间内达到的细胞密度(如通过例如在600nm的波长处的光密度(OD600)测量)。在某些实施例中，在细菌生长的对数期(或指数期)期间测量并比较这种速率，任选地其中对数期是早期对数期。
在某些实施例中，与不含本文披露的血红蛋白替代品的生长培养基中的细胞密度相比，本文提供的该方法和/或组合物增加了细菌细胞密度，使得血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中生长至更高的细菌细胞密度。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌在包含本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含本文披露的血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、或至少400％。在一些实施例中，该细菌细胞密度高于约200％至约400％。可以在细菌生长的生长稳定期测量细胞密度(例如，通过OD600或通过细胞计数)，任选地其中生长稳定期是早期生长稳定期。在一些实施例中，将生长稳定期确定为生长速率减缓的阶段，随后是生长指数期(例如，来自生长曲线)。在其他实施例中，生长稳定期由生长培养基中的低葡萄糖水平确定。
在一些实施例中，本文提供的方法包括在厌氧气氛下孵育该血红蛋白依赖性细菌。在某些方面，本文提供了在包含CO2的厌氧气氛下培养血红蛋白依赖性细菌的方法。在一些实施例中，该厌氧气氛包含大于1％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含大于5％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、或至少25％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含至少10％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含至少20％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含从10％至40％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含从20％至30％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、或约40％CO2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约25％CO2。
在某些方面，该厌氧气氛包含N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含小于95％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含小于90％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含小于85％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含小于80％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含从65％至85％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含从70％至80％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约75％N2。
在一些实施例中，该厌氧气氛基本上由CO2和N2组成。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约25％CO2和约75％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约20％CO2和约80％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约30％CO2和约70％N2。
因此，在一些实施例中，与常规厌氧培养条件(例如，在大于1％CO2水平下，例如，在大于5％CO2水平下，例如在约25％CO2水平下)相比，本文提供了在包含较大水平CO2的厌氧条件下培养血红蛋白依赖性细菌的方法。在某些实施例中，与常规厌氧培养条件(例如，在大于1％CO2水平下，例如在约25％CO2水平下)相比，本文提供了包含在包含较大水平CO2的条件下培养的血红蛋白依赖性细菌的生物反应器。在一些实施例中，与常规培养条件相比，本文提供的方法和组合物导致细菌产量增加。
在某些方面，与常规厌氧培养条件(例如，在小于95％N2水平下，例如，在小于90％N2水平下，例如在约75％N2水平下)相比，本文提供了在包含较低水平N2的厌氧条件下培养血红蛋白依赖性细菌的方法。在某些实施例中，与常规厌氧培养条件(例如，在低于95％N2水平下，例如在约75％N2水平下)相比，本文提供了包含在包含较低水平N2的条件下培养的血红蛋白依赖性细菌的生物反应器。在一些实施例中，与常规培养条件相比，本文提供的方法和组合物导致细菌产量增加。
在某些方面，本文提供了培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用包含大于1％CO2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；和b)在经步骤a)吹扫的生物反应器中培养该血红蛋白依赖性细菌。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含大于1％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含至少约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、或约40％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、或40％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含从5％至35％CO2、10％至40％CO2、10％至30％CO2、15％至30％CO2、20％至30％CO2、22％至28％CO2、或24％至26％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含大于5％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含至少10％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含至少20％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含从10％至40％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含从20％至30％CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含约25％CO2。
在某些方面，本文提供了培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用包含小于95％N2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；和b)在经步骤a)吹扫的生物反应器中培养该血红蛋白依赖性细菌。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含小于95％N2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％N2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％N2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含小于95％N2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含小于90％N2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含从65％至85％N2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含从70％至80％N2CO2。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含约75％N2。
在一些实施例中，该厌氧气体混合物基本上由CO2和N2组成。在一些实施例中，该厌氧气体混合物包含约25％CO2和约75％N2。
在一些实施例中，该厌氧气氛包含约20％CO2和约80％N2。在一些实施例中，该厌氧气氛包含约30％CO2和约70％N2。
在一些实施例中，该厌氧气体混合物以约1:99、约2:98、约3:97、约4:96、约5:95、约6:94、约7:93、约8:92、约9:91、约10:90、11:89、约12:88、约13:87、约14:86、约15:85、约16:84、约17:83、约18:82、约19:81、约20:80、21:79、约22:78、约23:77、约24:76、约25:75、约26:74、约27:73、约28:72、约29:71、约30:70、31:69、约32:68、约33:67、约34:66、约35:65、约36:64、约37:63、约38:62、约39:61、或约40:50的比率包含CO2和N2。在一些实施例中，该混合气体组合物提供了以约25:75的比率包含CO2和N2的生物反应器中的气氛。
在一些实施例中，在培养期间将厌氧气体混合物连续添加至生物反应器。在一些实施例中，以0.01至0.1vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以0.02vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含以上所述的气体混合物中的任一种。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括用血红蛋白依赖性细菌接种生长培养基的步骤，其中根据本文提供的方法在生长培养基中培养细菌。在一些实施例中，接种的血红蛋白依赖性细菌的体积在生长培养基的0.01％和10％v/v之间(例如，生长培养基的约0.1％v/v、生长培养基的约0.5％v/v、生长培养基的约1％v/v、生长培养基约5％v/v)。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌的体积是约1mL。
在一些实施例中，接种物可以在监测生长的烧瓶或较小生物反应器中制备。例如，该接种物大小可以是总生物反应器体积的大约0.1％v/v至5％v/v之间。在一些实施例中，该接种物是总生物反应器体积的0.1％-3％v/v、0.1％-1％v/v、0.1％-0.5％v/v、或0.5％-1％v/v。在一些实施例中，该接种物是总生物反应器体积的约0.1％v/v、约0.2％v/v、约0.3％v/v、约0.4％、v/v、约0.5％v/v、约0.6％v/v、约0.7％v/v、约0.8％v/v、约0.9％v/v、约1％v/v、约1.5％v/v、约2％v/v、约2.5％v/v、约3％v/v、约4％、v/v、或约5％v/v。
在一些实施例中，在接种之前，用生长培养基在所需的pH和温度下制备生物反应器。培养基的初始pH可不同于处理设定点。pH应激在低细胞浓度下可以是不利的；初始pH可在pH 7.5与处理设定点之间。例如，pH可设定于4.5与8.0之间，优选6.5。在发酵期间，pH可通过使用氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵进行控制。温度可控制于25℃至45℃，例如在37℃下。
在一些实施例中，取决于菌株及接种物大小，生物反应器发酵时间可有所变化。例如，发酵时间可从5小时至48小时有所变化。在一些实施例中，发酵时间可以是从5小时至24小时、8小时至24小时、8小时至18小时、8小时至16小时、8小时至14小时、10小时至24小时、10小时至18小时、10小时至16小时、10小时至14小时、10小时至12小时、12小时至24小时、12小时至18小时、12小时至16小时、或12小时至14小时。
在一些实施例中，培养血红蛋白依赖性细菌包括在50至300的RPM下搅拌该培养物。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌在约150的RPM下搅拌。
例如，在一些实施例中，培养方法包括培养血红蛋白依赖性细菌至少5小时(例如，至少10小时)。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养10-24小时。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养14至16小时。在一些实施例中，该方法进一步包括在生长培养基中接种约5％v/v的经培养的细菌的步骤。在一些实施例中，该生长培养基是约20L体积。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养10-24小时。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养12-14小时。在一些实施例中，该方法进一步包括在生长培养基接种约0.5％v/v的经培养的细菌的步骤。在一些实施例中，该生长培养基是约3500L体积。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养10-24小时。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养12-14小时。在一些实施例中，将血红蛋白依赖性细菌培养至少直到达到生长稳定期。
在某些实施例中，该培养方法进一步包括收获经培养的细菌的步骤。收获时间可以基于葡萄糖水平低于2g/L或达到生长稳定期时。在一些实施例中，该方法进一步包括在收获后离心经培养的细菌的步骤(例如，以产生细胞糊)。在一些实施例中，该方法进一步包括用稳定剂溶液稀释细胞糊以产生细胞浆液。在一些实施例中，该方法进一步包括冻干细胞浆液的步骤以产生粉末的步骤。在一些实施例中，该方法进一步包括用γ辐照照射该粉末。
例如，在一些实施例中，一旦发酵完成，将培养物冷却(例如，至10℃)并离心收集细胞糊。可以将稳定剂添加至细胞糊中并充分混合。可通过连续离心实施收获。产品可用各种赋形剂重新悬浮至所需的最终浓度。可添加赋形剂以用于冷冻保护或用于冻干期间的保护。赋形剂可包括但不限于蔗糖、海藻糖或乳糖，且可替代地这些赋形剂可与缓冲剂及抗氧化剂混合。在冻干之前，可以将细胞沉淀物液滴与赋形剂混合并浸没于液氮中。
在某些实施例中，可以将细胞浆液冻干。可以自一级干燥开始来冻干材料(包括活细菌)。在一级干燥期期间，去除冰。在此处，生成真空且将适当量的热量供应至材料以使冰升华。在二级干燥期期间，可以去除结合产物的水分子。在此处，将温度升至高于一级干燥期以裂解已在水分子与产物材料之间形成的任何物理-化学相互作用物。还可进一步降低压力以增强此阶段期间的解吸。在冷冻干燥处理完成之后，可使用惰性气体(例如氮)填充室。可将产物在干燥条件下密封于冷冻干燥器内，从而防止暴露于大气水及污染物。可以将冻干材料进行γ照射(例如，17.5kGy)。
生物反应器
在某些方面，本文提供了包含本文提供的生长培养基(即，包含本文披露的血红蛋白替代品(例如，螺旋藻属或其组分)的生长培养基)和/或本文提供的血红蛋白依赖性细菌的生物反应器。在一些实施例中，该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属细菌(例如，本文提供的普雷沃菌属菌株)。在一些实施例中，本文提供了在此类生物反应器中培养细菌的方法。
在某些实施例中，该生物反应器处于上述厌氧条件下。在某些方面，本文提供了在以上所披露的厌氧气氛下包含血红蛋白依赖性细菌的生物反应器。在某些方面，本文提供了不同大小的生物反应器。在一些实施例中，该生物反应器是至少1L体积、至少5L体积、至少10L体积、至少15L体积、至少20L体积、至少30L体积、至少40L体积、至少50L体积、至少100L体积、至少200L体积、至少250L体积、至少500L体积、至少750L体积、至少1000L体积、至少1500L体积、至少2000L体积、至少2500L体积、至少3000L体积、至少3500L体积、至少4000L体积、至少5000L体积、至少7500L体积、至少10,000L体积、至少15,000L体积、或至少20,000L体积。在一些实施例中，该生物反应器是约1L体积、约5L体积、约10L体积、约15L体积、约20L体积、约30L体积、约40L体积、约50L体积、约100L体积、约200L体积、约250L体积、约500L体积、约750L体积、约1000L体积、约1500L体积、约2000L体积、约2500L体积、约3000L体积、约3500L体积、约4000L体积、约5000L体积、约7500L体积、约10,000L体积、约15,000L体积、或约20,000L体积。
实例
实例1：材料和方法
生长培养基的制备
通过在0.01M NaOH中溶解猪血红蛋白来制备血红蛋白溶液。通过高压蒸汽灭菌对该溶液进行灭菌。使用20mg/L或200mg/L的工作浓度。
通过粉末化螺旋藻属片剂来并在水中或0.01M NaOH中溶解粉末制备螺旋藻属。将溶液通过高压蒸汽灭菌进行灭菌，并在不同工作浓度(例如，0.02g/L、0.2g/L、或2g/L)下添加至生长培养基。
将叶绿酸(西格玛公司，目录号11006-34-1)溶解于水或0.01M NaOH中并高压灭菌，然后在0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、或0.2g/L的最终浓度下添加至生长培养基。
将维生素B12和FeCl2作为生长补充剂单独或以组合形式进行测试。通过将维生素B12溶解在水中并使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌来制备其溶液。
生长分析
每个生长分析进行四次重复。每种培养物使用来自冷冻细胞库的0.1％接种物。如下所述，细菌在SPYG1培养基中生长。通过在读板器上每30分钟测量一次光密度(OD600)持续48小时，同时在37℃的厌氧环境中培养来测量细菌生长的动力学。
实例2:血红蛋白依赖性细菌的示例性制造方法
本文提出了血红蛋白依赖性细菌(例如，栖组织普雷沃菌)的示例性制造方法。在此示例性方法中，该血红蛋白依赖性细菌在包含表4中所列的组分的生长培养基中生长。在使用之前将培养基进行过滤灭菌。
表3：示例性生长培养基
Figure BDA0003492191510000541
Figure BDA0003492191510000551
表4：另一种示例性生长培养基(SPYG1培养基)
Figure BDA0003492191510000552
简而言之，用1mL已储存在-80℃下的细胞库样品接种1L的瓶子。由于此菌株对有氧条件的敏感性，所以将这种接种的培养物在37℃、pH＝6.5下的厌氧室中进行孵育。当瓶子达到对数生长期(生长大约14至16小时后)时，在5％v/v下使用培养物接种20L生物反应器。对数生长期(生长大约10至12小时后)期间，在0.5％v/v下使用培养物接种3500L生物反应器。
将发酵培养物与以0.02VVM添加的混合气体(25％CO2和75％N2的组合物)连续混合。用氢氧化铵将pH保持在6.5，并将温度控制在37℃。收获时间取决于何时达到生长稳定期(生长大约12至14小时后)。
一旦发酵完成，将培养物冷却至10℃，离心并收集所得的细胞糊。将10％稳定剂添加到细胞糊中并充分混合(稳定剂浓度(在浆液中)：1.5％蔗糖、1.5％葡聚糖、0.03％半胱氨酸)。将细胞浆液冻干并进行γ照射(在室温下为17.5kGy)。
对于可以使用的其他生长条件，参见，例如，WO 2019/051381，其披露内容通过引用并入本文。
表5：稳定剂配制品
组分 g/kg
蔗糖 200
葡聚糖40k 200
半胱氨酸HCl 4
水 596
实例3：在不存在血红蛋白的情况下，维生素B12和/或FeCl2不能促进血红蛋白依 赖性细菌的生长
为了找到用于生长血红蛋白依赖性细菌的GMP级补充剂的可替代性来源，将非动物性产品(例如维生素B12和/或FeCl2)作为生长补充剂进行了测试。如实例1中所述，代表性血红蛋白依赖性细菌，普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)在补充有维生素B12和/或FeCl2的SPYG1培养基中生长。与不含任何补充剂的生长培养基相比，生长培养基中不同量的维生素B12、FeCl2(与血红蛋白相关的铁)或其组合均不能改善血红蛋白依赖性细菌的生长。如图1中所见，维生素B12和FeCl2不能替代血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。
实例4：螺旋藻属可以替代血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长
与维生素B12或FeCl2相比，在不存在血红蛋白的情况下，向生长培养基中添加螺旋藻属改善了血红蛋白依赖性细菌(普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329))的生长。添加0.2g/L螺旋藻属增强了细菌的生长，并导致生长速率和细胞密度的增加(图2)。因此，在不存在血红蛋白的情况下，螺旋藻属以剂量依赖性的方式促进血红蛋白依赖性细菌的生长，如与0.02g/L螺旋藻属相比，0.2g/L的螺旋藻属增强了生长。
为了确定在不存在血红蛋白的情况下叶绿酸是否可以改善血红蛋白依赖性细菌的生长，将不同量的叶绿酸滴定到生长培养基中。0.2g/L浓度下的叶绿酸抑制了血红蛋白依赖性细菌的生长而不是改善其生长(图2)。甚至在0.02g/L的较低浓度下，叶绿酸也不能改善血红蛋白依赖性细菌的生长(图2)。
为了确定溶解螺旋藻属的最佳溶剂，比较了在不存在血红蛋白的情况下，溶解于水与0.01M NaOH的螺旋藻属支持血红蛋白依赖性细菌的生长的能力。尽管在不存在血红蛋白的情况下，水中和NaOH中的螺旋藻属均支持血红蛋白依赖性细菌的生长并达到比阴性对照更大的程度，但与包含溶解于0.01M NaOH中的螺旋藻属的培养基中生长相比，在包含溶解于水中的螺旋藻属的培养基中生长时，血红蛋白依赖性细菌以更快的速度生长并生长至更高的细胞密度(图3)。
为了确定螺旋藻属是否可以替代血红蛋白或其衍生物，将血红蛋白依赖性细菌(栖组织普雷沃菌)在包含不同量的螺旋藻属的生长培养基中培养，并将它们的生长曲线与在补充有血红蛋白或叶绿酸的培养基中培养的细菌的生长曲线进行比较。在2g/L下，螺旋藻属与血红蛋白支持血红蛋白依赖性细菌的生长的程度相当(图4)。实际上，与包含血红蛋白的培养基相比，在包含2g/L螺旋藻属的生长培养基中培养的细菌显示出更快的生长速率(图4)。如图2中所见，在任何测试浓度下，叶绿酸都不支持血红蛋白依赖性细菌的生长(图4)。通过过滤灭菌的螺旋藻属溶液也有效地支持了细菌的生长，这表明它与包括高压蒸汽灭菌和过滤在内的不同灭菌方式兼容，并且螺旋藻属的可溶性组分足以支持血红蛋白依赖性细菌的生长。
实例5：在包含螺旋藻属的生长培养基中培养的血红蛋白依赖性细菌在迟发型超 敏反应(DTH)小鼠模型中是有效的
螺旋藻属(在不存在血红蛋白的情况下)促进了血红蛋白依赖性细菌的产生，这些细菌在功能上等同于在血红蛋白存在下培养的血红蛋白依赖性细菌。为了测试螺旋藻属是否促进在功能上等同于在血红蛋白存在下培养的血红蛋白依赖性细菌的血红蛋白依赖性细菌的产生，比较了在螺旋藻属或血红蛋白存在下培养的血红蛋白依赖性细菌在迟发型超敏反应(DTH)小鼠模型中的功效。
迟发型超敏反应(DTH)是异位性皮炎(或过敏性接触性皮炎)的动物模型，如由Petersen等人,(In vivo pharmacological disease models for psoriasis and atopicdermatitis in drug discovery.为了制备DTH的小鼠模型，从泰康利生物科学公司(Taconic Biosciences)(纽约州日耳曼敦)获得6至8周龄的C57Bl/6小鼠的6个组群(每个组群5只小鼠)。在第0天，用100μg在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的钥孔戚血蓝素(KLH)(在200μl中以1:1的比率)，通过在背部四个位点(上方和下方)进行四次皮下(s.c.)注射来致敏小鼠。在第8天，通过向小鼠右耳皮内注射10μg在10μl 0.01％DMSO的生理盐水中的KLH激发小鼠，在耳部引起皮肤DTH。作为对照，左耳仅接受10μl 0.01％DMSO的生理盐水。通过使用Mitutoyo千分尺在激发之前和之后的不同时间点测量耳厚度来确定DTH响应(如耳朵肿胀所指示的)。耳厚度是在皮内激发之前作为各个别动物的基线水平进行测量。在皮内激发之后大约24小时及48小时(即分别为第9天及第10天)还测量了耳厚度两次。
向每个组群小鼠每天施用一次持续9天，如下：
(i)口服施用厌氧PBS(媒剂对照)；
(ii)以1mg/kg腹膜内施用地塞米松(阳性对照)；
(iii)口服施用1x109CFU的在包含1g/L螺旋藻属(V3)的BM1培养基(不含B12)中培养的栖组织普雷沃菌生物质；
(iv)口服施用1x109CFU的在包含1g/L螺旋藻属(V4)的BM1培养基中培养的栖组织普雷沃菌生物质；
(v)口服施用1x109CFU的在包含1g/L螺旋藻属(V1)的SPYG1培养基中培养的栖组织普雷沃菌生物质；或
(vi)口服施用10mg在包含血红蛋白的生长培养基中培养的栖组织普雷沃菌的粉末。
如图5中可以看出的，在螺旋藻属存在下培养的栖组织普雷沃菌(普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329))与在血红蛋白存在下培养的那些在耳厚度减少所证明的DTH反应降低方面的效果相同。因此，螺旋藻属促进了血红蛋白依赖性细菌的产生(在不存在血红蛋白的情况下)，其在功能上等同于在血红蛋白存在下培养的血红蛋白依赖性细菌。
实例6：螺旋藻可以替代血红蛋白来促进Fournierella和副拟杆菌属细菌的生长
将以下血红蛋白依赖性细菌在含或不含螺旋藻属的生长培养基中培养：Fournierella菌株A、Fournierella菌株B、和副拟杆菌属菌株A。该血红蛋白依赖性细菌在包含表6中所列的组分的生长培养基中生长。
表6：生长培养基SPY
Figure BDA0003492191510000591
使用的碳源是最终浓度为5g/L的N-乙酰基-葡糖胺(NAG)或葡萄糖(Glu)。使用最终浓度为0.02g/L的血红蛋白溶液，自1％的0.01M NaOH中的储备溶液添加。使用最终浓度为1g/L的螺旋藻属溶液，自5％的0.01M NaOH中的储备溶液添加。
如图6-图8中所示，在不存在血红蛋白或其衍生物的情况下，包含螺旋藻属的生长培养基支持这些血红蛋白依赖性细菌的每一种的生长。螺旋藻将Fournierella菌株和副拟杆菌属菌株A的生长恢复到与含有血红蛋白的培养基中的生长相当的水平(图6和图8)。在这些条件下，Fournierella菌株B在含螺旋藻属情况下的生长显示出轻微改善，也与使用血红蛋白的生长相当。
实例7：使用螺旋藻属代替血红蛋白用于其它血红蛋白依赖性细菌
在这些实验中测试的微生物是副拟杆菌属菌株B、粪杆菌属菌株A、拟杆菌属菌株A、和Alistipes菌株A。
副拟杆菌属菌株B与副拟杆菌属菌株A是相同的属(副拟杆菌属)，但是是该属的不同物种。
Alistipes菌株A在一项端点研究中进行了测试以确定最佳的生长条件。
用于测试这些微生物的基础培养基是SPY或PM11，含有以下组分：
表7：生长培养基
Figure BDA0003492191510000601
表8：生长培养基
Figure BDA0003492191510000602
使用的碳源是最终浓度为5g/L(Glu5)或10g/L(Glu10)的葡萄糖(Glu)。
使用最终浓度为0.2g/L的血红蛋白溶液，自1％的0.01M NaOH中的储备溶液添加。
使用最终浓度为1g/L或2g/L的螺旋藻属溶液，自5％的0.01M NaOH中的储备溶液添加。
生长动力学曲线来源于在厌氧条件中在读板器上以96孔格式进行的动力学生长测试。
在厌氧条件下用3个OD600测量点进行端点测试以确定最佳生长条件。
如图9中所示，与血红蛋白相比，通过添加螺旋藻属部分恢复了副拟杆菌属菌株B的生长。在不添加血红蛋白或螺旋藻属的情况下未观察到生长，使得此菌株为血红蛋白依赖性的。添加1g/L螺旋藻属部分恢复了生长，添加2g/L螺旋藻属已使生长增加至少两倍，潜在地将螺旋藻属浓度增加到2g/L以上将导致与含血红蛋白的生长相当。
如图10中所示，在螺旋藻属存在下，粪杆菌属菌株A的生长等于或优于在含有血红蛋白的培养基中的生长。迟缓期被缩短，并且类似于在含血红蛋白的培养基中的迟缓期，并且光密度甚至比在含血红蛋白的培养基中的光密度更高。
如图11中所示，通过添加螺旋藻属来支持拟杆菌属菌株A的生长，不含螺旋藻属的菌株没有生长。
如图12中所示，Alistipes菌株A在含有螺旋藻属的培养基中比在含有血红蛋白的培养基中的生长更好。
实例8：使用螺旋藻属代替血红蛋白用于普雷沃菌属菌株C
如实例2中所述，在螺旋藻属存在下在根据表9A的培养基中培养另一种血红蛋白依赖性细菌普雷沃菌属菌株C(PTA-126140)。螺旋藻属支持血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株C的生长(数据未显示)。
表9A：示例性生长培养基(SPYG)
Figure BDA0003492191510000621
为了制作1L培养基，在4种不同的溶液(溶液1-4)(后续将其合并)中制备培养基组分。
1.溶液1
表9B：溶液1
溶液1(SPY基底)： g/L
酵母提取物19512有机技术公司 10
大豆蛋白胨A2 SC 19649有机技术公司 10
大豆蛋白胨E110 19885有机技术公司 10
磷酸氢二钾K2HPO4 2.5
将表9B中溶液1的组分溶解于蒸馏水中，并且将体积调整至960mL的最终体积。将溶液在121℃下高压灭菌30分钟。
2.溶液2
表9C：溶液2
Figure BDA0003492191510000622
将5g的L-半胱氨酸-HCl添加至100mL的蒸馏水中，并混合直到将L-半胱氨酸-HCl溶解。可以将溶液温和加热以促进溶解。将溶液在121℃下高压灭菌30分钟。
3.溶液3
表9D：溶液3
Figure BDA0003492191510000631
将50g的葡萄糖溶解于蒸馏水中，并将最终体积调整到100mL。将溶液在121℃下高压灭菌30分钟。
4.溶液4
表9E：溶液4
Figure BDA0003492191510000632
将25g的螺旋藻属粉末添加至水和氢氧化钠中，并搅拌直到溶解。可能有必要一些摇晃以促进重悬。一旦在溶液中重悬，使用1μm过滤器将悬浮液过滤。将过滤的溶液在121℃下高压灭菌30分钟。
通过在生物安全柜中合并表9F中所示的所有必要组分来完成培养基：
表9F：SPYG培养基
Figure BDA0003492191510000633
在用普雷沃菌属接种之前将完成的培养基脱气。
通过引用并入
在本文中提及的所有出版物、专利申请都通过引用以其全文特此并入，如同各个单独的出版物或专利申请被确切地并且单独地指明为通过引用并入。如果出现冲突，则以本申请(包含本文的任何定义)为准。
等效形式
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能确定本文所述本发明的具体实施例的许多等效形式。此类等效形式旨在为下列权利要求所涵盖。

Claims (528)

1.一种培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括在包含血红蛋白替代品的生长培养基中孵育该血红蛋白依赖性细菌，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
2.如权利要求1所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
3.如权利要求2所述的方法，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
4.如权利要求2所述的方法，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
5.如权利要求4所述的方法，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
6.如权利要求5所述的方法，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
8.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
9.如权利要求8所述的方法，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
10.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
11.如权利要求10所述的方法，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
12.如权利要求11所述的方法，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
13.如权利要求1所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
14.如权利要求13所述的方法，其中该绿藻是小球藻目。
15.如权利要求14所述的方法，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
17.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
18.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
21.如权利要求20所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
22.如权利要求20所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
23.如权利要求20所述的方法，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
24.如权利要求20所述的方法，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99.5％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
25.如权利要求20所述的方法，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌来自基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品能够替代生长培养基中的血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中该生长培养基不包含动物产品。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中以增长的速率生长。
32.如权利要求31所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少50％。
33.如权利要求31所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少100％。
34.如权利要求31所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高200％至400％。
35.如权利要求31所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少300％。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的细胞密度相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至更高的细胞密度。
37.如权利要求36所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少50％。
38.如权利要求36所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少100％。
39.如权利要求36所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高200％至400％。
40.如权利要求36所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少300％。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中该方法包括在包含大于1％CO2的厌氧气氛下孵育该血红蛋白依赖性细菌。
42.如权利要求41所述的方法，其中该厌氧气氛包含至少10％CO2。
43.如权利要求41所述的方法，其中该厌氧气氛包含至少20％CO2。
44.如权利要求41所述的方法，其中该厌氧气氛包含从10％至40％CO2。
45.如权利要求41所述的方法，其中该厌氧气氛包含从20％至30％CO2。
46.如权利要求41所述的方法，其中该厌氧气氛包含约25％CO2。
47.如权利要求41-46中任一项所述的方法，其中该厌氧气氛基本上由CO2和N2组成。
48.如权利要求41所述的方法，其中该厌氧气氛包含约25％CO2和约75％N2。
49.如权利要求41所述的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)用包含大于1％CO2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；以及
b)在经步骤a)吹扫的生物反应器中孵育该血红蛋白依赖性细菌。
50.如权利要求49所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含至少10％CO2。
51.如权利要求49所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含至少20％CO2。
52.如权利要求49所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含从10％至40％CO2。
53.如权利要求49所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含从20％至30％CO2。
54.如权利要求49所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含约25％CO2。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中该厌氧气体混合物基本上由CO2和N2组成。
56.如权利要求49所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含约25％CO2和约75％N2。
57.如权利要求49-56中任一项所述的方法，其中该生物反应器是约1L、约20L、约3,500L、或约20,000L的生物反应器。
58.如权利要求49-57中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括用血红蛋白依赖性细菌接种生长培养基的步骤，其中该接种步骤在步骤b)之前。
59.如权利要求58所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌的体积是该生长培养基的约0.1％v/v。
60.如权利要求58所述的方法，其中该生长培养基是约1L体积。
61.如权利要求58所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌的体积是约1mL。
62.如权利要求49-61中任一项所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
63.如权利要求62所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育14至16小时。
64.如权利要求62或63所述的方法，其中该方法进一步包括在生长培养基中接种约5％v/v的经培养的细菌的步骤。
65.如权利要求64所述的方法，其中该生长培养基是约20L体积。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
67.如权利要求66所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育12至14小时。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中该方法进一步包括在生长培养基中接种约0.5％v/v的经培养的细菌的步骤。
69.如权利要求68所述的方法，其中该生长培养基是约3500L体积。
70.如权利要求68或69所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
71.如权利要求70所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育12至14小时。
72.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex 21D、和/或葡萄糖。
73.如权利要求72所述的方法，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L酵母提取物19512。
74.如权利要求72所述的方法，其中该生长培养基包含约10g/L酵母提取物19512。
75.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
76.如权利要求75所述的方法，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨A2SC19649。
77.如权利要求75所述的方法，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨A2SC19649。
78.如权利要求72至77中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨E110 19885。
79.如权利要求78所述的方法，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨E11019885。
80.如权利要求78所述的方法，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨E11019885。
81.如权利要求72至80中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含1g/L至3g/L磷酸氢二钾。
82.如权利要求81所述的方法，其中该生长培养基包含约1.59g/L磷酸氢二钾。
83.如权利要求81所述的方法，其中该生长培养基包含约2.5g/L磷酸氢二钾。
84.如权利要求72至83中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含0.5g/L至1.5g/L磷酸二氢钾。
85.如权利要求84所述的方法，其中该生长培养基包含约0.91g/L磷酸二氢钾。
86.如权利要求72至85中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/LL-半胱氨酸-HCl。
87.如权利要求86所述的方法，其中该生长培养基包含约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。
88.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L氯化铵。
89.如权利要求88所述的方法，其中该生长培养基包含约0.5g/L氯化铵。
90.如权利要求72至89中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含20g/L至30g/Lglucidex 21D。
91.如权利要求90所述的方法，其中该生长培养基包含约25g/Lglucidex 21D。
92.如权利要求72至91中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L葡萄糖。
93.如权利要求92所述的方法，其中该生长培养基包含约5g/L葡萄糖或约10g/L葡萄糖。
94.如权利要求1-93中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含至少0.5g/L的血红蛋白替代品。
95.如权利要求94所述的方法，其中该生长培养基包含至少0.75g/L血红蛋白替代品。
96.如权利要求94所述的方法，其中该生长培养基包含至少1g/L的血红蛋白替代品。
97.如权利要求94所述的方法，其中该生长培养基包含约1g/L的血红蛋白替代品。
98.如权利要求94所述的方法，其中该生长培养基包含约2g/L的血红蛋白替代品。
99.如权利要求1-98中任一项所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌在35℃至39℃的温度下孵育。
100.如权利要求99所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌在约37℃的温度下孵育。
101.如权利要求1-100中任一项所述的方法，其中该生长培养基在5.5至7.5的pH下。
102.如权利要求101所述的方法，其中该生长培养基在约6.5的pH下。
103.如权利要求1-102中任一项所述的方法，其中孵育该血红蛋白依赖性细菌包括在50至300的RPM下搅拌生长培养基。
104.如权利要求103所述的方法，其中将该生长培养基在约150的RPM下搅拌。
105.如权利要求49-104中任一项所述的方法，其中在孵育期间连续添加该厌氧气体混合物。
106.如权利要求105所述的方法，其中以约0.02vvm的速率添加该厌氧气体混合物。
107.如权利要求1-106中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括当达到稳定生长期时收获血红蛋白依赖性细菌的步骤。
108.如权利要求107所述的方法，该方法进一步包括收获之后离心该血红蛋白依赖性细菌的步骤以产生细胞糊。
109.如权利要求108所述的方法，该方法进一步包括用稳定剂溶液稀释该细胞糊以产生细胞浆液。
110.如权利要求109所述的方法，该方法进一步包括冻干该细胞浆液的步骤以产生粉末。
111.如权利要求110所述的方法，该方法进一步包括用γ辐照照射该粉末。
112.一种培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括(a)向生长培养基中添加血红蛋白替代品和血红蛋白依赖性细菌；以及(b)在生长培养基中孵育该血红蛋白依赖性细菌，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
113.如权利要求112所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
114.如权利要求113所述的方法，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
115.如权利要求113所述的方法，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
116.如权利要求115所述的方法，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
117.如权利要求116所述的方法，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
118.如权利要求113至117中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
119.如权利要求113至117中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
120.如权利要求119所述的方法，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
121.如权利要求113至117中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
122.如权利要求121所述的方法，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
123.如权利要求122所述的方法，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
124.如权利要求112所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
125.如权利要求124所述的方法，其中该绿藻是小球藻目。
126.如权利要求125所述的方法，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
127.如权利要求124至126中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
128.如权利要求124至126中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
129.如权利要求124至126中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
130.如权利要求112-129所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
131.如权利要求112-129所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
132.如权利要求131所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
133.如权利要求131所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
134.如权利要求131所述的方法，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少90％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
135.如权利要求131所述的方法，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
136.如权利要求131所述的方法，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
137.如权利要求131-136中任一项所述的方法，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
138.如权利要求131-137中任一项所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌是基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
139.如权利要求112-138中任一项所述的方法，其中该血红蛋白替代品能够替代生长培养基中的血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。
140.如权利要求112-139中任一项所述的方法，其中该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。
141.如权利要求112-140中任一项所述的方法，其中该生长培养基不包含动物产品。
142.如权利要求112-141中任一项所述的方法，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中以增长的速率生长。
143.如权利要求142所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少50％。
144.如权利要求142所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少100％。
145.如权利要求142所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高200％至400％。
146.如权利要求142所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少300％。
147.如权利要求112-146中任一项所述的方法，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的细胞密度相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至更高的细胞密度。
148.如权利要求147所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少50％。
149.如权利要求147所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少100％。
150.如权利要求147所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高200％至400％。
151.如权利要求147所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少300％。
152.如权利要求112-151中任一项所述的方法，其中该方法包括在包含大于1％CO2的厌氧气氛下孵育该血红蛋白依赖性细菌。
153.如权利要求152所述的方法，其中该厌氧气氛包含至少10％CO2。
154.如权利要求152所述的方法，其中该厌氧气氛包含至少20％CO2。
155.如权利要求152所述的方法，其中该厌氧气氛包含从10％至40％CO2。
156.如权利要求152所述的方法，其中该厌氧气氛包含从20％至30％CO2。
157.如权利要求152所述的方法，其中该厌氧气氛包含约25％CO2。
158.如权利要求152-157中任一项所述的方法，其中该厌氧气氛基本上由CO2和N2组成。
159.如权利要求152所述的方法，其中该厌氧气氛包含约25％CO2和约75％N2。
160.如权利要求152所述的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)用包含大于1％CO2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；以及
b)在经步骤a)吹扫的生物反应器中孵育该血红蛋白依赖性细菌。
161.如权利要求160所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含至少10％CO2。
162.如权利要求160所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含至少20％CO2。
163.如权利要求160所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含从10％至40％CO2。
164.如权利要求160所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含从20％至30％CO2。
165.如权利要求160所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含约25％CO2。
166.如权利要求160-165中任一项所述的方法，其中该厌氧气体混合物基本上由CO2和N2组成。
167.如权利要求160所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含约25％CO2和约75％N2。
168.如权利要求160-167中任一项所述的方法，其中该生物反应器是约1L、约20L、约3,500L、或约20,000L的生物反应器。
169.如权利要求160-168中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括用血红蛋白依赖性细菌接种生长培养基的步骤，其中该接种步骤在步骤b)之前。
170.如权利要求169所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌的体积是该生长培养基的约0.1％v/v。
171.如权利要求169所述的方法，其中该生长培养基是约1L体积。
172.如权利要求169所述的方法，其中该血红蛋白依赖性细菌的体积是约1mL。
173.如权利要求160-172中任一项所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
174.如权利要求173所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育14至16小时。
175.如权利要求173或174所述的方法，其中该方法进一步包括在生长培养基中接种约5％v/v的经培养的细菌的步骤。
176.如权利要求175所述的方法，其中该生长培养基是约20L体积。
177.如权利要求175或176所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
178.如权利要求177所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育12至14小时。
179.如权利要求177或178所述的方法，其中该方法进一步包括在生长培养基中接种约0.5％v/v的经培养的细菌的步骤。
180.如权利要求179所述的方法，其中该生长培养基是约3500L体积。
181.如权利要求179或180所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
182.如权利要求181所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育12至14小时。
183.如权利要求112-182中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E11019885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex21D、和/或葡萄糖。
184.如权利要求183所述的方法，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L酵母提取物19512。
185.如权利要求183所述的方法，其中该生长培养基包含约10g/L酵母提取物19512。
186.如权利要求183至185中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
187.如权利要求186所述的方法，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨A2SC19649。
188.如权利要求186所述的方法，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨A2SC19649。
189.如权利要求183至188中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨E110 19885。
190.如权利要求189所述的方法，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨E11019885。
191.如权利要求189所述的方法，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨E11019885。
192.如权利要求183至191中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含1g/L至3g/L磷酸氢二钾。
193.如权利要求192所述的方法，其中该生长培养基包含约1.59g/L磷酸氢二钾。
194.如权利要求192所述的方法，其中该生长培养基包含约2.5g/L磷酸氢二钾。
195.如权利要求183至194中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含0.5g/L至1.5g/L磷酸二氢钾。
196.如权利要求195所述的方法，其中该生长培养基包含约0.91g/L磷酸二氢钾。
197.如权利要求183至196中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L L-半胱氨酸-HCl。
198.如权利要求197所述的方法，其中该生长培养基包含约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。
199.如权利要求183至198中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L氯化铵。
200.如权利要求199所述的方法，其中该生长培养基包含约0.5g/L氯化铵。
201.如权利要求183至200中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含20g/L至30g/Lglucidex 21D。
202.如权利要求201所述的方法，其中该生长培养基包含约25g/L glucidex 21D。
203.如权利要求183至202中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L葡萄糖。
204.如权利要求203所述的方法，其中该生长培养基包含约5g/L葡萄糖或约10g/L葡萄糖。
205.如权利要求112-204中任一项所述的方法，其中该生长培养基包含至少0.5g/L的血红蛋白替代品。
206.如权利要求205所述的方法，其中该生长培养基包含至少0.75g/L血红蛋白替代品。
207.如权利要求205所述的方法，其中该生长培养基包含至少1g/L的血红蛋白替代品。
208.如权利要求205所述的方法，其中该生长培养基包含约1g/L的血红蛋白替代品。
209.如权利要求205所述的方法，其中该生长培养基包含约2g/L的血红蛋白替代品。
210.如权利要求112-209中任一项所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌在35℃至39℃的温度下孵育。
211.如权利要求210所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌在约37℃的温度下孵育。
212.如权利要求112-211中任一项所述的方法，其中该生长培养基在5.5至7.5的pH下。
213.如权利要求212所述的方法，其中该生长培养基在约6.5的pH下。
214.如权利要求112-213中任一项所述的方法，其中孵育该血红蛋白依赖性细菌包括在50至300的RPM下搅拌生长培养基。
215.如权利要求214所述的方法，其中将该生长培养基在约150的RPM下搅拌。
216.如权利要求160-215中任一项所述的方法，其中在孵育期间连续添加该厌氧气体混合物。
217.如权利要求216所述的方法，其中以约0.02vvm的速率添加该厌氧气体混合物。
218.如权利要求112-217中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括当达到稳定生长期时收获血红蛋白依赖性细菌的步骤。
219.如权利要求218所述的方法，该方法进一步包括收获之后离心该血红蛋白依赖性细菌的步骤以产生细胞糊。
220.如权利要求219所述的方法，该方法进一步包括用稳定剂溶液稀释该细胞糊以产生细胞浆液。
221.如权利要求220所述的方法，该方法进一步包括冻干该细胞浆液的步骤以产生粉末。
222.如权利要求221所述的方法，该方法进一步包括用γ辐照照射该粉末。
223.一种生物反应器，该生物反应器包含在生长培养基中的血红蛋白依赖性细菌，该生长培养基包含血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
224.如权利要求223所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
225.如权利要求224所述的生物反应器，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
226.如权利要求224所述的生物反应器，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
227.如权利要求226所述的生物反应器，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
228.如权利要求227所述的生物反应器，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
229.如权利要求224至228中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
230.如权利要求224至228中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
231.如权利要求230所述的生物反应器，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
232.如权利要求224至228中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
233.如权利要求232所述的生物反应器，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
234.如权利要求233所述的生物反应器，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
235.如权利要求223所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
236.如权利要求235所述的生物反应器，其中该绿藻是小球藻目。
237.如权利要求236所述的生物反应器，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
238.如权利要求235至237中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
239.如权利要求235至237中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
240.如权利要求235至237中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
241.如权利要求223-240中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
242.如权利要求223-240中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
243.如权利要求242所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
244.如权利要求242所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
245.如权利要求242所述的生物反应器，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
246.如权利要求242所述的生物反应器，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99.5％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
247.如权利要求242所述的生物反应器，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
248.如权利要求242-247中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
249.如权利要求242-248中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌来自基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
250.如权利要求223-249中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白替代品能够替代生长培养基中的血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。
251.如权利要求223-250中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。
252.如权利要求223-251中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基不包含动物产品。
253.如权利要求223-252中任一项所述的生物反应器，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中以增长的速率生长。
254.如权利要求253所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少50％。
255.如权利要求253所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少100％。
256.如权利要求253所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高200％至400％。
257.如权利要求253所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少300％。
258.如权利要求223-257中任一项所述的生物反应器，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的细胞密度相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至更高的细胞密度。
259.如权利要求258所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少50％。
260.如权利要求258所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少100％。
261.如权利要求258所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高200％至400％。
262.如权利要求258所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少300％。
263.如权利要求223-262中任一项所述的生物反应器，其中该血红蛋白依赖性细菌处于包含至少约1％CO2的厌氧气氛下。
264.如权利要求263所述的生物反应器，其中该厌氧气氛包含至少10％CO2。
265.如权利要求263所述的生物反应器，其中该厌氧气氛包含至少20％CO2。
266.如权利要求263所述的生物反应器，其中该厌氧气氛包含从10％至40％CO2。
267.如权利要求263所述的生物反应器，其中该厌氧气氛包含从20％至30％CO2。
268.如权利要求263所述的生物反应器，其中该厌氧气氛包含约25％CO2。
269.如权利要求263-268中任一项所述的生物反应器，其中该厌氧气氛基本上由CO2和N2组成。
270.如权利要求263所述的生物反应器，其中该厌氧气氛包含约25％CO2和约75％N2。
271.如权利要求263-270中任一项所述的生物反应器，其中生物反应器是1L、20L、3500L或20,000L的生物反应器。
272.如权利要求223-271中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex 21D、和/或葡萄糖。
273.如权利要求272所述的生物反应器，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L酵母提取物19512。
274.如权利要求272所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约10g/L酵母提取物19512。
275.如权利要求272至274中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
276.如权利要求275所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
277.如权利要求275所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
278.如权利要求272至277中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨E110 19885。
279.如权利要求278所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨E110 19885。
280.如权利要求278所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨E110 19885。
281.如权利要求272-280中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含1g/L至3g/L磷酸氢二钾。
282.如权利要求281所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约1.59g/L磷酸氢二钾。
283.如权利要求281所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约2.5g/L磷酸氢二钾。
284.如权利要求272-283中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含0.5g/L至1.5g/L磷酸二氢钾。
285.如权利要求284所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约0.91g/L磷酸二氢钾。
286.如权利要求272-285中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L L-半胱氨酸-HCl。
287.如权利要求286所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。
288.如权利要求272-287中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L氯化铵。
289.如权利要求288所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约0.5g/L氯化铵。
290.如权利要求272-289中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含20g/L至30g/L glucidex 21D。
291.如权利要求290所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约25g/L glucidex21D。
292.如权利要求272-291中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L葡萄糖。
293.如权利要求292所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约5g/L葡萄糖或约10g/L葡萄糖。
294.如权利要求223-293中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基包含至少0.5g/L的血红蛋白替代品。
295.如权利要求294所述的生物反应器，其中该生长培养基包含至少0.75g/L血红蛋白替代品。
296.如权利要求294所述的生物反应器，其中该生长培养基包含至少1g/L的血红蛋白替代品。
297.如权利要求294所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约1g/L的血红蛋白替代品。
298.如权利要求294所述的生物反应器，其中该生长培养基包含约2g/L的血红蛋白替代品。
299.如权利要求223-298中任一项所述的生物反应器，其中该生物反应器在35℃至39℃的温度下。
300.如权利要求299所述的生物反应器，其中该生物反应器在37℃的温度下。
301.如权利要求223-300中任一项所述的生物反应器，其中该生长培养基在5.5至7.5的pH下。
302.如权利要求301所述的生物反应器，其中该生长培养基在约6.5的pH下。
303.一种在如权利要求223-302中任一项所述的生物反应器中培养血红蛋白依赖性细菌的方法，该方法包括在生物反应器中孵育血红蛋白依赖性细菌。
304.如权利要求303所述的方法，其中在包含大于1％CO2的厌氧气体混合物中孵育该血红蛋白依赖性细菌。
305.如权利要求303所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含至少10％CO2。
306.如权利要求303所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含至少20％CO2。
307.如权利要求303所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含从10％至40％CO2。
308.如权利要求303所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含从20％至30％CO2。
309.如权利要求303所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含约25％CO2。
310.如权利要求303-309中任一项所述的方法，其中该厌氧气体混合物基本上由CO2和N2组成。
311.如权利要求310所述的方法，其中该厌氧气体混合物包含约25％CO2和约75％N2。
312.如权利要求303-311中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在孵育之前用血红蛋白依赖性细菌接种生长培养基的步骤。
313.如权利要求312所述的方法，其中该接种的血红蛋白依赖性细菌的体积是该生长培养基的约0.1％v/v。
314.如权利要求312所述的方法，其中该生长培养基是约1L体积。
315.如权利要求312所述的方法，其中该接种的血红蛋白依赖性细菌的体积是约1mL。
316.如权利要求303-315中任一项所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌培养10-24小时。
317.如权利要求316所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育14至16小时。
318.如权利要求316或317所述的方法，其中该方法进一步包括在生长培养基中接种约5％v/v的经培养的细菌的步骤。
319.如权利要求318所述的方法，其中该生长培养基是约20L体积。
320.如权利要求318或319所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
321.如权利要求320所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育12至14小时。
322.如权利要求320或321所述的方法，其中该方法进一步包括在生长培养基中接种约0.5％v/v的经培养的细菌的步骤。
323.如权利要求322所述的方法，其中该生长培养基是约3500L体积。
324.如权利要求322或323所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育10-24小时。
325.如权利要求324所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌孵育12至14小时。
326.如权利要求303-325中任一项所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌在35℃至39℃的温度下孵育。
327.如权利要求326所述的方法，其中将该血红蛋白依赖性细菌在37℃的温度下孵育。
328.如权利要求303-327中任一项所述的方法，其中孵育该血红蛋白依赖性细菌包括在50至300的RPM下搅拌生长培养基。
329.如权利要求328所述的方法，其中将该生长培养基在150的RPM下搅拌。
330.如权利要求303-329中任一项所述的方法，其中在孵育期间连续添加该厌氧气体混合物。
331.如权利要求330所述的方法，其中以0.02vvm的速率添加该厌氧气体混合物。
332.如权利要求303-331中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括当达到稳定生长期时收获血红蛋白依赖性细菌的步骤。
333.如权利要求332所述的方法，该方法进一步包括收获之后离心该血红蛋白依赖性细菌的步骤以产生细胞糊。
334.如权利要求333所述的方法，该方法进一步包括用稳定剂溶液稀释该细胞糊以产生细胞浆液。
335.如权利要求334所述的方法，该方法进一步包括冻干该细胞浆液的步骤以产生粉末。
336.如权利要求335所述的方法，该方法进一步包括用γ辐照照射该粉末。
337.一种组合物，该组合物包含
a)血红蛋白依赖性细菌，以及
b)包含血红蛋白替代品的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
338.如权利要求337所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
339.如权利要求338所述的组合物，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
340.如权利要求338所述的组合物，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
341.如权利要求340所述的组合物，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
342.如权利要求341所述的组合物，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
343.如权利要求338至342中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
344.如权利要求338至342中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
345.如权利要求344所述的组合物，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
346.如权利要求338至342中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
347.如权利要求346所述的组合物，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
348.如权利要求347所述的组合物，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
349.如权利要求337所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
350.如权利要求349所述的组合物，其中该绿藻是小球藻目。
351.如权利要求350所述的组合物，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
352.如权利要求349至351中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
353.如权利要求349至351中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
354.如权利要求349至351中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
355.如权利要求337-354中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
356.如权利要求337-354中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
357.如权利要求356所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
358.如权利要求356所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
359.如权利要求356所述的组合物，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少90％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
360.如权利要求356所述的组合物，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
361.如权利要求356所述的组合物，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
362.如权利要求356-361中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
363.如权利要求356-362中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
364.如权利要求337-363中任一项所述的组合物，其中该血红蛋白替代品能够替代生长培养基中的血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。
365.如权利要求337-364中任一项所述的组合物，其中该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。
366.如权利要求337-365中任一项所述的组合物，其中该生长培养基不包含动物产品。
367.如权利要求337-366中任一项所述的组合物，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中以增长的速率生长。
368.如权利要求367所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少50％。
369.如权利要求367所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少100％。
370.如权利要求367所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高200％至400％。
371.如权利要求367所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少300％。
372.如权利要求337-371中任一项所述的组合物，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的细胞密度相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至更高的细胞密度。
373.如权利要求372所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少50％。
374.如权利要求372所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少100％。
375.如权利要求372所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高200％至400％。
376.如权利要求372所述的组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少300％。
377.如权利要求337-376中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E11019885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex21D、和/或葡萄糖。
378.如权利要求377所述的组合物，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L酵母提取物19512。
379.如权利要求377所述的组合物，其中该生长培养基包含约10g/L酵母提取物19512。
380.如权利要求377-379中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
381.如权利要求380所述的组合物，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨A2SC19649。
382.如权利要求380所述的组合物，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨A2SC19649。
383.如权利要求377-382中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨E110 19885。
384.如权利要求383所述的组合物，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨E11019885。
385.如权利要求383所述的组合物，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨E11019885。
386.如权利要求377-385中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含1g/L至3g/L磷酸氢二钾。
387.如权利要求386所述的组合物，其中该生长培养基包含约1.59g/L磷酸氢二钾。
388.如权利要求386所述的组合物，其中该生长培养基包含约2.5g/L磷酸氢二钾。
389.如权利要求377-388中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含0.5g/L至1.5g/L磷酸二氢钾。
390.如权利要求389所述的组合物，其中该生长培养基包含约0.91g/L磷酸二氢钾。
391.如权利要求377-390中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L L-半胱氨酸-HCl。
392.如权利要求391所述的组合物，其中该生长培养基包含约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。
393.如权利要求377-392中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L氯化铵。
394.如权利要求393所述的组合物，其中该生长培养基包含约0.5g/L氯化铵。
395.如权利要求377-394中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含20g/L至30g/L glucidex 21D。
396.如权利要求395所述的组合物，其中该生长培养基包含约25g/L glucidex 21D。
397.如权利要求377-396中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L葡萄糖。
398.如权利要求397所述的组合物，其中该生长培养基包含约5g/L葡萄糖或约10g/L葡萄糖。
399.如权利要求337-398中任一项所述的组合物，其中该生长培养基包含至少0.5g/L的血红蛋白替代品。
400.如权利要求399所述的组合物，其中该生长培养基包含至少0.75g/L血红蛋白替代品。
401.如权利要求399所述的组合物，其中该生长培养基包含至少1g/L的血红蛋白替代品。
402.如权利要求399所述的组合物，其中该生长培养基包含约1g/L的血红蛋白替代品。
403.如权利要求399所述的组合物，其中该生长培养基包含约2g/L的血红蛋白替代品。
404.如权利要求337-403中任一项所述的组合物，其中该生长培养基在5.5至7.5的pH下。
405.如权利要求404所述的组合物，其中该生长培养基在约6.5的pH下。
406.一种用于在培养血红蛋白依赖性细菌中使用的生长培养基，该生长培养基包含血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
407.如权利要求406所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
408.如权利要求407所述的生长培养基，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
409.如权利要求407所述的生长培养基，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
410.如权利要求409所述的生长培养基，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
411.如权利要求410所述的生长培养基，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
412.如权利要求407至411中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
413.如权利要求407至411中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
414.如权利要求413所述的生长培养基，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
415.如权利要求407至411中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
416.如权利要求415所述的生长培养基，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
417.如权利要求416所述的生长培养基，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
418.如权利要求406所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
419.如权利要求418所述的生长培养基，其中该绿藻是小球藻目。
420.如权利要求419所述的生长培养基，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
421.如权利要求418至420中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
422.如权利要求418至420中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
423.如权利要求418至420中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
424.如权利要求406-423所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
425.如权利要求406-423中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
426.如权利要求425所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
427.如权利要求425所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
428.如权利要求425所述的生长培养基，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少90％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
429.如权利要求425所述的生长培养基，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
430.如权利要求425所述的生长培养基，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
431.如权利要求425-430中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
432.如权利要求425-431中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌是基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
433.如权利要求406-432中任一项所述的生长培养基，其中该血红蛋白替代品能够替代生长培养基中的血红蛋白来促进血红蛋白依赖性细菌的生长。
434.如权利要求406-433中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基不包含血红蛋白或其衍生物。
435.如权利要求406-434中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基不包含动物产品。
436.如权利要求406-435中任一项所述的生长培养基，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中以增长的速率生长。
437.如权利要求436所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少50％。
438.如权利要求436所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少100％。
439.如权利要求436所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高200％至400％。
440.如权利要求436所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中的生长速率高至少300％。
441.如权利要求406-440中任一项所述的生长培养基，其中与不含血红蛋白替代品的生长培养基中的细胞密度相比，该血红蛋白依赖性细菌在相同的但包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至更高的细胞密度。
442.如权利要求441所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少50％。
443.如权利要求441所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少100％。
444.如权利要求441所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高200％至400％。
445.如权利要求441所述的生长培养基，其中该血红蛋白依赖性细菌在包含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度比血红蛋白依赖性细菌在相同的但不含血红蛋白替代品的生长培养基中生长至的细胞密度高至少300％。
446.如权利要求406-445中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨A2SC 19649、大豆蛋白胨E110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸-HCl、氯化铵、glucidex 21D、和/或葡萄糖。
447.如权利要求446所述的生长培养基，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L酵母提取物19512。
448.如权利要求446所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约10g/L酵母提取物19512。
449.如权利要求446-448中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
450.如权利要求449所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
451.如权利要求449所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨A2SC 19649。
452.如权利要求446-451中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含10g/L至15g/L大豆蛋白胨E110 19885。
453.如权利要求452所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约12.5g/L大豆蛋白胨E110 19885。
454.如权利要求452所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约10g/L大豆蛋白胨E110 19885。
455.如权利要求446-454中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含1g/L至3g/L磷酸氢二钾。
456.如权利要求455所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约1.59g/L磷酸氢二钾。
457.如权利要求455所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约2.5g/L磷酸氢二钾。
458.如权利要求446-457中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含0.5g/L至1.5g/L磷酸二氢钾。
459.如权利要求458所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约0.91g/L磷酸二氢钾。
460.如权利要求446-459中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L L-半胱氨酸-HCl。
461.如权利要求460所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约0.5g/L L-半胱氨酸-HCl。
462.如权利要求446-461中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含0.1g/L至1.0g/L氯化铵。
463.如权利要求462所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约0.5g/L氯化铵。
464.如权利要求446-463中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含20g/L至30g/L glucidex 21D。
465.如权利要求464所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约25g/L glucidex21D。
466.如权利要求446-465中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含5g/L至15g/L葡萄糖。
467.如权利要求466所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约5g/L葡萄糖或约10g/L葡萄糖。
468.如权利要求406-467中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基包含至少0.5g/L的血红蛋白替代品。
469.如权利要求468所述的生长培养基，其中该生长培养基包含至少0.75g/L血红蛋白替代品。
470.如权利要求468所述的生长培养基，其中该生长培养基包含至少1g/L的血红蛋白替代品。
471.如权利要求468所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约1g/L的血红蛋白替代品。
472.如权利要求468所述的生长培养基，其中该生长培养基包含约2g/L的血红蛋白替代品。
473.如权利要求406-472中任一项所述的生长培养基，其中该生长培养基在5.5至7.5的pH下。
474.如权利要求473所述的生长培养基，其中该生长培养基在约6.5的pH下。
475.一种血红蛋白替代品，该血红蛋白替代品用于作为在生长培养基中用于血红蛋白依赖性细菌的血红蛋白或其衍生物的替代品使用，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
476.如权利要求475所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
477.如权利要求476所述的血红蛋白替代品，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
478.如权利要求476所述的血红蛋白替代品，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
479.如权利要求478所述的血红蛋白替代品，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
480.如权利要求479所述的血红蛋白替代品，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
481.如权利要求476至480中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
482.如权利要求476至480中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
483.如权利要求482所述的血红蛋白替代品，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
484.如权利要求476至480中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
485.如权利要求484所述的血红蛋白替代品，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
486.如权利要求485所述的血红蛋白替代品，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
487.如权利要求475所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
488.如权利要求487所述的血红蛋白替代品，其中该绿藻是小球藻目。
489.如权利要求488所述的血红蛋白替代品，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
490.如权利要求487至489中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
491.如权利要求487至489中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
492.如权利要求487至489中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
493.如权利要求475-492中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
494.如权利要求475-492中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
495.如权利要求494所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
496.如权利要求494所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
497.如权利要求494所述的血红蛋白替代品，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少90％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
498.如权利要求494所述的血红蛋白替代品，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
499.如权利要求494所述的血红蛋白替代品，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
500.如权利要求494-499中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
501.如权利要求494-500中任一项所述的血红蛋白替代品，其中该血红蛋白依赖性细菌是基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
502.一种细菌组合物，该细菌组合物包含
(a)血红蛋白依赖性细菌，以及
(b)血红蛋白替代品，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌组分、蓝藻细菌生物质、绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
503.如权利要求502所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌、蓝藻细菌生物质、或蓝藻细菌组分。
504.如权利要求503所述的细菌组合物，其中该蓝藻细菌是颤藻目。
505.如权利要求503所述的细菌组合物，其中该蓝藻细菌是以下属：Arthronema、节旋藻属、Blennothrix、发毛针藻属、吉特勒氏线状蓝细菌属、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、瘦鞘丝藻属、湖生蓝丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、席藻属、浮鞘丝藻属、拟浮丝藻属、浮游蓝丝藻属、织线藻属、Pseudonabaena、绮藻属、裂须藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属、束藻属、Trichocoleus、束毛藻属、或常丝藻属。
506.如权利要求504所述的细菌组合物，其中该蓝藻细菌是节旋藻属。
507.如权利要求505所述的细菌组合物，其中该蓝藻细菌是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻。
508.如权利要求503至507中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌。
509.如权利要求503至507中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌生物质。
510.如权利要求509所述的细菌组合物，其中该蓝藻细菌生物质是螺旋藻属。
511.如权利要求503至507中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是蓝藻细菌组分。
512.如权利要求511所述的细菌组合物，其中该蓝藻细菌组分是螺旋藻属组分。
513.如权利要求512所述的细菌组合物，其中该螺旋藻属组分是可溶性螺旋藻属组分。
514.如权利要求502所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻、绿藻组分、或绿藻生物质。
515.如权利要求514所述的细菌组合物，其中该绿藻是小球藻目。
516.如权利要求515所述的细菌组合物，其中该绿藻是以下属：粗刺藻属、星藻属、虚幻球藻属、Apodococcus、Auxenochlorella、Brandtia、Carolibrandtia、Catena、小球藻属、绿微藻属、拟新月藻属、Compactochlorella、Coronacoccus、Coronastrum、Cylindrocelis、长刺藻属、双细胞藻属、双月藻属、胶网藻属、对囊藻属、Eomyces、Fissuricella、Follicularia、双胞藻属、胶丝藻属、拟多芒藻属、黑氏球藻属、旋孢藻属、海尼球藻属、亨氏球藻属、Hormospora、Kalenjinla、角球藻属、Kermatia、微小球藻属、Marasphaerium、Marinchlorella、Marvania、Masaia、迈耶球藻属、微芒藻属、霉球藻属、Muriella、微球藻属、Nanochlorum、Palmellochaete、拟小球藻属、浮小球藻属、Podohedra、无绿藻属、Pseudochloris、Pseudosiderocelopsis、Pumiliosphaera、褐胞藻属、Siderocelopsis、或虫绿藻属。
517.如权利要求514至516中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻。
518.如权利要求514至516中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻生物质。
519.如权利要求514至516中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白替代品是绿藻组分。
520.如权利要求502-519中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、Anaerobutyricum、芽孢杆菌属、拟杆菌属、Cloacibacillus、梭菌属、柯林斯菌属、Cutibacterium、Eisenbergiella、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、Fournierella、梭杆菌属、巨球形菌属、副拟杆菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、Rarimicrobium、Shuttleworthia、或韦荣氏球菌属。
521.如权利要求502-519中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是普雷沃菌属。
522.如权利要求521所述的细菌组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。
523.如权利要求521所述的细菌组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种。
524.如权利要求521所述的细菌组合物，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少90％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
525.如权利要求521所述的细菌组合物，其中该普雷沃菌属与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)的核苷酸序列包含至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性。
526.如权利要求521所述的细菌组合物，其中该普雷沃菌属是普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)或普雷沃菌属菌株C(ATTC保藏号PTA-126140)。
527.如权利要求521-526中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌是普雷沃菌属细菌的菌株，该菌株包含一种或多种表1中所列的蛋白质。
528.如权利要求521-527中任一项所述的细菌组合物，其中该血红蛋白依赖性细菌是基本上不含表2中所列的蛋白质的普雷沃菌属菌株。
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