CN117448187A - 一种含有降嘌呤的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的组合物及其应用 - Google Patents

一种含有降嘌呤的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的组合物及其应用。所述组合物包含的菌株具有降解嘌呤类化合物的能力。其优选菌株分类命名为枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn‑2，于2022年4月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，微生物保藏编号为CCTCC NO：M 2022444。本发明所涉及的菌株可促进尿酸前体嘌呤类化合物的降解，并显著降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平。作为降低血尿酸的新型可食用型菌株，在制备药品和/或其他相关产品方面具有广阔的应用前景。

Description

一种含有降嘌呤的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的组合物及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种含有降嘌呤的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的组合物及其应用。
背景技术
高尿酸血症是一种慢性代谢性疾病，除因尿酸结晶引发痛风外，还可能发展为肾病、尿路结石、心脑血管紊乱等。健康状态下，人体尿酸的产生和排泄保持着动态平衡。尿酸来源包括外源性富含嘌呤的食物，以及内源性嘌呤核苷酸分解代谢生成。人体内尿酸除了2/3由肾脏排泄，还有约1/3从肠道排泄。尿酸的肠道代谢障碍是导致高尿酸血症的重要因素。
临床常用的治疗高尿酸血症药物的作用之一为抑制尿酸产生，如非布司他的作用机制即为通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，阻碍嘌呤向尿酸转化，从而减少尿酸的生成。但这类药物都有着不同程度的副反应，如胃肠道反应、肝功能损害、心血管不良反应等。再如苯溴马龙，抑制肾脏尿酸转运蛋白回吸收尿酸，增加尿酸排泄，但其对肾脏有较大的副作用。另外，由于化药的毒副作用，目前有30-50％的痛风患者无药可治。因此，非常有必要开发一种疗效可靠、毒副作用小的治疗方式。
与传统治疗药物相比，微生态制剂的应用给高尿酸血症的治疗带来了新的发展：其一，补充具有分解嘌呤/嘌呤前体功能的菌群，通过减少肠道嘌呤吸收，阻止嘌呤在肠道内向尿酸转化，达到降低血尿酸的治疗目的；其二，痛风患者肠道菌群失调导致嘌呤代谢不平衡和肠道尿酸排泄受阻，这可能是高尿酸症状的重要原因。目前微生态制剂的一个重要开发方向是促进肠道菌群平衡的恢复。
目前筛选微生态制剂的技术手段，主要是在体外缓冲液体系中测试目标菌株降解或转化嘌呤类化合物的能力。值得注意的是，肠道环境远比体外缓冲液体系复杂。人体肠道为低氧环境，含氧量低于4％。另外肠道环境中通常营养较丰富，存在多种氮源，且有胆汁和胰酶的影响，均可能会干扰目标菌株的生长代谢、及对嘌呤类分子的利用与转化。但是在现有的筛选流程中，较少考虑这些因素，因此需要进一步评估筛选出的菌株在模拟体内环境的条件下是否发挥作用。
综上所述，有必要筛选出更多能在人体肠道环境中具有分解嘌呤/嘌呤前体能力，同时有助于肠道菌群向相对健康的方向进行平衡的细菌。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种具有降解嘌呤类化合物能力的枯草芽孢杆菌，并显著降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平。本发明的枯草芽孢杆菌来源于可食用纳豆产品，人体服用安全性高，作为降低血尿酸的新型可食用型菌株，在制备药品和/或其他相关产品方面具有广阔的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种可口服用于降低血尿酸的组合物，含有可降解嘌呤类化合物的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的微生物分类命名为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto)。所述组合物中的枯草芽孢杆菌在低氧条件下(氧含量≦1.0％，和/或1～2％，和/或2～3％，和/或3～4％)，以及在含胰酶和胆盐的模拟肠道环境中，对嘌呤化合物具有降解和利用能力，可减少嘌呤类化合物吸收入血，在体内转化成尿酸，或减少这些嘌呤类化合物在肠道内转化成尿酸，以免再吸收入血导致体内尿酸水平升高。所述嘌呤类化合物包括嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤)、嘌呤核苷(鸟苷、腺苷、黄嘌呤核苷、肌苷)、嘌呤核苷酸(鸟苷酸、腺苷酸、肌苷酸)中的一种或以上。
优选地，上述组合物包含枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-1,KBsn-2,KBsn-3,KBsn-8菌株中的至少一种。
进一步优选地，上述组合物包含分类名称为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillussubtilis subsp.Natto)KBsn-2菌株，于2022年4月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022444；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
更进一步优选地，上述组合物的活性成分包含有效量的枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株，其含有枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2的孢子数的量不低于104CFU/g或104CFU/mL组合物。
第二方面，本发明提供一株可食用纳豆产品来源的枯草芽孢杆菌菌株，其分类名称为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.Natto)KBsn-2菌株，于2022年4月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022444；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
第三方面，本发明提供了一种食品，其包含第二方面所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。
第四方面，本发明提供了一种食品添加剂，其包含第二方面所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。
第五方面，本发明提供了一种微生物制剂，其包含第二方面所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。
第六方面，本发明提供了一种保健品，其包含第二方面所述的保藏编号为CCTCCNO:M 2022444枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第二方面所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。
第八方面，本发明提供第一方面所述的组合物或第二方面所述的枯草芽孢杆菌纳豆亚种在制备减少肠道嘌呤吸收的药物或食品中的应用。
第九方面，本发明提供第一方面所述的组合物或第二方面所述的枯草芽孢杆菌纳豆亚种在制备预防和治疗高尿酸血症和/或痛风的药物或食品中的应用。
优选地，上述应用中，所述的药物是供口服的剂型。
优选地，上述应用中，所述剂型是选自于下列所构成的群组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊。
优选地，上述应用中，所述的食品，包括普通食品，保健食品，或特殊医学用途配方食品。
第十方面，本发明提供第一方面所述的组合物或第二方面所述的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株在降低饮食品中嘌呤类化合物的应用。
第十一方面，本发明提供一种抑制饮食品来源嘌呤类化合物摄入的方法，其包括使饮食品的原料或中间产品与第一方面所述的组合物、第二方面所述枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和/或其处理物接触的工序。
第十二方面，本发明提供一中降低饮食品中嘌呤类化合物的制造方法，其包括使饮食品的原料或中间产品与第一方面所述的组合物、第二方面所述枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和/或其处理物接触的工序。
本发明的有益效果
本发明从纳豆(粉)、稻草、其它枯草、土壤等中分离菌株。挑取可以在含嘌呤类化合物的培养基平板上生长的菌落。经过16s rDNA测序和纳豆发酵试验鉴定为可用于制备纳豆的枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌纳豆亚种。在嘌呤类化合物的培养基中分别接种这些菌株，观测其生长状况。挑选可在复合嘌呤培养平板上快速生长的菌株，模拟肠道环境，检测在有其他氮源存在、同时限制于低氧条件(氧含量≦1.0％，和/或1～2％，和/或2～3％，和/或3～4％)下，这些菌株消耗培养基中嘌呤类化合物的能力，筛选出降解能力强且降解速度快的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。
选取在体外筛选中具有显著降解嘌呤类化合物的枯草芽孢杆菌纳豆亚种的菌株及其组合物，对高尿酸血症模型小鼠进行灌胃治疗，观察对小鼠血清尿酸值的影响，结果发现能够显著抑制血清尿酸值上升的枯草芽孢杆菌纳豆亚种。
本发明筛选到的枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株，在高尿酸血症的鼠模型的降尿酸效果试验显示，上述菌株显示出明显的降血尿酸效果。因此，具有降解嘌呤类化合物能力的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株作为降低血尿酸和痛风治疗的新手段，在不降低生活品质(低嘌呤饮食)条件下，显著减少食源性嘌呤的吸收，达到低嘌呤饮食的效果。
所选菌具有消耗肠道内氧气的能力。抑制需氧的病原菌生长，促进兼性厌氧或厌氧的乳杆菌及双歧杆菌增殖，有助于肠道菌群向相对健康的方向进行平衡，进一步帮助肠道内嘌呤与尿酸代谢正常化，帮助血尿酸正常化。
本发明筛选到的枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株，降低肠道嘌呤类化合物的吸收，起到降低尿酸生成的作用，与临床化药治疗方式相比，无毒副作用，安全性更高，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1.为高尿酸血症模型小鼠口服枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株后对血尿酸值的改善作用。
图2.为枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株不同灌胃剂量对于高尿酸血症模型小鼠血尿酸的控制作用。
生物保藏说明
枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏机构简称：CCTCC，保藏日期为2022年04月21日，生物保藏编号为CCTCC NO：M 2022444，菌株命名：枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：从纳豆食品中分离与纯化可用于制备纳豆的枯草芽孢杆菌菌株。
(1)菌种分离：从市场上购买来自中国、日本和马来西亚的可食用纳豆产品，将其研磨物重悬于无菌水，离心取上清，接种环蘸取后在LB平板划线，37℃培养24小时后，挑取单菌落。(2)经16S rDNA测序鉴定，选取序列比对结果为枯草芽孢杆菌的菌株。(3)纳豆发酵试验：将黄豆按清洗、浸泡过夜、蒸煮、沥干、37℃冷却的步骤处理后，蒸煮后的黄豆按5g每份均分，每份熟黄豆(5g)各接种5×104～5×105cfu的上述枯草芽孢杆菌，搅拌均匀。37-40℃发酵16～24小时后进行观察，若出现丰富的黏液拉丝，则认为初始接种菌为可用于制备纳豆的枯草芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌纳豆亚种。
实施例2：从自然界中分离与纯化枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株
(1)菌种分离：从全国各地搜集稻草、土壤等样品，将其研磨物重悬于无菌水，80℃处理5分钟，离心取上清，接种环蘸取后在LB平板划线，37℃培养24小时后，挑取单菌落。(2)经16S rDNA测序鉴定，选取序列比对结果为枯草芽孢杆菌的菌株。(3)纳豆发酵试验：将黄豆按清洗、浸泡过夜、蒸煮、沥干、37℃冷却的步骤处理后，蒸煮后的黄豆按5g每份均分，每份熟黄豆(5g)各接种5×104～5×105cfu的上述枯草芽孢杆菌，搅拌均匀。37-40℃发酵16～24小时后进行观察，若出现丰富的黏液拉丝，则认为初始接种菌为可用于制备纳豆的枯草芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌纳豆亚种。
实施例3：菌种的基因鉴定。
16s rDNA鉴定：
上游引物：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
下游引物：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3'
使用以上引物进行菌落PCR，扩增得～900bp条带，回收后测序。16s rDNA典型序列如SEQ ID NO：1所示。与NCBI基因数据库比对，结果显示与已知枯草芽孢杆菌的序列一致性最高(>99.5％)。
经过上述基因鉴定以及纳豆发酵试验，本发明共分离出的枯草芽孢杆菌中有8株可用于制备纳豆的枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株KBsn-1～KBsn-8，其中KBsn-1～KBsn-5来源于纳豆食品，KBsn-6～KBsn-8来源于稻草、土壤等自然样本。
实施例4：体外检测菌种的嘌呤利用能力
(1)在以嘌呤/核苷/核苷酸混合物为唯一氮源的培养基平板上分别接种上述8株菌。优选的分离培养基配方包括但不限于含有嘌呤混合物、20g/L葡萄糖、1.5％琼脂的无机盐(十二水磷酸氢二钠8.55g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.01g/L、pH 6.8)固体培养基，添加嘌呤核苷、嘌呤核苷酸以及嘌呤碱基的混合物，包括腺苷、腺苷酸二钠、鸟苷、鸟苷酸二钠、黄嘌呤核苷、肌苷和肌苷酸二钠(每种成分各0.5g/L)，以及腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤(每种成分各10mg/L)。在优选的固体培养基上划线，37℃静置培养至长出单菌落。
表1所述菌株在嘌呤/核苷/核苷酸混合平板上的生长情况
结果显示所述菌株在嘌呤/核苷/核苷酸混合平板上的生长差异：KBsn-4在平板上生长较慢，其他菌株均可利用所述11种嘌呤/核苷/核苷酸的混合物作为氮源快速生长。
实施例5：低氧条件下的降嘌呤能力
所述枯草芽孢杆菌纳豆亚种为需氧菌，其孢子萌发、生长和代谢随环境中氧浓度升高而更加活跃。人体肠道中氧含量低于4％。为说明其功能，在优选的实施例中，选取上述可在尿酸平板上快速生长的7个菌株(即KBsn-1，KBsn-2，KBsn-3，KBsn-5，KBsn-6，KBsn-7，KBsn-8)，检测其在氧含量0.5～1.0％的条件下降解嘌呤类化合物的能力。具体如下：
(1)活化与培养：对上述7株菌进行活化，离心去发酵上清液并用PBS清洗菌泥两次，重悬后分别以初始OD600＝1.0(108～109cfu/mL)的活菌接种于低氧检测培养基中。优选的低氧培养基配方包括但不限于：在无机盐(十二水磷酸氢二钠8.55g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.01g/L、pH 6.8)缓冲液中，添加20g/L葡萄糖。此外，腺嘌呤、嘌呤核苷(腺苷、或鸟苷、或黄嘌呤核苷、或肌苷)、或嘌呤核苷酸(腺苷酸二钠、或鸟苷酸二钠、或肌苷酸二钠)的初始添加量为0.5g/L；由于溶解度远低于腺嘌呤和嘌呤核苷/核苷酸，黄嘌呤或次黄嘌呤初始添加量为10mg/L，鸟嘌呤初始添加量为5mg/L。装瓶量为2～5mL溶液置于50mL三角瓶中。调节培养箱至37℃和氧含量为0.5～1.0％，静置培养18h，测定终末OD600以确定生长状况。
(2)嘌呤类化合物含量检测：采用HPLC法测定发酵上清中的嘌呤类化合物含量。配置流动相：取2.72g磷酸二氢钾加水使溶解成1L溶液(终浓度20mM)，用30％磷酸溶液调节pH至2.50，0.22μm滤膜过滤，超声20min。采用C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，调节柱温为30℃，流速为1.0mL/min。进样量为10μL，检测波长为254nm。9种不同嘌呤类分子单独检测时的保留时间总结如下表(表2)。
表2 HPLC检测9种嘌呤类分子的保留时间(min)
(3)嘌呤类化合物利用能力测算：通过降解率和降解速度两个参数来进行鉴定，计算方法：①嘌呤类分子降解率％＝[100*(初始总量－终末总量)÷初始总量]％；②嘌呤类分子降解速度(mg/(L*OD*h))＝(初始总量(mg)－终末总量(mg))÷初始OD600÷反应时间(h)÷总体积(L)。检测结果整理后见表3和表4。
表3在0.5～1.0％氧含量培养条件下的18h嘌呤降解率ΔP％和嘌呤降解速度VP(mg/(L*OD*h))
表4在0.5～1.0％氧含量培养条件下的18h核苷/核苷酸降解率ΔN％和核苷/核苷酸降解速度VN(mg/(L*OD*h))
实施例6：在模拟肠道环境的培养体系中降解嘌呤类化合物。
在所选实施例中，选取上述在低氧条件下消耗嘌呤类分子能力最强的4株菌(即KBsn-1、KBsn-2、KBsn-3、KBsn-8)进行检测。在体外模拟肠道环境，为了检测所述菌株对胃液和胆汁的耐受能力，在检测缓冲液中添加胰酶和胆盐；为了检测所述菌株在含有其他营养物质的环境中，利用嘌呤类化合物的能力是否会受到影响，在检测缓冲液中额外添加复合氮源(有机氮源和无机氮源)；为了模拟肠道低氧环境，控制培养环境中的氧含量为0.5～1.0％。具体如下：
(1)活化与培养：将所述4株菌(KBsn-1、KBsn-2、KBsn-3、KBsn-8)进行活化，离心去发酵上清液并用PBS清洗菌泥两次，重悬后分别以初始OD600＝1.0(108～109cfu/mL)的活菌接种于低氧检测培养基中。优选的低氧培养基配方包括但不限于：在无机盐(十二水磷酸氢二钠8.55g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.01g/L，pH6.8)缓冲液中，添加20g/L葡萄糖，0.5g/L硫酸铵，0.5g/L胰蛋白胨，添加0.10％或0.20％胆盐和130,000U/g胰酶。在此基础上，分别各添加0.5g/L的腺苷、或腺苷酸二钠、或鸟苷、或鸟苷酸二钠、或黄嘌呤核苷、或肌苷、或肌苷酸二钠，或0.5g/L的腺嘌呤，或10mg/L的黄嘌呤、或次黄嘌呤，或5mg/L的鸟嘌呤。装瓶量为2～5mL溶液置于50mL三角瓶中。调节培养箱至37℃和氧含量0.5～1.0％，静置培养养18h。
(2)嘌呤类化合物含量检测：采用HPLC法测定发酵上清中的嘌呤类化合物含量。配置流动相：取2.72g磷酸二氢钾加水使溶解成1L溶液(终浓度20mM)，用30％磷酸溶液调节pH至2.50，0.22μm滤膜过滤，超声20min。采用C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，调节柱温为30℃，流速为1.0mL/min。进样量为10μL，检测波长为254nm。
(3)嘌呤类化合物利用能力测算：通过降解率和降解速度两个参数来进行鉴定，计算方法：①嘌呤类分子降解率％＝[100*(初始总量－终末总量)÷初始总量]％；②嘌呤类分子降解速度(mg/(L*OD*h))＝(初始总量(mg)－终末总量(mg))÷初始OD600÷反应时间(h)÷总体积(L)。结果总结于表5～表7。
表5.优选菌株在模拟肠道条件(0.10％胆盐，130,000U/g胰酶，0.5～1％含氧量)下降解嘌呤碱基的降解率ΔP％和降解速度VP(mg/(L*OD*h))
表6.优选菌株在模拟肠道条件(0.10％胆盐，130,000U/g胰酶，0.5～1％含氧量)下降解嘌呤核苷和核苷酸的降解率ΔN％和降解速度VN(mg/(L*OD*h))
结果显示，0.10％的胆盐和130,000U/g的胰酶不会减弱KBsn-1、KBsn-2、KBsn-3、KBsn-8降解嘌呤碱基、嘌呤核苷、以及嘌呤核苷酸的能力，并且在含有额外复合氮源的情况下，KBsn-1、KBsn-2、KBsn-3、KBsn-8的降解能力显著增强。可能的解释为，所述优选菌株在含有其他有机氮源和无机氮源的环境中，摄取利用嘌呤碱基、嘌呤核苷、以及嘌呤核苷酸的能力不但不会被抑制，反而会因为生长状态更好而加强。其中，相比其他3株菌，KBsn-2的能力最强且最全面。
保持其他条件不变，当胆盐浓度提升至0.20％后，KBsn-2降嘌呤类化合物的能力有所下降，但仍具备较强的降解鸟嘌呤核苷/鸟嘌呤核苷酸、黄嘌呤/黄嘌呤核苷、以及腺苷/腺苷酸的能力(表7)。
表7.KBsn-2在模拟肠道条件(0.20％胆盐，130,000U/g胰酶，0.5～1％含氧量)下降解嘌呤类化合物的降解率ΔN％和降解速度VN(mg/(L*OD*h))
实施例7：动物试验
试验动物为6-8周龄，体重25±5g的雄性昆明种小鼠，被饲养于SPF级动物房内，饲养期间严格遵照我国《实验动物福利伦理审查指南(GB/T 35892-2018)》的要求。试验期间，小鼠自由摄入饲料和蒸馏水。
试验动物喂予正常成鼠饲料和饮用蒸馏水适应环境1周后，将其随机分为每组10只，共4组：
①对照组(C)：从第0天至试验结束，对照组小鼠均正常饮食，自由饮水；
②高尿酸模型组(HU)：从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾以300mg/kg体重/天的剂量腹腔注射，麦芽糊精0.1g/天灌胃；
③阳性药物组(HU+AP)：从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾300mg/kg体重/天腹腔注射，别嘌醇(Allopurinol)10mg/kg体重/天灌胃；
④实验组(HU+KBsn-2)：从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾300mg/kg体重/天腹腔注射，以及枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株KBsn-2冻干粉1.0g/天灌胃。
以上灌胃液用灭菌水配置，不超过0.2～0.3mL/天。所述冻干粉填充剂为麦芽糊精，每0.1g冻干粉含有1×108cfu的KBsn-2。
试验时间共4周。第0天和试验结束的最后一天，小鼠取血并测定血清尿酸水平。试验最后一天取血时间为小鼠灌胃后2～4h。测试试剂盒选用酶比色法尿酸含量检测试剂盒(宁波博泰)。所得的实验数据使用GraphPad prism软件进行统计，以Mean±SEM表示。采用Student’s t-test比较模型组(HU)与对照组(C)、以及各实验组与模型组(HU)的实验结果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
检测小鼠血液中的尿酸含量：根据各组小鼠的第0天和最后一天血尿酸(μmol/L)平均值，整理下表8，绘制图1。
表8小鼠血尿酸含量(μmol/L)
血尿酸(μmol/L) C HU HU+AP HU+KBsn-2
第0天 127.1±37.7 150.2±38.4 130.2±28.9 136.2±40.4
第28天 134.7±24.1 280.7±58.3 162.2±42.5 196.7±31.6
实施例8：不同剂量枯草芽孢杆菌纳豆亚种灌胃对于小鼠血尿酸水平的控制作用
在高血尿酸模型小鼠上检测枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2的有效剂量。试验动物为6-8周龄，体重25±5g的雄性昆明种小鼠，被饲养于SPF级动物房内，饲养期间严格遵照我国《实验动物福利伦理审查指南(GB/T 35892-2018)》的要求。试验期间，小鼠自由摄入饲料和蒸馏水。试验动物喂予正常成鼠饲料和饮用蒸馏水适应环境1周后，将其随机分为每组8只，共6组：
①对照组(C)：从第0天至试验结束，对照组小鼠均正常饮食，自由饮水；
②高尿酸模型组(HU)：从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾以300mg/kg体重/天的剂量腹腔注射，麦芽糊精0.1g/天灌胃；
③高剂量组(H):从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾300mg/kg体重/天腹腔注射，含枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株的冻干粉灌胃，剂量为1×107cfu/天。
④中剂量组(M)：从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾300mg/kg体重/天腹腔注射，含枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株的冻干粉灌胃，剂量为1×106cfu/天。
⑤低剂量组(L):从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾300mg/kg体重/天腹腔注射，含枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株的冻干粉灌胃，剂量为1×105cfu/天。
⑥极低剂量组(LL):从第1天开始10％酵母粉喂食，氧嗪酸钾300mg/kg体重/天腹腔注射，枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株的冻干粉灌胃，剂量为1×104cfu/天。
以上灌胃液用灭菌水配置，不超过0.2～0.3mL/天。所述冻干粉填充剂为麦芽糊精。
试验时间共4周。第0天和试验结束的最后一天，小鼠取血并测定血清尿酸水平。试验最后一天取血时间为小鼠灌胃后2～4h。测试试剂盒选用酶比色法尿酸含量检测试剂盒(宁波博泰)。计算各组小鼠的第0天和最后一天血尿酸(μmol/L)平均值，所得的实验数据使用GraphPad prism软件进行处理，以Mean±SD表示。整理于表9。计算各组小鼠在试验结束时相对第0天的血尿酸上升百分比(ΔsUA％)，比较KBsn-2菌株不同灌胃剂量对于高嘌呤饮食诱导的小鼠高血尿酸值的影响，结果绘制于图2，ΔsUA％＝100×(第28天血尿酸值－第0天血尿酸)÷第0天血尿酸。采用Student’s t-test比较各剂量试验组与HU组结果之间的差异，*表示p<0.05，***表示p<0.005。
表9小鼠血尿酸含量(μmol/L)
枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株的血尿酸控制作用显示出一定的剂量依赖性。灌胃剂量在1×104cfu/天时，虽无显著性差异，但显示出控制尿酸升高的趋势。当灌胃剂量在1×105cfu/天时，血尿酸较模型组已有显著差异，高于1×107cfu/天时，效果极显著。使用高剂量的枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株进行灌胃的小鼠未见异常，未观察到显著毒副作用。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉康复得泌尿系结石研究院有限公司
<120> 一种含有降嘌呤的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的组合物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 907
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
ctgcgggcgg ctgctataat gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc agactgaata ccggggaatt ttggtgcagc 900
cggacgg 907
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (17)

1.一种可口服用于降低血尿酸的组合物，其特征在于，所述组合物是含有可降解嘌呤类化合物的枯草芽孢杆菌，微生物分类命名为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilissubsp.natto)。
2.如权利要求1所述，其特征在于，所述组合物中的枯草芽孢杆菌在低氧条件下(氧含量≦1.0％，和/或1～2％，和/或2～3％，和/或3～4％)，以及在含胰酶和胆盐的模拟肠道环境中，对嘌呤化合物具有降解和利用能力，可减少嘌呤类化合物吸收入血，在体内转化成尿酸，或减少这些嘌呤类化合物在肠道内转化成尿酸，以免再吸收入血导致体内尿酸水平升高；所述嘌呤类化合物包括嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤)、嘌呤核苷(鸟苷、腺苷、黄嘌呤核苷、肌苷)、嘌呤核苷酸(鸟苷酸、腺苷酸、肌苷酸)中的一种或以上。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-1,KBsn-2,KBsn-3,KBsn-8菌株中的至少一种。
4.如权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，高血尿酸模型小鼠口服所述含枯草芽孢杆菌的组合物，可显著降低血尿酸值。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含的优选菌株的名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)KBsn-2菌株，于2022年4月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022444；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，其活性成分包含有效量的枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2菌株，其含有包含孢子在内的枯草芽孢杆菌纳豆亚种KBsn-2的量不低于104CFU/g或104CFU/mL组合物。
7.一株可食用纳豆产品来源的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其分类名称为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.Natto)KBsn-2菌株，于2022年4月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022444；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
8.一种食品，其包含权利要求7所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌菌株。
9.一种食品添加剂，其包含权利要求7所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌菌株。
10.一种微生物制剂，其包含权利要求7所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌菌株。
11.一种保健品，其包含权利要求7所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌菌株。
12.一种药物组合物，其包含权利要求7所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2022444枯草芽孢杆菌菌株。
13.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株在制备减少肠道嘌呤吸收的药物或食品中的应用。
14.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株在制备预防和治疗高尿酸血症和/或痛风的药物或食品中的应用；
优选地，所述应用中，所述的药物是供口服的剂型；
优选地，所述应用中，所述剂型是选自于下列所构成的群组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊；
优选地，所述应用中，所述的食品，包括普通食品，保健食品，或特殊医学用途配方食品。
15.权利要求1所述的组合物或权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌株在降低饮食品中嘌呤类化合物的应用。
16.一种抑制饮食品来源嘌呤类化合物摄入的方法，其包括使饮食品的原料或中间产品与权利要求1所述的组合物、权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌株和/或其处理物接触的工序。
17.一种降低饮食品中嘌呤类化合物的制造方法，其包括使饮食品的原料或中间产品与权利要求1所述的组合物、权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌株和/或其处理物接触的工序。
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