WO2017213469A2 - 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법 - Google Patents

남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법 Download PDF

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WO2017213469A2
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spirulina
cell culture
cell
saccs
cyanobacteria
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강도형
박건후
이수진
김태호
오철홍
허수진
이영득
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한국해양과학기술원
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture medium containing a cyanobacteria spirulina extract, a method of preparing the same, and a method of culturing cells using the same, and more specifically, to obtain a cyanobacteria spirulina extract from a sample of the genus Spirulina sp.
  • the present invention relates to a cell culture solution containing a cyanobacteria spirulina extract prepared by filtration, a preparation method thereof, and a method of culturing cells using the same.
  • Cell culture is one of the most important underlying technologies for medical, immunological and biological research. Life phenomena through human genome analysis and protein analysis, stem cell research for treatment and regenerative medicine for incurable diseases, toxicity and safety tests of natural and bioactive substances used as food and pharmaceutical ingredients, diagnostic methods and preventive methods through disease cause analysis
  • the field of cell culture is expanding, including the development of new drugs through the development of new drugs, screening of drug candidates such as antibiotics, anticancer drugs and vaccines, and the production of various recombinant peptides and proteins used in medicine and industry. It is becoming.
  • the importance of cell research is because cells derived from living bodies are recognized as a living model and are studied on behalf of living bodies.
  • a cell culture medium In order to stably culture living cells derived from a living body on a plate of a laboratory, a cell culture medium is necessary.
  • Cell culture is used by adding 10% to 20% of serum to synthetic media, which contains various nutrients, vitamins and minerals. However, it contains hormones, adhesion factors, and growth factors that are essential for cells involved in cell growth, division, and differentiation.
  • Serum essential for animal cell culture is used separately from animals such as fetuses, calves, horses, sheep, pigs, dogs, and goats. Fetal bovine serum (FBS) is most commonly used.
  • Fetal bovine serum is most commonly used because it requires large individuals with large amounts of blood in order to supply serum smoothly. Cattle are the most suitable for animal husbandry around the world. Immunoglobulins in a serum induce an immune rejection reaction, which causes a variety of side effects. Since fetal bovine serum is separated from fetuses before giving birth from the mother, it has only minimal intrinsic immunoglobulin, so it is most suitable for cell culture because the immune rejection reaction is relatively low compared to other animal-derived serum.
  • the fetus is extracted from the womb of a pregnant mother, the needle is inserted into the fetal heart, blood is collected, and the serum is separated and used.
  • the fetal bovine serum products that can be industrially produced due to the difficulty and scarcity of the production process has a serious problem of high cost structure that is very high priced.
  • the growing dependence on cell research due to the international community's recommendation for animal testing has led to destabilization of fetal bovine serum supply and burden of research materials for industry, academia and research.
  • the US Food and Drug Administration, the European Union's European Medicines Agency (EMEA), and the international community have encouraged the use of fetal bovine serum and the development of serum substitutes.
  • Serum-free medium is a cell culture medium that does not use serum that has unethical, unenvironmental, and high cost problems. It is produced by adding a recombinant protein synthesis technology to various hormones and growth factors essential for cell culture. It is a cell culture medium which has no use.
  • Serum-free medium is rapidly growing in demand both domestically and internationally, especially in the pharmaceutical industry market.
  • the reason for this is that in the case of recombinant protein drugs produced through cell culture, the use of fetal bovine serum may result in the synthesis of recombinant proteins with unintended unknown antigens, which may cause potential side effects. While it is very difficult and expensive, recombinant protein drugs produced through cells cultured in serum-free medium have the advantage of being able to produce high purity recombinant protein with little concern for side effects due to the clarity of components.
  • Serum substitutes such as KNOCKOUT TM serum substitutes (Invitrogen, Calif.), are referred to as chemically defined culture media that lack serum and contain nutrients and other proteins essential for cell growth.
  • KNOCKOUT SRTM contains protein factors with short half-lives, most of which are included in commercial formulations. KNOCKOUT SRTM cannot be used as a substitute for fetal bovine serum in plating of feeder cells due to lack of adhesion factors, thus resulting in inappropriate cell adhesion to the formulation.
  • PC-1TM serum-free medium (Lonza, Maryland) is a low-protein, serum-free medium formulated in a specially modified DMEM / F12 medium base and complete HEPES buffer with known amounts of insulin, transferrin, fatty acids and patent proteins Contains the system. Transferrin in PC-1 media has a half-life of 2-4 weeks in solution.
  • Cellgro COMPLETE TM (Cellgro, VA) is a serum-free low protein formulation based on a blend of DMEM / F12, RPMI 1640 and McCoy 5A. Cellgro COMPLETETM does not contain insulin, transferrin, cholesterol, growth or adhesion factors.
  • Cellgro COMPLETE TM comprises a mixture of trace elements and high molecular weight carbohydrates, surplus vitamins, non-animal protein sources, and bovine serum albumin (1 g / L).
  • Cellgro FREETM (Cellgro, VA) is a serum-free protein growth medium that does not contain any hormones or growth factors.
  • chlorella's cell wall is made of cellulose, and in order to be used in a medium, it is necessary to break chlorella's cell wall.
  • the active ingredients of chlorella are destroyed during the cell wall disruption, but also the cost of the cell wall disruption step, that is, the pretreatment step.
  • the drying step of chlorella also has a significant cost problem.
  • Serum-free medium is also disclosed in International Patent Publication Nos. WO2009023194, WO2008137641, WO2006017370, WO2001011011, WO2007071389, WO2007016366, WO2006045064, WO2003064598, WO2001011011, US Patent Publication Nos. US20050037492, US20080113433, US20080299540, US Patent Nos. 5,324,64, 6,162,6429,6,162,6429,6728 It is described in European Patent Application No. EP2243827.
  • fetal bovine serum substitutes must overcome the limitations and high costs of research due to the unethical, unenvironmental and high cost of fetal serum and the limitation of applicable cell lines, which is a problem of serum-free media. Furthermore, the materials used for fetal bovine serum substitutes should be proved by the international community for their nutritional excellence and safety so that they can be applied immediately to medical, bio research and industrial fields. You should be able to harmonize with them.
  • Spirulina sp. Is a species of cyanobacteria that is recognized by WHO as a complete food, superfood, etc., and is used for medical, health, and hunger free programs. NASA is conducting research and development as a space food, and the FDA and It is a biological material recognized for safety by KFDA.
  • Eco-friendly Spirulina sp. Contains physiologically active substances such as phycocyanin, beta-carotene, Ca-Sp, GLA and Immolina, and has been reported to promote cell activity and immune system.
  • the antioxidant effect of inhibiting phosphorus free radicals is 20 times that of green yellow vegetables, 10 times of milk calcium per Kg, 20 times of carrot beta-carotene, 50 times of iron of spinach, and 5 times higher protein content of eggs. It is a nutritionally perfect biological material such as, EPA and natural pigments. Spirulina sp. Has a high rate of cell division and cell growth, resulting in much higher yields per unit area than land animals and plants, and very low production costs compared to land animals and plants. In addition, it is possible to cultivate and easily collect raw materials after mass cultivation, and the domestic market of 80 billion won is already formed, which is a biological resource with great utilization potential in medical, bio research and industrial fields.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture solution (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing a cyanobacteria spirulina extract, a preparation method thereof, and a method of culturing cells using the same.
  • Spirulina Animal Cell Culture Solution SACCS
  • It provides a method for producing a cell culture solution containing cyanobacteria spirulina extract comprising the step of recovering the obtained cyanobacterial spirulina extract (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing the filtered blue alga spirulina extract do.
  • Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS cyanobacterial spirulina extract
  • the present invention also provides
  • the present invention also provides
  • a cell culture medium containing the cyanobacteria spirulina extract (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) in an appropriate volume ratio (% v / v), a cell culture medium.
  • the present invention also provides
  • a method for culturing cells using the cell culture medium prepared by the above method, and containing a cell culture solution (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract in an appropriate volume ratio (% v / v). .
  • a cell culture solution Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS
  • SACCS cyanobacteria spirulina extract
  • Cell culture solution (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing the algae spirulina extract prepared by the method according to the present invention is safe from animal-derived diseases and provides a serum substitute for cell culture that can be used at low cost in conventional cell culture. It has the effect of reducing the dependence of the serum used, and it is expected to be of high value for research in basic research and industrial fields by suggesting the usefulness as a serum substitute of environmentally friendly marine organisms.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the development of a cell culture solution (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing a cyanobacteria spirulina extract and a method of culturing cells using the same.
  • Spirulina Animal Cell Culture Solution SACCS
  • FIG. 2 is a comparison of cell culture solution (SACCS) and fetal bovine serum (FBS) containing cyanobacteria spirulina extract, (A) is the pH and salinity of the stock solution (B) is added to the synthetic medium at 10% pH and Salinity is shown.
  • SACCS cell culture solution
  • FBS fetal bovine serum
  • Figure 3 was used to examine the contamination level of the cell culture solution (SACCS) containing the algae spirulina extract using a diagnostic kit, (A) shows the bacterial contamination, (B) fungal contamination and (C) shows the microplasma contamination.
  • SACCS cell culture solution
  • Figure 4 shows the test report according to the component analysis, (A) the general component and mineral component analysis of FBS, (B) the general component and inorganic component analysis of spirulina or raw material and (C) the general component and inorganic component of SACCS Component analysis is shown.
  • Figure 6 is a test of the culture state of the cell line in a medium containing a cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract, (A) HeLa cell line, (B) HCT116 cell line and (C) HEK293 cell line The culture state is shown.
  • SACCS cell culture solution
  • Figure 7 shows the results of microscopic observation of the HeLa cell line adapted in medium containing FBS and SACCS.
  • Figure 8 confirms the protein expression pattern of the adapted HeLa cell line in the medium containing FBS and SACCS.
  • Figure 9 analyzes the cell cycle of adapted HeLa cell lines in medium containing FBS and SACCS.
  • Figure 10 is an analysis of apoptosis by ultraviolet light of HeLa cell line adapted in medium containing FBS and SACCS.
  • 11 is a result of culturing the H460 cell line in a medium containing a cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 13 shows the results of culturing T24 cell lines in a medium containing cell culture solution (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 15 is a result of culturing A549 cell line using cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • Figure 16 shows the results of culturing IMR90 normal cell lines using cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • FIG. 17 shows morphological observations of IMR90 normal cell lines cultured in medium containing cell culture solution (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 18 shows morphological observations of CHO-K1 cell lines cultured in cell culture medium (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract.
  • 19 is a culture result of CHO-K1 cell line using a cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • 20 is a batch culture result of a CHO-K1 cell line using a cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 21 shows the results of culturing and morphological observations of CHO-GSR cell lines using a cell culture solution containing SAAC spirulina extract (SACCS).
  • Figure 22 shows the results of batch culture of CHO-GSR cell line using cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • Figure 23 shows the results of antibody productivity per unit cell of the CHO-GSR cell line using a cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 24 shows N-glycosylation profile analysis results of CHO-GSR cell line-derived antibodies cultured in cell culture medium containing SAB spirulina extract (SACCS).
  • Figure 25 shows the results of testing the endotoxin of the SACCS derived from the photobioculture and channel culture spirulina.
  • Figure 26 shows the osmotic pressure analysis results of FBS and SACCS.
  • F means FBS and "S” means SACCS.
  • F5 S5
  • F3 S7
  • F1: S9 means FBS10%: SACCS 90%. The same is true for other numbers.
  • the present invention is prepared by using the Cyanobacteria spirulina sp. (Spirulina sp.) As part of the development of the serum substitute material, the development of Spirulina Animal Cell Culture Solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract and cells using the cell culture It relates to a culture method of.
  • Spirulina Animal Cell Culture Solution SACCS
  • the present invention relates to a serum substitute using cyanobacteria spirulina sp.
  • Spirulina sp. Extract, a preparation method thereof, and a method of culturing cells using the same, a cell culture solution containing cyanobacteria spirulina extract using an extract derived from cyanobacteria spirulina genus.
  • Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS was prepared, and the cell culture medium and serum (eg, Fetal Bovine Serum (FBS)) were added to the synthetic medium at an appropriate mixing ratio to prepare a cell culture medium.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the spirulina genus powder is treated by enzymatic, ultrasonic and high temperature and high pressure to crush the spirulina genus cells, centrifugation After separation, the supernatant was recovered with spirulina extract, and filtered through a filter to remove bacteria, fungi and microplasma to prepare a cell culture containing cyanobacteria spirulina extract (see Example 1).
  • cell culture solution SACCS
  • FBS fetal bovine serum
  • the nutritional component of cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract was analyzed.
  • SACCS cell culture solution
  • the cytotoxicity and viability of HeLa cells treated with cell culture solution (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract was confirmed.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 5 there was no cytotoxicity of HeLa cells treated with SACCS, showed about 15% increased cell viability compared to HeLa cells (non-treated) treated with SACCS, distilled water It showed about 10% increased cell viability compared to the treated HeLa cells (control) (see Example 5).
  • the medium containing the cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract is suitable for HeLa cell culture.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 6A when using a medium containing SACCS HeLa cells were found to be stable growth rate of HeLa cells from the first generation of the culture to the third generation and late 10 generations of culture.
  • the FBS 50%: SACCS 50% (% v / v) medium which reduced the use of FBS by 50% and replaced by 50% with SACCS, was 40% compared to the [FBS 100%] (% v / v) control medium.
  • Abnormally high cell viability and 70% replacement of SACCS [FBS 30%: SACCS 70%] (% v / v) medium showed similar cell viability to [FBS 100%] control medium (see Example 6). ).
  • the medium containing the cell culture solution (SACCS) containing the cyanobacteria spirulina extract is suitable for HCT116 cell culture.
  • SACCS cell culture solution
  • the mixed medium containing FBS and SACCS [FBS 70%: SACCS 30%] medium and [FBS 50%: SACCS 50%] medium compared to the [FBS 100%] control medium
  • FBS 70%: SACCS 30%] medium and [FBS 50%: SACCS 50%] medium compared to the [FBS 100%] control medium about 10% increased survival (see Example 7).
  • the medium containing the cell culture solution (SACCS) containing the cyanobacteria spirulina extract is suitable for HEK293 cell culture.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 6C [FBS 50%: SACCS 50%] medium in which 50% of FBS was replaced with SACCS showed a cell survival rate of 45% or higher compared to the [FBS 100%] control medium.
  • 70% replaced [FBS 30%: SACCS 70%] medium showed 30% higher cell viability than [FBS 100%] control medium (see Example 8).
  • the cell culture state before and after freezing in a medium containing a cell culture solution (SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract was verified.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 7 cells cultured to SACCS according to before and after freezing at the time of microscopic observation were divided into three groups ([FBS 100%] medium, [FBS 50%: SACCS 50%] medium or [FBS 30%: SACCS 70%] media) were found to be morphologically similar (see Example 9).
  • HSP housekeeping protein
  • HSP heat shock protein
  • the cell cycle of HeLa cells adaptively cultured in a medium containing a cell culture solution (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract was investigated.
  • SACCS cell culture solution
  • the cell cycle of HeLa cells cultured for a long time in [FBS 100%] medium, [FBS 50%: SACCS 50%] medium and [FBS 30%: SACCS 70%] medium was very It was found to be similar (see Example 11).
  • the degree of apoptosis of HeLa cells adaptively cultured in a medium containing a cell culture solution (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract was confirmed.
  • SACCS cell culture solution
  • FIG. 10 UV irradiation induced about 45.6% of apoptosis in [FBS 100%] control medium, and about 36.3% in [FBS 50%: SACCS 50%] medium and [FBS 30%].
  • SACCS 70% About 36.6% of apoptosis was confirmed in the medium.
  • HeLa cells cultured in a medium containing SACCS showed slightly stronger resistance to induction of apoptosis by UV within about 10% compared to the [FBS 100%] control medium (see Example 12).
  • the cyanobacteria spirulina sp. (Spirulina sp.) Is Spirulina maxima, Spirulina platensis, Spirulina geitleri, Spirulina siamese, Spirulina siamese, Spirulina major Spirulina subsalsa, Spirulina princeps, Spirulina laxissima, Spirulina curta, and Spirulina spirulinoides, but may be selected from the group of Spirulina spirulinoides However, the present invention is not limited thereto, and preferably Spirulina maxima is used.
  • the spirullina (Spirulina sp.) Can be used by replacing the microalgae hematococcus (Haematococcus sp.) Or Chlorella sp. (Chlorella sp.).
  • the cyanobacteria spirulina genus sample may be in a dry powder state or lyophilized state, but is not limited thereto.
  • Obtaining the algae spirulina extract from the cyanobacterial spirulina genus sample in the step (a) is through extracting juice, steam extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, solvent extraction, enzyme extraction, grinding extraction, high temperature and high pressure extraction or reflux cooling extraction It may be carried out, but is not limited thereto, preferably, enzyme extraction, ultrasonic extraction or high temperature and high pressure extraction.
  • the ultrasonic extraction may use an ultrasonic mill or an ultrasonic water heater.
  • the solvent extraction may be extracted with ethanol, methanol, acetone, hexane, ethyl acetate, methylene chloride, water or a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • phosphate buffered drinking water and physiological drinking water may be added. It can be extracted by including.
  • the algae spirulina extract may be obtained from the algae spirulina genus sample, and then further characterized in that the clarification is performed, and the clarification may be performed by centrifugation.
  • the present invention is not limited thereto, and may be preferably centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes.
  • clarification as used in the present invention may be used in combination with “purification” and means to remove impurities such as precipitates formed when a cyanobacteria spirulina extract is obtained from a cyanobacteria spirulina sample.
  • the “purification” step in the present invention generally includes one or more of the following alone or in various combinations thereof, such as one or more steps of filtration, precipitation, flocculation and sedimentation, more particularly depth filtration (DF), In the group consisting of microfiltration (MF), nanofiltration (NF), ultrafiltration (UF), sterile filtration, membrane chromatography (MC) and centrifugation It can be carried out using one or more techniques selected, the purification step in the present invention to remove impurities, particularly nucleic acid impurities, cell debris and endotoxins, etc. contained in the algae spirulina extract Can be.
  • DF depth filtration
  • MF microfiltration
  • NF nanofiltration
  • UF ultrafiltration
  • MC membrane chromatography
  • centrifugation step in the present invention to remove impurities, particularly nucleic acid impurities, cell debris and endotoxins, etc. contained in the algae spirulina extract Can be.
  • the cyanobacterial spirulina extract may be sequentially filtered using a 0.45 ⁇ m filter, a 0.2 ⁇ m filter, and a 0.1 ⁇ m filter, but is not limited thereto.
  • the filtration of step (b) may be performed to preserve useful substances (eg, nutrients) of cyanobacteria spirulina extract useful for cell culture, and to remove bacteria, fungi or microplasma, but is not limited thereto.
  • Ultraviolet and gamma irradiation may be performed in order to effectively remove potential viral contamination of the cell culture in the method of preparing the cyanobacteria spirulina or cell culture of the present invention, but is not limited thereto.
  • the identification of the color, flavor (odor), pH and composition (eg salinity) of the cell culture medium and bacteria may further include measuring the degree of contamination of the fungus and / or microplasma.
  • Cell culture medium (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing the cyanobacteria spirulina extract is included in a suitable volume ratio (% v / v), a method for producing a cell culture medium.
  • '% W / w' means 'volume / volume', preferably in units of 'mL / mL'.
  • Cell culture medium containing the cyanobacteria spirulina extract in the cell culture medium may be included in a volume ratio (% v / v) of 0.1 to 20%, preferably 1 to 15%, more preferably 5 to 10% to be.
  • Serum (serum) additionally included in the cell culture medium may be 0.1 to 19.9%, preferably in a volume ratio (% v / v) of 1 to 15%, more preferably 5 to 10%.
  • the total volume ratio (% v / v) with the cell culture containing the cyanobacterial spirulina extract may be 0.1-20% with respect to the cell culture medium, preferably 1-15%, more preferably 5-10 %to be.
  • the serum may be, but is not limited to, animal blood, preferably serum derived from mammal (eg, pig, horse, cow, goat, sheep and dog) blood, more preferably fetal bovine serum, FBS).
  • animal blood preferably serum derived from mammal (eg, pig, horse, cow, goat, sheep and dog) blood, more preferably fetal bovine serum, FBS).
  • mammal eg, pig, horse, cow, goat, sheep and dog
  • FBS fetal bovine serum
  • the synthetic medium containing the cell culture solution and / or fetal bovine serum containing cyanobacteria spirulina extract is a basic medium (cellal medium) for cell culture, MEM (Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) , DMEM-F12, Roswell Park Memorial Institute (RPMI), Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM), M199, Ham's F12, Ham's 10, NCTC 109, NCTC 135, NeuroCult Basal Medium, and others.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • DMEM-F12 Roswell Park Memorial Institute
  • K-SFM Keratinocyte Serum Free Medium
  • the medium is sufficient, and may include one or more selected from the group consisting of various nutrients, minerals, minerals, vitamins, amino acids, peptides, recombinant proteins, adhesion factors, growth factors and hormones, but is not limited thereto. It is not.
  • the present invention relates to a cell culturing method using a cell culture medium prepared by the above method and containing a cell culture solution (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing a cyanobacteria spirulina extract in an appropriate volume ratio (% v / v). .
  • a cell culture solution Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS
  • SACCS Cell Culture Solution
  • Cell culture medium containing the cyanobacteria spirulina extract in the cell culture medium may be included in a volume ratio (% v / v) of 0.1 to 20%, preferably 1 to 15%, more preferably 5 to 10% to be.
  • Serum (serum) additionally included in the cell culture medium is included in a volume ratio (% v / v) of 0.1 ⁇ 19.9%, but the total volume ratio (% v / v) with the cell culture containing the cyanobacteria spirulina extract
  • the cell culture medium may be 0.1-20%, preferably 1-15%, more preferably 5-10%.
  • the serum may be, but is not limited to, animal blood, preferably serum derived from mammal (eg, pig, horse, cow, goat, sheep and dog) blood, more preferably fetal bovine serum, FBS).
  • animal blood preferably serum derived from mammal (eg, pig, horse, cow, goat, sheep and dog) blood, more preferably fetal bovine serum, FBS).
  • mammal eg, pig, horse, cow, goat, sheep and dog
  • FBS fetal bovine serum
  • Cells cultured in the cell culture medium are initially cultured at a volume ratio (% v / v) of the cell culture medium at 0.1-20%, preferably 1-15%, more preferably 5-10%. Then, the cell culture medium to sequentially decrease the volume ratio (% v / v) of the serum in the cell culture medium and sequentially increase the volume ratio (% v / v) of the cell culture containing the cyanobacteria spirulina extract It may be characterized in that the culture.
  • the volume ratio (% v / v) of the serum sequentially reduced in the cell culture medium may be 0.09 to 19.99%, preferably 1 to 15%, more preferably 5 to 10%, sequential
  • the volume ratio (% v / v) of the cell culture medium containing the cyanobacterial spirulina extract increased by 0.01 to 19.91%, preferably 1 to 15%, more preferably 5 to 10%.
  • the cell may be an animal cell, but is not limited thereto, and may be an insect cell or a plant cell.
  • HeLa Human adenocarcinoma
  • HCT116 Human colorectal carcinoma
  • HEK293 Human embryonic Kidney 293
  • HEK293F Human embryonic Kidney 293F
  • African green monkey kidney fibroblast-like (COS) Baby hamster kidney (BHK)
  • myeloma cells Spodoptera frugiperda (Sf9) and Taxus species
  • HeLa HeLa
  • HCT116 Human colorectal carcinoma
  • HEK293 Human embryonic Kidney 293
  • HEK293F Human embryonic Kidney 293F
  • COS Baby hamster kidney
  • BHK Baby hamster kidney
  • CHO Chinese hamster ovary
  • myeloma cells Spodoptera frugiperda
  • Sf9 Spodoptera frugiperda
  • Culture medium of the microalgae spirulina sp. (Spirulina sp.) Which is used in the present invention is NaCl 29.23g; KCl 1.105 g; 11.09 g MgSO 4 7H 2 O; 1.21 g of Tris base ((HOCH 2 ) 3 CNH 2 ); 1.83 g of CaCl 2 ⁇ 2H 2 O; And 0.25 g of NaHCO 3, and may further include 3.0 mL of trace metal solution.
  • Micronutrient solution is 281.3 mg of NaNO 3 ; NaH 2 PO 4 H 2 O 21.2 mg; Na 2 EDTA 16.35 mg; 11.8 mg FeCl 3 .6H 2 O; 675 ⁇ g MnCl 2 ⁇ H 2 O; 37.5 ⁇ g CoCl 2 ⁇ H 2 O; 37.5 ⁇ g ZnSO 4 7H 2 O; 22.5 ⁇ g Na 2 MoO 4 ; 0.375 ⁇ g of vitamin B1 and 0.188 ⁇ g of biotin.
  • the medium and the micronutrient solution can be used by dissolving in sea water, and the prepared medium can be autoclaved using autoclave and filtered through filter paper to be used as a culture medium.
  • the culture broth may be prepared as a nitrogen-containing culture broth by supplying NaNO 3 as a nitrogen source, wherein the nitrogen source is preferably contained at a concentration of 37.0 to 38.0 mg / L in the medium.
  • concentration of the nitrogen source is less than 37.0mg / L there is a problem that the growth of microalgae is reduced due to the lack of nitrogen source as a nutrient for cell division, the cell mass is reduced, when the concentration of the microalgae exceeds 38.0mg / L There are many organic matters accumulated through photosynthesis, but there is a problem of low lipid content.
  • the Spirulina sp. May be used by replacing the microalgae Hematococcus sp. Or Chlorella sp.
  • a cell culture solution (Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) containing cyanobacteria spirulina extract
  • SACCS Animal Cell Culture Solution
  • spirulina genus cells were crushed by enzymatic and ultrasonic treatment of cyanobacterial spirulina genus powder.
  • the supernatant except cell debris was recovered by Cyanobacteria spirulina extract through centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes, and filtered sequentially using 0.45 ⁇ m, 0.2 ⁇ m, and 0.1 ⁇ m filters to remove bacteria, fungi, and microplasma.
  • the manufacturing process of the cell culture solution containing the specific cyanobacteria spirulina extract is shown in FIG.
  • the treatment of the spirulina genus cells with ultrasound and high temperature and high pressure is because the cell wall of spirulina is physically weakened through the ultrasonic treatment, and the cell effective ingredient can be effectively extracted through the high temperature and high pressure treatment.
  • the combined treatment of ultrasonic and high temperature and high pressure it is possible to obtain a substantially similar level of extract from spirulina raw materials having different culture environments and harvesting periods, thereby obtaining a uniform SACCS.
  • results obtained without significant differences by batch (Lot.) It was confirmed that the cell culture capacity is almost similar even when using different batches.
  • it is possible to minimize the source of contamination important for pure cell culture by using sonic / high temperature and high pressure complex extraction.
  • endotoxin, microplasma, mold and bacterial contamination were not detected in the culture solution prepared through the combined treatment of ultrasonic and high temperature and high pressure.
  • the SACCS of the present invention is preferably prepared by extracting the spirulina genus cells through a combination of ultrasonic and high temperature and high pressure, and do not use solvent extraction.
  • the SACCS may be prepared as a cell culture using an extract derived from the genus Hematococcus sp., which is a microalgae, instead of an extract derived from the genus Spirulina sp.
  • SACCS Cell culture solution
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • SACCS cell culture
  • DiaPlexC TM Bacteria Detection Kit containing primers specific for bacteria, fungi and microplasma Solgent, Korea
  • PCR polymerase chain reaction
  • PrevalTM Carbohydrate ES (4.6 ⁇ 250 mm, 5 ⁇ m, Grace, Japan) was used as a free sugar analysis column, and acetonitrile and distilled water were mixed at 7: 3 as the mobile phase, and the flow rate was 0.8 mL per minute, and the ELSD was used as a detector.
  • Free sugar content was quantified from the standard curve obtained by HPLC analysis of the standard prepared by concentration (Sigma, St. Louis, MO, USA).
  • General ingredients, saturated fat, cholesterol, and vitamin A were analyzed by Food Code (2015) and AOAC method. Crude fat was analyzed by ether extraction, crude protein by Kjeldahl method, saturated fat and cholesterol by GC (GC-2010, Shimadzu). .
  • Vitamin A was pretreated according to the Food Code and then analyzed by HPLC (Waters 2690).
  • HPLC Waters 2690
  • sample is taken in a crucible, dried and carbonized, and then incubated at 450 ⁇ 550 °C.
  • the ash is soaked with water, 2 ⁇ 4 mL of hydrochloric acid is added and dried in an aqueous solution. After filtering with a glass filter was used as a test solution to a 20mL.
  • Lead, cadmium standard solution, test solution and blank were analyzed by injecting ICP-OES (Varian, MPX, AUS).
  • the standard solution was prepared by diluting the standard 1000 mg / L standard with 4% nitric acid to prepare a mixed 100 mg / L stock solvent, and the standard used for the test was diluted again with 4% nitric acid as a standard.
  • 1 g of the sample was taken in a painting vessel, carbonized, and incubated for several hours at a temperature of 550 ° C. until ash of white or off-white ash was obtained.
  • the ash was digested sequentially with hydrochloric acid, diluted to a certain amount, filtered, and quantified using an ICP analyzer (Optima8300, Perkin Elmer).
  • the algae spirulina was found to have higher general and mineral contents than FBS, but SACCS was found to be somewhat lost in nutrients. It is estimated that the loss of nutrients occurred during the production of SACCS.
  • Example 5 cyanobacteria Spirulina Treated with derived cell culture HeLa Cell viability
  • HeLa cell line which is a human-derived cell
  • MEM Minimum Essential Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 100 ⁇ g / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin
  • a medium to which FBS and SACCS was added at various mixing ratios was prepared. More specifically, FBS-containing medium [FBS 100%] (% v / v) medium was used as a control, and FBS and SACCS were added to the synthetic medium at various mixing volume ratios (% v / v) to [FBS 70%: SACCS 30%] (% v / v) medium, [FBS 50%: SACCS 50%] (% v / v) medium and [FBS 30%: SACCS 70%] (% v / v) medium were prepared. However, the mixture was prepared so that the final 10% volume ratio (% v / v) in the medium. Then, HeLa cells were cultured and maintained in the same conditions as in Example 5 in each medium containing FBS and SACCS.
  • the SACCS may be used in place of a cell culture containing an extract derived from Haematococcus sp., which is a microalgae, or an extract derived from Chlorella sp., Instead of an extract derived from Spirulina sp. .
  • first-, third- or 10th-generation passaged HeLa cells were 96-well After seeding at 2x103 / ml on the plate, the survival rate was confirmed for 3 days using the MTT assay kit, and the cell growth rates of the first generation, the third generation, and the last ten generations in the medium containing SACCS were compared together. Analyzes evaluated the cell culture capacity of the medium containing SACCS.
  • Example 8 Culture of HEK293 with Cyanobacteria Spirulina-derived Cell Culture
  • Human-derived HEK293 cell line was cultured for 10 generations in a culture medium containing cell culture solution (SACCS) containing Cyanobacteria spirulina extract, seeded at 2x103 / ml in a 96-well plate, and then using an MTT assay kit. Three days survival rate was confirmed.
  • SACCS cell culture solution
  • MTT assay kit Three days survival rate was confirmed.
  • [FBS 50%: SACCS 50%] medium in which 50% of FBS was replaced with SACCS showed a cell survival rate of 45% or higher compared to the [FBS 100%] control medium.
  • 70% replaced [FBS 30%: SACCS 70%] medium showed 30% higher cell viability than [FBS 100%] control medium.
  • Example 9 cyanobacteria Spirulina Derived cells Culture medium Cell culture before and after freezing in a containing medium
  • HeLa cells [FBS 100%] medium, [FBS 50%: SACCS 50%) cultured for a long time in 10 generations of passage culture for molecular biological evaluation of cell culture medium (SACCS) -adapted cells containing Cyanobacteria spirulina extract obtained in Example 6 ] Or [FBS 30%: SACCS 70%] medium) was cryopreserved.
  • Cell cryopreservation was performed by washing the cultured cells with phosphate buffer solution, trypsin treatment, centrifugation, removing the supernatant and removing the cells by 50% (% v / v) MEM, 10% (% v / v) DMSO.
  • cells cultured to SACCS according to before and after freezing at the time of microscopic observation were divided into three groups ([FBS 100%] medium, [FBS 50%: SACCS 50%] medium or [FBS 30%: SACCS 70%] media) were found to be morphologically similar.
  • Example 10 cyanobacteria Spirulina HKP and HSP expression patterns of adaptively cultured cells in a culture medium containing the derived cell culture
  • HTP house keeping protein
  • HSP heat shock protein
  • HKP House keeping protein
  • HSP heat shock protein
  • the PVDF membrane was blocked for 1 hour at room temperature in PBST (PBS + 0.1% Tween 20) buffer containing 5% BSA, and then reacted with primary antibody at 4 ° C. for 1 day. After the reaction, the PVDF membrane was washed with PBST buffer, and then reacted with peroxidase-conjugated secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, USA) for 1 hour at room temperature, followed by washing with PBST buffer and using an ECL (Enhanced Chemilunimoecence) kit. X-ray film on the photosensitive to the amount of ⁇ -Tubulin, ⁇ -Actin, GAPDH and pHSP27 were analyzed.
  • PBST PBS + 0.1% Tween 20
  • Example 11 cyanobacteria Spirulina Cell cycle of adaptively cultured cells in culture medium containing derived cell culture
  • the cell cycle is divided into G1, S, G2 and M.
  • the G1 cycle is a general cell growth
  • the S cycle is DNA replication
  • the G2 cycle is a growth and preparation stage for cell division
  • cell division occurs in the M cycle.
  • the purpose of this study was to determine whether cells cultured adaptively in a cell culture solution containing SAB spirulina extract had a normal cell cycle.
  • the cell cycle of SACCS-adapted HeLa cells obtained in Example 6 and the cell cycle of HeLa cells cultured in FBS were compared and analyzed using the CycleTEST TM PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, CA, USA).
  • FBS / SACCS volume ratios % v / v
  • each cell cultured for 10 generations or longer was seeded on a plate at a number of 2x105 / ml, and the next day, phosphate buffered saline (PBS, Gibco) was seeded.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 12 cyanobacteria Spirulina Apoptosis of Adaptive Cultured Cells in Culture Media Containing Derived Cell Cultures
  • Ultraviolet radiation exposes the cell to a strong energy called ultraviolet light, which induces apoptosis by destroying or modifying DNA inside the cell.
  • Apoptosis is an immunological mechanism by which cells suspend themselves by certain external or internal stimuli and is an important system for living things.
  • PS phosphatidyl serine
  • the Annexin V protein is inverted and binds only to the surface of the phospholipid exposed to the outside of the cell.
  • Annexin V protein bound to the phospholipid is attached to the FITC fluorescent material, so the intensity of fluorescence is measured using a flow cytometer, so the degree of apoptosis can be confirmed.
  • each HeLa cell cultured for 10 generations or more with a cell culture solution prepared by mixing FBS and SACCS in different volume ratios was 2x105 cells / Seeding in ml number, irradiated with 365nm wavelength of UV light for 1 hour, the culture medium was removed, washed twice with PBS, centrifuged, and adjusted to have a cell density of 1 x 10 6 cells / ml using a binding buffer. . 5 ⁇ l of Annexin V-FITC and PI were added to 100 ⁇ l solution and stained at room temperature for 15 minutes. After addition of 400 ⁇ l of binding buffer, the degree of apoptosis was measured using a flow cytometer.
  • UV irradiation induced about 45.6% of apoptosis in [FBS 100%] control medium, and about 36.3% in [FBS 50%: SACCS 50%] medium and [FBS 30%]. : SACCS 70%] About 36.6% of apoptosis was confirmed in the medium.
  • HeLa cells cultured in a medium containing SACCS showed a little stronger resistance to UV-induced apoptosis in the range of about 10% compared to the [FBS 100%] control medium.
  • Example 13 cyanobacteria Spirulina H460 using derived cell culture Cell line culture
  • the H460 cell line showed a cell growth rate of 50% to 112% for FBS replacement rate and a cell growth rate of 101% to 70% for FBS replacement rate compared to [FBS 100%] control, and 86% for 90% of FBS replacement rate. Cell proliferation was confirmed respectively (Fig. 11). It was also observed that the morphology of the cultured cells remained unchanged (FIG. 12).
  • Example 15 cyanobacteria Spirulina Culture of A549 Cell Line Using Derived Cell Culture
  • Example 16 cyanobacteria Spirulina Using derived cell culture IMR90 Evaluation of culture capacity of normal cells
  • Example 17 cyanobacteria Spirulina Using derived cell culture CHO -Cultivation of K1 Host Cell Line
  • Cell culture was performed by applying SACCS to the CHO-K1 host cell line, an antibody pharmaceutical production cell line.
  • Example 18 cyanobacteria Spirulina Using derived cell culture CHO - GSR Evaluation of cell line culture capacity
  • the CHO-GSR cell line is a cell line that introduces genes into CHO-K1 host cells to produce therapeutic antibodies (Rituxan). Cell culture was performed by applying SACCS to the CHO-GSR cell line.
  • the cell growth rate of 85% was confirmed in the 50% replacement rate group compared to the FBS control group, and the cell proliferation rate was reduced by 50% in the 70% replacement rate group (FIG. 21).
  • Example 19 cyanobacteria Spirulina Using derived cell culture CHO - GSR Evaluation of the therapeutic antibody (Rituxan) productivity per unit cell of cell line
  • the CHO-GSR cell line was cultured in SACCS in a T25 flask, and the culture solution of the cells in culture was collected. In addition, the concentration of Rituxan, a therapeutic antibody protein, in the collected culture was measured. The specific production rate was also measured from the productivity per unit cell.
  • Example 20 cyanobacteria Spirulina Cultured in the derived cell culture CHO - GSR Analysis of N-glycosylation profile of cell line-derived therapeutic antibody (Rituxan)
  • CHO-GSR cell lines were subjected to batch culture in SACCS (15 mL volume) in T-75 flasks. After 6 days of batch culture, the culture solution was recovered and the antibody was purified. The N-glycosylation profile of the Fc fragment CH2 domain was analyzed using HPLC [Fluorescence detector (360 nm ⁇ 425 nm)].
  • LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation kit 50ul of Limulus amenocyte lysate (LAL) was added to 50ul of SACCS samples, and the mixture was slowly mixed for 10 seconds. After reacting at 37 ° C. for 10 minutes, 100 ⁇ l of Chromogenic substrate was added thereto, followed by reaction at 37 ° C. for 6 minutes. Then 25% Acetic acid (stop solution) was added 50 ⁇ l each and the absorbance was measured at 405nm.
  • LAL Limulus amenocyte lysate
  • the endotoxin of the SACCS sample derived from the photobioreactor raw material was about 5EU / mL, and the endotoxin of the SACCS sample derived from the aqueous culture medium raw material was found to be about 1EU / mL (FIG. 25).
  • Osmotic pressure in the medium is an important physico-chemical factor that must be taken into account in animal cell culture. Increased osmotic pressure affects the quality of therapeutic antibody pharmaceuticals.
  • Cytotoxicity evaluation of SACCS derived from aqueduct culture (ORP-SACCS) and photobioculture (PBR-SACCS) raw materials was performed.
  • Distilled water (D.W, Distilled Water) and FBS was used as a control.
  • the human-derived normal cell line IMR90 cells were seeded 2x103 in 200ul of DMEM medium in a 96well plate and then treated with distilled water, FBS and SACCS at various concentrations for 24 hours or 48 hours, respectively (each treatment concentration is expressed in volume%), Thereafter, cell viability was measured using an MTT assay kit.

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Abstract

본 발명은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득한 다음, 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 여과하여 제조되는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 남조류 스피룰리나 추출물을 함유한 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)은 세포배양용 혈청 대체제로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법
본 발명은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득한 다음, 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 여과하여 제조되는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 관한 것이다.
세포 배양은 의학, 면역학 및 생물학 연구에 가장 중요한 기반 기술 중 하나이다. 인간 게놈 분석 및 단백체 분석을 통한 생명현상연구, 난치병 치료 및 재생의학을 위한 줄기세포 연구, 식·의약품 원료로 사용되는 천연물 및 생리활성 물질의 독성 및 안전성 검사, 질병의 원인분석을 통한 진단법 및 예방법 개발, 항생제, 항암제 및 백신과 같은 신약 후보 물질 스크리닝을 통한 신약 개발 및 기전 분석, 의학 및 산업적으로 사용되는 각종 재조합 펩타이드 및 단백질 생산 등 세포 배양의 활용분야는 점점 확장되고 있으며, 그 중요성은 더욱 부각되고 있다. 세포 연구의 중요성은 생체에서 유래된 세포가 하나의 생체 모델로 인식되고 생체를 대신하여 연구되기 때문이다.
동물세포의 배양은 1885년 Roux에 의해 병아리 수정란 배양에서부터 시작되어 많은 연구자의 노력으로 다양한 동물 유래 세포를 대상으로 한 세포 배양 기술이 개발되어 오다가 1952년 Gey에 의해 최초의 인간 유래 불멸화 세포주인 HeLa 세포주가 확립되었고 세포 연구의 기틀이 마련되었다.
생체에서 유래된 살아있는 세포를 실험실의 평판접시 위에서 안정적으로 배양하기 위해서는 세포배양용 배지가 반드시 필요하다. 세포배양은 합성배지(synthetic media)에 혈청(serum)을 10~20% 농도로 첨가하여 사용하는데, 합성배지는 각종 영양성분, 비타민 및 무기질을 포함하고 있으며, 혈청의 경우 구성성분이 완전히 밝혀지진 않았지만 세포의 성장, 분열 및 분화 등에 관여하는 세포에 필수적인 호르몬, 부착인자 및 성장인자를 포함하고 있다. 동물세포 배양에 필수적인 혈청은 소태아, 송아지, 말, 양, 돼지, 개, 염소 등의 동물에서 분리하여 사용되는데, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 가장 일반적으로 사용된다.
소태아혈청이 가장 많이 사용되는 이유는 혈청을 원활히 공급하기 위해 혈액의 양이 많은 큰 개체가 필요한데 전 세계적으로 축산되는 동물 가운데 소가 가장 적합하기 때문이고, 동물세포의 배양에 있어 다른 종으로부터 유래한 혈청의 면역글로불린이 면역거부 반응을 유도하는데 그로 인하여 다양한 부작용이 유발된다. 소태아혈청의 경우 어미 소로부터 출산하기 이전의 소태아에서 분리하기 때문에 최소한의 고유 면역글로불린만을 가지므로 타 동물 유래 혈청에 비하여 면역거부반응이 상대적으로 적게 유발되어 세포배양에 가장 적합하다.
세포배양을 위한 소태아혈청의 제조과정을 보면 임신한 어미 소의 자궁에서 소태아를 적출하여 소태아 심장에 바늘을 꽂아 혈액을 채취한 후 혈청을 분리하여 사용하는데 이 과정이 매우 비윤리적이고 비환경적이다. 또한, 생산과정의 어려움과 희소성으로 산업적으로 생산 가능한 소태아혈청 제품은 매우 높은 가격이 책정되는 고비용 구조의 심각한 문제점이 있다. 또, 국제사회의 동물 실험 자제권고로 높아지는 세포 연구 의존도는 소태아혈청 공급의 불안정화와 산·학·연의 연구재료비 부담으로 이어지고 있다. 이에 미국 FDA(US Food and Drug Administration), 유럽연합의 EMEA(European Medicines Agency) 및 국제사회는 소태아혈청 사용의 자제와 혈청 대체재 개발을 권고하고 있는 실정이다.
최근 소태아혈청 대체재로 무혈청배지가 각광받고 있다. 무혈청 배지는 비윤리적, 비환경적, 고비용 문제점을 가진 혈청을 사용하지 않는 세포배양용 배지로 합성배지에 세포배양에 필수적인 다양한 호르몬과 성장인자를 재조합 단백질 합성 기술로 생산하여 첨가해줌으로 혈청의 사용을 불필요하게 한 세포배양용 배지이다.
무혈청 배지는 국내·외적으로 그 수요가 급증하고 있는데, 특히 의약품산업 시장에 있어 의존도가 높아지고 있다. 그 원인은 세포배양을 통해 생산하게 되는 재조합 단백질 의약품의 경우 소태아혈청 사용으로 인해 의도하지 하지 않은 미지의 항원을 가진 재조합 단백질이 합성되어 잠재적인 부작용을 초래할 수 있으므로 의약품으로 인·허가 받는 과정이 매우 어렵고 비용이 많이 드는 반면, 무혈청 배지에서 배양된 세포를 통해 생산되는 재조합 단백질 의약품은 구성성분의 명확함으로 부작용의 우려가 적고 고순도 재조합 단백질을 생산할 수 있는 장점이 있기 때문이다.
하지만, 무혈청 배지에서 세포배양이 가능한 세포주의 종류가 한정적이고, 배양을 위한 세포주 적응 과정이 번거로우며 소태아혈청을 사용하는 대신 재조합 단백질의 첨가가 필요하기 때문에 여전히 고비용 문제점이 있다. 특히, 산업적 재조합 펩타이드 및 단백질 생산 분야 이외에 세포배양이 기반이 되는 세포신호전달, 기전분석, 기능성 및 신약 후보 물질 스크리닝, 화장품·식품·의약품 원료의 세포 독성 및 안전성 테스트 등 전반적인 의학, 면역학 및 생물학 연구 분야에는 적용하기 힘든 한계성이 있다.
특성화되지 않은 혈청 조성물의 성질 및 혈청의 로트-대-로트(lot-to-lot) 변화에 따른 불확실성을 극복하기 위해 혈청 대체재 또는 무혈청 배지 배양물을 사용하는 것이 바람직하다(Pei et al., Arch Androl. 49(5):331-42, 2003). 아울러, 세포 배양물에서 성장시킨 치료 용도를 위한 세포, 재조합 단백질 또는 백신의 경우, 동물-유래 성분의 부가는 인간에게 투여시 잠재적 바이러스 오염, 전염성해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE) 감염 우려 및/또는 동물 단백질의 잠재적 면역원성 효과로 인해 바람직하지 않다. 혈청 대체재는 세포 배양물에 대한 소태아혈청의 영향을 최소화할 뿐만 아니라 인간 세포의 배양물에 사용되는 동물 단백질의 양을 최소화하기 위해 개발되었다. 혈청 대체재, 예컨대 KNOCKOUTTM 혈청 대체재(Invitrogen, 캘리포니아)는 혈청이 부족하고 세포성장에 필수적인 영양소 및 다른 단백질들을 함유하는 화학적으로 규정된 배양물 배지라고 한다. KNOCKOUT SRTM는, 대부분이 상업적 제형에 포함되는 짧은 반감기를 갖는 단백질 인자들을 함유한다. KNOCKOUT SRTM은 부착 인자의 부족으로 인해 피더(feeder) 세포의 플레이팅에 있어서 소태아혈청의 대체재로 사용될 수 없으며, 따라서 상기 제형에 부적절한 세포 부착을 초래한다. PC-1TM 무혈청 배지(Lonza, 메릴랜드)는 특수 변형된 DMEM/F12 배지 베이스에서 제형화된 저-단백질, 무혈청 배지이고, 공지된 양의 인슐린, 트랜스페린, 지방산 및 특허 단백질을 갖는 완전한 HEPES 완충 시스템을 함유한다. PC-1 배지 중의 트랜스페린은 용액 중에서 2~4주 반감기를 나타낸다. Cellgro COMPLETETM(Cellgro, 버지니아)는 DMEM/F12, RPMI 1640 및 맥코이(McCoy) 5A의 혼합을 기제로 하는 무혈청 저-단백질 제형이다. Cellgro COMPLETETM는 인슐린, 트랜스페린, 콜레스테롤, 성장 또는 부착 인자를 함유하지 않는다. Cellgro COMPLETETM는 미량 원소 및 고분자량 탄수화물, 잉여 비타민, 비-동물 단백질원, 및 소혈청 알부민(1g/L)의 혼합물을 포함한다. Cellgro FREETM(Cellgro, 버지니아)는 임의의 호르몬이나 성장 인자도 함유하지 않은 무혈청 무단백질 성장 배지이다.
한편, 클로렐라 열수 추출물을 이용하여 세포 배양 배지를 제조하는 기술 또한 개발되었다. 그러나 클로렐라는 그 세포벽이 셀룰로오스로 되어 있어, 배지에 이용하기 위하여는 클로렐라의 세포벽을 파쇄시킬 필요가 있다. 그러나 세포벽의 파쇄 과정에서 클로렐라의 활성 성분들이 파괴될 뿐 아니라, 세포벽 파쇄 단계, 즉 전처리 단계에 비용이 발생하게 된다. 더군다나 클로렐라는 상당히 크기가 작기 때문에(스피룰리나의 약 10 내지 100 분의 1 정도), 클로렐라의 건조 단계 역시 비용이 상당히 요구되는 문제가 있다.
무혈청 배지는 또한 국제특허 공보번호 WO2009023194, WO2008137641, WO2006017370, WO2001011011, WO2007071389, WO2007016366, WO2006045064, WO2003064598, WO2001011011, US특허 공보번호 US20050037492, US20080113433, US20080299540, US 특허번호 5,324,666, 6,162,643, 6,103,529, 6,048,728, 7,709,229 및 유럽특허 출원번호 EP2243827에 기술되어 있다.
결국, 소태아혈청 대체재는 소태아혈청이 가지는 비윤리적, 비환경적 및 고비용 문제점과 무혈청 배지의 문제점인 적용 가능한 세포주의 제한에 따른 연구 분야의 한계성 및 고비용을 극복할 수 있어야 한다. 더 나아가 소태아혈청 대체재에 사용되는 소재는 의학·바이오연구 및 산업 분야에 즉시 적용될 수 있도록 그 소재의 영양학적인 우수성과 안전성이 국제사회에서 입증되어야 할 것이고 원료 소재의 원활한 공급으로 수요와 공급의 균형을 조화롭게 맞출 수 있어야 할 것이다.
스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 남조류의 일종으로 WHO에서 완전식품, 수퍼푸드 등으로 인정받아 의료, 건강, 기아해방프로그램 등에 이용되고 있으며, NASA에서는 우주식량으로서 연구·개발을 진행하고 있고, FDA 및 식약처에 그 안전성을 인정받은 생물 소재이다. 친환경적인 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 피코시아닌, 베타카로틴, Ca-Sp, GLA 및 Immolina 등의 생리활성물질을 함유하여 세포 활성 및 면역시스템을 촉진하는 것으로 보고되었고, 노화 및 각종 질병의 원인인 활성산소를 억제하는 항산화 효과가 녹황색야채의 20배에 이르고 Kg당 우유 칼슘의 10배, 당근 베타카로틴의 20배, 시금치 철분의 50배, 계란의 5배 높은 단백질 함유량이 있으며, 미네랄, 비타민, EPA 및 천연색소 등 영양학적으로 완벽한 생물 소재이다. 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 세포분열 및 세포성장 속도가 매우 빨라 단위면적당 생산량이 육상 동·식물에 비해 훨씬 높고, 육상 동·식물에 비교하여 생산비용이 매우 적게 들며, 환경이 척박한 사막 지역에서도 배양이 가능하고 대량배양 후 원료 수거가 용이할 뿐만 아니라 이미 800억 원 규모의 국내 시장이 형성되어 있어 의학·바이오연구 및 산업 분야에 큰 활용 잠재력을 가진 생물자원이다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 동물 유래 질병(예컨대, 전염성해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE) 감염)으로부터 안전하고, 저렴한 가격으로 사용가능한 세포배양용 혈청 대체재를 개발하고자 예의 노력한 결과, 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.)으로부터 추출되어 제조된 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)을 합성배지(synthetic media)에 첨가하여 이용시 혈청이 포함된 배지와 대등한 조건에서 인간 유래 3종의 세포주를 10세대 이상 장기 계대 배양할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS), 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법을 제공하는 데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득하는 단계; 및
(b) 수득한 남조류 스피룰리나 추출물을 여과하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)으로 회수하는 단계;를 포함하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 방법으로 제조된 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)을 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)이 적정한 부피비율(%v/v)로 포함되는, 세포 배양용 배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 방법으로 제조되고, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)이 적정한 부피비율(%v/v)로 포함된 세포 배양용 배지를 이용하는, 세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)은 동물 유래 질병으로부터 안전하고, 저렴한 가격으로 사용가능한 세포배양용 혈청 대체재를 제공함으로써 종래 세포배양에서 이용되는 혈청의 의존도를 낮출 수 있는 효과가 있으며, 친환경적 해양생물 소재의 혈청 대체재로서의 유용성을 제시함으로써 기초학문의 연구와 산업적 분야에 이용가치가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS) 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 대한 개발 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)과 소태아혈청(FBS)을 비교한 것으로, (A)는 원액의 pH 및 염분도 및 (B)는 합성배지에 10%로 첨가 후 pH 및 염분도를 나타낸 것이다.
도 3은 진단 키트를 사용하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)의 오염도를 조사한 것으로, (A)는 박테리아 오염도, (B)는 곰팡이 오염도 및 (C)는 마이크로플라스마 오염도를 나타낸 것이다.
도 4는 성분분석에 따른 검사 성적서를 나타낸 것으로, (A)는 FBS의 일반성분 및 무기질 성분분석, (B)는 스피룰리나 원말의 일반성분 및 무기질 성분분석 및 (C)는 SACCS의 일반성분 및 무기질 성분분석을 나타낸 것이다.
도 5는 HeLa 세포주를 이용한 SACCS의 세포독성 및 생존율을 검증한 것이다.
도 6은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서의 세포주의 배양상태를 시험한 것으로, (A)는 HeLa 세포주, (B)는 HCT116 세포주 및 (C)는 HEK293 세포주의 배양 상태를 나타낸 것이다.
도 7은 FBS 및 SACCS가 함유된 배지에서 적응된 HeLa 세포주를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 FBS 및 SACCS가 함유된 배지에서 적응된 HeLa 세포주의 단백질 발현 양상을 확인한 것이다.
도 9는 FBS 및 SACCS가 함유된 배지에서 적응된 HeLa 세포주의 세포 주기를 분석한 것이다.
도 10은 FBS 및 SACCS가 함유된 배지에서 적응된 HeLa 세포주의 자외선에 의한 세포자멸사를 분석한 것이다.
도 11은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서의 H460 세포주의 배양 결과이다.
도 12는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서 배양된 H460 세포주의 형태학적 관찰 결과이다.
도 13은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서의 T24 세포주의 배양 결과이다.
도 14는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서 배양된 T24 세포주의 형태학적 관찰 결과이다.
도 15는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용한 A549 세포주의 배양 결과이다.
도 16은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용한 IMR90 정상 세포주의 배양 결과이다.
도 17은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서 배양된 IMR90 정상 세포주의 형태학적 관찰 결과이다.
도 18은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)에서 배양된 CHO-K1 세포주의 형태학적 관찰 결과이다.
도 19는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용한 CHO-K1 세포주의 배양 결과이다.
도 20은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용한 CHO-K1 세포주의 회분식 배양 결과이다.
도 21은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용한 CHO-GSR 세포주의 배양 결과 및 형태학적 관찰 결과이다.
도 22는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용한 CHO-GSR 세포주의 회분식 배양 결과이다.
도 23은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 이용 시CHO-GSR 세포주의 단위 세포당 항체 생산성 분석 결과이다.
도 24는 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)에서 배양된 CHO-GSR 세포주 유래 항체의 N-glycosylation profile 분석 결과이다.
도 25는 광생물배양기 및 수로형배양기 스피룰리나 유래 SACCS의 내독소를 검사한 결과이다.
도 26은 FBS 및 SACCS의 삼투압 분석 결과이다.
도 27은 FBS 및 SACCS의 세포 독성 평가 결과이다.
상기 도면들에서, “F”는 FBS를 의미하며, “S”는 SACCS를 의미한다.
또한 “F5:S5”는 FBS 50% : SACCS 50%를 의미하며, 마찬가지로 “F3:S7”은 FBS 30% : SACCS 70%를. “F1:S9”는 FBS10% : SACCS 90%를 의미한다. 다른 숫자들의 경우도 마찬가지이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 혈청 대체 소재 개발의 일환으로 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.)을 활용하여 제조되고, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)의 개발 및 상기 세포 배양액을 이용한 세포의 배양방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 추출물을 활용한 혈청 대체재, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 관한 것으로, 남조류 스피룰리나 속 유래 추출물을 활용하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)을 제조한 다음, 상기 세포 배양액과 혈청(예컨대, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS))을 적절한 혼합비율로 합성배지에 첨가하여 세포 배양용 배지를 제조하였다. 그 다음, 상기 세포 배양용 배지의 세포주 배양능(인간 유래 3종의 세포주를 대상으로 10세대 이상 장기 계대 배양)을 확인함으로써 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 혈청 대체 비율을 확립하고 혈청 대체 소재로서의 스피룰리나 속(Spirulina sp.)의 활용 가능성을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)의 제조를 위해 스피룰리나 속 건조분말을 효소, 초음파 및 고온고압 처리하여 스피룰리나 속 세포를 파쇄하고, 원심분리한 다음, 상층액을 스피룰리나 추출액으로 회수하였으며, 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마의 제거를 위하여 필터로 여과하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액을 제조하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)과 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 비교하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, SACCS 또는 FBS가 함유된 합성배지의 색, 질감, 향, pH 및 염분도가 매우 유사한 것으로 나타났다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)의 제조과정에서 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마로 인한 SACCS의 오염 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0.45μm, 0.2μm 및 0.1μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과된 각각의 SACCS의 샘플에서 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마가 검출되지 않은 것으로 확인되었다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)의 영양성분을 분석하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 스피룰리나 원말은 FBS에 비하여 일반성분 및 무기질 함량이 높은 것으로 나타났으나, SACCS는 영양성분이 다소 소실된 것으로 확인되었다(실시예 4 참조)
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)으로 처리된 HeLa 세포의 세포독성 및 생존율을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, SACCS로 처리된 HeLa 세포의 세포 독성은 없었으며, SACCS가 처리되지 않은 HeLa 세포(non-treated)에 비해 약 15% 증가된 세포 생존율을 나타내었고, 증류수로 처리된 HeLa 세포(control)에 비해 약 10% 증가된 세포 생존율을 나타내었다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지가 HeLa 세포 배양에 적합한지 확인하였다. 그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, SACCS를 함유하는 배지를 이용할 경우 HeLa 세포는 배양 초기인 1세대부터 중기 3세대 및 후기 10세대에 이르기까지 HeLa 세포의 성장률이 안정하게 나타나는 것으로 확인되었다. 특히, FBS의 사용을 50% 절감하고 SACCS로 50% 대체한 [FBS 50% : SACCS 50%](%v/v) 배지는 [FBS 100%](%v/v) 컨트롤 배지에 비해 40% 이상 높은 세포 생존율을 나타내었고, SACCS로 70% 대체한 [FBS 30% : SACCS 70%](%v/v) 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지와 유사한 세포 생존율을 나타내었다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지가 HCT116 세포 배양에 적합한지 확인하였다. 그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, FBS 및 SACCS를 함유하는 혼합배지인 [FBS 70% : SACCS 30%] 배지 및 [FBS 50% : SACCS 50%] 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지에 비해 약 10% 증가된 생존율을 나타내었다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지가 HEK293 세포 배양에 적합한지 확인하였다. 그 결과, 도 6C에 나타난 바와 같이, FBS를 SACCS로 50% 대체한 [FBS 50% : SACCS 50%] 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지에 비하여 45% 이상 높은 세포 생존율을 나타내었고, SACCS로 70% 대체한 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지 대비 30% 높은 세포 생존율을 나타내었다(실시예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지에서의 동결 전후에 따른 세포 배양 상태를 검증하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 현미경 관찰시 동결 전후에 따른 SACCS에 적응 배양된 세포는 세 그룹([FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 또는 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지) 모두에서 형태학적으로 유사하게 나타난 것으로 확인되었다(실시예 9 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지에서 적응 배양된 HeLa 세포의 하우스 키핑 프로테인(House keeping protein, HKP) 및 열충격단백질(Heat Shock Protein, HSP)의 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, [FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 배양된 세포 모두에서 동일한 수준의 α-Tubulin, β-Actin, GAPDH 및 pHSP27 단백질이 발현되는 것을 확인함으로써 SACCS에서 적응 배양된 세포의 HSP 단백질 발현 양상 및 스트레스 정도가 FBS 적응 세포와 유사함을 확인하였다(실시예 10 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지에서 적응 배양된 HeLa 세포의 세포 주기를 조사하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, [FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 장기간 적응 배양된 HeLa 세포의 세포주기는 매우 유사한 것으로 나타났다(실시예 11 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배지에서 적응 배양된 HeLa 세포의 세포자멸사의 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 자외선 조사에 의해 [FBS 100%] 컨트롤 배지에서 약 45.6%의 세포자멸이 유도되었고 [FBS 50% : SACCS 50%] 배지에서 약 36.3%, [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 약 36.6%의 세포자멸이 확인되었다. SACCS가 함유된 배지에서 배양된 HeLa 세포의 경우 [FBS 100%] 컨트롤 배지와 비교하여 약 10% 이내의 범위에서 자외선 의한 세포자멸사 유도에 조금 더 강한 내성을 나타내었다(실시예 12 참조).
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
(a) 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득하는 단계; 및
(b) 수득한 남조류 스피룰리나 추출물을 여과하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)으로 회수하는 단계;를 포함하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액에 관한 것이다.
본 발명에 있어서,
상기 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulina laxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta) 및 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 바람직하게는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima)이다.
상기 스피룰리나(Spirulina sp.)는 미세조류인 헤마토코커스 속(Haematococcus sp.) 또는 클로렐라 속(Chlorella sp.)으로 대체하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서,
상기 남조류 스피룰리나 속 시료는 건조분말된 상태 또는 동결건조된 상태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서,
상기 (a) 단계에서 상기 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득하는 단계는 착즙 추출, 수증기 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 용매 추출, 효소 추출, 분쇄 추출, 고온고압 추출 또는 환류냉각 추출을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 바람직하게는 효소 추출, 초음파 추출 또는 고온고압 추출이다. 여기서, 상기 초음파 추출은 초음파 분쇄기 또는 초음파 온탕기를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서,
상기 용매 추출은 에탄올, 메탄올, 아세톤, 헥산(hexane), 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 물 또는 이들의 혼합물로 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예컨대, 인산 완충 식용수, 생리 식용수를 추가로 포함시켜 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서,
상기 (a) 단계에서 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득한 다음, 정화(clarification)시키는 것을 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 정화는 원심분리(centrifugation)하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 바람직하게는 10,000rpm으로 30분간 원심분리하여 수행될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "정화(clarification)"는 "정제(purification)"와 혼용하여 사용할 수 있으며, 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득시 형성되는 침전물 등의 불순물을 제거하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 "정화" 단계는 일반적으로 이하의 단독 또는 그의 다양한 조합을 포함하는, 예컨대, 여과, 석출, 응집 및 침강의 하나 이상의 단계, 더욱 상세하게는, 심층 여과(depth filtration, DF), 정밀여과(microfiltration, MF), 나노여과(nanofiltration, NF), 한외여과(ultrafiltration, UF), 멸균 여과(sterile filtration), 맴브레인 크로마토그래피(membrane chromatography, MC) 및 원심분리(centrifugation)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기법을 이용하여 수행될 수 있으며, 본 발명에서의 정화 단계를 통해 남조류 스피룰리나 추출물에 포함되어 있는 불순물, 특히 핵산 불순물, 세포 파쇄물(cell debris) 및 내독소(endotoxin) 등이 제거될 수 있다.
본 발명에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 0.45μm 필터, 0.2μm 필터 및 0.1μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기서, 상기 (b) 단계의 여과는 세포 배양에 유용한 남조류 스피룰리나 추출물의 유용물질(예컨대, 영양소)을 보존하고, 박테리아, 곰팡이 또는 마이크로플라스마의 제거를 위해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 남조류 스피룰리나 세포 배양액의 제조방법에서 상기 세포 배양액의 잠재적 바이러스 오염을 효과적으로 제거하기 위하여 자외선 및 감마선 조사를 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법에서 상기 세포 배양액의 세포 배양 적합성을 검증하기 위해, 세포 배양액의 색, 향(이취), pH 및 조성성분(예컨대, 염분도)의 확인 및 박테리아, 곰팡이 및/또는 마이크로플라스마의 오염도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서,
상기 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)이 적정한 부피비율(%v/v)로 포함되는, 세포 배양용 배지의 제조방법에 관한 것이다.
상기 '%w/w'는 'volume/volume'을 의미하며, 바람직하게는 'mL/mL'를 단위로 한다.
본 발명에 있어서,
상기 세포 배양용 배지에서 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액은 0.1~20%의 부피비율(%v/v)로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%이다.
본 발명에 있어서,
상기 세포 배양용 배지에 추가로 포함되는 혈청(serum)은 0.1~19.9%일 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%의 부피비율(%v/v)로 포함하되 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액과의 총 부피비율(%v/v)이 세포 배양용 배지에 대해 0.1~20%일 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%이다.
상기 혈청은 동물 혈액일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 포유동물(예: 돼지, 말, 소, 염소, 양 및 개) 혈액으로부터 유래된 혈청이며, 더욱 바람직하게는 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이다.
여기서, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액 및/또는 소태아혈청이 포함되는 합성배지(synthetic media)는 세포배양용 기본 배지(basal medium)로 MEM(Minimum Essential Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12, RPMI(Roswell Park Memorial Institute), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), M199, Ham's F12, Ham's 10, NCTC 109, NCTC 135, NeuroCult Basal Medium 등이 있으며, 이 외에 당해 업계에서 이용되는 배지이면 충분하며, 각종 영양성분, 미네랄, 무기질, 비타민, 아미노산, 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질, 부착인자, 성장인자 및 호르몬으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
상기 방법으로 제조되고, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)이 적정한 부피비율(%v/v)로 포함된 세포 배양용 배지를 이용하는, 세포의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서,
상기 세포 배양용 배지에서 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액은 0.1~20%의 부피비율(%v/v)로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%이다.
본 발명에 있어서,
상기 세포 배양용 배지에 추가로 포함되는 혈청(serum)은 0.1~19.9%의 부피비율(%v/v)로 포함하되 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액과의 총 부피비율(%v/v)이 세포 배양용 배지에 대해 0.1~20%일 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%이다.
상기 혈청은 동물 혈액일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 포유동물(예: 돼지, 말, 소, 염소, 양 및 개) 혈액으로부터 유래된 혈청이며, 더욱 바람직하게는 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이다.
본 발명에 있어서,
상기 세포 배양용 배지에서 배양되는 세포는 세포 배양용 배지 중 혈청의 부피비율(%v/v)은 0.1~20%, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%로 초기 배양한 다음, 상기 세포 배양용 배지 중 혈청의 부피비율(%v/v)을 순차적으로 감소시키고 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 부피비율(%v/v)을 순차적으로 증가시키는 세포 배양용 배지에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서,
상기 세포 배양용 배지에서 순차적으로 감소시킨 혈청의 부피비율(%v/v)은 0.09~19.99%일 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%일 수 있고, 순차적으로 증가시킨 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 부피비율(%v/v)은 0.01~19.91%일 수 있으며, 바람직하게는 1~15%, 더욱 바람직하게는 5~10%이다.
본 발명에 있어서,
상기 세포는 동물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 곤충세포 또는 식물세포일 수 있으며, 예컨대, HeLa(Human adenocarcinoma), HCT116(Human colorectal carcinoma), HEK293(Human embryonic Kidney 293), HEK293F(Human embryonic Kidney 293F), COS(African green monkey kidney fibroblast-like), BHK(Baby hamster kidney), CHO(Chinese hamster ovary), 골수종 세포, Sf9(Spodoptera frugiperda) 및 주목(Taxus species)일 수 있고, 바람직하게는 HeLa, HCT116 및 HEK293이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액의 제조
남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 세포의 배양
본 발명에서 사용되는 미세조류인 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.)의 배양용 배지는 NaCl 29.23g; KCl 1.105g; MgSO4·7H2O 11.09g; 트리스 베이스((HOCH2)3CNH2) 1.21g; CaCl2·2H2O 1.83g; 및 NaHCO3 0.25g을 포함하고, 3.0mL의 미량 영양용액(trace metal solution)을 추가로 포함할 수 있다. 미량 영양용액은 NaNO3 281.3mg; NaH2PO4·H2O 21.2mg; Na2·EDTA 16.35mg; FeCl3·6H2O 11.8mg; MnCl2·4H2O 675㎍; CoCl2·6H2O 37.5㎍; ZnSO4·7H2O 37.5㎍; Na2MoO4 22.5㎍; 비타민 B1 0.375㎍ 및 바이오틴(biotin) 0.188㎍을 포함한다. 배지 및 미량 영양용액을 해수에 용해시켜 사용할 수 있고, 제조된 배지는 고압멸균기를 이용하여 가압 멸균하고 여과지를 통해 여과하여 배양액으로 사용할 수 있다.
상기 배양액에는 질소원으로 NaNO3을 공급하여 질소 함유 배양액으로 제조될 수 있고, 이때, 질소원은 상기 배지내에 37.0~38.0mg/L의 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 질소원의 농도가 37.0mg/L 미만인 경우에는 세포 분열을 위한 영양원인 질소원의 결핍으로 인해 미세조류의 생육이 저하되어 균체량이 저하되는 문제가 있고, 38.0mg/L를 초과하는 경우에는 미세조류의 광합성을 통해 축적된 유기물은 많으나 지질 함량이 적은 문제가 있다.
필요에 따라, 상기 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 미세조류인 헤마토코커스 속(Haematococcus sp.) 또는 클로렐라 속(Chlorella sp.)으로 대체하여 사용할 수 있다.
남조류 스피룰리나 속 유래 세포 배양액의 제조방법
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)의 제조를 위해 남조류 스피룰리나 속 건조분말을 효소, 초음파 처리한 후 고온고압 처리하여 스피룰리나 속 세포를 파쇄하였다. 10,000rpm 30분간 원심분리를 통해 세포 찌꺼기를 제외한 상층액을 남조류 스피룰리나 추출액으로 회수하였으며, 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마의 제거를 위하여 0.45μm, 0.2μm 및 0.1μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과하였다. 구체적인 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조과정은 도 1에 나타내었다.
이렇게 스피룰리나 속 세포를 초음파 및 고온고압의 복합 처리를 하는 것은, 초음파 처리를 통하여 스피룰리나의 세포벽을 물리적으로 약하게 만들고, 고온고압 처리를 통하여 세포 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있기 때문이다. 이러한 초음파 및 고온고압의 복합 처리를 통하여 배양 환경 및 수확 시기가 다른 스피룰리나 원료로부터 상당히 유사한 수준의 추출액을 수득할 수 있게 되는바, 균일한 SACCS를 얻는 것이 가능하게 된다. 즉, 배치별(Lot.)로 유의한 차이가 없는 결과물을 얻을 수 있어, 서로 다른 배치들을 이용하더라도 세포배양능은 거의 유사한 것을 확인하였다. 또한 음파/고온고압 복합 추출법을 사용함으로써 세포 순수배양에 중요한 오염원을 최소화하는 것이 가능해진다. 본 발명자들이 확인한 결과, 초음파 및 고온고압의 복합 처리를 통하여 제조한 배양액에서 내독소, 마이크로플라스마, 곰팡이 및 박테리아 오염이 검출되지 않았다.
반면, 스피룰리나 속 세포를 용매 추출(예컨대, 열수 추출)하는 경우 용매 속 스피룰리나에 열전달 효율이 일정하지 않아 추출 효율이 낮고, 추출물에 함유된 유효 성분의 회수율이 낮아 결과적으로 배치 별 variation 편차가 클 가능성이 매우 높다. 그러므로 본 발명의 SACCS는 스피룰리나 속 세포를 초음파 및 고온고압의 복합 처리를 통하여 추출하여 제조하는 것이 바람직하며, 용매 추출은 이용하지 않는 것이 좋다.
필요에 따라, 상기 SACCS는 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 유래 추출물 대신 미세조류인 헤마토코커스 속(Haematococcus sp.) 유래 추출물 을 이용하여 세포 배양액으로 제조될 수 있다.
실시예 2: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액과 소태아혈청의 비교
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS) 또는 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 원액을 최종 농도가 10%가 되도록 합성배지에 첨가한 다음, 색, 질감, 향, pH 및 염분도를 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, SACCS 또는 FBS가 함유된 합성배지의 색, 질감, 향, pH 및 염분도가 매우 유사한 것으로 나타났다.
실시예 3: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액의 오염도 측정
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS) 제조과정에서 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마로 인한 SACCS의 오염 여부를 확인하고자, 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마에 대한 특이적인 프라이머를 포함하는 DiaPlexC™ Bacteria Detection Kit(Solgent, Korea), DiaPlexC™ Fungi Detection Kit(Solgent, Korea), DiaPlexC™ Mycoplasma Detection Kit(Solgent, Korea)을 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였다. 필터링 이전의 SACCS(unfiltered), 0.2μm 필터로 여과된 SACCS(0.2μm filtered) 및 0.1μm 필터로 여과한 SACCS (0.1 μm filtered)을 진단 kit에 제공된 양성대조군(positive control) 및 음성대조군(negative control)과 함께 PCR를 수행한 후 1% agarose gel을 사용하여 전기영동하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0.45μm, 0.2μm 및 0.1μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과된 각각의 SACCS의 샘플에서 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라스마가 검출되지 않은 것으로 확인되었다.
실시예 4: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액의 영양성분 분석
남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 원말, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS) 및 FBS의 성분분석은 식약처 인증기관인 제주대학교 생명과학 혁신센터에서 수행하였다. 유리당 분석은 시료 1g에 50% ACN 50mL를 가하여 10분간 초음파 추출(3회) 하였다. 추출된 시료액은 분석조건에 맞도록 희석한 다음 Sep-Pak C18 cartridges(Waters, MA, μSA)를 통과시킨 후, 0.45μm membrane filter(Woongki science co. Ltd., Seoul, Korea)로 여과한 다음, HPLC(Waters 2695, MA, USA)로 분석하였다. 여기서, 유리당 분석 column은 PrevalTM Carbohydrate ES(4.6ㅧ250 mm, 5μm, Grace, Japan)을 사용하였고 이동상으로는 acetonitrile과 증류수를 7:3으로 혼합하여 사용하였고, 유속은 분당 0.8mL였고, 검출기로는 ELSD를 사용하였다. 유리당 함량은 농도별로 제조한 표준물질(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 HPLC로 분석하여 얻은 표준곡선으로부터 정량하였다. 일반성분, 포화지방, 콜레스테롤, 비타민 A는 식품공전(2015) 및 AOAC법에 의해 수행하였으며, 조지방은 에테르 추출법, 조단백질은 Kjeldahl법, 포화지방 및 콜레스테롤은 GC(GC-2010, Shimadzu)로 분석하였다. 비타민 A는 식품공전에 준하여 전처리한 다음, HPLC(Waters 2690)로 분석하였다. 납, 카드뮴 분석은 검체를 도가니에 취해 건조하여 탄화시킨 다음 450~550℃에서 회화한 후, 회분을 물로 적시고 염산 2~4mL를 가하여 수용액상에서 건조한 다음 4% 질산을 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 유리여과기로 여과한 후 20mL로 정용하여 시험용액으로 사용하였다. 납, 카드뮴 표준용액과 시험용액, 블랭크를 ICP-OES(Varian, MPX, AUS)에 주입하여 분석하였다. 표준용액은 표준품 1000mg/L 표준물질을 4% 질산으로 희석하여 혼합된 100mg/L 농도의 Stock 용매를 제조한 후, 시험에 사용된 표준물질은 4% 질산으로 재차 희석하여 표준물질로 하였다. 무기질 분석은 시료 1g을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색 또는 회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화하였다. 상기 회분을 염산으로 순차적으로 이용하여 분해한 후 일정량으로 희석하고 여과한 다음, ICP analyzer(Optima8300, Perkin Elmer)를 사용하여 정량하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 남조류 스피룰리나 원말은 FBS에 비하여 일반성분 및 무기질 함량이 높은 것으로 나타났으나 SACCS는 영양성분이 다소 소실된 것으로 확인되었다. 상기 영양성분의 소실은 SACCS 제조과정에서 발생한 것으로 추정된다.
실시예 5: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액으로 처리된 HeLa 세포의 생존도
세포의 세포독성 및 생존율을 확인하고자 인간 유래 세포인 HeLa 세포주를 사용하였다. HeLa 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)과 항생제(100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린)을 포함하는 MEM(Minimum Essential Medium)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 유지되었다.
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)에 대한 세포의 세포독성 및 생존율을 확인하고자, 상기와 같이 배양 유지된 HeLa 세포를 96웰 프레이트(well-plate)에 2x103/ml로 시딩(seeding)한 후 다음날 1% 농도로 SACCS 또는 증류수(control)를 24시간 동안 처리하고 MTT assay kit을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 세포생존율은 EZ-CyTox kit(Daelillab service CO, Korea)를 이용하였고, EZ-CyTox reagent를 웰(well) 당 10μl 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 미처리된 세포(non-treated)는 SACCS 또는 증류수(control)로 처리되지 않은 샘플을 의미한다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, SACCS로 처리된 HeLa 세포의 세포 독성은 없었으며 SACCS가 처리되지 않은 HeLa 세포(non-treated)에 비해 약 15% 증가된 세포 생존율을 나타내었고, 증류수로 처리된 HeLa 세포(control)에 비해 약 10% 증가된 세포 생존율을 나타내었다.
실시예 6: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 HeLa의 배양
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)를 포함하는 배지가 세포 배양에 적합한지 확인하고자, 다양한 혼합비율로 FBS 및 SACCS가 첨가된 배지를 제조하였다. 더욱 상세하게는, FBS 만을 함유하는 배지[FBS 100%](%v/v) 배지를 컨트롤로 사용하고, FBS 및 SACCS를 다양한 혼합 부피비율(%v/v)로 합성배지에 첨가하여 [FBS 70% : SACCS 30%](%v/v) 배지, [FBS 50% : SACCS 50%](%v/v) 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%](%v/v) 배지를 제조한되 상기 혼합물이 배지에 최종 10% 부피비율(%v/v)이 되도록 제조하였다. 그다음, FBS 및 SACCS를 함유하는 각각의 배지에 실시예 5와 동일한 조건으로 배양 유지된 HeLa 세포를 배양하였다.
여기서, 상기 SACCS는 스피룰리나 속(Spirulina sp.) 유래 추출물 대신 미세조류인 헤마토코커스 속(Haematococcus sp.) 유래 추출물 또는 클로렐라 속(Chlorella sp.) 유래 추출물을 함유하는 세포 배양액으로 대체하여 사용할 수 있다.
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배지에서의 HeLa 세포의 계대 배양 기간에 따른 세포 성장의 효과를 비교하고자, 1세대, 3세대 또는 10세대 계대 배양된 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 2x103/ml로 시딩(seeding) 한 후 MTT assay kit을 사용하여 3일간의 생존율을 확인하였고, SACCS이 함유된 배지에서의 초기 1세대, 중기 3세대 및 후기 10세대의 세포 성장률을 함께 비교·분석하여 SACCS를 함유하는 배지의 세포 배양능을 평가하였다.
그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, SACCS를 함유하는 배지를 이용할 경우 HeLa 세포는 배양 초기인 1세대부터 중기 3세대 및 후기 10세대에 이르기까지 HeLa 세포의 성장률이 안정하게 나타나는 것으로 확인되었다. 특히, FBS의 사용을 50% 절감하고 SACCS로 50% 대체한 [FBS 50% : SACCS 50%](%v/v) 배지는 [FBS 100%](%v/v) 컨트롤 배지에 비해 40% 이상 높은 세포 생존율을 나타내었고, SACCS로 70% 대체한 [FBS 30% : SACCS 70%](%v/v) 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지와 유사한 세포 생존율을 나타내었다.
실시예 7: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 HCT116의 배양
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배양 배지에서 인간 유래 HCT116 세포주를 10세대 장기 계대 배양하고, 96-웰 플레이트에 2x103/ml로 시딩(seeding) 한 후 MTT assay kit을 사용하여 3일간 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, FBS 및 SACCS를 함유하는 혼합배지인 [FBS 70% : SACCS 30%] 배지 및 [FBS 50% : SACCS 50%] 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지에 비해 약 10% 증가된 생존율을 나타내었다.
실시예 8: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 HEK293의 배양
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배양 배지에서 인간 유래 HEK293 세포주를 10세대 장기 계대 배양하고, 96-웰 플레이트에 2x103/ml로 시딩(seeding) 한 후 MTT assay kit을 사용하여 3일간 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 6C에 나타난 바와 같이, FBS를 SACCS로 50% 대체한 [FBS 50% : SACCS 50%] 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지에 비하여 45% 이상 높은 세포 생존율을 나타내었고, SACCS로 70% 대체한 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지는 [FBS 100%] 컨트롤 배지 대비 30% 높은 세포 생존율을 나타내었다.
결국, 실시예 6~실시예 8의 결과에 따르면 SACCS의 세포주 배양능과 함께 50~70%의 혼합비율로 FBS를 SACCS로 대체할 가능성이 있음을 시사한다.
실시예 9: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액를 포함하는 배지에서의 동결 전후의 세포 배양
실시예 6에서 얻은 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS) 적응 세포의 분자생물학적 평가를 위하여 10세대 계대 배양으로 장기 배양된 HeLa 세포([FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 또는 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지)를 동결보존하였다. 세포 동결보존은 배양된 세포를 인산완충용액으로 세척 후 트립신을 처리하고 원심분리를 수행한 다음, 상등액을 제거하고 세포를 50%(%v/v) MEM, 10%(%v/v) DMSO 및 40%(%v/v) FBS로 구성된 동결 배지에 넣고 -196℃의 액체 질소에 보관하였다. 약 3개월간 동결보존 후 [FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 각각 배양되고 동결된 세포를 해동한 다음, 동일한 조건인 [FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 배양하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 현미경 관찰시 동결 전후에 따른 SACCS에 적응 배양된 세포는 세 그룹([FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 또는 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지) 모두에서 형태학적으로 유사하게 나타난 것으로 확인되었다.
실시예 10: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 포함하는 배양 배지에서 적응 배양된 세포의 HKP 및 HSP 발현 양상
남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)을 포함하는 배양 배지에서 배양된 세포의 하우스 키핑 프로테인(House keeping protein, HKP)과 열충격단백질(Heat Shock Protein, HSP)의 발현 양상을 분석하였다.
(1) HKP: 세포의 종류, 분화 및 성숙도에 관계없이 항상 일정하게 발현되고, 세포 생존에 필수적인 단백질인 하우스 키핑 프로테인(House keeping protein, HKP)의 발현 및 활성을 비교·분석하고자 다양한 분자생물학 실험에 컨트롤로 사용되는 대표적인 하우스 키핑 프로테인인 α-Tubulin, β-Actin 및 GAPDH를 지표 마커로 이용하였다.
(2) HSP: FBS 및 SACCS 배지에서 장기간 계대 배양된 적응 세포의 스트레스 정도를 확인하고자 세포의 분화, 성숙, 분열 및 사멸에 관여하고, 스트레스 인자로 확인된 열충격단백질(Heat Shock Protein, HSP)인 pHSP27 단백질을 지표 마커로 이용하였다.
먼저, FBS 및 SACCS가 함유된 배지에서 적응된 HeLa 세포의 α-Tubulin, β-Actin, GAPDH 및 pHSP27 단백질의 발현량을 확인하기 위해 Western Blot으로 확인하였다. 더욱 상세하게는 실시예 6에서 얻은 SACCS 적응 세포에 RIPA buffer를 처리하여 용해시킨 다음, 15,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리된 상등액은 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 상등액에 포함된 단백질의 농도를 측정하였다. 그다음, 상등액에 포함된 30μg의 단백질을 12% SDS-PAGE 상에서 분리한 후 PVDF(Polyvinylidene Difluoride, Millipore) 멤브레인으로 전이(transfer)하였다. PVDF 멤브레인은 5% BSA를 함유하는 PBST(PBS + 0.1% Tween 20) 완충용액에서 실온 1시간 동안 블로킹한 다음, 1차 항체로 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 PVDF 멤브레인은 PBST 완충용액으로 세척 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)로 1시간 동안 실온 반응한 다음, PBST 완충용액으로 세척하고 ECL(Enhanced Chemilunimoecence) kit를 이용하여 암실에서 X-ray film에 감광시켜 α-Tubulin, β-Actin, GAPDH 및 pHSP27의 양을 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, [FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 배양된 세포 모두에서 동일한 수준의 α-Tubulin, β-Actin, GAPDH 및 pHSP27 단백질이 발현되는 것을 확인함으로써 SACCS에서 적응 배양된 세포의 HSP 단백질 발현 양상 및 스트레스 정도가 FBS 적응 세포와 유사함을 확인하였다.
실시예 11: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 포함하는 배양 배지에서 적응 배양된 세포의 세포주기
정상적인 세포는 일정한 패턴을 가지고 성장과 세포분열을 하는데 이것을 세포 주기라 한다. 세포 주기는 G1, S, G2, M으로 구분되며 G1 주기는 일반적인 세포 성장, S 주기는 DNA 복제, G2 주기는 세포분열을 위한 성장 및 준비 단계가 이루어지고, M 주기에서 세포분열이 일어난다.
따라서, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)에서 적응 배양된 세포가 정상적인 세포주기를 가지는지 확인하고자 하였다. 실시예 6에서 얻은 SACCS 적응 HeLa 세포의 세포주기와 FBS에서 배양된 HeLa 세포의 세포주기를 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit(Becton Dickinson, CA, USA)를 이용하여 비교·분석하였다. 서로 다른 FBS/ SACCS 부피비율(%v/v)로 혼합 제조된 세포 배양액에서 10세대 이상 장기 배양된 각각의 세포를 2x105/ml 개수로 플레이트에 시딩(seeding)하고 다음날 인산완충식염수(PBS, Gibco invitrogen corporation, USA)로 세척 후 1X Typsin-EDTA(Gibco-invitrogen corporation, USA) 처리하여 세포를 떼어낸 다음 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 회수된 세포는 RNase A를 첨가하여 실온에서 빛을 차단한 상태로 10분 처리 후 세포핵 내부의 DNA를 선택적으로 염색하는 PI(propidium iodide) 용액으로 4℃에서 10분간 염색하고 유세포 분석기를 이용하여 10,000개의 세포를 동일하게 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, [FBS 100%] 배지, [FBS 50% : SACCS 50%] 배지 및 [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 장기간 적응 배양된 HeLa 세포의 세포주기는 매우 유사한 것으로 나타났다.
실시예 12: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 포함하는 배양 배지에서 적응 배양된 세포의 세포자멸사
도 7의 현미경 관찰, 도 8의 하우스 키핑 프로테인과 스트레스 단백질 및 도 9의 세포 주기를 분석한 결과, 도 6의 실험결과로 얻은 FBS 및 SACCS 적응 HeLa 세포주의 세포 특성이 매우 유사함을 확인하였다.
대부분의 암세포는 세포자멸 시스템을 회피하여 불멸화되어 있는데 암의 발생을 이해하고 정복하기 위해 전 세계 많은 연구자들이 세포자멸 실험을 실시하고 있다. 자외선 조사는 세포를 자외선이라는 강한 에너지에 노출시키므로 세포 내부의 DNA를 파괴하거나 변형시켜 세포자멸사를 유도한다.
세포자멸사는 세포가 외부 혹은 내부의 특정 자극을 받고 스스로 자멸하는 면역학적 메커니즘으로 생물이 삶을 유지하는데 매우 중요한 시스템이다. 자외선 조사에 의해 세포자멸사가 유도되면 세포막 성분인 인지질(phosphatidyl serine, PS)이 세포 내부를 향하고 있다가 외부로 뒤집히게 되는데 이러한 원리를 이용하여 뒤집혀서 세포 외부로 노출된 인지질 표면에만 결합하는 Annexin V 단백질을 처리함으로 세포자멸 과정을 겪고 있는 세포만 특이적으로 선별하게 된다. 인지질에 결합된 Annexin V 단백질은 FITC 형광물질이 부착되어 있기 때문에 유세포 분석기를 이용하여 형광의 강도를 측정하므로 세포자멸 정도를 확인할 수 있는 것이다.
따라서, 자외선 조사에 의해 SACCS에서 적응 배양된 세포의 세포자멸사의 정도를 확인하고자, 서로 다른 부피비율로 FBS 및 SACCS가 혼합되어 제조된 세포배양액으로 10세대 이상 장기 배양된 각각의 HeLa 세포를 2x105cells/ml 개수로 시딩(seeding)하고 365nm 파장의 자외선을 1시간 조사한 후 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척하고 원심분리한 다음, binding buffer를 이용하여 1 x 106cells/ml의 세포밀도를 가지도록 조절하였다. 100μl 용액에 Annexin V-FITC 와 PI를 각각 5μl 첨가하여 실온에서 15분간 염색한 후 binding buffer 400μl 첨가 후 세포자멸 정도를 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 자외선 조사에 의해 [FBS 100%] 컨트롤 배지에서 약 45.6%의 세포자멸이 유도되었고 [FBS 50% : SACCS 50%] 배지에서 약 36.3%, [FBS 30% : SACCS 70%] 배지에서 약 36.6%의 세포자멸이 확인되었다. SACCS가 함유된 배지에서 배양된 HeLa 세포의 경우 [FBS 100%] 컨트롤 배지와 비교하여 약 10% 이내의 범위에서 자외선 의한 세포자멸사 유도에 조금 더 강한 내성을 나타내었다.
실시예 13: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 H460 세포주 의 배양
SACCS의 FBS 대체 가능성 및 세포주 배양능 평가를 위해 인간 유래 폐암 H460 세포주를 10세대 계대 배양하면서 각각의 세대 마다 세포수를 측정하여 세포 증식을 관찰하였다.
그 결과, H460 세포주의 경우 [FBS 100%] 컨트롤 대비 FBS 대체비율 50%에서 112%의 세포증식율, FBS 대체비율 70%에서 101%의 세포증식율을 나타내었고 FBS 대체비율 90% 조건에서 86%의 세포증식율이 각각 확인되었다(도 11). 또한 배양된 세포의 형태는 변화가 없는 것으로 관찰되었다(도 12).
실시예 14: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 T24 세포주의 배양
인간 방광암 유래 T24 세포주를 9세대 계대 배양하면서 각각의 세대 마다 세포수를 측정하여 세포 증식을 관찰하였다.
그 결과, [FBS 100%] 컨트롤 대비 FBS 대체비율 50%에서 101%의 세포증식율, FBS 대체비율 70%에서 89%의 세포증식율을 나타내었고 FBS 대체비율 90% 조건에서 61%의 세포증식율을 각각 확인하였다(도 13). 또한 배양된 세포의 형태는 변화가 없는 것으로 관찰되었다(도 14).
실시예 15: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 A549 세포주의 배양
SACCS를 활용하여 인간 폐암 유래 A549 세포주 배양에 적용한 결과, [FBS 100%] 컨트롤 대비 SACCS 적용 모든 실험군에서 세포증식율이 증가된 것을 확인하였다(도 15).
실시예 16: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 IMR90 정상 세포의 배양능 평가
SACCS를 활용하여 인간 유래 정상 세포주 IMR90에 적용한 결과, FBS 컨트롤 대비 FBS 대체비율 50%에서 109%의 세포증식율, FBS 대체비율 70%에서 107%의 세포증식율을 나타내었다(도 16). 배양된 세포의 형태 또한 유사한 것으로 관찰되었다(도 17).
실시예 17: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 CHO -K1 숙주 세포주의 배양능 평가
항체 의약품 생산 세포주인 CHO-K1 숙주 세포주에 SACCS를 적용하여 세포 배양을 수행하였다.
5 세대 계대 배양 세포와 10세대 계대 배양 세포의 부착 모습을 현미경으로 관찰한 결과, SACCS로 FBS를 70%까지 대체한 세포에서도 정상적인 세포의 모습이 확인되었다(도 18).
10세대 계대 배양을 완료하고, 적응 배양 (T25 flask)한 결과, FBS 대비 SACCS로 FBS를 70%까지 대체하여도 세포 성장에 문제가 없는 것이 확인되었다(도 19).
한편, 12-well 플레이트에서 회분식 배양 후(day 2-4-6) 세포 수를 관찰한 결과, 회분식 배양이 진행될수록 SACCS로 FBS를 대체한 세포주에서 오히려 향상된 세포생존율이 나타났다(도 20, #1: FBS 100%, #2: FBS 50%: SACCS 50%, #3: FBS 30% : SACCS 70%).
실시예 18: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 CHO - GSR 세포주의 배양능 평가
CHO-GSR 세포주는 CHO-K1 숙주세포에 유전자를 도입하여 치료용 항체 (Rituxan)를 생산하는 세포주이다. 상기 CHO-GSR 세포주에 SACCS를 적용하여 세포 배양을 실시하였다.
그 결과, CHO-K1 숙주 세포주의 결과와 마찬가지로 대조군과 유사한 세포 모양이 확인되었다(도 21).
또한 10세대 계대 배양을 수행한 결과, FBS 대조군 대비 50% 대체 비율 군에서 85%의 세포 증식율을 확인하였고, 70% 대체 비율군에서 50% 감소된 세포 증식율을 확인하였다(도 21).
한편, 12-well 플레이트에서 10세대 계대 배양된 CHO-GSR 세포주의 회분식 배양을 수행한 후(day 2-4-6) 세포 수를 관찰한 결과, FBS 대비 약 80% 세포 수가 확인되었다(도 22).
실시예 19: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액을 이용한 CHO - GSR 세포주의 단위 세포당 치료용 항체 (Rituxan) 생산성 평가
CHO-GSR 세포주를 T25 flask 내 SACCS에서 배양하면서, 배양 중인 세포의 배양액을 채취하였다. 그리고 채취된 배양액 내 치료용 항체 단백질인 Rituxan의 농도를 측정하였다. 또한 단위 세포당 생산성으로부터 비생산속도를 측정하였다.
치료용 항체 단백질의 단위 세포당 생산성을 측정한 결과, SACCS로 FBS를 대체하였을 때 단위 세포당 생산성이 증가하는 경향을 보였으며, 결과적으로 FBS 컨트롤과 유사한 단위 세포당 항체 생산성이 확인되었다(도 23).
실시예 20: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액에서 배양된 CHO - GSR 세포주 유래 치료용 항체 (Rituxan)의 N-glycosylation profile 분석
CHO-GSR 세포주를 T-75 플라스크 내 SACCS에서 (15mL volume) 회분식 배양을 수행하였다. 회분식 배양 6일 후 배양액을 회수하고 항체를 정제하여 Fc fragment CH2 domain의 N-glycosylation profile을 HPLC [Fluorescence detector (360 nm → 425 nm)]를 사용하여 분석하였다.
10세대 계대 배양한 CHO-GSR 세포주의 회분식 배양 (6일) 결과 항체의 당쇄화 품질에 큰 차이가 나지 않는 것이 확인되었다(도 24).
실시예 21: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액의 내독성 평가
SACCS의 내독소 오염 정도를 LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation kit를 사용하여 확인하였다. SACCS 샘플 50ul에 Limulus amenocyte lysate(LAL)을 50μl 씩 첨가한 후 10초간 천천히 섞었다. 그리고 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후 Chromogenic substrate를 100μl 씩 첨가하고, 그 후 37℃에서 6분 동안 반응시켰다. 그 후 25% Acetic acid(stop solution)를 50μl 씩 첨가하고 흡광도 405nm에서 측정하였다.
그 결과, 광생물배양기 원료 유래 SACCS 샘플의 내독소는 약 5EU/mL 이며, 수로형배양기 원료 유래 SACCS 샘플의 내독소는 약 1EU/mL 로 확인되었다(도 25).
또한 수로형배양기(ORP, Open Raceway Pond)에 비하여 광생물배양기(PBR, Photobioreactor) 원료의 내독소가 다소 높게 나타났지만, 국제혈청산업협회(ISIA, International Serum Industrial Association)에서 인증하여 현재 전 세계에서 시판되고 있는 소태아 혈청(FBS)의 내독소가 10EU/mL 이하인 것을 감안한다면 SACCS 의 내독소 수치는 적합한 것으로 판단되었다.
실시예 22: 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액의 삼투압 평가
배지 내 삼투압은 동물 세포 배양 시 반드시 고려해야 할 중요한 물리-화학적 요소이다. 삼투압의 증가는 치료용 항체 의약품 품질에 영향을 끼친다.
그러므로 어느점 내림법의 원리(osmometer)를 이용하여 FBS 및 SACCS의 삼투압을 측정하였다.
그 결과, FBS : SACCS의 비율에 상관없이 유사한 수준의 삼투압을 갖는 것이 확인되었다(도 26).
실시예 23: 인간 유래 정상세포 대상 남조류 스피룰리나 유래 세포 배양액의 세포 독성 평가
수로형배양기(ORP-SACCS) 및 광생물배양기(PBR-SACCS) 원료 유래 SACCS의 세포 독성 평가를 수행하였다. 이 때 증류수(D.W, Distilled Water) 및 FBS를 대조군으로 사용하였다. 인간 유래 정상 세포주 IMR90 세포를 96well plate 내 DMEM 배지 200ul에 2x103으로 seeding 한 후 다음날 증류수, FBS 및 SACCS를 각각 여러 가지 농도로 24시간 또는 48시간 처리하고(각 처리 농도는 부피 %로 표시함), 그 후 MTT assay kit을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 수로형 배양기 및 광생물 배양기 원료 유래 SACCS에는 세포 독성이 없는 것이 확인되었다(도 27).
결국, 도 7~도 24에 나타난 바와 같이, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(SACCS)이 포함된 배양 배지에서 장기간 적응 배양된 세포가 FBS가 포함된 배지에서 적응된 세포와 비슷한 세포학적 특성을 가지고 있기 때문에 SACCS는 일반적인 분자세포생물학 실험 적용이 가능하며 더 나아가 SACCS의 FBS 대체 가능성을 시사한다.
결론적으로, 세포배양에 필수적인 소태아혈청이 가지는 비윤리적, 비환경적 및 고비용 문제점과 무혈청 배지의 문제점인 적용 가능한 세포주의 제한에 따른 연구 분야의 한계성을 극복하고 영양학적인 우수성과 안전성이 국제사회에서 입증된 소태아혈청 대체 소재 개발을 위하여 원료 소재의 원활한 공급이 가능하고 FDA 및 식약처에 고시되었으며 영양학적으로 완벽한 생물 소재인 남조류 스피룰리나 속(Spirulina sp.)을 활용하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)을 최초로 개발하였고 인간 유래 3종의 세포주를 대상으로 10세대 이상 장기 계대 배양에 성공하였다.
지금까지 본 발명에 따른 남조류 스피룰리나 속으로부터 추출되어 제조된 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS), 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포의 배양방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위에는 설명된 실시예에 국한되어 전해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. (a) 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득하는 단계; 및
    (b) 수득한 남조류 스피룰리나 추출물을 여과하여 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)으로 회수하는 단계;를 포함하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 남조류 스피룰리나 속은 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulina laxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta) 및 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득하는 단계는 착즙 추출, 수증기 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 용매 추출, 효소 추출, 분쇄 추출, 고온고압 추출 및 환류냉각 추출로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 용매 추출은 에탄올, 메탄올, 아세톤, 헥산(hexane), 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 물 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 통해 추출한 것을 특징으로 하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 남조류 스피룰리나 속 시료로부터 남조류 스피룰리나 추출물을 수득한 다음, 정화(clarification)시키는 것을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 0.45μm 필터, 0.2μm 필터 및 0.1μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과하는 것을 특징으로 하는, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS).
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액(Spirulina Animal Cell Culture Solution, SACCS)이 적정한 부피비율(%v/v)로 포함된 세포 배양용 배지를 이용하는, 세포의 배양방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에서 상기 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액은 0.1~20%의 부피비율(%v/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에 추가로 포함되는 혈청(serum)은 0.1~19.9%의 부피비율(%v/v)로 포함하되 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액과의 총 부피비율(%v/v)이 세포 배양용 배지에 대해 0.1~20%인 것을 특징으로 하는, 세포의 배양방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에서 배양되는 세포는 혈청 0.1~20%의 부피비율(%v/v)로 초기 배양한 다음, 상기 세포 배양용 배지 중 혈청의 부피비율(%v/v)을 순차적으로 감소시키고, 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 부피비율(%v/v)을 순차적으로 증가시키는 세포 배양용 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에서 순차적으로 감소시킨 혈청의 부피비율(%v/v)은 0.09~19.99%이고, 순차적으로 증가시킨 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액의 부피비율(%v/v)은 0.01~19.91%인 것을 특징으로 하는, 세포의 배양방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 세포는 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는, 세포의 배양방법.
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