WO2023249363A1 - 소태아 혈청(fbs) 대체 조성물 - Google Patents

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WO2023249363A1
WO2023249363A1 PCT/KR2023/008497 KR2023008497W WO2023249363A1 WO 2023249363 A1 WO2023249363 A1 WO 2023249363A1 KR 2023008497 W KR2023008497 W KR 2023008497W WO 2023249363 A1 WO2023249363 A1 WO 2023249363A1
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bovine serum
fetal bovine
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fbs
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PCT/KR2023/008497
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이승욱
이효선
윤현지
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계명대학교 산학협력단
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/82—Undefined extracts from animals from invertebrates

Definitions

  • the present invention relates to a composition replacing fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • Serum is a complex product of various substances and is used as an additive to the basic culture medium in cell culture rooms. It contains growth factors, hormones, and components that stimulate cells in cell culture, and is used in various ways depending on the type of cell. However, fetal bovine serum is generally used the most. Fetal bovine serum is a serum isolated from bovine blood during pregnancy, especially in animal cell culture, which is the basic stage of biotechnology-related experiments, as well as vaccines, protein drugs, and It is a raw material used in the development of therapeutic antibodies, etc.
  • the present invention seeks to provide an economical and safe fetal bovine serum replacement composition containing insect protein hydrolyzate and a cell culture method using the same in order to reduce the use of fetal bovine serum.
  • the present invention can provide a fetal bovine serum replacement composition for cell culture containing insect protein hydrolyzate.
  • the present invention provides a medium composition for cell culture containing a fetal bovine serum replacement composition.
  • the present invention can provide a cell culture method including the step of adding a fetal bovine serum replacement composition to cells and culturing them.
  • the present invention includes a first step of grinding insects and preparing a substrate solution in distilled water; A second step of inactivating the autologous enzyme by boiling the substrate solution in a bath; A third step of hydrolyzing the substrate solution by adding a proteolytic enzyme and then heating to inactivate the enzyme; A fourth step of obtaining a filtrate or supernatant by allowing the hydrolyzed hydrolyzate to cool and then filtering or centrifuging it; and a fifth step of drying the filtrate or supernatant to obtain an insect protein hydrolyzate.
  • the amount of fetal bovine serum used is reduced, while exhibiting a cell growth promoting effect equal to or greater than that of including only fetal bovine serum, during cell culture. Not only can it be used as a replacement for essential fetal bovine serum, but it also has the advantage of being useful in various food industries that use cultured meat as a material.
  • Figure 1 is a graph comparing the cell viability of HaCaT cells, which are human skin keratinocytes, by medium.
  • Figure 2 is a graph showing cell viability for each medium for HaCaT cells using a medium containing protein hydrolyzate of insects and defatted soybeans.
  • Figure 3 is a graph showing the cell number according to the number of subcultures while subculturing HaCaT cells using a medium containing a mixture of FBS/brown beetle larval alcalase protein hydrolyzate (TMA) (Fig. 3A) and a reverse phase contrast graph showing the cell shape.
  • TMA FBS/brown beetle larval alcalase protein hydrolyzate
  • Figure 4 is a graph showing cell viability for each medium for various cells of human and rodent origin using a medium containing protein hydrolyzate of brown mealworm larvae (TMA) or silkworm pupa (BMA). am.
  • TMA brown mealworm larvae
  • BMA silkworm pupa
  • Figure 5 is a graph showing cell viability for each medium for HaCaT cells using a medium containing a fetal calf serum (FCS)/protein hydrolyzate mixture.
  • FCS fetal calf serum
  • the present inventors reduced the amount of fetal bovine serum and used human skin keratinocytes, HaCaT cells, C2C12 mouse myoblasts, human-derived solid cancer cell lines H460 and Panc-1, and human-derived blood cancer.
  • the present invention was completed by discovering that in the cell lines HL-60 and Jurkat cells, there was no or minimal effect on cell viability compared to when the cells were cultured with only fetal bovine serum.
  • the present invention provides a fetal bovine serum replacement composition for cell culture containing insect protein hydrolyzate.
  • the insect protein hydrolyzate is prepared and used in the form of one or more of thermal hydrolyzate, enzyme hydrolyzate, acid hydrolyzate, and alkaline hydrolyzate, and is preferably an enzyme hydrolyzate.
  • the insect protein hydrolyzate may be a hydrolysis product obtained by enzymatic hydrolysis of edible insects, defatted edible insects, or their pulverized products.
  • the edible insects refer to insects that can be used as food in whole or in part, and may include eggs, larvae, pupae, and adults.
  • the edible insects may be insects that are traditionally used as food or approved for use as food raw materials by national agencies, for example, may be insects approved for use as food raw materials by the Korea Food and Drug Safety Evaluation Institute.
  • the edible insects are edible insects consisting of brown mealworm larvae, silkworm pupae, twin-star crickets, white-spotted radish larvae, rhinoceros beetle larvae, silkworms, grasshoppers, bellworms, American king mealworm larvae, and drone pupae. It may be one or more types selected from the group, but is not limited thereto.
  • the edible insects may be dried or crushed.
  • the enzyme may be a GRAS grade hydrolase.
  • the GRAS grade hydrolases include Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Savinase, ficin, and Bromelain. ) and papain, but is not limited thereto.
  • Cells that can be applied during cell culture include cancer cells selected from the group consisting of blood cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, stomach cancer cells, breast cancer cells, pancreatic cancer cells, and colon cancer cells; osteoblast; kidney cells; fibroblast; cartilage cells; liver cells; nerve cells; It may be one or more types selected from the group consisting of muscle cells and stem cells, but may not be limited thereto.
  • the composition may be capable of subculturing cells.
  • passage refers to replacing culture vessels or dividing cell groups into a method of cultivating successive generations of cells in order to continuously cultivate cells in a healthy state for a long period of time. Replacing a culture vessel once or cultivating a group of cells by dividing them is called one passage. In the present invention, passage may be used interchangeably with generation.
  • the composition is applied to HaCaT cells, which are human skin keratinocytes, mouse myoblasts, H460 and Panc-1, which are human-derived solid tumor cell lines, and HL-60 and Jurkat cells, which are human-derived blood cancer cell lines.
  • HaCaT cells which are human skin keratinocytes, mouse myoblasts, H460 and Panc-1, which are human-derived solid tumor cell lines, and HL-60 and Jurkat cells, which are human-derived blood cancer cell lines.
  • composition may further include fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • composition may include 50 to 90% by weight of insect protein hydrolyzate and 10 to 50% by weight of fetal bovine serum or calf serum.
  • the present invention provides a medium composition for cell culture containing the fetal bovine serum replacement composition.
  • the term “medium” refers to a medium that can support the growth, survival, and differentiation of cells in vitro, and is a typical medium suitable for the culture and differentiation of stem cells used in the relevant field. Includes all. Depending on the type of cell, the type of medium and culture conditions can be selected at the technical level of the field.
  • the medium used for culture is specifically cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source, and trace element components.
  • the cell culture minimal media includes, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, etc., but are not limited thereto. Additionally, the medium may contain antibiotics such as penicillin, streptomycin, gentamicin, or a mixture of two or more thereof.
  • the present invention provides a cell culture method comprising adding the fetal bovine serum replacement composition to cells and culturing them.
  • the present invention includes a first step of grinding insects and preparing a substrate solution in distilled water; A second step of inactivating the autologous enzyme by boiling the substrate solution in a bath; A third step of hydrolyzing the substrate solution by adding a proteolytic enzyme and then heating to inactivate the enzyme; A fourth step of obtaining a filtrate or supernatant by allowing the hydrolyzed hydrolyzate to cool and then filtering or centrifuging it; and a fifth step of drying the filtrate or supernatant to obtain an insect protein hydrolyzate.
  • the hydrolytic enzymes include Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Savinase, ficin, Bromelain, and It may be one or more types selected from the group consisting of papain, but is not limited thereto.
  • the second step may be to inactivate the autologous enzyme by boiling at 80 to 100° C. for 10 to 30 minutes.
  • the third step may be to inactivate the enzyme by heating at 80 to 100 °C for 10 to 30 minutes.
  • Brown mealworm larvae were pulverized to prepare a 4% (w/w) substrate solution in distilled water, and then boiled at 90°C for 20 minutes to inactivate the autologous enzyme.
  • Protein hydrolyzing enzymes Alcalase and Flavorzyme were added to the substrate solution at 1% (w/w) each, and hydrolyzed at 55°C and 100 rpm for 8 hours. Afterwards, the enzyme was inactivated by heating at 90°C for 20 minutes. The hydrolyzed hydrolyzate was left to cool and then centrifuged at 13,000
  • TSH brown mealworm larvae protein hydrolyzate
  • freeze-dried protein hydrolyzate was dissolved in distilled water at a ratio of 0.5% (w/v) and 1% (w/v) and then heated at 9,000 rpm for 20 minutes.
  • the supernatant was recovered by centrifugation.
  • the separated supernatant was filtered using a 0.2 ⁇ m filter to remove bacteria, mold, and microplasma, and then stored in a freezer at 20°C for use in experiments.
  • the HaCaT cell line a human keratinocyte, was purchased from the Korea Cell Line Bank and used. 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotics penicillin and streptomycin were added to DMEM medium (Dulbeccos modified Eagles medium high glucose) and used as a culture medium, 5% CO 2 and 37°C. Cells were cultured in an incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM medium Dulbeccos modified Eagles medium high glucose
  • FBS or FBS/TMH mixed medium was prepared at various ratios.
  • FBS:TMH (10:0) using 10% FBS alone was used as a control, and FBS and 0.5% (0.5x) and 1% (1x) protein hydrolyzate were used in ratios of 5:5, 3:7, and 1:9.
  • the mixed mixture was prepared in DMEM medium to a final ratio (v/v) of 10%.
  • Cultured cells were treated with trypsin, collected, distributed into 48-wells at a density of 3x10 cells/well, and cultured for 24 hours. Afterwards, the culture medium was removed, replaced with medium containing FBS or each mixture, and cultured for additional 44 or 68 hours, then treated with 20 ⁇ l of WST-8 (BIOMAX, Seoul, Korea) solution and cultured for a total of 48 to 72 hours. did. Afterwards, the mixture was mixed well for 5 minutes using a microplate shaker and the absorbance was measured at 450 nm.
  • medium was prepared by mixing FBS and TMH at various ratios, and then the cell viability of each medium was compared for HaCaT cells, which are human skin keratinocytes, as shown in Figure 1.
  • the medium prepared by adding TMH (0.5x), which was diluted twice with distilled water, to a protein hydrolyzate prepared by hydrolyzing it with FBS and alkalase enzyme at a ratio of 3:7 was maintained for 48 to 72 hours. It was confirmed to be the optimal alternative medium composition with no effect on cell growth during culture.
  • Cultured cells were treated with trypsin, collected, distributed into 48-wells at a density of 3 ⁇ 10 4 cells/well, and cultured for 24 hours. Afterwards, the culture medium was removed, replaced with medium containing FBS or each mixture, and cultured for additional 44 or 68 hours, then treated with 20 ⁇ l of WST-8 (BIOMAX, Seoul, Korea) solution and cultured for a total of 48 to 72 hours. did. Afterwards, the mixture was mixed well for 5 minutes using a microplate shaker and the absorbance was measured at 450 nm.
  • Alcalase protein hydrolyzate (0.5x) was prepared for each raw material and mixed at a ratio of 3:7 compared to FBS to prepare medium.
  • Each of the prepared media was cultured for 48 hours and 72 hours, as shown in Figures 2A and 2B, respectively.
  • protein hydrolysates of silkworm pupae (BM) in addition to brown mealworm larvae (TM) were shown to promote cell growth. It was confirmed to be an excellent alternative medium composition as it had no or minimal effect on
  • TMA FBS/brown mealworm larval alcalase protein hydrolyzate
  • the medium containing 10% FBS alone was used as a control, and a mixture of FBS and 0.5% (0.5x) TMA in a 3:7 ratio was prepared in DMEM medium to a final ratio of 10% (v/v).
  • Cells of each generation were distributed in each medium at a density of 1x10 6 cells/dish in 100-pi dishes and cultured for 48 hours, and then cells were collected using trypsin. Afterwards, the cells were stained using 0.4% trypan blue reagent, and the number of unstained living cells was measured using a hemocytometer, as shown in Figure 3A.
  • the cell shape of each generation was photographed at 100x magnification using an inverted phase-contrast microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) and shown in Figure 3B.
  • Mouse myoblasts C2C12 (ATCC, Manassas, VA, USA), rat myoblasts L6 (ATCC, Manassas, VA, USA), human-derived solid tumor cell line H460 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea), human pancreatic cancer cell line Panc-1 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea), human-derived hematological cancer cell line HL-60 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea), HL-60 of Jurkat (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea), and Jurkat is RPMI1640. 10% FBS and 1% antibiotics penicillin and streptomycin were added to the medium (Roswell Park Memorial Institute) and used as a culture medium.
  • DMEM medium Dulbeccos modified Eagles medium high glucose
  • Antibiotics penicillin and streptomycin were added and used as a culture medium to culture the cells in an incubator at 5% CO 2 and 37°C.
  • TMA FBS/brown mealworm larval alcalase protein hydrolyzate
  • BMA FBS/silkworm pupa alcalase protein hydrolyzate
  • the cultured cells were collected using trypsin and grown into C2C12 1.5 ⁇ 10 4 cells/well, L6 1 ⁇ 10 4 cells/well, H460 3.5 ⁇ 10 4 cells/well, Panc-1 3.5 ⁇ 10 4 cells/well, HL-60 3 ⁇ 10 5 cells/well, Jurkat 3 ⁇ 10 5 cells/well were dispensed into 48-wells and cultured for 24 hours. Afterwards, the culture medium was removed and replaced with medium containing FBS or each mixture, cultured for additional 44 or 68 hours, and then treated with 20 ⁇ l of WST-8 (BIOMAX, Seoul, Korea) solution for a total of 48 to 72 hours. Cultured. Afterwards, the mixture was mixed well for 5 minutes using a microplate shaker and the absorbance was measured at 450 nm.
  • TMA and BMA which had excellent FBS replacement effects, were used to confirm their potential as FBS replacement in the culture of various cells derived from humans and rodents.
  • TMA and BMA showed a slight decrease in cell growth compared to FBS in C2C12 cells and Panc-1 cells, but had no significant effect in the culture of other cells. Therefore, TMA and BMA can be used as an alternative to FBS in the culture of various cells, and can be used in the culture of suspended cells as well as adherent cells.
  • FCS/TMA or FCS/BMA mixtures were mixed in 5:5 and 3:7 ratios.
  • the mixed mixture was prepared in DMEM medium to a final ratio of 10% (v/v).
  • Cultured cells were treated with trypsin, collected, distributed into 48-wells at a density of 3 ⁇ 10 4 cells/well, and cultured for 24 hours. Afterwards, the culture medium was removed, replaced with medium containing FBS or each mixture, and cultured for additional 44 or 68 hours, then treated with 20 ⁇ l of WST-8 (BIOMAX, Seoul, Korea) solution and cultured for a total of 48 to 72 hours. did. Afterwards, the mixture was mixed well for 5 minutes using a microplate shaker and the absorbance was measured at 450 nm.
  • Figure 5 is a graph comparing the cell growth rate of each medium mixed with FCS and BMA or TMA in various ratios for HaCaT cells, which are human skin keratinocytes.
  • FCS and BMA0.5x Figure 7A
  • TMA0.5x Figure 7B
  • FBS FBS

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Abstract

본 발명은 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 대체하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 배양시 곤충 단백가수분해물을 포함함으로써 고가이면서 윤리적 문제가 있는 소태아 혈청의 사용량을 줄이면서도 인간을 포함한 동물 유래의 다양한 세포 배양시 소태아 혈청을 포함한 경우와 세포 생육에 미치는 영향이 동등하거나 그 이상의 세포 생장 촉진 효과가 확인됨에 따라, 상기 곤충 단백가수분해물을 포함하는 조성물은 소태아 혈청의 대체소재로 사용되며, 바이오분야에서의 세포 배양뿐만 아니라 배양육 및 이를 소재로 하는 다양한 식품 산업분야에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

소태아 혈청(FBS) 대체 조성물
본 발명은 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 대체하는 조성물에 관한 것이다.
혈청은 여러 물질이 혼합된 복합 산물이며 세포 배양실에서 기본 배양 배지에 첨가제로 사용되며, 세포배양에 있어서 성장인자, 호르몬 그리고 세포를 자극하는 성분 등을 포함하고 있으며, 세포의 종류에 따라 다양하게 사용되고 있으나 일반적으로 소태아 혈청을 가장 많이 이용하고 있다. 소태아 혈청은 임신기간 중에 소 혈액으로부터 분리되는 혈청으로, 특히 바이오기술 관련 실험의 기초적인 단계에 속하는 동물세포 배양뿐만 아니라 최근 몇 년 동안 전 세계적으로 기술속도가 점점 더 빨라지고 있는 백신, 단백질의약품, 치료용 항체 등 개발에 사용되는 원료물질이다.
상기 소태아 혈청의 한국 시장은 약 200억원대이며, 전 세계 시장 크기는 약 2조원에 이른다. 이 중 미국산이 약 85%를 차지하고 호주와 뉴질랜드산이 약 15%를 이룬다. 한국에서 생산판매는 전무하며 수입금지 조치가 내려지면 대처할 수 있는 상황이 현재로서는 매우 미흡한 상황이다. 따라서, 소태아 혈청을 대체할 수 있는 다른 혈청의 개발에 대한 필요성이 크게 대두되고 있다.
또한, 종래 소태아 혈청은 고가라는 문제도 있으나, 이보다 윤리적인 문제와 GRAS 등급(식품등급)에 맞는 혈청을 사용하고자 하는 요구로 인하여 소태아 혈청 대체제를 개발할 필요성이 있다.
이에, 본 발명은 소태아 혈청의 사용을 감소시키기 위해, 경제적이면서도 안전한 곤충 단백가수분해물을 함유한 소태아 혈청 대체 조성물 및 이를 이용한 세포 배양 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 곤충 단백가수분해물을 포함하는 세포 배양용 소태아 혈청 대체 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 소태아 혈청 대체 조성물을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소태아 혈청 대체 조성물을 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 곤충을 분쇄하여 증류수에 기질 용액으로 제조하는 제1단계; 상기 기질 용액을 중탕시켜 자가 효소를 불활성화하는 제2단계; 상기 기질 용액에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 가수분해한 후 가열하여 효소를 불활성화하는 제3단계; 상기 가수분해한 가수분해물을 방랭한 후 여과 또는 원심분리하여 여과액 또는 상등액을 얻는 제4단계; 및 상기 여과액 또는 상등액을 건조하여 곤충 단백가수분해물을 수득하는 제5단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 단백가수분해물의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포 배양시 곤충 단백가수분해물을 포함함으로써 고가이면서 윤리적 문제가 있는 소태아 혈청의 사용량을 줄이면서도 소태아 혈청만을 포함한 경우와 동등하거나 그 이상의 세포 생장 촉진 효과를 나타내어, 세포 배양시 필수적으로 사용되는 소태아 혈청의 대체소재로 사용될 뿐만 아니라, 배양육을 소재로 하는 다양한 식품 산업분야에 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포의 배지별 세포 생육도(cell viability)를 비교한 그래프이다.
도 2는 곤충 및 탈지대두의 단백가수분해물을 포함한 배지를 이용하여, HaCaT 세포를 대상으로 각 배지별 세포 생육도(cell viability)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 FBS/갈색거지리 유충 alcalase 단백가수분해물(TMA) 혼합물을 포함한 배지를 이용하여, HaCaT 세포를 계대 배양하면서 계대 배양 횟수에 따른 세포 수를 나타낸 그래프(도 3A) 및 세포 모양을 역상 위상차 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 100배율로 촬영한 사진(도 3B)이다.
도 4는 갈색거저리 유충(TMA) 또는 누에번데기(BMA)의 단백가수분해물을 포함하는 배지를 이용하여, 인간 및 설치류 유래의 다양한 세포를 대상으로 각 배지별 세포 생육도(cell viability)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 송아지 혈청(fetal calf serum; FCS)/단백가수분해물 혼합물을 포함한 배지를 이용하여, HaCaT 세포를 대상으로 각 배지별 세포 생육도(cell viability)를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 세포 배양시 곤충 단백가수분해물을 포함함으로써, 소태아 혈청의 사용량을 줄이면서도 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포, C2C12 마우스 근아세포, 인간 유래 고형암 세포주인 H460과 Panc-1, 인간 유래 혈액암 세포주인 HL-60과 Jurkat 세포에서, 소태아 혈청만을 포함하여 세포를 배양한 경우와 대비하여 세포 생육도(cell viability)에 미치는 영향이 없거나 미미한 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 곤충 단백가수분해물을 포함하는 세포 배양용 소태아 혈청 대체 조성물을 제공한다.
상기 곤충 단백가수분해물은 열가수분해물, 효소 가수분해물, 산가수분해물, 알칼리가수분해물 중 어느 하나 이상의 형태로 제조하여 사용하며, 바람직하게는 효소 가수분해물일 수 있다.
상기 곤충 단백가수분해물은 식용곤충, 탈지한 식용곤충 또는 이의 분쇄물을 효소 가수분해시킨 가수분해 산물인 것일 수 있다.
상기 식용곤충(edible insects)은 그 전부 또는 일부 성분을 식품으로 활용할 수 있는 곤충들을 의미하며, 알, 유충, 번데기 및 성충을 포함할 수 있다. 상기 식용곤충은 전통적으로 식품으로 사용되거나 또는 국가기관에서 식품 원료로서 사용이 허가된 곤충일 수 있으며, 예를 들면 대한민국 식품의약품안전평가원에서 식품원료로서 사용이 허가된 곤충일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 식용곤충은 갈색거저리 유충, 누에번데기, 쌍별귀뚜라미, 흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 누에, 메뚜기, 풀무치, 아메리카 왕거저리 애벌레 및 수벌 번데기로 이루어진 식용곤충 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식용곤충은 건조된 것일 수 있으며, 분쇄한 것을 사용할 수 있다.
상기 효소는 GRAS 등급 가수분해효소인 것일 수 있다.
상기 GRAS 등급 가수분해효소는 알칼라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타맥스(Protamex), 사비나아제(Savinase), 피신(ficin), 브로멜라인(Bromelain) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포 배양시 적용될 수 있는 세포로는 혈액암세포, 폐암세포, 전립선암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암세포 및 대장암세포로 이루어진 군에서 선택된 암세포; 조골세포; 신장세포; 섬유모세포; 연골세포; 간세포; 신경세포; 근육세포 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 조성물은 세포의 계대배양이 가능한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, “계대”는 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법에서, 배양용기를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 의미한다. 한 차례 배양용기 교체 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대라고 한다. 본 발명에서 상기 계대는 세대와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물을 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포, 마우스 근아세포(myoblast), 인간 유래 고형암 세포주인 H460과 Panc-1, 인간 유래 혈액암 세포주인 HL-60과 Jurkat 세포에 적용시, 1세대부터 10세대, 즉 1계대부터 10계대까지 정상적인 배양 및 분화가 가능함을 확인하였다.
상기 조성물은 소태아 혈청 또는 송아지 혈청(fetal calf serum; FCS)을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 곤충 단백가수분해물 50 내지 90 중량% 및 소태아 혈청 또는 송아지 혈청 10 내지 50 중량%를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 소태아 혈청 대체 조성물을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어,“배지”는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당 분야에서 사용되는 줄기세포의 배양 및 분화에 적절한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 해당 분야의 기술적 수준에서 배지의 종류와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 구체적으로 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 상기 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow’s Minimal essential Medium), Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 또는 이들의 2 이상의 혼합물 등의 항생제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 소태아 혈청 대체 조성물을 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양방법을 제공한다.
본 발명은 곤충을 분쇄하여 증류수에 기질 용액으로 제조하는 제1단계; 상기 기질 용액을 중탕시켜 자가 효소를 불활성화하는 제2단계; 상기 기질 용액에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 가수분해한 후 가열하여 효소를 불활성화하는 제3단계; 상기 가수분해한 가수분해물을 방랭한 후 여과 또는 원심분리하여 여과액 또는 상등액을 얻는 제4단계; 및 상기 여과액 또는 상등액을 건조하여 곤충 단백가수분해물을 수득하는 제5단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 단백가수분해물의 제조방법을 제공한다.
상기 가수분해효소는 알칼라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타맥스(Protamex), 사비나아제(Savinase), 피신(ficin), 브로멜라인(Bromelain) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2단계는 80 내지 100 ℃에서 10 내지 30분 동안 중탕하여 자가 효소를 불활성화하는 것일 수 있다.
상기 제3단계는 80 내지 100 ℃에서 10 내지 30분 동안 가열하여 효소를 불활성화하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 갈색거저리 유충 단백가수분해물(TMH) 세포 배양액의 제조방법
갈색거저리 유충을 분쇄하여 증류수에 4 %(w/w)의 기질 용액으로 제조한 후, 90 ℃에서 20분 동안 중탕시켜 자가 효소를 불활성화하였다. 기질 용액에 기질 대비 단백질 가수분해 효소인 알칼라아제(Alcalase) 및 플라보르자임(Flavourzyme)을 각각 1 %(w/w)가 되도록 첨가하여 55 ℃, 100 rpm에서 8시간 동안 가수분해하였으며, 그 후, 90 ℃에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화하였다. 상기 가수분해한 가수분해물을 방랭한 후 13,000 xg에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었으며 이를 72시간 동안 동결 건조하여 최종적으로 갈색거저리 유충 단백가수분해물(TMH)을 얻었다.
갈색거저리 유충 단백가수분해물(TMH)을 함유하는 세포 배양액의 제조를 위해 동결 건조한 단백가수분해물을 증류수로 0.5 %(w/v)와 1 %(w/v) 비율로 녹인 후 9,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 분리한 상층액은 박테리아, 곰팡이 및 마이크로플라즈마의 제거를 위하여 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 여과한 후 20 ℃의 동결고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
< 실험예 1> 갈색거저리 유충 단백가수분해물 ( TMH ) 세포 배양액의 비율별 HaCaT 세포 생육도 비교
인간 각질 형성세포(keratinocyte)인 HaCaT 세포주는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. DMEM 배지(Dulbeccos modified Eagles medium high glucose)에 10 % 소태아 혈청(FBS) 및 1 % 항생제인 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가하여 배양 배지로 사용하고, 5 % CO2 및 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.
갈색거저리 유충 단백가수분해물(TMH)를 함유하는 세포 배양액이 세포 배양에 적합한지 확인하고자, 다양한 비율로 FBS 또는 FBS/TMH 혼합배지를 제조하였다. 10 % FBS를 단독으로 사용한 FBS:TMH (10:0)을 대조군으로 하여 FBS와 0.5 %(0.5x)와 1 %(1x) 단백가수분해물을 5:5, 3:7 및 1:9 비율로 섞은 혼합물을 DMEM 배지에 최종 10 % 비율(v/v)이 되도록 제조하였다.
배양된 세포를 트립신을 처리하여 수집하고 3x104 cells/well 밀도로 48-well에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 FBS 또는 각 혼합물을 함유하는 배지로 교체하여 44 또는 68시간 동안 추가 배양한 후, WST-8(BIOMAX, 서울, 한국) 용액을 20 ㎕ 처리하여 총 48∼72시간 동안 배양하였다. 그 후 마이크로플레이트 쉐이커를 이용하여 5분간 잘 섞어준 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
TMH의 FBS 대체효과를 알아보기 위해 FBS와 TMH를 다양한 비율로 섞어 배지를 제조한 후 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 대상으로 배지별 세포 생육도(cell viability)를 비교하여 도 1에 나타내었다. 도 1을 참고하면, FBS와 알칼라아제 효소로 가수분해하여 제조한 단백가수분해물을 증류수로 2배 희석한 TMH(0.5x)를 3:7의 비율로 첨가하여 제조한 배지가 48∼72시간 동안 배양하는 동안 세포 생육에 미치는 영향이 없는 최적의 대체배지 조성물로 확인되었다.
< 실험예 2> 다른 곤충 및 탈지대두 단백가수분해물의 세포 배양액별 HaCaT 세포 생육도(cell viability) 비교
갈색거저리 유충 알칼라아제 단백가수분해물의 FBS 대체 효과를 다른 곤충(장수풍뎅이 유충, 누에번데기, 쌍별귀뚜라미, 흰점박이꽃무지 유충) 및 탈지 대두의 알칼라아제 단백가수분해물과 비교하고자, FBS와 0.5 % (w/v) 농도의 각 단백가수분해물을 3:7 비율로 섞은 혼합물을 DMEM 배지에 최종 10 % 비율(v/v)이 되도록 제조하였다.
배양된 세포를 트립신을 처리하여 수집하고 3×104 cells/well의 밀도로 48-well에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 FBS 또는 각 혼합물을 함유하는 배지로 교체하여 44 또는 68시간 동안 추가 배양한 후, WST-8(BIOMAX, 서울, 한국) 용액을 20 ㎕ 처리하여 총 48∼72시간 동안 배양하였다. 그 후 마이크로플레이트 쉐이커를 이용하여 5분간 잘 섞어준 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
갈색거저리 유충 알칼라아제 단백가수분해물의 FBS 대체 효과를 비교하기 위해, 각 원료별로 알칼라아제 단백가수분해물(0.5x)을 제조한 후 FBS 대비 3:7의 비율로 섞어 배지를 제조한 후, 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 대상으로 배지별 세포 생육도를 비교하여 도 2에 나타내었다. 제조한 각각의 배지를 48시간, 72시간 동안 배양하여 도 2A, 2B에 각각 나타내었으며, 특히 72시간 동안 배양한 결과, 갈색거저리 유충(TM) 외에도 누에번데기(BM)의 단백가수분해물이 세포 생육에 미치는 영항이 없거나 미미하여 우수한 대체배지 조성물로 확인되었다.
< 실험예 3> 갈색거저리 유충 단백가수분해물 ( TMH ) 세포 배양액을 이용한 HaCaT 세포의 배양
세포 배양에 있어 FBS/갈색거저리 유충 알칼라아제 단백가수분해물(TMA) 혼합물의 FBS 대체 가능성을 추가적으로 평가하기 위해 HaCaT 세포를 10세대 장기 계대 배양하면서 각각의 세대마다 세포 수를 측정함으로써 세포 증식에 미치는 영향을 관찰하였다.
10 % FBS를 단독으로 사용한 배지를 대조군으로 하여 FBS와 0.5 %(0.5x) TMA를 3:7 비율로 섞은 혼합물을 DMEM 배지에 최종 10 % 비율(v/v)이 되도록 제조하였다. 각각의 배지로 세대별 세포를 100파이 디쉬에 1x106 cells/dish의 밀도로 분주하고 48시간 동안 배양한 후, 트립신을 이용하여 세포를 수거하였다. 그 후, 0.4 % 트립판블루 시약을 이용하여 세포를 염색하고 헤모사이토미터를 이용하여 염색되지 않은 살아있는 세포의 수를 측정하여 도 3A에 나타내었다. 또한, 세대별 세포 모양은 역상 위상차 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 100배 배율로 촬영하여 도 3B에 나타내었다.
HaCaT 세포를 대상으로 연속적인 계대배양을 10회 진행하며 계대배양 횟수에따라 세포 생육도에 미치는 영항을 조사함으로써 FBS/갈색거저리 유충 알칼라아제 단백가수분해물(TMA 0.5x)의 FBS 대체 효과를 추가적으로 확인하였다. 도 3A를 참조하면, 10회의 계대배양 동안 FBS 대비 세포 생육도에 미치는 영향이 없거나 크지 않은 것으로 나타나 여러 번의 계대배양을 진행하는 중에도 FBS 대체효과가 우수한 것으로 확인되었다. 또한 도 3B를 참조하면, 각각 1회, 5회, 10회 계대배양된 세포의 모습을 관찰한 결과 10회에 걸친 계대배양을 진행하는 동안에도 두 그룹 모두 세포 모양에 유의적인 차이를 보이지 않음을 알 수 있다.
< 실험예 4> 갈색거저리 유충 및 누에번데기 단백가수분해물 세포 배양액을 이용한 세포주별 세포 생육도의 비교
마우스 근아세포인 C2C12(ATCC, Manassas, VA, USA), 래트 근아세포인 L6(ATCC, Manassas, VA, USA), 인간 유래 고형암 세포주인 H460(한국세포주은행, 서울, 한국), 인간 췌장암세포주인 Panc-1(한국세포주은행, 서울, 한국), 인간 유래 혈액암 세포주인 HL-60(한국세포주은행, 서울, 한국), Jurkat(한국세포주은행, 서울, 한국) 중 HL-60, Jurkat은 RPMI1640 배지(Roswell Park Memorial Institute)에 10 % FBS 및 1 % 항생제인 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 배양 배지로 사용하고, 그 외의 세포주는 DMEM 배지(Dulbeccos modified Eagles medium high glucose)에 10 % FBS 및 1 % 항생제인 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 배양 배지로 사용하여 5 % CO2 및 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.
다양한 세포들을 대상을 FBS/갈색거저리 유충 알칼라아제 단백가수분해물(TMA) 및 FBS/누에번데기 알칼라아제 단백가수분해물(BMA)의 FBS 대체 효과를 확인하고자, 10 % FBS를 단독으로 사용한 배지를 대조군으로 하여 FBS와 0.5 %(0.5x) TMA 또는 BMA를 3:7 비율로 섞은 혼합물을 배지에 최종 10 % 비율(v/v)이 되도록 제조하였다.
배양된 세포를 트립신을 이용하여 세포를 수집하고 C2C12 1.5×104 cells/well, L6 1×104 cells/well, H460 3.5×104 cells/well, Panc-1 3.5×104 cells/well, HL-60 3×105 cells/well, Jurkat 3×105 cells/well의 밀도로 48-well에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 FBS 또는 각 혼합물을 함유하는 배지로 교체하여 44 또는 68시간 동안 추가 배양한 후, WST-8(BIOMAX, 서울, 한국) 용액을 20 ㎕ 처리하여 총 48∼72시간 동안 배양하였다. 그 후 마이크로플레이트 쉐이커를 이용하여 5분간 잘 섞어준 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
HaCaT 세포를 대상으로 한 실험에서 FBS 대체효과가 뛰어났던 TMA 및 BMA을 이용하여 인간 및 설치류 유래 다양한 세포들의 배양에 있어 이들의 FBS 대체 가능성을 확인하였다. 실험에는 C2C12 마우스 근아세포(myoblast), 인간 유래 고형암 세포주인 H460와 Panc-1, 인간 유래 혈액암 세포주인 HL-60, Jurkat 세포가 사용되었다. 각각의 배지로 48시간 배양한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, TMA 및 BMA 모두 C2C12 세포와 Panc-1 세포에서는 FBS 대비 세포 생육이 조금 저하되는 것으로 나타났으나 그 외 세포들의 배양에서는 큰 영향이 없었다. 따라서, TMA 및 BMA가 다양한 세포들의 배양에 있어 FBS 대체소재로 활용이 가능하며, 부착형 세포뿐만 아니라 부유형 세포들의 배양에도 활용이 가능할 수 있다.
< 실험예 5> 송아지 혈청(fetal calf serum; FCS )/곤충 단백가수분해물 혼합물 함유 배지를 이용한 HaCaT 세포의 배양 및 생육도 확인
FCS/TMA 또는 FCS/BMA 혼합물의 완전한 FBS 대체 가능성을 확인하기 위해, 10 % FBS를 단독으로 사용한 배지를 대조군으로 하여 FCS와 0.5 %(0.5x) TMA 또는 BMA를 5:5 와 3:7의 비율로 섞은 혼합물을 DMEM 배지에 최종 10 % 비율(v/v)이 되도록 제조하였다.
배양된 세포를 트립신을 처리하여 수집하고 3×104 cells/well의 밀도로 48-well에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 FBS 또는 각 혼합물을 함유하는 배지로 교체하여 44 또는 68시간 동안 추가 배양한 후, WST-8(BIOMAX, 서울, 한국) 용액을 20 ㎕ 처리하여 총 48∼72시간 동안 배양하였다. 그 후 마이크로플레이트 쉐이커를 이용하여 5분간 잘 섞어준 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 대상으로 FCS와 BMA 또는 TMA를 다양한 비율로 혼합한 배지별 세포 생육도를 비교한 그래프이다. 그 결과, FCS와 BMA0.5x(도 7A) 또는 TMA0.5x(도 7B)를 각각 5:5 또는 3:7 비율로 첨가하여 제조한 배지로 배양한 세포의 경우 FBS를 첨가하여 제조한 배지로 배양한 세포와 비교하여 48∼72시간 동안 세포 생육에 큰 차이를 보이지 않았다. 이를 통해, FCS/단백가수분해물 혼합물 또한 FBS 대체제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 곤충 단백가수분해물을 포함하는 세포 배양용 소태아 혈청 대체 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 곤충 단백가수분해물은 식용곤충, 탈지한 식용곤충 또는 이의 분쇄물을 효소 가수분해시킨 가수분해 산물인 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 식용곤충은 갈색거저리 유충, 누에번데기, 쌍별귀뚜라미, 흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 누에, 메뚜기, 풀무치, 아메리카 왕거저리 애벌레 및 수벌 번데기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 효소는 GRAS 등급 가수분해효소인 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 GRAS 등급 가수분해효소는 알칼라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타맥스(Protamex), 사비나아제(Savinase), 피신(ficin), 브로멜라인(Bromelain) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 혈액암세포, 폐암세포, 전립선암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암세포 및 대장암세포로 이루어진 군에서 선택된 암세포; 조골세포; 신장세포; 섬유모세포; 연골세포; 간세포; 신경세포; 면역세포; 근육세포; 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 세포의 계대배양이 가능한 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 또는 송아지 혈청(fetal calf serum; FCS)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 곤충 단백가수분해물 50 내지 90 중량% 및 소태아 혈청(FBS) 또는 송아지 혈청(fetal calf serum; FCS) 10 내지 50 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 소태아 혈청 대체 조성물.
  10. 청구항 1에 따른 소태아 혈청 대체 조성물을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물.
  11. 청구항 1에 따른 소태아 혈청 대체 조성물을 세포에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양방법.
  12. 곤충을 분쇄하여 증류수에 기질 용액으로 제조하는 제1단계;
    상기 기질 용액을 중탕시켜 자가 효소를 불활성화하는 제2단계;
    상기 기질 용액에 가수분해효소를 첨가하여 가수분해한 후 가열하여 효소를 불활성화하는 제3단계;
    상기 가수분해한 가수분해물을 방랭한 후 여과 또는 원심분리하여 여과액 또는 상등액을 얻는 제4단계; 및
    상기 여과액 또는 상등액을 건조하여 곤충 단백가수분해물을 수득하는 제5단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 단백가수분해물의 제조방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 가수분해효소는 알칼라아제(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 프로타맥스(Protamex), 사비나아제(Savinase), 피신(ficin), 브로멜라인(Bromelain) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 곤충 단백가수분해물의 제조방법.
  14. 청구항 12에 있어서,
    상기 제2단계는 80 내지 100 ℃에서 10 내지 30분 동안 중탕하여 자가 효소를 불활성화하는 것을 특징으로 하는 곤충 단백가수분해물의 제조방법.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 제3단계는 80 내지 100 ℃에서 10 내지 30분 동안 가열하여 효소를 불활성화하는 것을 특징으로 하는 곤충 단백가수분해물의 제조방법.
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