WO2024128564A1 - 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024128564A1
WO2024128564A1 PCT/KR2023/017908 KR2023017908W WO2024128564A1 WO 2024128564 A1 WO2024128564 A1 WO 2024128564A1 KR 2023017908 W KR2023017908 W KR 2023017908W WO 2024128564 A1 WO2024128564 A1 WO 2024128564A1
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WO
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cells
thraustochytrid
cell culture
extract
microalgae
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PCT/KR2023/017908
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English (en)
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Inventor
신원섭
유애진
김지영
전승집
장성훈
강혜원
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for cell culture containing a microalgae extract and its use.
  • fetal bovine serum is the most popular component.
  • ethical issues inevitably arise during the manufacturing process of fetal bovine serum, and there are various problems such as contamination issues and supply limitations, so the development of substitutes is essential.
  • Various studies are underway to develop a serum-free medium that does not use fetal bovine serum (KR 10-2021-0090560), but there is still a need to additionally add various hormones or growth factors to replace fetal bovine serum. Therefore, additional development is needed for user convenience.
  • an extract is obtained from biomass produced through fermentation of microalgae of the Thraustochytrid series and used as a medium component for cell culture.
  • the fermentation-based microalgae biomass production and extraction process has the advantage of being free from ethical issues and stability issues such as contamination issues.
  • the present invention provides a medium composition for cell culture, comprising thraustochytrid and microalgae extract.
  • Another example provides a medium additive for cell culture, comprising thraustochytrid and microalgae extract.
  • Another example provides a medium for cell culture, including the above medium additive for cell culture.
  • Another example provides a method of culturing cells using the cell culture medium composition.
  • Another example provides the use of Thraustochytrid and microalgae extracts as media additives that can replace animal serum while promoting cell proliferation and survival.
  • the present invention relates to a medium composition for cell culture containing Thraustochytrid and microalgae extract.
  • the present invention relates to a medium additive for cell culture, comprising thraustochytrid and microalgae extract.
  • the present invention relates to a medium for cell culture containing the above medium additive.
  • the present invention relates to a method of culturing cells, comprising culturing cells in the medium.
  • the present invention relates to the use of Thraustochytrid and microalgae extract as a medium additive that can replace animal serum and promote cell proliferation and survival.
  • the present invention provides a medium composition for cell culture containing thraustochytrid and microalgae extract.
  • cell culture refers to the process of artificially growing living cells in vitro under controlled conditions.
  • a portion of an individual's tissue is aseptically removed, the intercellular connecting material is decomposed with enzymes, and the resulting suspension is spread on the flat bottom of a culture dish such as a bottle or Petri dish to grow and proliferate cells.
  • the cell culture may include culturing cells to produce cell cultured meat. Therefore, the composition may be a medium composition for producing cultured meat.
  • the medium composition of the present invention may contain Thraustochytrid and microalgae extract instead of the commonly used fetal bovine serum.
  • the thraustochytrid and microalgae extract is a material rich in nutrients such as proteins and amino acids, so stability problems can be eliminated, and the production cost is lower than fetal bovine serum, so excellent productivity can be expected.
  • cultured meat refers to edible meat obtained by collecting animal cells and proliferating them using cell engineering technology, and is a field of cellular agriculture in which meat is obtained without going through the process of raising livestock. It can be said.
  • cultured meat alternative meat, or artificial meat.
  • in vitro meat which means grown in a test tube
  • artificial meat which means that it is synthesized using human stem cells, not natural, and not in a traditional breeding facility.
  • clean meat meaning it is produced in a clean production facility, and lab-grown meat, because it is made in a laboratory.
  • culture media refers to a medium that can support the growth, survival, and differentiation of cells or stem cells in vitro, and is used in the field of cells or stem cells. Includes all conventional media appropriate for culture and differentiation. Depending on the type of cell, the type of medium and culture conditions can be selected at the technical level of the relevant field.
  • the medium used for culture is specifically cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source, and trace element components.
  • the cell culture minimal media includes, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax complete medium, AminoMax ⁇ medium, EBM (Endothelial Basal Medium) medium, Chang's Medium, MesenCult -XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) medium, and MCDB+DMEM/LG (MCDB+Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) medium.
  • DMEM Dynamic Eagle's Medium
  • MEM Minimum Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • the medium may contain antibiotics such as penicillin, streptomycin, gentamicin, or a mixture of two or more thereof. Therefore, the medium composition for cell culture of the present invention may include thraustochytrid and microalgae extract added to the minimal cell culture medium.
  • Thraustochytrid and microalgae refers to heterotrophic microorganisms belonging to the order Thraustochytriales, which can produce bio-oil containing unsaturated fatty acids such as DHA (docosahexaenoic acid). It is known as an oleaginous microorganism and is rich in protein and amino acids, so it is considered a good protein source.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the thraustochytrid microalgae may be any genus available to those skilled in the art. Specifically, it may be any one selected from the group consisting of the genus Schizochytrium , the genus Aurantiochytrium , the genus Thraustochytrium , and the genus UIkenia , but is not limited thereto. That is not the case.
  • extract in this specification refers to the resulting liquid component obtained by immersing the target material in various solvents and then extracting it at room temperature or at a heated state for a certain period of time, and the solid content obtained by removing the solvent from the liquid component. It can mean.
  • extracts of all formulations that can be formed using the extract itself and the extract, such as dilutions of the results, concentrates, crude preparations, purifications, or mixtures thereof. You can. Additionally, the extract may include fractions obtained therefrom.
  • the extract may be extracted from natural, hybrid, or mutated thraustochytrid microalgae, and may also be extracted from tissue culture of thraustochytrid microalgae.
  • the extraction solvent for the extract may be a protic polar solvent or an aprotic polar and non-polar solvent.
  • the protic polar solvent may be water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, or butanol.
  • the aprotic polar solvent may be dichloromethane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetone, 2-butanone, or hexamethylphosphoramide.
  • the non-polar solvent may be pentane, hexane, chloroform, or diethyl ether.
  • the non-polar solvent excludes benzene.
  • the solvent may be a C1-C6 alcohol, a C3-C10 ester, such as a C3-C10 acetate, a C3-C10 ketone, a C1-C6 unsubstituted or halogenated hydrocarbon, a C2-C10 ring ether, or mixtures thereof. or it may be a mixture of one or more of the above solvents and water.
  • the solvent may be ethanol, propanol, acetonitrile, ethyl acetate, acetone, 2-butanone, chloroform, dichloromethane, hexane, mixtures thereof, or a mixture of one or more of the above solvents and water.
  • the hydrocarbon may be an alkane, alkene, or alkyne.
  • the extract is water; C1 to C4 lower alcohols such as methanol, ethanol, propanol, and butanol; Polyhydric alcohols such as glycerine, butylene glycol, and propylene glycol; and hydrocarbon solvents such as methyl acetate, ethyl acetate, acetone, bezene, hexane, diethyl ether, and dichloromethane. It may be extracted with one or more solvents selected from the group. Specifically, the extract may be obtained by extracting water with a solvent.
  • the thraustochytrid and microalgae extract may be extracted from the thraustochytrid and microalgae culture medium itself, and the culture medium is freeze-dried or dehydrated using a centrifuge and then freeze-dried. It may be manufactured from biomass and then extracted by introducing other drying processes using dry, drum dry, spray dry, granulator, etc., but is not limited to this.
  • biomass refers to It may be the thraustochytrid microalgae itself, its culture, its dried product, its crushed product, or a product produced by culturing or fermenting the microalgae, or it may be a concentrate or dried product of the biomass. It is not limited.
  • the thraustochytrid and microalgae extract can be extracted from thraustochytrid and microalgae or thraustochytrid and microalgae biomass by conventional methods, for example, hot water extraction, cold needle extraction, reduced pressure and high temperature. Extraction methods such as extraction method, boiling water extraction method, room temperature extraction method, fractional extraction method, reflux cooling extraction method, solvent extraction method, steam distillation method, ultrasonic extraction method, elution method, and compression method can be used. Preferably, it may be extracted using hot water extraction method.
  • the thraustochytrid and microalgae extract may be a commercially available thraustochytrid and microalgae extract.
  • the hot water extraction method may be performed at 80 to 140°C, 85 to 135°C, 90 to 130°C, 95 to 125°C, 100 to 120°C, or 105 to 115°C. In one embodiment, it is performed at 110°C. It may be, but is not limited to this. In addition, the hot water extraction method is 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 1 to 30 minutes, 2 to 30 minutes, 3 to 30 minutes, 4 to 30 minutes, 5 to 30 minutes, 6 to 30 minutes, 7 to 30 minutes.
  • fraction refers to a result obtained by performing fractionation to separate a specific component or specific group of components from a mixture containing various components.
  • the fractionation method for obtaining the above fraction is not particularly limited and may be performed according to methods commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the fractionation method include fractionation performed by treating various solvents, ultrafiltration fractionation performed by passing through an ultrafiltration membrane with a certain molecular weight cut-off value, and various chromatography methods (size, charge, hydrophobicity or There are chromatographic fractionation methods (designed for separation based on affinity), and combinations thereof.
  • the type of fractionation solvent used to obtain the fraction is not particularly limited, and any solvent known in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the fractionating solvent include polar solvents such as water and alcohols having 1 to 4 carbon atoms; Nonpolar solvents such as hexane, ethyl acetate, chloroform, and dichloromethane; Or a mixed solvent thereof, etc. may be mentioned. These may be used alone or in combination of one or more types, but are not limited thereto.
  • the thraustochytrid and microalgae extract may be included in the cell culture medium composition at a concentration of 25 g/L or less, specifically 23.6 g/L or less.
  • the concentration is 0.001 to 25 g/L, 0.005 to 25 g/L, 0.01 to 25 g/L, 0.05 to 25 g/L, 0.1 to 25 g/L, 0.2 to 25 g/L, 0.4 to 25 g/L, 0.8 to 25 g/L, 1 to 25 g/L, 2 to 25 g/L, 3 to 25 g/L, 0.001 to 23.6 g/L, 0.005 to 23.6 g/L, 0.01 to 23.6 g/L, 0.05 to 23.6 g/L, 0.1 to 23.6 g/L, 0.2 to 23.6 g/L, 0.4 to 23.6 g/L, 0.8 to 23.6 g/L, 1 to 23.6 g/L, 2 to 23.6 g/L, 3 to 2
  • the cells include somatic cells, embryonic cells, germ cells, stem cells, cancer cells, cell lines, cultured cells (in vitro), graft cells and primary culture cells (in vitro and ex vivo), and in vivo (in vitro).
  • the cells may be cancer cells, stem cells, vascular endothelial cells, leukocytes, immune cells, epithelial cells, germ cells, may be selected from the group consisting of fibroblasts, muscle cells, bone marrow cells, epidermal cells, osteoblasts, and nerve cells.
  • the eukaryotic organism may be an insect, amphibian, bird (chicken, turkey, duck, etc.) or mammal (human, primate such as monkey, dog, pig, cow, sheep, goat, mouse, rat, etc.).
  • the cells may be cells isolated from an individual or eukaryotic organism.
  • the cells may be undifferentiated cells, cells in differentiation, or cells that have completed differentiation, and may specifically be stem cells.
  • stem cell refers to a cell having potency and self-renewal ability. Stem cells are divided into pluripotency, multipotency, or unipotency depending on their differentiation ability.
  • the stem cells include embryonic stem cells (ESC) (inner cells of pre-implantation embryos), adult stem cells (undifferentiated cells present in each tissue and organ), and induced induced stem cells. It may be one or more selected from the group consisting of pluripotent stem cell (iPSC) (cells in which dedifferentiation is induced by inserting genes and/or proteins into somatic cells, or induced pluripotent stem cells).
  • ESC embryonic stem cells
  • adult stem cells undifferentiated cells present in each tissue and organ
  • induced induced stem cells It may be one or more selected from the group consisting of pluripotent stem cell (iPSC) (cells in which dedifferentiation is induced by inserting genes and/or proteins into somatic cells, or induced pluripotent stem cells).
  • iPSC pluripotent stem
  • the type and origin of the stem cells are not limited as long as they have differentiation and self-renewal abilities.
  • the stem cells may be derived from, for example, mammals, humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, or rabbits.
  • the stem cells may be derived from isolated umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, muscle, umbilical cord blood, or amniotic fluid.
  • isolated means existing in an environment different from that of the cell or tissue in which it naturally occurs. Separating the umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, muscle, umbilical cord blood or amniotic fluid and obtaining stem cells therefrom may be performed by conventional anatomical methods and known methods.
  • the cells may be muscle cells or muscle stem cells, and may be derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle cells or muscle stem cells derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle cells or muscle stem cells derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle cells or muscle stem cells derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle cells or muscle stem cells derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle cells or muscle stem cells derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle cells or muscle stem cells derived from livestock such as chicken, bovine, and porcine, and more specifically, bovine or porcine. ) may be muscle
  • muscle stem cell refers to a cell having the characteristics of a muscle stem cell, including proliferation without transformation, unlimited proliferation, self-reproduction ability, and the ability to differentiate into muscle. , any cell that shows self-reproduction ability, unlimited proliferation ability, or muscle differentiation ability can be included without limitation. The self-reproduction ability and muscle differentiation ability can be confirmed using markers.
  • the muscle stem cells can be used interchangeably with muscle satellite cells (SCs).
  • the medium composition containing the thraustochytrid and microalgae extract exhibits significantly excellent cell proliferation efficacy in muscle stem cells.
  • the composition may additionally include serum.
  • the serum may be one or more selected from the group consisting of fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BCS), human serum, and horse serum (HS), and may be specifically It may be fetal bovine serum.
  • the composition may include serum and thraustochytrid and microalgae extract, and the serum has a weight ratio of 1000:1 to 1:1 compared to the thraustochytrid and microalgae extract (serum: thraustochytrid and microalgae extract) It may be included as an extract).
  • the weight ratio of the serum and chlorella extract is 1000:1 to 1:1, 800:1 to 1:1, 600:1 to 1:1, 500:1 to 1:1, 400:1 to 1: 1, 350:1 to 1:1, 300:1 to 1:1, 250:1 to 1:1, 200:1 to 1:1, 150:1 to 1:1, 100:1 to 1:1, 50:1 to 1:1, 40:1 to 1:1, 30:1 to 1:1, 25:1 to 1:1, 20:1 to 1:1, 15:1 to 1:1, 12.5 :1 to 1:1, 10:1 to 1:1, 7.5:1 to 1:1, 5:1 to 1:1 or 2.5:1 to 1:1.
  • the culture composition allows subculture of cells.
  • passage refers to replacing culture vessels or dividing cell groups in a method of continuously culturing cells, specifically stem cells, in a healthy state for a long period of time. do. Replacing a culture vessel once or cultivating a group of cells by dividing them is called one passage. In the present invention, passage may be used interchangeably with generation.
  • the culture may be growth and proliferation.
  • growth and proliferation mean an increase in the number of cells.
  • the culture may be undifferentiated proliferation.
  • the undifferentiated proliferation means that stem cells proliferate into cells that have the same properties as the original cells, that is, cells with potency and self-renewal without being differentiated into specific cells.
  • differentiation refers to the phenomenon in which cells become specialized in structure or function while they divide and grow, that is, the form or function of living cells, tissues, etc. change to perform a given task. . Measuring or determining the degree of differentiation into a specific cell type can be performed by methods well known in the art.
  • the differentiation may be characterized by cell surface markers (e.g., staining cells with tissue-specific or cell-label specific antibodies) and changes in cell morphology (e.g., using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry). For example, by examining cell morphology using light or confocal microscopy, measuring nuclear/cytoplasmic ratios, or by familiarizing yourself with techniques in the art such as polymerase chain reaction (PCR) and gene-expression profiling. It can be confirmed by measuring changes in gene expression using known techniques.
  • cell surface markers e.g., staining cells with tissue-specific or cell-label specific antibodies
  • changes in cell morphology e.g., using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention provides a medium additive for cell culture, comprising thraustochytrid and microalgae extract.
  • the medium additive can replace all or part of the animal serum contained in the medium, so the cell culture medium containing the medium additive may have a reduced serum content compared to a general culture medium (containing about 10% serum). Additionally, the low serum culture medium containing the above medium additive can exhibit cell growth rate, cell viability, and subculture efficiency that are equivalent to or significantly superior to the culture medium containing 10% serum.
  • the present invention provides a cell culture method comprising culturing isolated cells using the cell culture medium composition.
  • the isolated cells may be cells isolated from livestock, and specifically, may be cells isolated from livestock such as cows, pigs, or chickens.
  • the cell culture method may be a method of culturing cells to produce cultured meat, and specifically, may be a method of proliferating and culturing muscle stem cells for producing cultured meat. Therefore, cultured meat can be produced using cells cultured using the above method, specifically muscle stem cells.
  • the culture form may be a conventional two-dimensional or three-dimensional culture known in the art.
  • three-dimensional culture may be desirable to realize tissues similar to actual biological tissues through cell-to-cell interactions.
  • Specific examples of three-dimensional culture include 3D porous scaffolds, scaffold-free platforms using cells themselves or cell sheet technology, methods of placing cells within microchips, methods using hydrogels, and biological There is a method using a reactor.
  • the present invention provides the use of thraustochytrid and microalgae extract as a medium additive that can replace animal serum and promote cell proliferation and survival.
  • thraustochytrids for the purpose of this application, thraustochytrids, microalgae, extracts, medium additives, etc. are as described above.
  • the composition for cell culture can be used as a replacement for fetal bovine serum among the cell culture medium components. Furthermore, because the microalgae extract contained in the cell culture composition of the present invention undergoes a fermentation-based production process, unlike the existing fetal bovine serum production process, it is free from various ethical and contamination issues, and is continuously maintained while maintaining a more consistent quality. It has the advantage of being capable of mass production.
  • Example 1 Obtaining microalgae extract
  • Schizochytrium sp. belongs to the Thraustochytrid family of microalgae. The strain was cultured in the dark and then dried to obtain biomass.
  • Schizochytrium sp The strain was grown in sterilized MJW01 medium (Glucose 30 g/L, MgSO 4 ⁇ 7H2O 3.0 g/L, Na 2 SO 4 10 g/L, NaCl 1.0 g/L, yeast extract 9.0 g/L, MSG ⁇ 1H 2 O 1.0 g/L, NaNO 3 1.0 g/L, KH 2 PO 4 0.1 g/L, K 2 HPO 4 0.5 g/L, CaCl 2 0.5 g/L, vitamin mixed solution 10 ml/L) Fermentation was carried out in The bacterial culture medium was freeze-dried as is, or dehydrated through a centrifuge and then freeze-dried to secure biomass.
  • MJW01 medium Glucose 30 g/L, MgSO 4 ⁇ 7H2O 3.0 g/L, Na 2 SO 4 10 g/L, NaCl 1.0 g/L, yeast extract 9.0 g/L, MSG ⁇ 1
  • the obtained microalgae biomass was dispersed in purified water at a concentration of 1.5% and then heated at 110°C for 10 minutes for hot water extraction.
  • the extract was filtered to remove remaining suspended solids and then freeze-dried to obtain a Thraustochytrid microalgae extract.
  • the individual amino acid content and total amino acid content compared to the dry weight of the obtained Thraustochytrid microalgae extract were measured and are shown in Table 1 below.
  • Amino Acid Types Amino acid content compared to dry weight (%) Asp 3.19 Thr 1.17 Ser 1.10 Glu 24.58 Gly 1.59 Ala 1.75 Cys 0.31 Val 1.92 Met 0.57 Ile 1.13 Leu 1.96 Tyr 0.91 Phe 1.25 Lys 1.91 His 0.64 Arg 7.45 Pro 0.74 total amino acids 52.17
  • the total amino acid content compared to the dry weight of the obtained Thraustochytrid microalgae extract was confirmed to be 52.17%, with the highest content of glutamic acid, arginine (Arg), It was confirmed that the amino acid content was high in the order of aspartic acid (Asp).
  • cells with a subculture number of 3 or 5 were seeded at 5,000 per well in a 96-well culture plate. Three wells were seeded for each condition, and cultured for one day at 37°C and 5% CO 2 conditions. Afterwards, it was replaced with a new culture medium containing 10% FBS and Thraustochytrid extract from 0.001 g/L to 40 g/L and cultured for 3 days. Then, 5 ⁇ L of WST-8 per well was treated and cultured for an additional 3 hours. The metabolic activity of cells was determined by measuring absorbance (OD450) at a wavelength of 450 nm using a microplate spectrophotometer.
  • OD450 absorbance
  • cell proliferation of bMuSC was at a similar level to that of the control group when the Thraustochytrid extract was included in the concentration range of 0.001 to 2 g/L.
  • the Thraustochytrid extract was included at a concentration of 4 g/L, cell viability increased by 115.8% compared to the control group, showing the highest cell viability within the concentration range used in the experiment. Accordingly, it was confirmed that the concentration of 4 g/L was E max . Additionally, the CC 50 value was confirmed to be 23.6 g/L.
  • the Thraustochytrid extract did not show any toxicity to cells when contained in the culture medium at a concentration of 4 g/L or less.
  • cell proliferation increased when the culture medium contained the above-mentioned concentration of the Thraustochytrid extract. You can tell it's excellent.
  • a WST-8 test was performed to determine what effect adding Thraustochytrid extract at the E max concentration confirmed in Example 2 had on bMuSC cells under culture conditions with reduced fetal bovine serum (FBS) in the culture medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • Small muscle cells with passage numbers of 5, 6, or 15 were seeded in 96-well culture plates, 3 wells per condition, 5,000 cells per well.
  • half of the culture medium was replaced with culture medium containing FBS at a concentration of 0% to 10% and Thraustochytrid extract at a concentration of 0 g/L to 4 g/L, and FBS was added.
  • the weight ratio of and Thraustochytrid extract is shown in Table 2 below.
  • FBS concentration Thraustochytrid extract (g/L) Media Weight per 500mL (g)
  • FBS: Thraustochytrid extract weight ratio FBS Thraustochytrid extract 0 0 0 0 - 2 One - 4 2 - One 0 5 0 - 2 One 5:1 4 2 2.5:1 2 0 10 0 - 2 One 10:1 4 2 5:1 5 0 25 0 - 2 One 25:1 4 2 12.5:1 10 0 50 0 - 2 One 50:1 4 2 25:1
  • Thraustochytrid extract (g/L) Cell viability (% of D0) Day 3 (D3) Day 6 (D6) 0% FBS 0 13.8 10.2 2 12.6 8.0 4 24.0 9.0 1%FBS 0 26.6 19.6 2 31.2 40.2 4 42.7 24.0 2%FBS 0 32.4 29.2 2 40.7 59.3 4 58.2 66.4 5%FBS 0 61.3 63.4 2 58.7 80.2 4 74.6 110.3 10%FBS 0 100.0 100.0 2 88.5 108.4 4 104.0 126.9

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 트라우스토키트리드 과에 속하는 미세조류 바이오매스부터 추출한 추출물을 포함하는 배지에서 근육세포를 배양하는 경우, 근육세포의 세포 증식능이 향상됨을 확인하였는 바, 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물은 세포 배양용 배지 성분 중 소태아혈청을 대체하여 사용할 수 있다.

Description

미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물 및 이의 용도
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2022년 12월 15일자 한국 특허 출원 제10-2022-0175629호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌들에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재까지 동물세포 배양에 사용되는 기본 배지 성분 중 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 가장 대중적으로 사용되는 성분이다. 그러나, 소태아혈청의 제조 과정에서 윤리 문제가 반드시 발생하며, 오염 문제 및 공급량 제한 등 여러 문제점들이 산재해 있기 때문에 이의 대체재 개발이 반드시 필요하다. 소태아혈청을 사용하지 않은 무혈청배지를 개발하기 위한 다양한 연구들이 진행되고 있으나(KR 10-2021-0090560), 아직까지 소태아혈청을 대체하기 위해 각종 호르몬 또는 성장인자를 추가적으로 첨가해야 할 필요가 있어 사용자의 편의성을 위해서는 추가적인 개발이 필요한 실정이다.
본 발명에서는, Thraustochytrid 계열의 미세조류 발효를 통하여 생산된 바이오매스로부터 추출물을 수득하여, 세포 배양용 배지 성분으로 활용하고자 한다. 발효를 기반으로 하는 미세조류 바이오매스 생산 및 추출 공정은 기존의 소태아혈청 생산 과정과 달리 윤리 문제에서 자유로우며, 오염 이슈 등의 안정성 문제에서도 벗어날 수 있다는 장점이 있다.
본 발명은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는, 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
다른 예는, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
또 다른 예는, 상기 세포 배양용 배지 첨가제를 포함하는, 세포 배양용 배지를 제공한다.
또 다른 예는, 상기 세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는, 동물 혈청을 대체하면서도 세포의 증식과 생존을 촉진할 수 있는 배지 첨가제로서의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물의 용도를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 배지 첨가제를 포함하는, 세포 배양용 배지에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 배지 내에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 동물 혈청을 대체하면서도 세포의 증식과 생존을 촉진할 수 있는 배지 첨가제로서의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물의 용도에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “세포 배양(cell culture)”은 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 의미한다. 또한, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시키는 것일 수 있다.
상기 세포 배양은 세포 배양육을 제조하기 위해 세포를 배양하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 배양육을 제조하기 위한 배지 조성물일 수 있다. 본 발명의 배지 조성물은 일반적으로 사용되는 소태아혈청 대신 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함할 수 있다. 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 단백질 및 아미노산 등의 영양성분이 풍부한 소재로서 안정성 문제를 배제할 수 있으며, 소태아혈청에 비해 생산 단가가 낮아 우수한 생산성을 기대할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양육"은 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기를 의미하며, 가축을 사육하는 과정을 거치지 않고 고기를 얻는 세포농업 (cellular agriculture)의 한 분야라고 할 수 있다. 한국어로는 배양육, 대체육 혹은 인공 고기라는 말로 불리며, 영어로는 시험관에서 키운다는 의미로 in vitro meat, 천연이 아닌 인간이 줄기세포를 이용하여 합성한다는 의미에서 artificial meat, 전통적인 사육 시설이 아닌 청정한 생산시설에서 생산된다는 의미로 clean meat, 실험실에서 만들어지기도 해서 lab-grown meat로 불리고 있다.
본 명세서에서 용어 "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro)에서 세포 또는 줄기세포의 성장, 생존 및 분 화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당분야에서 사용되는 세포 또는 줄기세포의 배양 및 분화에 적절 한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 해당분야의 기술적 수준에서 배지의 종류와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 구체적으로 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 상기 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB+Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 배지는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신 (gentamicin) 또는 이들의 2 이상의 혼합물 등의 항생제를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양용 배지 조성물은 상기 세포 배양 최소 배지에 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물이 첨가되어 포함된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류”는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목에 속하는 종속영양 미생물로, DHA(docosahexaenoic acid)와 같은 불포화지방산을 함유하는 바이오오일을 생산할 수 있는 유지성 미생물로 알려져 있으며, 단백질과 아미노산이 풍부하여 좋은 단백질원으로 여겨지고 있다.
상기 트라우스토키트리드 과 미세조류는 당업자가 입수 가능한 모든 속일 수 있다. 구체적으로, 스키조키트리움(Schizochytrium) 속, 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) 속, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 울케니아(UIkenia) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서의 용어 “추출물”은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정 시간 동안 추출하여 수득한 액상 성분, 상기 액상 성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 이로부터 수득한 분획물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 추출물은 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류의 천연, 잡종 또는 변종 트라우스토키트리드 과 미세조류로부터 추출될 수 있고, 트라우스토키트리드 과 미세조류 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.
상기 추출물의 추출 용매는 양성자성 극성 용매 또는 비양성자성 극성 및 비극성 용매일 수 있다. 상기 양성자성 극성 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 또는 뷰탄올일 수 있다. 상기 비양성자성 극성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로퓨란, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, 아세톤, 2-뷰탄온, 또는 헥사메틸포스포르아미드일 수 있다. 상기 비극성 용매는 펜탄, 헥산, 클로로포름, 또는 디에틸에테르일 수 있다. 상기 비극성 용매는 벤젠이 제외된다. 상기 용매는 C1-C6의 알콜, C3-C10의 에스테르, 예를 들면, C3-C10의 아세테이트, C3-C10의 케톤, C1-C6의 비치환 또는 할로겐화 탄화수소, C2-C10 고리 에테르, 이들의 혼합물 또는 상기 용매 중 하나 이상과 물의 혼합물일 수 있다. 상기 용매는 에탄올, 프로판올, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 아세톤, 2-뷰탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 이들의 혼합물, 또는 상기 용매 중 하나 이상과 물의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 탄화수소는 알칸, 알켄, 또는 알킨일 수 있다.
상기 추출물은 물; 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 뷰탄올(buthanol) 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린 (glycerine), 부틸렌글리콜 (butylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트(methyl acetate), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤 (acetone), 벤젠(bezene), 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 탄화수소계 용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 추출물은 물을 용매로 추출한 것일 수 있다.
상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 트라우스토키트리드 과 미세조류 배양액 그 자체로 추출한 것일 수 있고, 배양액을 동결 건조 또는 원심분리기로 탈수한 뒤 동결 건조(freeze dry), 드럼 건조(drum dry), 스프레이 건조(spray dry), 과립기 (granulator) 등을 이용한 기타 건조 공정을 도입하여 바이오매스로 제조한 뒤 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “바이오매스”는 트라우스토키트리드 과 미세조류 그 자체, 이의 배양물, 이의 건조물, 이의 파쇄물, 또는 상기 미세조류를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 트라우스토키트리드 과 미세조류 또는 트라우스토키트리드 과 미세조류 바이오매스를 통상의 방법에 의해 추출한 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 열수추출법, 냉침추출법, 감압고온추출법, 열탕추출법, 상온추출법, 분획추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 추출방법을 이용할 수 있고, 바람직하게 열수추출법을 사용하여 추출한 것일 수 있다. 또한, 필요에 따라 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 상업적으로 시판되는 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물을 사용할 수도 있다.
상기 열수추출법은 80 내지 140℃, 85 내지 135℃, 90 내지 130℃, 95 내지 125℃, 100 내지 120℃, 또는 105 내지 115℃로 수행하는 것일 수 있고, 일 구체예에서, 110℃로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 열수추출법은 3분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 1 내지 30분, 2 내지 30분, 3 내지 30분, 4 내지 30분, 5 내지 30분, 6 내지 30분, 7 내지 30분, 8 내지 30분, 9 내지 30분, 1 내지 25분, 2 내지 25분, 3 내지 25분, 4 내지 25분, 5 내지 25분, 6 내지 25분, 7 내지 25분, 8 내지 25분, 9 내지 25분, 1 내지 20분, 2 내지 20분, 3 내지 20분, 4 내지 20분, 5 내지 20분, 6 내지 20분, 7 내지 20분, 8 내지 20분, 9 내지 20분, 1 내지 15분, 2 내지 15분, 3 내지 15분, 4 내지 15분, 5 내지 15분, 6 내지 15분, 7 내지 15분, 8 내지 15분, 또는 9 내지 15분 동안 수행하는 것일 수 있고, 일 구체예에서, 10분 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서의 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다.
상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄 (Dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 상기 세포 배양용 배지 조성물에 25 g/L 이하의 농도, 구체적으로 23.6 g/L 이하의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 농도는 0.001 내지 25 g/L, 0.005 내지 25 g/L, 0.01 내지 25 g/L, 0.05 내지 25 g/L, 0.1 내지 25 g/L, 0.2 내지 25 g/L, 0.4 내지 25 g/L, 0.8 내지 25 g/L, 1 내지 25 g/L, 2 내지 25 g/L, 3 내지 25 g/L, 0.001 내지 23.6 g/L, 0.005 내지 23.6 g/L, 0.01 내지 23.6 g/L, 0.05 내지 23.6 g/L, 0.1 내지 23.6 g/L, 0.2 내지 23.6 g/L, 0.4 내지 23.6 g/L, 0.8 내지 23.6 g/L, 1 내지 23.6 g/L, 2 내지 23.6 g/L, 3 내지 23.6 g/L, 0.001 내지 22 g/L, 0.005 내지 22 g/L, 0.01 내지 22 g/L, 0.05 내지 22 g/L, 0.1 내지 22 g/L, 0.2 내지 22 g/L, 0.4 내지 22 g/L, 0.8 내지 22 g/L, 1 내지 22 g/L, 2 내지 22 g/L, 3 내지 22 g/L, 0.001 내지 20 g/L, 0.005 내지 20 g/L, 0.01 내지 20 g/L, 0.05 내지 20 g/L, 0.1 내지 20 g/L, 0.2 내지 20 g/L, 0.4 내지 20 g/L, 0.8 내지 20 g/L, 1 내지 20 g/L, 2 내지 20 g/L, 3 내지 20 g/L, 0.001 내지 15 g/L, 0.005 내지 15 g/L, 0.01 내지 15 g/L, 0.05 내지 15 g/L, 0.1 내지 15 g/L, 0.2 내지 15 g/L, 0.4 내지 15 g/L, 0.8 내지 15 g/L, 1 내지 15 g/L, 2 내지 15 g/L, 3 내지 15 g/L, 0.001 내지 12 g/L, 0.005 내지 12 g/L, 0.01 내지 12 g/L, 0.05 내지 12 g/L, 0.1 내지 12 g/L, 0.2 내지 12 g/L, 0.4 내지 12 g/L, 0.8 내지 12 g/L, 1 내지 12 g/L, 2 내지 12 g/L, 3 내지 12 g/L, 0.001 내지 11 g/L, 0.005 내지 11 g/L, 0.01 내지 11 g/L, 0.05 내지 11 g/L, 0.1 내지 11 g/L, 0.2 내지 11 g/L, 0.4 내지 11 g/L, 0.8 내지 11 g/L, 1 내지 11 g/L, 2 내지 11 g/L, 3 내지 11 g/L, 0.001 내지 10 g/L, 0.005 내지 10 g/L, 0.01 내지 10 g/L, 0.05 내지 10 g/L, 0.1 내지 10 g/L, 0.2 내지 10 g/L, 0.4 내지 10 g/L, 0.8 내지 10 g/L, 1 내지 10 g/L, 2 내지 10 g/L, 3 내지 10 g/L, 0.001 내지 8 g/L, 0.005 내지 8 g/L, 0.01 내지 8 g/L, 0.05 내지 8 g/L, 0.1 내지 8 g/L, 0.2 내지 8 g/L, 0.4 내지 8 g/L, 0.8 내지 8 g/L, 1 내지 8 g/L, 2 내지 8 g/L, 3 내지 8 g/L, 0.001 내지 5 g/L, 0.005 내지 5 g/L, 0.01 내지 5 g/L, 0.05 내지 5 g/L, 0.1 내지 5 g/L, 0.2 내지 5 g/L, 0.4 내지 5 g/L, 0.8 내지 5 g/L, 1 내지 5 g/L, 2 내지 5 g/L, 3 내지 5 g/L, 0.001 내지 4 g/L, 0.005 내지 4 g/L, 0.01 내지 4 g/L, 0.05 내지 4 g/L, 0.1 내지 4 g/L, 0.2 내지 4 g/L, 0.4 내지 4 g/L, 0.8 내지 4 g/L, 1 내지 4 g/L, 2 내지 4 g/L, 또는 3 내지 4 g/L일 수 있으며, 구체적으로 0.8 내지 4 g/L 일 수 있다.
상기 세포는 체세포, 배아세포, 생식세포, 줄기세포, 암세포, 세포주, 배양된 세포 (in vitro), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 배양 세포 (in vitro 및 ex vivo), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 진핵 유기체의 세포 또는 인간을 포함하는 포유류의 세포 (mammalian cell)일 수 있으며, 예를 들어 상기 세포는 암세포, 줄기세포, 혈관내피 세포, 백혈구, 면역 세포, 상피 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 골수 세포, 표피 세포, 골아세포, 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 진핵 유기체는 곤충, 양서류, 조류(닭, 칠면조, 오리 등) 또는 포유류(인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등)일 수 있다.
상기 세포는 개체 또는 진핵 유기체로부터 분리된 세포일 수 있다.
상기 세포는 미분화 세포, 분화 중인 세포, 또는 분화가 완료된 세포일 수 있으며, 구체적으로 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능 (pluripotency), 다분화능 (multipotency) 또는 단일분화능 (unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC) (착상 전 배아의 내세 포), 성체 줄기세포 (adult stem cell) (각 조직 및 장기에 존재하는 미분화된 세포) 및 역분화 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC) (체세포에 유전자 및/또는 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포, 또는 유도만능 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 근육, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다. 탯줄, 태반, 지방, 골수, 근육, 제대혈 또는 양수를 분리하는 것 및 이로부터 줄기세포를 수득하는 것은 통상의 해부학적 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 세포는 근육 세포 또는 근육 줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 닭(Chicken), 소(Bovine) 및 돼지(Porcine) 등의 가축으로부터 유래된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 소(Bovine) 또는 돼지(Porcine)로부터 유래된 근육 세포 또는 근육 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "근육 줄기세포(myogenic stem cell)"는 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가 재생산 능력 및 근육으로의 분화할 수 있는 능력을 모두 포함하는 근육줄기세포의 특성을 갖는 세포를 의미하며, 자가 재생산능력 또는 무한증식 능력 및 근육분화 능력을 보이는 세포라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 자가 재생산 능력 및 근육 분화능력은 마커로서 확인이 가능하다. 상기 근육 줄기세포는 근육 위성세포(satellite cells, SCs)와 혼용하여 사용될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물을 포함하는 배지 조성물은 근육 줄기세포에서 현저히 우수한 세포 증식 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 조성물은 혈청을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 혈청은 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 소아혈청(Bovine calf serum, BCS), 사람혈청(human serum) 및 말혈청(Horse serum, HS)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 소태아혈청일 수 있다.
상기 조성물은 혈청 및 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 혈청은 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물 대비 1000:1 내지 1:1 중량비(혈청: 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물)로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어 상기 혈청 및 클로렐라 추출물의 중 량비는 1000:1 내지 1:1, 800:1 내지 1:1, 600:1 내지 1:1, 500:1 내지 1:1, 400:1 내지 1:1, 350:1 내지 1:1, 300:1 내지 1:1, 250:1 내지 1:1, 200:1 내지 1:1, 150:1 내지 1:1, 100:1 내지 1:1, 50:1 내지 1:1, 40:1 내 지 1:1, 30:1 내지 1:1, 25:1 내지 1:1, 20:1 내지 1:1, 15:1 내지 1:1, 12.5:1 내지 1:1, 10:1 내지 1:1, 7.5:1 내지 1:1, 5:1 내지 1:1 또는 2.5:1 내지 1:1일 수 있다.
상기 배양 조성물은 세포의 계대배양이 가능하다.
본 명세서에서 용어, "계대"는 세포, 구체적으로 줄기세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법에서, 배양용기를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 의미한다. 한 차례 배양용기 교체 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대라고 한다. 본 발명에서 상기 계대는 세대와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "성장 (growth) 및 증식 (proliferation)"이란, 세포 수의 증가를 의미한다. 상기 배양은 미분화 증식인 것일 수 있다. 상기 미분화 증식 (undifferentiated proliferation)은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 분화능 (potency) 및 자기재생능 (selfrenewal)을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 용어 "분화 (differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분화는, 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화 (예를 들면, 핵 비율/세포질 비율)를 측정 하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
또한, 본 발명은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 배지 첨가제는 배지에 포함된 동물 혈청을 전부 또는 일부 대체할 수 있는 바, 상기 배지 첨가제가 함유된 세포 배양 배지는 일반적인 배양 배지(약 10% 혈청 함유) 보다 혈청 함유량이 감소될 수 있다. 또한, 상기 배지 첨가제가 포함된 저혈청 배양 배지는 10% 혈청 함유 배양 배지와 동등하거나 현저히 우수한 세포 성장률, 세포 생존률 및 계대 배양 효율을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법을 제공한다.
상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
상기 분리된 세포는 가축으로부터 분리된 세포일 수 있으며, 구체적으로, 소, 돼지 또는 닭 등의 가축으로부터 분리된 세포일 수 있다.
상기 세포 배양 방법은 배양육을 제조하기 위해 세포를 배양하는 방법일 수 있으며, 구체적으로, 배양육을 제조하기 위한 근육 줄기세포를 증식 배양하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법으로 배양된 세포, 구체적으로 근육 줄기세포를 이용하여 배양육을 제조할 수 있다.
상기 배양 형태는 당업계에 공지된 통상적인 2차원 또는 3차원적 배양일 수 있다. 다만, 세포와 세포간의 상호 작용에 의한 실제 생체조직과 유사한 조직의 구현을 위하여 3차원적 배양이 바람직할 수 있다. 3차원적 배양의 구체적인 예를 들면, 3D 다공성 스캐폴드, 세포 자체 또는 셀 시트 기술을 통한 비스캐폴드 형태(scaffold-free platforms), 마이크로칩 내에 세포를 배치하는 방법, 하이드로겔을 이용한 방법, 생물반응기를 이용한 방법이 있다.
또한, 본 발명은 동물 혈청을 대체하면서도 세포의 증식과 생존을 촉진할 수 있는 배지 첨가제로서의 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물의 용도를 제공한다.
본 출원의 용도에 있어서, 트라우스토키트리드 과 미세조류, 추출물, 배지 첨가제 등은 전술한 바와 같다.
본 발명의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과에 속하는 미세조류 바이오매스부터 추출한 추출물을 포함하는 배지에서 근육세포를 배양하는 경우, 소 근육세포의 세포 증식능이 향상됨을 확인하였는 바, 미세조류 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물은 세포 배양용 배지 성분 중 소태아혈청을 대체하여 사용할 수 있다. 나아가, 본 발명의 세포 배양용 조성물에 포함되는 미세조류 추출물은 발효 기반의 생산 과정을 거치기 때문에 기존 소태아혈청 생산 과정과 달리 다양한 윤리 문제 및 오염 문제에서 자유로우며, 보다 일정한 품질을 유지하면서 지속적으로 대량 생산이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 소 근육 줄기세포에 대한 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물의 세포 독성 및 세포 증식 효과를 나타낸 도면이다. 평균(N=3) ± 표준편차로 표시하였다.
도 2는 소 근육 줄기세포에 대한 다양한 농도의 FBS 및 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물을 포함하는 배양액의 세포 증식 효과를 나타낸 도면이다. 평균(N=3) ± 표준편차로 표시하였으며, 통계적 비교는 동일한 배양 기간동안 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물 없이 배양된 세포에 대해 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물을 포함하는 배지로 배양된 세포간에 이루어졌다. (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, 스튜던트 T검정)
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세조류 추출물의 수득
Thraustochytrid 과 미세조류에 속하는 Schizochytrium sp. 균주를 암배양한 뒤 건조하여 바이오매스를 확보하였다.
구체적으로, Schizochytrium sp. 균주는 멸균된 MJW01 배지 (Glucose 30 g/L, MgSO4·7H2O 3.0 g/L, Na2SO4 10 g/L, NaCl 1.0 g/L, 효모추출물 9.0 g/L, MSG·1H2O 1.0 g/L, NaNO3 1.0 g/L, KH2PO4 0.1 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, CaCl2 0.5 g/L, 비타민 혼합 용액 10 ml/L)가 들어있는 5 L 발효조에서 발효를 진행하였다. 균체 배양액은 배양액 상태 그대로 동결 건조하거나, 원심분리기를 통하여 탈수한 뒤 동결 건조하여 바이오매스를 확보하였다. 확보한 미세조류 바이오매스는 정제수에 1.5% 농도로 분산시킨 뒤, 110℃에서 10분간 가열하여 열수추출을 진행하였다. 추출액을 여과하여 잔여 부유물을 제거한 뒤 동결 건조하여 Thraustochytrid 미세조류 추출물을 수득하였다. 수득한 Thraustochytrid 미세조류 추출물의 건조 중량 대비 개별 아미노산 함량과 총 아미노산 함량을 측정하여 하기의 표 1에 나타내었다.
아미노산 종류 건조 중량 대비 아미노산 함량(%)
Asp 3.19
Thr 1.17
Ser 1.10
Glu 24.58
Gly 1.59
Ala 1.75
Cys 0.31
Val 1.92
Met 0.57
Ile 1.13
Leu 1.96
Tyr 0.91
Phe 1.25
Lys 1.91
His 0.64
Arg 7.45
Pro 0.74
총 아미노산 52.17
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 수득한 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)계 미세조류 추출물의 건조중량 대비 총 아미노산 함량은 52.17%로 확인되었으며, 글루탐산의 함량이 가장 높고, 알지닌(Arg), 아스파르트산(Asp) 순서로 아미노산 함량이 높음을 확인하였다.
실시예 2. 미세조류 추출물의 세포 독성 확인
트라우스토키트리드(Thraustochytrid)계 미세조류 추출물이 사태 및 등심에서 추출한 소 근육 줄기세포(Bovine muscle stem cells, bMuSC)에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 WST-8 검사를 수행하였다.
구체적으로, 계대 배양 횟수가 3 또는 5인 세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰 당 5,000개씩 시딩(seeding)하였다. 각 조건 별 3개 웰씩 시딩하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 하루동안 배양하였다. 이후 10% FBS 및 0.001 g/L 부터 40 g/L의 Thraustochytrid 추출물이 포함된 새 배양액으로 교체하여 3일간 배양한 뒤, 웰 당 5μL의 WST-8을 처리하고 3시간 추가 배양을 진행하였다. 세포의 대사활성도는 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도 (OD450) 측정을 통해 결정하였다. 세포없이 배양액만 있는 웰은 블랭크(blank) 대조군으로, Thraustochytrid 추출물 미처리 웰은 음성 대조군으로 사용하였으며, Thraustochytrid 추출물이 처리된 세포의 OD450 값을 비교하여 상대적인 세포 생존능을 비교하였다. 가장 높은 생존능을 보이는 Thraustochytrid 추출물의 농도를 Emax로 명명하였으며, Quest GraphTM IC50 calculator를 이용하여 세포 생존능이 음성 대조군의 50%인 CC50 값을 계산하였다. 본 실험을 통해 측정한 Thraustochytrid 추출물 농도에 따른 Cell viability 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, bMuSC의 세포 증식은 Thraustochytrid 추출물이 0.001~2 g/L 농도 범위로 포함된 경우에서 대조군과 유사한 수준이었다. Thraustochytrid 추출물이 4 g/L의 농도로 포함된 경우, 대조군 대비 115.8% 증가하여 실험에 사용한 농도 범위 내에서 가장 높은 Cell viability를 보였으며, 이에 따라 상기 4g/L의 농도가 Emax임을 확인하였다. 또한, CC50 값은 23.6 g/L로 확인되었다.
결론적으로, Thraustochytrid 추출물은 배양액에 4 g/L 농도 이하로 포함된 경우 세포에 대한 독성이 나타나지 않았으며, 특히 한우근육세포에서 (bMuSC)는 배양액에 상기 농도의 Thraustochytrid 추출물이 포함된 경우 세포 증식이 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 3. Thraustochytrid 추출물의 혈청대체효과 확인
Thraustochytrid 추출물의 혈청대체효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 배양액 내 소태아혈청 (FBS)이 감소된 배양 조건에서 상기 실시예 2에서 확인한 Emax 농도로 Thraustochytrid 추출물을 첨가하는 것이 bMuSC 세포에 어떠한 영향을 미치는지 WST-8 검사를 수행하였다. 계대배양횟수가 5, 6 또는 15인 소근육세포를 96-웰 배양 플레이트에 조건 별로 3개 웰씩, 웰 당 세포 5,000개씩 시딩하였다. 37℃, 5% CO2 조건에서 하루 배양한 뒤, 배양액 절반을 0% 내지 10% 농도의 FBS 및 0 g/L 내지 4 g/L 농도의 Thraustochytrid 추출물이 포함된 배양액으로 교체하였으며, 첨가된 FBS와 Thraustochytrid 추출물의 중량비는 하기 표 2와 같다.
FBS 농도 (%) Thraustochytrid 추출물 (g/L) Media 500mL 당 중량 (g) FBS: Thraustochytrid 추출물 중량비
FBS Thraustochytrid 추출물
0 0 0 0 -
2 1 -
4 2 -
1 0 5 0 -
2 1 5:1
4 2 2.5:1
2 0 10 0 -
2 1 10:1
4 2 5:1
5 0 25 0 -
2 1 25:1
4 2 12.5:1
10 0 50 0 -
2 1 50:1
4 2 25:1
세포가 새 배양액에 적응할 수 있도록 하루동안 배양을 진행하였으며, 이후 새로운 배양액으로 다시 한번 교체하여 교체 시점부터 3일, 6일이 되는 날에 WST-8 검사를 수행하였다. 3일, 6일차의 세포 증식은 측정된 OD450 값을 0일차에 측정된 OD450 값과 비교하여 결정하였으며, 측정된 결과를 도 2 및 하기 표 3에 나타내었다.
　 Thraustochytrid 추출물 (g/L) Cell viability (% of D0)
3일째 (D3) 6일째 (D6)
0% FBS 0 13.8 10.2
2 12.6 8.0
4 24.0 9.0
1% FBS 0 26.6 19.6
2 31.2 40.2
4 42.7 24.0
2% FBS 0 32.4 29.2
2 40.7 59.3
4 58.2 66.4
5% FBS 0 61.3 63.4
2 58.7 80.2
4 74.6 110.3
10% FBS 0 100.0 100.0
2 88.5 108.4
4 104.0 126.9
그 결과, 도 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, Thraustochytrid 추출물이 포함된 배지에서 bMuSC 세포를 배양한 경우, 세포 증식이 증가하는 것을 확인하였다. Thraustochytrid 추출물이 Emax 농도로 포함된 경우, 6일 배양 결과를 기준으로, 10% FBS 조건에서 Thraustochytrid 추출물 미처리 대조군 대비 세포 증식률이 26.9% 증가하였고, 5% FBS 조건에서는 74.0%, 2% FBS 조건에서는 127.4% 증가하였다. 5% FBS 조건에서는 10% FBS 대조군 대비 동등 이상 수준의 세포 증식을 보였다. 따라서, Thraustochytrid 추출물은 FBS를 대체하여 bMuSC 세포의 증식을 유도할 수 있음을 확인할 수 있으며, 구체적으로 Thraustochytrid 추출물이 Emax 농도인 4 g/L로 포함될 경우, 50% 내지 80%의 FBS 대체율을 보이는 것을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과 미세조류 추출물을 포함하는, 세포 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 23.6 g/L 이하의 농도로 포함된 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 0.4 g/L 내지 10 g/L 이하의 농도로 포함된 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류는 스키조키트리움(Schizochytrium) 속, 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) 속, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 울케니아(UIkenia) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물은 건조 중량 대비 총 아미노산 함량이 40% 이상인 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 근육 줄기세포 또는 근육 세포인 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 소(Bovine) 또는 돼지(Porcine) 유래 세포인 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈청을 추가로 포함하는 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 혈청은 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 소아혈청(Bovine calf serum, BCS), 사람혈청(human serum) 및 말혈청(Horse serum, HS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 혈청은 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물 대비 1000:1 내지 1:1 중량비 (혈청: 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물)로 포함된 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  11. 트라우스토키트리드 과 미세조류 추출물을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120055918A (ko) * 2010-11-24 2012-06-01 한국생명공학연구원 트라우스토키트리드계 미세조류를 이용한 섬유질계 바이오매스로부터 바이오오일의 제조방법
KR20180029249A (ko) * 2015-07-17 2018-03-20 페르망탈그 트라우스토키트리드의 단백질이 풍부한 바이오매스, 배양 방법 및 용도
US20210030024A1 (en) * 2018-09-21 2021-02-04 Heliae Development, Llc Compositions and methods for introduction of odd-chain fatty acids into poultry eggs
KR20220080593A (ko) * 2020-12-07 2022-06-14 씨제이제일제당 (주) 단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스
KR20220138345A (ko) * 2021-04-05 2022-10-12 주식회사 씨위드 클로렐라 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120055918A (ko) * 2010-11-24 2012-06-01 한국생명공학연구원 트라우스토키트리드계 미세조류를 이용한 섬유질계 바이오매스로부터 바이오오일의 제조방법
KR20180029249A (ko) * 2015-07-17 2018-03-20 페르망탈그 트라우스토키트리드의 단백질이 풍부한 바이오매스, 배양 방법 및 용도
US20210030024A1 (en) * 2018-09-21 2021-02-04 Heliae Development, Llc Compositions and methods for introduction of odd-chain fatty acids into poultry eggs
KR20220080593A (ko) * 2020-12-07 2022-06-14 씨제이제일제당 (주) 단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스
KR20220138345A (ko) * 2021-04-05 2022-10-12 주식회사 씨위드 클로렐라 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물

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