KR20180029249A - 트라우스토키트리드의 단백질이 풍부한 바이오매스, 배양 방법 및 용도 - Google Patents

트라우스토키트리드의 단백질이 풍부한 바이오매스, 배양 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류, 특히 트라우스토키트리드(thraustochytrid)의 배양에 관한 것이다. 본 발명은 트라우스토키트리드의 단백질이 풍부한 바이오매스, 상기 바이오매스를 수득하는 방법, 및 그것의 용도에 관한 것이다.

Description

트라우스토키트리드의 단백질이 풍부한 바이오매스, 배양 방법 및 용도
본 발명은 미세조류, 특히 트라우스토키트리드(thraustochytrid)의 배양에 관한 것이다. 본 발명은 단백질이 풍부한 트라우스토키트리드 바이오매스, 상기 바이오매스를 수득하는 공정 및 식품에서 그것의 용도를 목적으로 한다.
동물 및 인간에게 신진 대사에 필요한 아미노산을 제공하기 위해 인간 또는 동물이 직접적으로 또는 식이 보충제로 소비하는 식품에서 사용되는 식물 단백질들의 여러 공급원이 알려져있다. 일단 음식이 소비되면 이러한 단백질 공급원들은 동물 또는 인간에게 이용가능한 아미노산의 공급원으로 이용된다.
동물 사료에 사용되는 식물 단백질들의 가장 잘 알려진 공급원은 대두로서, 일반적으로 오일 추출 후 잔류하는 고체 잔류물인 대두박 형태이다. 그러나, 대두박의 사용은 그 기원과 관련하여 몇 가지 단점이 있다. 대두박은 일반적으로 집중적으로 대두를 경작하여 생물 다양성을 제공하는 다른 식물에 피해를 주게되는 국가에서 수입된다. 더욱이 많은 나라가, 대두박 중의 비-유전적 변형(non-GM) 대두와 혼합되는 것으로 발견되는, 유전적으로 변형된(GM) 대두 변이체의 경작을 장려하고, 이는 유전적 변형 유기체(GMO)-비함유 제품에 대한 수요 증가에 부응하지 못한다.
유전적으로 변형된 광합성 미생물로 구성된 바이오매스에 기초한 동물 사료는 WO 2010/051489에 공지되어 있다. GM 미생물에 의해 생산된 재조합 효소의 효과는 상기 바이오매스를 분해하여 동물 사료와 양립할 수 있게 하는 것이다.
식물 단백질의 다른 공급원은 인간의 식이 보충제로 이용되는, 특히 스피룰리나 및 클로렐라가 알려져 있다.
그러나, 스피룰리나는 클로렐라와 같이 생산성이 낮은 단점이 있으며, 이는 고수율의 발효조 배양을 방해한다. 그들의 배양이 통상적인 식이 보충제의 지역적이고 제한된 수요는 충족시킬 수 있더라도, 식이 단백질의 공급원에 대한 더 넓고 경제적으로 가능한 산업적인 생산 목표인, 동물 및 인간이 섭취하는 식품에서 대두와 같은 일반적인 공급원을 대체할 수 있도록 하는 품질로 달성되는 것에는 도움이 되지 않는다.
반대로, 발효조에서의 산업적 생산 능력이 알려진 원생생물은 DHA 또는 EPA와 같은 고도 불포화 지방산이 많은 지방을 생산하는데 오랫 동안 사용되어 왔다[예를 들어, 참조: WO 97/37032, WO 2015/004402 또는 WO 2012/175027]. 그러나, 지방 추출 후를 포함하여 수득된 바이오매스들은 적어도 값비싼 추가적인 단백질 농축 단계 없이는 식품에서 단백질 공급원으로 사용하기에 충분한 단백질 함량을 포함하지 않는다. 또한, 오일 추출에 사용되는 방법은 종종, 특히 소비를 부적합하게 하는 유기 용매로 잔류 바이오매스를 오염시킨다.
본 발명의 목적 중 하나는 동물 또는 인간의 소비를 위한 단백질의 신규 공급원을 제공하는 것이며, 이는 광범위하고 경제적으로 실행 가능한 산업적인 생산의 목표를 충족시키고, 대두와 같은 일반적인 공급원을 대체할 수 있는 품질을 제공한다.
본 발명은, 특정 배양 조건하에서, 고도 불포화 지방산(특히 DHA, EPA) 함량이 높은 오일의 생산에서 이용되는 것으로 알려진 트라우스토키트리드가, 다량의 단백질들을 생성할 수 있어, 특히 동물 사료에서 상기 단백질들을 대두와 비슷한 식이 단백질들의 공급원이 될 수 있도록 하는, 미생물이라는 것을 밝힌다.
따라서, 본 발명은 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로, 적어도 60% 초과, 실제 75% 초과의 단백질 범위일 수 있는, 적어도 35%의 단백질, 바람직하게는 적어도 45%의 단백질, 특히 45% 내지 75%의 단백질을 포함하는 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 바이오매스를 제1 목적으로 한다.
단백질의 중량 퍼센트는 단백질 자체 또는 상기 단백질에 함유된 아미노산을 기준으로 표현될 수 있다.
본 발명의 변형에 따라, 상기 바이오매스는 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더 바람직하게는 7% 미만의 지방을 추가로 포함할 수 있다.
우선적으로 본 발명에 따라, 상기 바이오매스는 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 적어도 35%의 단백질, 바람직하게는 적어도 45%의 단백질, 매우 바람직하게는 45% 내지 60%의 단백질 및 또한 건조 물질 중량 대비 중량으로 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 7% 미만의 지방을 포함할 수 있는 트라우스토키트리드 바이오매스이다.
본 발명은 또한 하기를 포함함을 특징으로 하는 상기 및 하기에 정의된 바와 같은 바이오매스를 제조하는 방법에 관한 것이다:
a. 적합한 배양 배지 중에서 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 적어도 35%의 단백질의 생산을 촉진할 수 있고, 선택적으로 건조 물질 중량과 비교한 중량으로 20% 미만으로 지방의 생산을 제한하는 조건 하에서, 적어도 40g/L 건조물질, 바람직하게는 적어도 60g/L, 더 바람직하게는 적어도 80g/L의 배양 밀도가 얻어질 때까지, 트라우스토키트리드를 배양하는 제1 단계;
b. 상기 바이오매스를 배양 배지로부터 분리(수거)함으로써 제1 단계에서 수득된 바이오매스를 회수하는 제2 단계; 및 필요한 경우
c. 제2 단계에서 회수된 바이오매스를 건조시키는 제3 단계.
본 발명은 또한 인간 또는 동물의 화장품 및 식품 분야 및 특히 상기 바이오매스를 포함하는 식품 분야에서 상기 또는 하기에 기재된 바이오매스의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 바이오매스에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 바이오매스를 포함하는, 인간 또는 동물을 위한 화장품 또는 약학적 조성물 및 인간 또는 동물을 위한 식품 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따라, "바이오매스"라는 용어는 유리하게는 상기의 원생생물을 배양함으로써 생성되고, 일정 수준의 본원에 기재된 단백질 및 선택적으로 지방산을 갖는 일단의 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 세포들을 지칭하며, 세포들은 그들의 물리적 통합을 유지하거나 유지하지 않을 수 있다.
따라서, 상기 바이오매스는 0% 내지 100% 범위의 소정량의 분해된 트라우스토키트리드 세포를 포함할 수 있다. "분해된"이란 용어는 상기 트라우스토키트리드 세포가 변형된 그들의 구조 및/또는 조성을 가질 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 건조 단계 또는 오일 수거 단계를 거칠 수 있으며, 중요한 것은 이들 세포를 포함하는 바이오매스가 본원에 기재된 단백질 및 선택적으로 지방산을 갖는다는 점이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따라, 바이오매스는 수거 중 또는 수거 후에 그것의 아미노산 조성을 변형시키는 처리를 거치지 않았다. 즉, 상기 바이오매스가 수거 후 거치는 처리는 그 아미노산 조성을 변화시키지 않는다. 특히, 바이오매스는 단백질 및/또는 아미노산의 농축 단계를 거치지 않았다. 즉, 본 발명에 따른 바이오매스에 포함된 단백질, 펩티드 및 아미노산은 오직 트라우스토키트리드의 배양으로부터만 유래한다. 트라우스토키트리드에 의해 생성되지 않는 단백질 또는 아미노산은 배양 배지에, 특히 효모 추출물을 포함하는 배지에서의 예비 배양의 경우에 존재하는 것일 수 있다. 바이오매스에 존재할 수 있는 이들 단백질의 잔류량은, 존재하더라도, 단백질 및/또는 아미노산의 농축단계를 거치지 않은 바이오매스의 정의에 포함되는, 탐지할 수 없는 미량으로 존재할 것이다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현 예에 따라, 바이오매스는 그의 아미노산 및 지방 조성을 변형시키는 처리를 거치지 않았다. 즉, 상기 바이오매스가 수거 후 거치는 처리는 그의 아미노산 및 지방 조성을 변형시키지 않는다. 특히, 지방에 대한 아미노산의 상대적 조성은 실질적으로 일정하게 유지된다.
특정한 경우, 본 발명에 따른 바이오매스의 비-분해된 트라우스토키트리드는 분해된 트라우스토키트리드에 비해 보존 및 소화성의 더 우수한 성질을 갖는다는 것이 관찰되었다. 본 발명의 바람직한 형태 중 하나는 실질적으로 우세한 양의 비-분해된 트라우스토키트리드를 포함하는 바이오매스이다.
본 발명에 따라, "분해된"이라는 용어는, 예를 들어 균질화 공정으로부터 생성된, 용해된 트라우스토키트리드와 같이 구조적 및/또는 화학적 통합성이 변형될 수 있는 트라우스토키트리드를 지칭한다.
그렇지만, 분명히, 바이오매스는 일단 생성되면, 조물질로서 사용되거나, 선택적으로 건조되거나, 또는 그의 사용에 필요한 임의의 처리, 특히 균질화 처리될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 바이오매스는 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 1% 내지 95%의 수분 함량을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 변형에 따라, 상기 바이오매스는 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 70% 내지 90%, 바람직하게는 80% 내지 85%의 수분 함량을 가질 수 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 제2 변형에 따라, 상기 바이오매스는 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 1% 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 7%의 수분 함량을 가질 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 트라우스토키트리드는 트라우스토키트리드 목에 속할 수 있고, 바람직하게는 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 아강에 속할 수 있고, 보다 바람직하게는 오란티오키트리움(Aurantiochytrium), 아플라노키트리움(Aplanochytrium), 보트료키트리움(Botryochytrium), 자포노키트리움(Japonochytrium), 오브론지키트리움(Oblongichytrium), 파리에티키트리움(Parietichytrium), 스키조키트리움(Schizochytrium), 시초이도키트리움(Sicyoidochytrium), 트라우스트키트리움(Thraustochytrium) 및 울케니아(Ulkenia)를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있는 속일 수 있다.
트라우스토키트리드는 매우 바람직하게는 비-유전적으로 변형된 미생물이다. GM 트라우스토키트리드가 사용되는 경우, 식품으로 사용하기 위해 바이오매스를 분해하거나 소화시키는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다.
유리하게, 상기 트라우스토키트리드는 아플라노키트리움 켈규렌즈(Aplanochytrium kerguelense); 아플라노키트리움 미누타(Aplanochytrium minuta); 아플라노키트리움 스트로치노이(Aplanochytrium stocchinoi); 아플라노키트리움종 PR24-1; 오란티오키트리눔 리마치움(Aplanochytrium limacinum); 오란티오키트리움 리마치눔 AB022107(Aplanochytrium limacinum AB022107); 오란티오키트리움 리마치움 HM042909; 오란티오키트리움 리마시눔 JN986842; 오란티오키트리움 리마시눔 SL1101 JN986842; 오란티오키트리움 맹그로베이(Aurantiochytrium mangrovei); 오란티오키트리움 맹그로베이 DQ323157; 오란티오키트리움 맹그로베이 DQ356659; 오란티오키트리움 맹그로베이 DQ367049; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/2; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/3; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/4; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/6; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/1; 오란티오키트리움 종 AB052555; 오란티오키트리움 AB073308; 오란티오키트리움 종 ATCC PRA276 DQ836628; 오란티오키트리움 종 BL10 FJ821477; 오란티오키트리움 종 LY 2012 PKU Mn5 JX847361; 오란티오키트리움 종 LY2012 JX847370; 오란티오키트리움 종 N1-27; 오란티오키트리움 종 SD116; 오란티오키트리움 종 SEK209 AB290574; 오란티오키트리움 종 SEK217 AB290572; 오란티오키트리움 종 SEK 218 AB290573; 오란티오키트리움 종 18W-13a; 보트료키트리움 라디아튬(Botryochytrium radiatum); 보트료키트리움 라디아튬 락후크마 16(Botryochytrium radiatum Raghukumar 16); 보트료키트리움 라디아튬 SEK353; 보트료키트리움 종; 보트료키트리움종 BUTRBC 143; 보트료키트리움 종 락후크마 29; 오브론지키트리움 미누튬(Oblongichytrium minutum); 오브론지키트리움 멀티루디먼탈리스(Oblongichytrium multirudimentalis); 오브론지키트리움종; 오브론지키트리움 종 SEK347; 파리에티키트리움 사카리아눔(Parieticytrium sarkarianum); 파리에티키트리움 사카리아눔 SEK351; 파리에티키트리움 사카리아눔 SEK364; 파리에티키트리움 종; 파리에티키트리움종 F3-1; 파리에티키트리움 종 H1-14; 파리에티키트리움 종 NBRC102984; 파이토프토라 인페스트란(Phytophthora infestans); 스키조키트리움 아그레가튬(Schizochytrium aggregatum DQ323159; 키조키트리움 아그레가튬 DQ356661; 스키조키트리움 아그레가튬; 스키조키트리움 리마시눔; 스키조키트리움 리마시눔 OUC166 HM042907; 스키조키트리움 맹그로베이; 스키조키트리움 맹그로베이 FB1; 스키조키트리움 맹그로베이 FB3; 스키조키트리움 맹그로베이 FB5; 스키조키트리움 minutum; 스키조키트리움 종 ATCC20888 DQ367050; 스키조키트리움 종 KGS2 KC297137; 스키조키트리움 종 SKA10 JQ248009; 스키조키트리움 종 ATCC 20111; 스키조키트리움 종 ATCC 20888; 스키조키트리움 종 ATCC 20111 DQ323158*; 스키조키트리움 종 ATCC 20888 DQ356660; 스키조키트리움 종 ATCC 20889; 스키조키트리움 종 ATCC 26185; 스키조키트리움 종 BR2.1.2; 스키조키트리움 종 BUCAAA 032; 스키조키트리움 종 BUCAAA 093; 스키조키트리움 종 BUCACD 152; 스키조키트리움 종 BUCARA 021; 스키조키트리움 종 BUCHAO 113; 스키조키트리움 종 BURABQ 133; 스키조키트리움 종 BURARM 801; 스키조키트리움 종 BURARM 802; 스키조키트리움 종 CCAP 4087/3; 스키조키트리움 종 CCAP 4087/1; 스키조키트리움 종 CCAP 4087/4; 스키조키트리움 종 CCAP 4087/5; 스키조키트리움 종 FJU-512; 스키조키트리움 종 KH105; 스키조키트리움 종 KK17-3; 스키조키트리움 종 KR-5; 스키조키트리움 종 PJ10.4; 스키조키트리움 종 SEK 210; 스키조키트리움 종 SEK 345; 스키조키트리움 종 SEK 346; 스키조키트리움 종 SR21; 스키조키트리움 종 TIO01; 시쵸이키트리움 미누튬 SEK354; 시쵸이키트리움 미누튬 NBRC 102975; 시쵸이키트리움 미누튬 NBRC 102979; 트라우스토키트리이대 종 BURABG162 DQ100295(Thraustochytriidae sp. BURABG162 DQ100295); 트라우스토키트리이대 종 CG9; 트라우스토키트리이대 종 LY2012 JX847378; 트라우스토키트리이대 종 MBIC11093 AB183664; 트라우스토키트리이대 종 NIOS1 AY705769; 트라우스토키트리이대 종 #32 DQ323161; 트라우스토키트리이대 종 #32 DQ356663; 트라우스토키트리이대 종 RT49 DQ323167; 트라우스토키트리이대 종 RT49 DQ356669; 트라우스토키트리이대 종 RT49; 트라우스토키트리이대 종 Thel2 DQ323162; 트라우스토키트리이대 종 Thel2; 트라우스트키트리움 아그레가튬; 트라우스트키트리움 아그레가튬 DQ356662; 트라우스트키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum); 트라우스트키트리움 아우레움 DQ356666; 트라우스트키트리움 개트너리움(Thraustochytrium gaertnerium); 트라우스트키트리움 키네이(Thraustochytrium kinnei); 트라우스트키트리움 키네이 DQ323165; 트라우스트키트리움 모티븀(Thraustochytrium motivum); 트라우스트키트리움 멀티루디멘테일(Thraustochytrium multirudimentale); 트라우스트키트리움 패키더멈(Thraustochytrium pachydermum); 트라우스트키트리움 로제움(Thraustochytrium roseum); 트라우스트키트리움 종 13A4.1; 트라우스트키트리움 종 ATCC 26185; 트라우스트키트리움 종 BL13; 트라우스트키트리움 종 BL14; 트라우스트키트리움 종 BL2; 트라우스트키트리움 종 BL3; 트라우스트키트리움 종 BL4; 트라우스트키트리움 종 BL5; 트라우스트키트리움 종 BL6; 트라우스트키트리움 종 BL7; 트라우스트키트리움 종 BL8; 트라우스트키트리움 종 BL9; 트라우스트키트리움 종 BP3.2.2; 트라우스트키트리움 종 BP3.3.3; 트라우스트키트리움 종 카우디보룸(Thraustochytrium sp. caudivorum); 트라우스트키트리움 종 CHN-1; 트라우스트키트리움 종 FJN-10; 트라우스트키트리움 종 HK1; 트라우스트키트리움 종 HK10; 트라우스트키트리움 종 HK5; 트라우스트키트리움 종 HK8; 트라우스트키트리움 종 HK8a; 트라우스트키트리움 종 KK17-3; 트라우스트키트리움 종 KL1; 트라우스트키트리움 종 KL2; 트라우스트키트리움 종 KL2a; 트라우스트키트리움 종 ONC-T18; 트라우스트키트리움 종 PJA10.2; 트라우스트키트리움 종 TR1.4; 트라우스트키트리움 종 TRR2; 트라우스트키트리움 스트리아튬(Thraustochytrium striatum); 트라우스트키트리움 스트리아튬 ATCC24473; 트라우스트키트리움 스트리아튬 DQ323163; 트라우스트키트리움 스트리아튬 DQ356665; 트라우스트키트리움 비서젠스(Thraustochytrium visurgense); 울케니아 아모에보이드 SEK 214(Ulkenia amoeboidea SEK 214); 울케니아 프로펀다(Ulkenia profunda); 울케니아 프로펀다 BUTRBG 111; 울케니아 종; 울케니아 종 ATCC 28207; 울케니아 비서제네시스(Ulkenia visurgensis); 울케니아 비서제네시스 BURAAA 141; 울케니아 비서제네시스 ATCC 28208 종들로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따라, 상기 트라우스토키트리드는 오란티오키트리움 및 스키조트리움 속들에서 선택될 수 있고, 바람직하게는
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/2(Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2),
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/3,
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/4,
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5,
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/6,
2013년 6월 21일 CCAP에서 기탁된 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/1,
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 스키조키트리움 종 CCAP 4087/3(Schizochytrium sp. 4087/3),
2012년 2월 28일 CCAP에서 기탁된 스키조키트리움 종 CCAP 4087/1,
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 스키조키트리움 종 CCAP 4087/4,
2014년 5월 20일 CCAP에서 기탁된 스키조키트리움 종 CCAP 4087/5 종 중에서 선택될 수 있다.
모든 기탁은 부다페스트 조약의 규정에 따라 CCAP(CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND PROTOZOA(CCAP), SAMS Research Services Ltd., Scottish Marine Institute, OBAN, Argyl PA37 1QA United Kingdom)에 이루어졌다.
본 발명의 바람직한 변형에 따라, 상기 바이오매스는
- 오란티오키트리움 및 스키조키트리움 속들에서 선택될 수 있는, 바람직하게는 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/2; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/3; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/4; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/6; 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/1; 스키조트리움 종 CCAP 4087/3; 스키조트리움 종 CCAP 4087/1; 스키조트리움 종 CCAP 4087/4; 스키조트리움 종 CCAP 4087/5 종들로부터 선택될 수 있는 트라우스토키트리드이고;
- 건조물질 중량과 비교한 중량으로 60% 초과, 실제 75% 초과의 단백질 범위일수 있는, 적어도 35%의 단백질, 바람직하게는 적어도 45%의 단백질, 특히 45% 내지 75%의 단백질 함량을 가지고;
- 건조물질 중량과 비교한 중량으로 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더 바람직하게는 7% 미만의 지방 함량을 가지고;
- 건조 전 70% 내지 90%, 바람직하게는 80% 내지 85%, 또는 건조 후 1% 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 7%의 수분 함량을 가지는 바이오매스일 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 전술한 바와 같은 바이오매스를 제조하는 방법을 목적으로 한다:
a. 적합한 배양 배지 중에서 건조 물질 중량과 비교한 중량으로, 60% 초과, 실제 75% 초과의 단백질 범위일 수 있는, 적어도 35%의 단백질, 바람직하게는 적어도 45%의 단백질, 특히 45% 내지 75%의 단백질 수준으로 단백질 생성을 촉진할 수 있고, 선택적으로 건조 물질 중량과 비교한 중량으로 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더 바람직하게는 7% 미만으로 지방의 생성을 제한하는 조건 하에서 적어도 40g/L 건조물질, 바람직하게는 적어도 60g/L, 더 바람직하게는 적어도 80g/L의 배양 밀도가 얻어질 때까지 트라우스토키트리드를 배양하는 제1 단계;
b. 상기 바이오매스를 배양 배지로부터 분리함으로써 제1 단계에서 얻어진 바이오매스를 회수하는 제2 단계; 및 필요한 경우
c.제2 단계에서 회수된 바이오매스를 건조시키는 제3 단계.
바람직하게는 트라우스토키트리드를 배양하는 제1 단계는 배양 배지 중에서 단백질의 생산을 촉진하고 지방의 생산을 제한하는데 적합한 조건하에서 수행된다.
본 발명에 따라, 상기 적합한 배양 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 인원(phosphorus source) 및 염을 포함하는 화학적으로 규정된 배양 배지이다.
본 발명에 따라, "화학적으로 규정된 배양 배지"라는 용어는 각 성분의 함량이 알려진 배양 배지를 의미한다. 정확하게, 본 발명은 풍부하거나 복잡한 유기 물질(rich or complex organic matter)을 포함하지 않는 배지에 관한 것이다. "풍부하거나 복잡한 유기물질"이라는 표현은 정화되지 않은 유기물질을 의미하며, 혼합물의 여러 구성성분의 정확한 조성과 농도를 정밀하게 알려지지 않았으며, 제어되지 않고, 하나의 배치에서 다른 배치로 상당한 변동성을 가질 수 있다. 풍부하거나 복잡한 유기물질의 예로서, 단백질 가수분해 산물인 효모 추출물 또는 펩톤에 의해 만들어질 수 있거나, 그들 각각의 구성성분의 고정적인 농도를 가지지 않는 해양 광물 염 또는 다른 복합적인 성장제(growth agent)와 같은 풍부한 광물질이 있을 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 규정된 배지는 칼슘, 코발트, 망간, 마그네슘, 아연, 니켈, 구리, 칼륨, 철 및 나트륨염, 및 이들의 혼합물로부터 선택된 염을 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 염은 염화칼슘, 염화코발트, 염화망간, 황화마그네슘, 황산아연, 황산니켈, 황산구리, 황산칼륨, 황산철, 몰리브덴산 나트륨, 아셀렌산 나트륨, 염화나트륨 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 변형 및 사용된 균주에 따라, 배지는, 특히 해양 기원의 특정 균주들을 위해, 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다.
이러한 변형에 따라, 염화나트륨을 포함할 수 있는 배양 배지를 허용할 수 있는 해양 균주의 예로서, 스키조키트리움 종, 특히 스키조키트리움 종 CCAP 4062/3의 균주가 언급될 수 있다.
본 발명의 또 다른 변형 및 사용되는 균주에 따라, 배지는 염화나트륨(NaCl)을 함유하지 않을 수 있으며, 적어도 3.5 g/L 미만, 바람직하게는 1 g/L 미만, 보다 바람직하게는 10 mg/L 미만의 나트륨 이온 및 1 g/L 미만, 바람직하게는 500 mg/L 미만, 보다 바람직하게는 200 mg/L의 염소 이온을 가지는, 매우 적은 양의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
이러한 변형에 따라, 염화나트륨(NaCl)을 포함하지 않을 수 있는, 적어도 매우 적은 양의 염화나트륨을 포함하는 배양 배지를 허용할 수 있는 균주의 예로서, 오란티오키트리움 맹그로베이 균주, 특히 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5 균주가 언급될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 규정된 배지의 탄소원은 하나 이상의 탄수화물, 하나 이상의 아세테이트, 하나 이상의 알콜, 하나 이상의 복합 분자, 또는 이들 공급원 중 적어도 2종의 임의의 비율을 가진 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 규정된 배지의 상기 질소원은 하나 이상의 질산염, 하나 이상의 글루탐산염, 하나 이상의 암모늄염, 요소, 암모니아, 또는 이들 공급원 중 적어도 2 종의 임의의 비율을 가진 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 규정된 배지의 인원은 인산, 인산염, 유리하게 인산수소나트륨(Na2HPO4), 또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 또는 인산이수소칼륨(KH2PO4), 또는 인산수소칼륨(K2HPO4), 또는 이들 중 적어도 2종의 임의의 비율을 가진 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 변형에 따라, 상기 배지는 염화마그네슘, 유리하게는 4수화물 형태(MgCl2ㆍ4H2O); 염화칼슘, 유리하게는 2수화물 형태(CaCl2ㆍ2H2O); 염화코발트 6수화물(CoCl2ㆍ6H2O); 염화망가니즈 4수화물(MnCl2ㆍ4H2O); 황화마그네슘 7수화물(MgSO4ㆍ7H2O); 황산아연 7수화물(ZnSO4ㆍ7H2O); 황산니켈 6수화물(NiSO4ㆍ6H2O); 황산구리 5수화물(CuSO4ㆍ5H2O); 황산칼륨(K2SO4); 황산철 7수화물(FeSO4ㆍ7H2O); 붕산(H3BO3); 에틸렌디아민테트라아세트산 2나트륨 2수화물(Na2EDTAㆍ2H2O); 몰리브덴산 나트륨 2수화물(Na2MoO4ㆍ2H2O); 아셀렌산 나트륨(Na2SeO3); 비타민으로서, 티아민, 코발아민 또는 비타민 B12, 판토텐산염 또는 비타민 B5; 탄소원; 질소원; 인원을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따라, 상기 배양 배지에서, 염화마그네슘은 0.008 내지 0.012 g/L, 유리하게 0.009 내지 0.011 g/L; 염화칼슘은 0.40 내지 0.70 g/L, 유리하게 0.50 내지 0.60 g/L; 염화코발트 6수화물은 0.00008 내지 0.00013 g/L, 유리하게 0.00009 내지 0.00012 g/L; 염화망가니즈(II) 4수화물은 0.008 내지 0.013 g/L, 유리하게 0.009 내지 0.012 g/L; 황화마그네슘 7수화물은 6 내지 10 g/L, 유리하게 7 내지 9 g/L; 황산아연 7수화물은 0.008 내지 0.013 g/L, 유리하게 0.009 내지 0.012 g/L; 황산니켈 6수화물은 0.004 내지 0.007 g/L, 유리하게 0.005 내지 0.006 g/L; 황산구리 5수화물은 0.005 내지 0.009 g/L, 유리하게 0.006 내지 0.008 g/L; 황산칼륨은 0.5 내지 3.5 g/L, 유리하게 1 내지 3 g/L; 황산철 7수화물은 0.03 내지 0.05 g/L, 유리하게 0.035 내지 0.045 g/L; 붕산은 0.0155 내지 0.0195 g/L, 유리하게 0.0165 내지 0.0185 g/L; 디나트륨염 디하이드레이트 형태의 에틸렌디아민사아세트산은 0.10 내지 0.14 g/L, 유리하게 0.11 내지 0.13 g/L; 몰리브덴산 나트륨 2수화물은 0.00001 내지 0.0003 g/L, 유리하게 0.00005 내지 0.0002 g/L; 아셀렌산 나트륨은 0.00000015 내지 0.000019 g/L, 유리하게 0.00000016 내지 0.00000018 g/L; 티아민은 0.015 내지 0.05 g/L, 유리하게 0.025 내지 0.04 g/L; 코발아민 또는 비타민 B12는 0.0004 내지 0.00065 g/L, 유리하게 0.00045 내지 0.00060 g/L; 판토텐산염 또는 비타민 B5는 0.008 내지 0.013 g/L, 유리하게 0.009 내지 0.012 g/L; 탄소원은 45 내지 65 g/L, 유리하게 50 내지 60 g/L; 질소원은 7 내지 11 g/L, 유리하게 8 내지 10 g/L; 인원은 2 내지 6 g/L, 유리하게 3 내지 5 g/L의 농도가 될 수 있다.
매우 바람직하게 본 발명에 따라, 상기 배양 배지에서, 염화마그네슘은 0.0108 g/L의 농도이고; 염화칼슘은 0.55 g/L의 농도이고; 염화코발트 6수화물(CoCl2ㆍ6H2O)은 0.000108 g/L의 농도이고; 염화망가니즈(II) 4수화물은 0.0108 g/L의 농도이고; 황화마그네슘 7수화물 8.01 g/L의 농도이고; 황산아연 7수화물은 0.0108 g/L의 농도이고; 황산니켈 6수화물은 0.0056 g/L의 농도이고; 황산구리 5수화물은 0.0072 g/L의 농도이고; 황산칼륨은 2.09 g/L의 농도이고; 황산철 7수화물은 0.04 g/L의 농도이고; 붕산은 0.0155 내지 0.0195 g/L에 포함된 0.0175 g/L의 농도이고; 디나트륨염 디하이드레이트 형태의 에틸렌디아민사아세트산은 0.12 g/L의 농도이고; 몰리브덴산 나트륨 2수화물은 0.000108 g/L의 농도이고; 아셀렌산 나트륨은 0.000000173 g/L의 농도이고; 티아민은 0.032 g/L의 농도이고; 코발아민 또는 비타민 B12는 0.00052 g/L의 농도이고; 판토텐산염 또는 비타민 B5는 0.0108 g/L의 농도이고; 탄소원은 55 g/L의 농도이고; 질소원은 9 g/L의 농도이고; 인원은 4 g/L의 농도이다.
본 발명에 따라, 제조방법의 제1 배양 단계 a)는 소위 "배치(batch)" 불연속 모드, 소위 "유가식(fed batch)" 반연속모드 또는 연속모드에서 수행될 수 있다.
본 발명의 특정한 구현 예에 따라, 제1 단계는 2개의 하위 단계로 나눠지고, 적합한 배양 배지에서의 제1 성장 하위 단계 a1)에 이어, 제2 생산 하위 단계 a2)에서는 배양 배지 중 성장을 제한하지 않는 질소 및 인 수준을 일정하게 유지하기 위해 하나 이상의 탄소원, 질소원 및/또는 인원 농축 용액이 배양 배지에 동시에 또는 연속적으로 첨가될 수 있다.
바람직한 구현 예에 따라, 성장 하위 단계 a1)는 탄소원, 보다 특히 글루코스의 농도가 20 g/L 미만으로 얻어질 때까지 수행된다.
또 다른 구현 예에 따라, 성장 하위 단계 a1)는 배양밀도가 적어도 20 g/L, 바람직하게 적어도 40 g/L, 더 바람직하게 적어도 60 g/L, 보다 더 바람직하게 적어도 80 g/L으로 얻어질 때까지 수행된다.
단계 a2)에서, 비-제한적 질소원의 수준은 유리하게 0.5 내지 5 g/L, 바람직하게 0.5 내지 2 g/L이고, 비-제한적 인원의 수준은 유리하게 0.5 내지 5 g/L, 바람직하게 0.5 내지 2 g/L이다. 이러한 단계 a)에서 요구되는 탄소원의 함량은 0 내지 200 g/L, 특히 5 또는 10 내지 50 g/L일 수 있다. 바람직하게는, 하위 단계 a2)에서 탄소원의 함량은 0 내지 50 g/L, 보다 바람직하게 0 내지 10 g/L이다.
바람직하게, 상기 정의된 바와 같이 두 개의 하위-단계 a1) 및 a2)로 나눠지는 제1 단계 a)는 소위 "유가식" 반연속 모드에서 수행될 수 있다.
20 g/L 초과의 밀도, 및 특히 80 g/L 초과의 밀도로, 트라우스토키트리드의 성장을 가능하게 하는 적합한 방법과 배양 배지는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따라, 배양은 임의의 공지된 배양 기술로, 예를 들면 플라스크 또는 반응기에서, 또한 발효조에서 또는 상기 기술이 요구되는 배양 조건을 수행하는 것을 가능하게 하는 경우에 한하여, 발효조 또는 원생식물, 특히 트라우스토키트리드를 성장시키기에 적합한, 예를 들면 "레이스웨이(raceway)" 유형의 대야(basin)와 같은 용기에서 수행될 수 있다.
바람직하게, 배양은 발효조에서 원생생물을 배양하는 알려진 방법에 따라 발효조에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 바이오매스를 회수하는 제조방법의 제2 단계 b)는 요구되는 수분 함량을 가질 수 있는 바이오매스를 수득하기 위한 적절한 조건에서 수행될 수 있다.
상기한 원생생물의 회수는 바이오매스의 회수를 허용하는 임의의 기술, 특히 여과, 중량법 또는 감압 하 원심 분리법, 경사 분리법, 또는 심지어 침전법에 이은 중량 여과방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기된 모든 변형의 본 발명에 따른 제조방법에 따라 수득될 수 있는 바이오매스를 목적으로 한다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물의 화장품, 제약 또는 식품 분야에서의 상기된 바이오매스의 용도를 목적으로 한다.
특히 본 발명은 동물의 수행능력 향상을 위한 상기 및 하기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 트라우스토키트리드 바이오매스의 용도에 관한 것이다. 수행능력의 개선은, 특히, 소모, 체중 증가 또는 사료 전환 비율을 측정함으로써 평가될 수 있다.
동물 사육에서, 가축 사육, 특히 집약적인 가축 사육은 가정에서 사육되는 동물(domestic animal) 또는 애완동물 또는 수족관 어류 또는 조류 또는 새장의 새와 같은 소위 "여가" 동물의 사육과 구분이 된다.
"가축"이라는 용어는 특히 방목가축(특히 육류, 우유, 치즈 및 가죽을 위해 길러진 소; 육류, 양모 및 치즈를 위해 길러진 양; 염소), 돼지, 토끼, 가금류(닭, 암탉, 칠면조, 오리, 거위 등), 말과 동물(조랑말, 말, 망아지), 인간의 활동(수송, 여가) 및 먹이를 지원하기 위한 동물들, 수생 동물(예를 들어, 물고기, 새우, 굴 및 홍합)을 지칭한다. 그러나, 치어 단계까지의 물고기의 먹이주기는 의도된 사료 및 사료의 조성물을 포함하여 양식된(raised) 물고기의 먹이주기와 구분될 수 있다.
포유류, 반추동물을 포함하거나 포함하지 않는 가정에서 사육되는 동물, 애완동물 및 여가 동물은 조류 및 어류와 구분이 될 것이다. 그들은 특히 개와 고양이를 포함한다.
본 발명은 또한 상기된 본 발명에 따른 바이오매스를 포함할 수 있는 인간 또는 동물을 위한 식품 또는 식품 조성물을 목적으로 한다. "식품"이라는 용어는 인간 또는 동물, 특히 가축을 위한 식품에 사용될 수 있는 모든 조성물을 지칭한다.
본 발명에 따라, 식품은 선택적으로 건조되고, 선택적으로 변형된 바이오매스만을 포함할 수 있거나, 선택적으로 건조되고, 선택적으로 변형되고, 인간 또는 동물의 섭취를 위한 식품 분야에서 사용되는 임의의 다른 첨가제, 담체 또는 지지체, 예를 들어, 식품보존제, 염료, 풍미 증강제, pH 조절제, 또는 성장호르몬, 항생제와 같은 약학적 첨가제와 혼합된 바이오매스를 포함할 수 있다.
본 발명은 특히 동물, 보다 특히 가축을 위한 사료에 관한 것이다. 이들 사료는 전형적으로 본 발명에 따른 바이오매스가 혼입되는 가루, 펠렛 또는 슬로프(slop)의 형태로 나타난다. "사료"라는 용어는 동물을 사육하는데 사용될 수 있는 모든 것을 지칭한다.
집중적인 동물 사육 시설의 경우, 사료는 조류 바이오매스 외에도 영양 베이스 및 영양 첨가제를 포함할 수 있다. 따라서, 동물사료 배급의 필수적인 부분은 "영양 베이스"와 조류 바이오매스로 구성된다. 이러한 베이스는, 예를 들어, 곡물, 동물 및/또는 식물 기원의 단백질 및 지방의 혼합물로 구성된다.
동물을 위한 영양 베이스는 이들 동물사료에 적용되고, 당업자에게 잘 알려져있다. 본 발명과 관련하여, 이들 영양 베이스는 예를 들어, 옥수수, 밀, 완두콩, 대두를 포함한다. 이들 영양 베이스는 다양한 동물 종의 필요에 맞게 적용된다. 이들 영양 베이스는 비타민, 무기염 및 아미노산과 같은 영양 첨가제를 이미 포함할 수 있다.
동물 사료에 사용되는 첨가제는 사료의 특정한 특성을 개선하기 위해, 예를 들어 그의 풍미를 향상시키거나, 사료 원료를 동물이 더 소화 가능하도록 만들거나 또는 동물을 보호하기 위해 첨가될 수 있다. 이들은 자주 대규모의 집중적인 사육 시설에서 사용된다.
동물사료에서 사용되는 첨가제는 특히 다음과 같은 하위 범주로 나눠질 수 있다(출처: EFSA):
- 기술적인 첨가제: 예를 들어, 방부제, 항산화제, 유화제, 안정화제, 산도 조절제 및 사일리지 첨가제,
- 감각 첨가제(sensory additive): 예를 들어, 향료, 염료,
- 영양 첨가제: 예를 들어, 비타민, 아미노산 및 미량 원소;
- 축산 첨가제(zootechnical additive): 예를 들어, 소화력 향상제, 장내 세균총 안정화제;
- 콕시디아 성장 억제제(coccidiostat) 및 히스토모노스타트(histomonostat)(살충제).
한 구현 예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득된 건조된 바이오매스 1% 내지 60%, 바람직하게 1% 내지 20%, 상당히 바람직하게 3% 내지 8%를 포함하는 가축 사료에 관한 것이다.
또 다른 구현 예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득된 건조되지 않은 바이오매스 1% 내지 40%, 바람직하게 5% 내지 10%를 포함하는 가축 사료에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현 예에 따라, 사료는 가축, 특히 소, 양, 돼지, 토끼, 가금류 및 말을 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현 예에 따라, 사료는 수생 동물, 특히 적어도 치어 단계까지, 실제로 양식 어류를 포함하는 어류를 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현 예에 따라, 사료는 가정에서 사육되는 동물, 애완동물 및/또는 여가 동물을 위한 것이다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 구현 예에 따라, 식품 조성물은 인간을 위한 것이다.
본 발명은 또한 상기된 본 발명에 따른 바이오매스를 포함하는 인간 또는 동물을 위한 화장품 또는 약학적 조성물을 목적으로 한다.
본 발명에 따라, 화장품 또는 약학적 조성물은 선택적으로 건조되고, 선택적으로 변형된 바이오매스만을 포함할 수 있거나, 선택적으로 건조되고 선택적으로 변형되며, 방부제, 염료, pH 조절제와 같은 화장품 또는 제약 분야에서 사용되는 임의의 다른 첨가제, 담체 또는 지지체와 혼합된 바이오매스를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 영양실조의 예방 및 치료뿐만 아니라 치료법에서 상기에 기재된 바이오매스의 용도에 관한 것이다.
도 1: 23일령 닭에서 겉보기(apparent) 대사가능 에너지(AME) 측정의 실험적 설계;(시험 14ALG069)
도 2: 병아리(7일령 및 9일령)에서 선택 및 소비 검사의 실험적 설계;(시험 14ALG081)
도 3: 선택 조건(옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료)에서 7일령의 사료 소비량 측정(시험 14ALG081)
도 4: 선택 조건(옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료)에서 9일령의 사료 소비량 측정(시험 14ALG081)
도 5: 선택 조건(옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료)에서 2가지 시험(7일 및 9일)에 대한 평균의 상대적인 사료 소비의 측정(시험 14ALG081)
도 6: 대조군 옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료를 먹인 0 내지 7일령 병아리에서 성장 수행능력의 측정(소비, 체중 증가, 사료 전환 비율)(선택 조건 하에서가 아님)(시험 14ALG081)
도 7: 대조군 옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료를 먹인 0 내지 9일령 병아리에서 성장 수행능력의 측정(소비, 체중 증가, 사료 전환 비율)(선택 조건 하에서가 아님)(시험 14ALG081)
본 발명의 다른 양상 및 특징은 하기 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해질 것이다.
ㆍ 도 1은 23일령 닭의 겉보기 대사가능 에너지(apparent metabolizable energy:AME) 측정의 실험적 설계를 보여준다; (시험 14ALG069). 약 300마리의 1일령 수컷 병아리(ROSS PM3)를 동일한 저밀도 밀폐용기에 넣었고, 밀, 옥수수, 대두박을 포함한 표준 스타터(starter)를 공급하였다. 13일령 닭의 무게를 재고 체중 그룹으로 분류되기 전에 2시간 동안 굶주리게 했다. 따라서 120마리의 닭을 고르고, 각각의 대사 케이지(metabolic cage)에 넣었고, 그들의 무게에 따라 실험적 처리 중 하나에 할당되었다(식단당 20회 반복).
시험 동안 사료 및 물은 자유롭게(ad libitum) 분배된다. 실험 피드는 3.2mm 직경의 펠릿으로 제공된다. 식단과 대사 케이지에 적응하는 7일의 기간 후에, 17시간의 단식기간이 있는 총 배설물 수집기간은 20일에서 23일까지 3일 동안 수행되었다. 배설물은 매일 개별적으로 수집되고, 합쳐지고 -20°C 에서 보관된다. 시험이 끝나면, 수집된 배설물들은 동결 건조된 후 수분 흡수 단계(48시간)에서 실온에서 방치하여 중량 측정, 분쇄(0.5 nm) 및 분석하기 전에 수분 함량을 안정화시킨다.
ㆍ 도 2는 병아리(7일령 및 9일령)의 선택 및 소비 검사의 실험적 설계를 보여준다;(시험 14ALG081). 두개의 실험적 검사는 동시에 행해진다.
1) 시험 1 - 선택 시험: 사료 선택의 검사를 위해, 약 200마리의 1일령 병아리(Ross PM3)는 약 20마리씩 그룹 지어 개별적인 대사케이지에 넣었고, 밀, 옥수수, 대두박을 함유한 표준 스타터를 공급하였다. 6일령 닭의 무게를 재고 체중 그룹으로 분류되기 전에 2시간 동안 굶기게 했다. 따라서 120마리의 닭을 고르고, 4개의 그룹으로 나누어 30개의 분리된 대사케이지에 넣고, 7일째에 그들의 무게에 따라 실험적 처리 중 하나에 할당하였다(처리 당 10회 반복). 각 케이지는 다음과 같은 3가지 실험적 처리에 해당하는 서로 다른 사료를 포함하는 2개의 다른 사료 접시를 포함한다:
o 처리 1: 옥수수-대두 스타터(사료 접시 1) 및 5% 미세조류(사료 접시 2)
o 처리 2: 옥수수-대두 스타터(사료 접시 1) 및 10% 미세조류(사료 접시 2)
o 처리 3: 옥수수-대두 스타터(사료 접시 1) 및 15% 미세조류(사료 접시 2)
시험 동안 사료와 물은 자유롭게 분배된다. 실험용 사료를 3.2-mm-직경 펠렛형태로 공급한다. 소비는 7일령 및 9일령에 매 시간마다 케이지의 사료 접시를 교체하면서 T0+1h, T0+2h, T0+3h, T0+4h 및 T0+6h에 측정된다. 두개의 소비 측정 사이에(8일), 동물은 밀-옥수수-대두 스타터를 공급받는다.
2) 시험 2 - 소비 측정: 제2 검사에서, 병아리는 선택적으로 미세조류로 보충된 한가지 유형의 사료에만 접근한다(도 6). 약 400마리의 1일령 수컷 병아리(로스 PM3)가 무게를 재고 체중 그룹으로 분류되었다. 240마리의 선택된 동물은 실험용 사료가 있는 각 케이지당 하나의 사료 접시와 함께 동일한 중량(4개의 케이지의 15개의 블록) 블록의 60개의 나눠지지 않은 케이지에서 1일에 4 그룹으로 배치하였다(사료당 15회 반복). 각 케이지에서, 4마리의 병아리는 각각으로 식별된다. 검사 동안 사료와 물은 자유롭게 분배된다. 실험용 사료는 0%, 5%, 10% 또는 15% 미세조류로 보충된, 또한 검사 1의 사료의 선택으로 사용된 옥수수-대두 스타터이다. 개별적인 생체중은 1, 7 및 9일령에 측정된다. 먹지 않은 사료는 무게를 재고 케이지당 소비는 7일령 및 9일령에 측정된다. 0 내지 7일령에, 대조군 및 다른 두개의 보충적인 식단과 비교하였을 때 10% 미세조류를 포함한 사료를 먹인 동물은 체중 증가가 상당히 개선되었다.
ㆍ 도 3은 선택 조건(옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료)에서 7일령의 사료 소비량 측정을 보여준다(시험 14ALG081);
ㆍ 도 4는 선택 조건(옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료)에서 9일령의 사료 소비량 측정을 보여준다(시험 14ALG081);
ㆍ 도 5는 선택 조건(옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료)에서 2가지 시험(7일 및 9일)에 대한 평균의 상대적인 음식 소비의 측정을 보여준다(시험 14ALG081);
ㆍ 도 6은 대조군 옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료를 먹인 0 내지 7일령 병아리의 성장 수행능력의 측정(소비, 체중 증가, 사료 전환 비율)을 보여준다(선택 조건 하에서가 아님)(시험 14ALG081);
ㆍ 도 7은 대조군 옥수수-대두 사료 대 5%, 10% 및 15%의 시험된 미세조류로 대체된 사료를 먹인 0 내지 9일령 병아리의 성장 수행능력의 측정(소비, 체중 증가, 사료 전환 비율)을 보여준다(선택 조건 하에서가 아님)(시험 14ALG081).
실시예 1 - 균주 배양
균주 예비배양:
오란티오키트리움 맹그로베이(Aurantiochytrium mangrovei) 예비배양물은 질소원으로서 효모 추출물 4 g 및 탄소원으로서 글루코스 30 g을 포함하는 예비배양 배지에서, 온도 조절식 용기(26°C)에서, 쉐이커 테이블(140 rpm)에서 준비된다. 48시간 동안 배양한 후 세포를 3000 g에서 5분간 원심분리하고 세포 펠렛을 효모 추출물이나 무기 또는 유기 질소의 어떠한 공급원도 포함하지 않는 예비배양 배지로 세척한다. 이 작업의 목적은 효모 추출물의 첨가를 통해 주 배양물에 Na+ 가 공급되는 것을 방지하기 위함이다. 예비배양물은 주 용액의 배양 부피의 1/100(v/v)에 해당한다. 스키조키트리움 종 CCAP 4062/3(Schizochytrium sp. CCAP 4062/3) 균주의 경우에는 27 g/L의 NaCl을 이 배지에 첨가한다.
배양 모니터링:
전체 바이오매스 농도는 건조질량을 측정하여 모니터링 한다(GF/F 필터(Whatman)에서 여과한 후 중량 측정 전 적어도 24시간 동안 105°C에서 오븐 건조).
총 지질 및 FAME 함량의 분석은 문헌에 고전적으로 기재된 방법에 따라 수행된다(Folch et al., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Folch J. et al., J Biol Chem. 1957 May;226(1):497-509.; Yokoyama et al., Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. Nov.; Mycoscience, 2007 Vol. 48, pp. 199-211).
실시예 1.1(비교)
오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5 배양은 컴퓨터 제어 자동화 시스템과 함께 사용하기 위해 1 L 내지 2 L 발효조(생물반응기)에서 준비된다.
배양 배지 및 첨가 용액의 조성은 다음과 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
시스템은 염기(NaOH 또는 KOH) 및/또는 산(황산 용액)를 첨가하여 pH 6으로 조절된다. 배양 온도는 26°C로 설정되었다. 용해된 산소 압력은 배양 동안 진탕 속도(250-1200 rpm), 송풍량(0.25-1 vvm), 또는 산소 유량(0.1-0.5 vvm)에 의해 배지에서 조절되었다. 컨트롤러로 통합되는 조절 매개변수는 5% 내지 30%의 일정한 pO2 를 유지할 수 있도록 했다. 배양 시간은 20 내지 100시간, 바람직하게 25 내지 96시간, 예를 들어 50시간이었다.
배양 동안, 첨가 용액 2의 첨가뿐만 아니라 첨가 용액 1의 3가지 첨가는 200 mM 내지 500 mM로 글루코스 농도를 유지하기 위해 수행되었다.
실시예 1.2(본 발명)
오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5 배양은 실시예 1.1에서 필수적으로 기재한 바와 같이 발효조에서 준비된다.
본 과정은, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에 의한 pH 조절과 관련된, 동물 사료의 개발과 관련하여 문제를 야기할 수 있는 Na+ 또는 K+ 의 대량 공급을 피하기 위해, 암모니아(NH4OH)를 첨가함으로써 pH 조절 관점에서 수정된다. 세포를 배양하기 위해 필수적인 질소의 일부는 암모니아(NH4OH)에 의한 pH 조절을 통해 공급된다.
이 실시예에서 사용된 배지는 하기 표 1에 기술한다. 실시예 1.1에서 기재된 배지와 달리, 화학적으로 규정된 배지는 영양적인 제한 없이 배양 동안 성장을 유지할 수 있도록 한다.
농도(g/L)
염화마그네슘 1.08·10-2
염화칼슘 0.55
염화코발트 6수화물(CoCl6H2O) 1.08?10-4
염화망가니즈(II) 4수화물 1.08·10-2
황화마그네슘 7수화물 8.01
황산아연 7수화물 1.08·10-2
황산니켈 6수화물 5.60·10-3
황산구리 5수화물 7.20·10-3
황산칼륨 2.09
황산철 7수화물 4.00·10-2
붕산 1.75·10-2
에틸렌디아민테트라아세트산 2나트륨 2수화물 0.12
몰리브덴산 나트륨 2수화물 1.08·10-4
아셀렌산 나트륨 1.73·10-7
티아민 3.20·10-2
코발아민 또는비타민 B12 5.20·10-4
판토텐산염 또는 비타민 B5 1.08·10-2
글루코스(탄소원) 55.00
황산암모늄(질소원) 9.00
인산이수소칼륨(인원) 4.00
소포제(Defoamer) 0.40
물리화학적 매개변수는 배양 동안에 통합된 조절기를 사용하여 최대 진탕 및 송풍량 값이 될 때까지 pH는 5 부근으로 유지되고, 온도는 30°C로 설정되고, pO2 는 30% 부근으로 유지된다.
배양 동안, 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 첨가 배지의 첨가는 배양 배지의 글루코스의 농도를 20 g/L 내지 50 g/L로 유지하기 위해 수행된다.
글루코스(탄소원) 688 g/L
황산암모늄(질소원) 76 g/L
인산이수소칼륨(인원) 39 g/L
실시예 1.3(본 발명)
오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5 배양은 실시예 1.1에 필수적으로 기재한 배양 조건 하에서 발효조에서 준비된다.
본 과정은 배지 및 이의 첨가 모드의 관점에서 수정된다.
배양은 하기 표 3에 나타난 배지에서 배치 모드로 시작된다.
화합물 배지의 초기 농도
글루코스
+ 해염
글루코스·1H2O 55.000 g/L
해염 15.000 g/L



무기염



MgSO7H2O 1.683 g/L
K2SO4 2.080 g/L
KH2PO4 4.000 g/L
MnCl4H2O 10.800 mg/L
ZnSO7H2O 1.080 mg/L
CoCl6H2O 0.011 mg/L
Na2MoO2H2O 0·108 mg/L
CuSO5H2O 0.720 mg/L
NiSO6H2O 0.560 mg/L
FeSO7H2O 40.000 mg/L
비타민 티아민 32.000 mg/L
비타민 B12 0.520 mg/L
판토텐산염 10.800 mg/L
질소 (NH4)2SO4 9.000 g/L
EDTA Na2EDTA 0.096 g/L
지속적인 배양 모드는 바이오매스가 배지에서 20 g/L가 되면 시작된다. 지속적으로 공급되는 사료 용액은 하기 표 4에 기술된다.
화합물 사료 용액(g/L)
글루코스·H2O 110.000
해염 15.000
MgSO7H2O 4.959
K2SO4 6.129
KH2PO4 11.786
MnCl4H2O 3.182·10-2
ZnSO7H2O 3.182·10-2
CoCl6H2O 3.2·10-4
Na2MoO2H2O 3.200·10-4
CuSO5H2O 2.121·10-2
NiSO6H2O 1.650·10-2
FeSO7H2O 1.179·10-1
티아민 9.429·10-2
비타민 12 1.530·10-3
판토텐산염 3.182·10-2
(NH4)2SO4 26.518
EDTA 4.092·10-1
예비 시험은 사용된 희석 속도가 바이오매스의 단백질 함량에 직접 영향을 미친다는 것을 보여 주었다(결과는 나타나지 않음). 이 실시예에서, 사용된 희석 속도는 0.13 h-1 이고, 이는 사용된 배양 조건 하에서 균주의 최대 성장 속도의 절반에 해당한다.
실시예 1.4(비교)
스키조키트리움 종 CCAP 4062/3 배양은 실시예 1.1에서 필수적으로 기재된 바와 같이 발효조에서 준비되며 배양 배지는 초기 발효조 배지 및 첨가 배지 각각에 대해 27 g/L 및 35.6 g/L NaCl가 보충된다.
실시예 1.5(본 발명)
스키조키트리움 종 CCAP 4062/3 배양은 실시예 1.2에서 필수적으로 기재된 바와 같이 발효조에서 준비되며 배양 배지는 초기 발효조 배지 및 첨가 배지 각각에 대해 27 g/L 및 35.6 g/L NaCl가 보충된다.
결과
Figure pct00003
DM: 건조 물질; AA: 아미노산;
*: USDA에 의해 주어진 값에 따라 100 % DM에 대한 상대 값(%)
불포화 지방산이 풍부한 지방의 생산을 목적으로 하는 당업계의 배양 공정은 높은 단백질 함량을 갖는 조성물을 수득하는 것을 가능하게 하지 않는 점이 주목된다(건조 물질에 대한 아미노산의 상대적인 중량 %로 표현됨).
실시예 2 - 동물 영양
실시예 2.1(재료 및 방법)
균주 오란티오키트리움 맹그로베이 CC4062/5를 실시예 1.2의 조건 하에서 배양된다. 이들 조건은 다른 언급이 없으면 하기의 실시예에서 사용되는 조건이다.
2.1.1 - 바이오매스 조성
미세조류 바이오매스는 먼저 이의 일반 조성에 대해 분석되었다((수분( 2009년 1월 27일 규정 EC 152/2009(103°C/4h) - SN의 개조된 EAU-H 내부 측정법(internal method)), 가수분해에 의한 지방(2009년 1월 27일 규정 EC 152/2009 - 과정 B - SN), 전체 아미노산 농도의 합계에 기초하여 예측된 조 단백질(지침 98/64/EC, 9/3/99 - 표준 NF EN ISO 13903), 무기질(2009년 1월 27일 규정 EC 152/2009 - SN)), 및 총 에너지(gross energy)(NF EN 14918), 전체 섬유질 fiber(AOAC 985.29 - SN), 불용성 벽(wall)(Carre 및 Brillouet의 방법에 따름(1989, Determination of water-insoluble cell walls in feeds: interlaboratory study. Journal Association of Official Analytical Chemists, 72, 463-467), 칼슘(NF EN ISO 6869 - March 2002 - CT), 인(2009년 1월 27일 규정 EC 152/2009 - CT), 염화물(ISO 1841-2 - July 1996 - SN의 개조된 내부 측정법), 칼륨(내부 측정법 - ICP 05/07 - SN), 나트륨(내부 측정법 - ICP 05/07 - SN) 및 전체 아미노산 농도.
2.1.2 맹장이 절제된 어린 수탉의 아미노산 소화능의 측정
동시에, 맹장이 절제된(caecectomized) 어린 수탉에서의 아미노산 소화능의 측정을 위해 미세조류를 생체 내에서 측정한다(Green et al., 1987). 동물(성체의 Isa Brown 어린 수탉)에게 시험된 성분(시험된 미세조류 또는 대조군 대두박) 중 하나로 구성되고 동물의 필요에 상응하도록 18%의 단백질 수준에 도달하기 위해 밀 전분으로 보충된 삶은 곡물 사료(mash)를 강제로 먹였다. 개별적인 케이지에서 거처가 제공된 12마리의 어린 수탉은 처리당 사용되었다. 각 동물은 24시간 동안 굶주린 후 평균적으로 171.2 ± 14.5 g의 삶은 곡물 사료를 공급받았다. 강제 급식 후 48시간까지 수집된 배설물은 4마리의 어린 수탉 그룹별로 수집하고, 처리당 3개의 배설물은 동결 건조하였다. 이어서, 그들은 수분 함량을 안정화시키기 위해 수분 섭취 단계(48시간) 동안 실온에 방치한 다음, 무게를 재고, 분쇄(0.5 mm)한 다음, 터프스트라(Terpstra) 방법(Terpstra and de Hart, 1974)에 의해 비요산 질소 함량 및 전체 아미노산 농도를 분석하였다(JEOL AminoTac JLC-500/V). 아미노산의 내생적 손실은 이전에 같은 실험 설계를 기반으로 단백질이 없는 식이를 평가함으로써 측정되었다. 다음과 같이, 기초 내생적 손실의 보정된 결과는 하기와 같이 아미노산의 표준화된 회장(ileal) 소화능 계수로 표현되고 계산되며 통계적 분석된다:
Figure pct00004
DIS(X)F: 원료 F의 아미노산 X의 표준화된 회장 소화능 계수(%); XF: 원료의 아미노산의 농도(g/100 g); XE: 배설물의 아미노산의 농도(g/100 g); ID: 소비된 사료의 양(g); QE: 배설된 양(g); LF: 사료 중 원료의 혼합비; XEND: 아미노산 X의 내생적 손실(g/100 g).
실험 결과는 먼저 95% 신뢰구간을 갖는 다음의 모델에 따른 ANOVA 절차(XLSTAT 2010.4.02 ⓒ Addinsoft 1995-2010)에 따라 성분 효과에 대해 분석된다:
Y = μ+ ai
Y = 매개변수
μ= 평균(mean)
ai = 성분 효과
각각 유의한 차이에 대해 평균은 쌍으로된 피셔의 LSD(pairwise Fisher’s LSD) 테스트에 의해 분석된다.
실시예 2.2: 49시간 동안 배양된 균주 CC4062/5의 조성
균주 CC4062/5는 상기에 언급한 바와 같이 배양되었다. 배양은 49시간에 중지되었고, 동물에서 예비 소화능 시험을 수행하기 위해 수십 킬로그램의 미세조류 바이오매스를 생산했다. 이 바이오매스는 건조 실린더에서 건조되었고 조각(flake) 형태를 가진다. 그것은 "균주, 4, 49시간 배양"로 확인된다.
"미세조류, 균주 4, 49시간 배양"의 생화학적 조성 결과는 하기 표 5에 제시되고, 총(gross) 및 보정된 건조 물질(DM) 함량으로 표현된다.
농도
(총 %)
농도
(건조 물질의 %)
대두박 대두박
건조 물질, % 94.8 89.5 - -
수분, % 5.2 10.5 - -
아미노산의 합계 50.8 46.9 53.4 52.4
지방 10.6 5.0 11.2 5.6
조섬유 n/d 4.2 n/d 4.7
무기 물질 7.3 5.8 7.7 6.5
녹말 <1.0 n/a <1.1 n/a
전체 당 1.3 n/d 1.4 n/d
ADF n/d 3.7 n/d 4.1
NDF n/d 7.2 n/d 8.0
전체 식이성 섬유(TDF) 16.5 n/d 17.4 n/d
불수용성 세포벽(WICW) 4.9 n/d 5.2 n/d
칼슘 0.118 0.371 0.124 0.414
1.448 0.598 1.527 0.668
염화물(Cl-) 0.150 n/d 0.158 n/d
칼륨 1.983 n/d 2.092 n/d
나트륨 0.068 n/d 0.072 n/d
(kcal/kg) (kcal/kg DM)
총 에너지 4870 4486 5137 5012
n/d: 측정되지 않음(not determined)
n/a: 해당 없음(not applicable)
㎂: 미세조류
(시험 14ALG058): 시험된 미세조류(균주 4, 49시간 배양) 대 대조군 대두박의 조성
이 결과는 미세조류가 대조군 대두박에 비하여 약간 더 많은 전체 질소 물질(아미노산의 합계) 및 무기 물질 조성을 가짐을 보여준다. 시험된 바이오매스의 무기물 함량은 공지된 가장 낮은 농도에 비슷하며, 미세조류의 종류, 속 및 종에 따라 7% 내지 43% DM의 범위이다. 인과 칼슘 함량은 대조군 대두박에 비하여 반대로 2.3배 인이 더 많고, 3.3배 칼슘이 더 적다. 시험된 "균주 4, 49시간 배양"은 저장 녹말(starch reserve)를 포함하지 않으며, 그 전체 당 농도는 동물 영양에 통상적으로 사용되는 원료에 비해 낮게 유지된다(1.4% DM). 대조적으로, 그 지방 함량은 대두박에 비하여 2배 더 높고(11.2% vs 5.6% DM) 그 총 에너지는 125 kcal/kg DM 이상이다.
미세조류 벽은 식물 기원의 원료에 비하여 다른 조성 및 구조를 가지며, 통상적으로 사용되는 섬유 분석에 부적합하게 만든다. 또한, 전체 식이성 섬유(TDF) 분석(Prosky et al., 1988) 덜 제한적이라는 이점을 가지며 "미세조류, 균주 4, 49시간 배양"은 5.2% DM에서 측정된 불수용성 세포벽(WICW)과 함께 17.4% DM의 전체 섬유 백분율(이는 비교에 따라 호밀 또는 보리 낟알의 분석에 관한 것임)을 가진다.
전체 단백질 농도는 상기 기재된 방법에 따라 분석된 아미노산 그 자체의 합계로부터 유래한 표 4 내지 8에 보고된다. "미세조류, 균주 4, 49시간 배양"의 전체 단백질의 추정 값으로서 아미노산의 합계는 53.4% DM이고, 더 정확하게 21.5% DM의 필수아미노산 및 32.0% DM의 비필수 아미노산이다. 표 6은 미세조류 및 대두박에서 분석된 아미노산의 농도를 보여주고 총 수치 또는 아미노산의 합계에 대한 상대적인 수치로 표현된다.
결과는 미세조류는 비교적 균형잡힌 아미노산 프로파일을 가지고 있는 것을 반영하는데, 이는 다른 미세조류의 아미노산 프로파일을 소위 통상적인 단백질 공급원과 비교하는 작업과 일치한다(Becker, 2007).
일반적으로, 미세조류의 필수아미노산 농도는 대두박에서 측정되는 것보다 약간 높다(각각 21.5% DM 및 24.0% DM).
[AA]
(총 %)
AA / 합계 AA
(%)
AA의 표준화된 회장의
소화능(%)
소화될 수 있는[AA]
(총 %)
SM SM SM p-value SM
건조 물질 94.8 89.5 - - - - - - -
전체 질소 10.6 7.8 - - 80.1 ± 0.3 89.6 ± 0.7 < 0.0001 8.49 6.97
합계 AA 50.8 46.9 - - 78.4 ± 1.0 88.5 ± 1.0 0.001 39.79 41.53
필수 AA 20.4 21.5
메티오닌 0.85 0.64 1.67 1.36 85.6 ± 1.3 90.9 ± 1.6 0.023 0.73 0.58
라이신 2.30 2.87 4.53 6.12 84.9 ± 1.3 87.6 ± 0.8 0.068 1.95 2.51
트레오닌 1.71 1.88 3.37 4.01 80.7 ± 1.8 86.0 ± 1.7 0.038 1.38 1.62
트립토판 0.55 0.67 1.08 1.43 82.9 ± 1.7 90.3 ± 1.3 0.009 0.46 0.61
아르기닌 6.83 3.42 13.44 7.29 61.0 ± 0.8 93.2 ± 0.8 < 0.0001 4.17 3.19
이소류신 1.48 2.30 2.91 4.90 85.4 ± 1.2 88.7 ± 1.2 0.048 1.26 2.04
류신 2.52 3.69 4.96 7.87 86.7 ± 1.1 88.5 ± 1.2 0.182 2.18 3.27
발린 2.01 2.35 3.96 5.01 87.5 ± 1.6 89.0 ± 1.5 0.389 1.76 2.09
히스티딘 0.66 1.18 1.30 2.52 88.7 ± 0.6 89.9 ± 1.4 0.327 0.59 1.06
페닐알라닌 1.52 2.48 2.99 5.29 84.6 ± 1.5 89.8 ± 1.0 0.014 1.29 2.23
비필수 AA 30.3 25.5
시스테인 0.55 0.63 1.08 1.34 60.9 ± 3.7 79.7 ± 2.0 0.003 0.34 0.50
세린 1.87 2.52 3.68 5.37 76.7 ± 1.6 88.5 ± 1.3 0.001 1.43 2.23
프롤린 1.07 2.14 2.11 4.56 84.3 ± 2.1 87.9 ± 1.3 0?107 0.90 1.88
알라닌 2.17 2.07 4.27 4.41 84.9 ± 1.1 84.9 ± 1.1 0.992 1.84 1.76
아스파르트산 3.57 5.49 7.03 11.71 n/d 85.9 ± 0.6 n/d n/d 4.71
글루탐산 18?10 8.81 35.63 18.78 73.4 ± 0.7 90.4 ± 0.7 0.0001 13.29 7.96
글리신 1.81 2.01 3.56 4.29 78.3 ± 2.3 84.3 ± 1.6 0.036 1.42 1.69
티로신 1.18 1.78 2.32 3.80 84.2 ± 1.7 89.5 ± 0.6 0.015 0.99 1.59
(시험 14ALG058): 전체 질소 및 아미노산 농도(총 %), 아미노산 합계에 대해 상대적인 아미노산 농도(% AA 합계), 맹장이 제거된 어린 수탉에서 측정된 아미노산의 표준화된 회장의 소화능 계수(%), 및 시험된 미세조류 대 대조군 대두박의 소화될 수 있는 아미노산 농도(총 %).
실시예 2.3: 바이오매스 아미노산 소화능의 측정(49시간 동안 배양한 균주 CC4062/5)
소화되는 아미노산의 농도뿐만 아니라 맹장이 제거된 어린 수탉에서 측정된 아미노산의 표준화된 회장의 소화능(SID)에 관한 결과는 표 6에 제시된다. 미세조류의 질소의 소화능과 아미노산 합계는 각각 80.1 ± 0.3% 및 78.4 ± 1.0%이고, 이는 대조군 대두박에 비해 9.5 및 10.1 포인트 낮다. 미세조류의 아르기닌 및 시스테인 SID는 가장 낮은 결과를 가지고, 각각 61.0 ± 0.8% 및 60.9 ± 3.7%이다. 일반적으로, 미세조류의 필수아미노산의 소화능 계수는 80.7 ± 1.8%(트레오닌 SID) 내지 88.7 ± 0.6%(히스티딘 SID)의 범위이다. 라이신 소화능은 85.6 ± 1.3%에서 측정된다. 이들 계수는 대조군 대두박에서 측정된 것에 비해 약 1.2(히스티딘 SID) 내지 7.4(트립토판 SID) 포인트 낮다. 그러나 그들은 좋은 품질의 단백질 공급원으로서 미세조류를 평가 가능하도록 높은 소화능 계수를 반영한다 즉, 그들은 문헌에 보고된 약 55% 내지 77%의 미세조류 단백질 소화능 수치에 비하여 상당히 높다(Henman et al., 2012).
실시예 2.4: 22시간 동안 배양한 균주 CC4062/5의 조성
균주 CC4062/5는 같은 조건이지만 22시간 동안 배양되었다. 그것은 "균주 4, 22시간 배양"으로 식별된다.
이전과 마찬가지로, 이 바이오매스는 건조 실린더에서 건조되었고 조각의 물리적 형태를 가진다.
근접값, 총 에너지, 총 섬유, 불용성 벽, 칼슘, 인, 염화물, 칼륨, 나트륨 및 전체 아미노산 농도로 그것의 조성으로 분석되었다.
"미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 생화학적 조성은 표 7에 제시된다. 결과는 총 및 보정된 건조 물질(DM) 함량으로 표현된다.
"미세조류, 균주 4, 22시간 배양" 총 질소 물질 조성(아미노산의 합계)은 대조군 대두박 및 "미세조류, 균주 4, 49시간 배양"에 비해 2.3 및 1.3 포인트 더 높다.
무기 물질 함량은 더 긴 배양에 비하여 증가하지만 문헌에 공지된 더 낮은 범위의 수치에서 농도의 수준이 유지된다(Skrede et al., 2011).
인/칼슘 비율은 불균형하다. 미세조류의 인과 칼슘 함량은 대조군 대두박에 비해 반대로 인은 3.6배 더 높고 칼슘은 3.6배 더 낮다. 최적화된 균주 4(22시간 배양)는 49시간 배양보다 총 인을 1.5배 더 포함한다. 지방 함량은 대두박에 비해 더 높고(8% 대 5.6% DM), 결과는 이 균주 4에서 녹말 또는 전체 당도 에너지 저장량의 형태를 대표하지 않음을 보여준다. 총 에너지는 4641 kcal/kg DM, 또는 371 kcal/kg DM 이하 대 대조군 대두박에서 측정된다.
"미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 총 식이성 섬유(TDF) 2.1% DM에서 측정한 불수용성 세포벽(WIWC) 잔여물이 있는 DM의 12.7%를 나타낸다. 동시에, 잔류물은 다음과 같이 추론된다: R(%) = 100 - 무기 물질(%) - 총 질소 물질(%) - 지방(%) - 녹말(%) - 당(%)은 TDF 함량이 27.8% DM에서 예측된 R에 비하여 1.5 포인트 더 낮다는 것을 보여준다. 이러한 관찰은 무기물질, 지질, 단백질 및 탄수화물 함량의 합계로 설명되지 않는 약 20% 내지 30%의 건조되지 않은 바이오매스의 양을 보고한 다른 연구(Lieve et al., 2012)와 일치한다.
"미세조류, 균주 4, 22시간 배양"은 비교된 대두박에 비해 2 포인트 높은 지방을 가진다(표 7).
AA 농도
(총 %)
AA 농도
(% 건조 물질)
대두박 대두박
건조 물질 94.6 89.5 - -
수분 5.4 10.5 - -
아미노산의 합계 51.7 46.9 54.7 52.4
지방 7.6 5.0 8.0 5.6
조섬유 n/d 4.2 n/d 4.7
무기물질 9.0 5.8 9.5 6.5
녹말 <0.5 n/a <0.5 <0.6
총 당 <0.5 n/d <0.5 <0.6
ADF n/d 3.7 n/d 4.1
NDF n/d 7.2 n/d 8.0
총 식이성 섬유(TDF) 12.0 n/d 12.7 n/d
불수용성 세포 벽(WICW) 2.0 n/d 2.1 n/d
칼슘 0.109 0.371 0.115 0.415
2.279 0.598 2.410 0.668
염화물(Cl-) 0.160 n/d 0.169 n/d
칼륨 2.238 n/d 2.366 n/d
나트륨 0.161 n/d 0.170 n/d
(kcal/kg) (kcal/kg DM)
총 에너지 4390 4486 4641 5012
n/d: 측정되지 않음; n/a: 해당되지 않음; ㎂: 미세조류
(시험 14ALG065): 시험된 미세조류(균주 4, 22시간 배양) 대 대조군 대두박의 조성
아미노산의 합계는 DM의 54.7%이고, 더 정확하게 필수아미노산의 23.9% DM 및 비필수 아미노산의 30.8% DM이다. 표 8은 대두박 및 미세조류에서 분석된 아미노산의 농도를 보여주고, 총 값 또는 아미노산 합계에 대한 상대적인 수치로 표현된다. 결과는 대조군 대두박과 비하여 비교적 균형적인 아미노산 프로파일을 가짐을 보여준다. "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 글루탐산, 아르기닌 및 아스파르트산은 각각 26.75%, 9.48% 및 8.26%의 값(% AA 합계)으로 높은 비율로 존재한다. 라이신 함량(% AA 합계)은 대조군 대두박(6.12%)과 비교하여 5.94%이다. 아르기닌, 메티오닌 및 그보다 적게는 트레오닌은 대조군 대두박에 비하여 시험된 미세조류 단백질에 더 크게 기여를 한다(각각 9.48% 대 7.29%, 2.13% 대 1.36%, 및 4.27% 대 4.01%.) 22시간 동안 배양된 미세조류는 49시간 배양된 것보다 2.4 포인트 필수적 산(esseential acid)을 더 가지거나, 대조군 대두박과 동일한 함량을 가지고 있다. 아르기닌을 제외하고, 필수아미노산은 아미노산 합계에 더 큰 비율을 나타낸다.
"미세조류, 균주 4, 22시간 배양"은 메티오닌, 아르기닌 및 트레오닌 함량은 대두박에 비해 높지만, 미세조류 바이오매스에서 라이신 및 발린 함량은 동일하거나 약간 높다.
실시예 2.5: 바이오매스 아미노산 소화능 측정(22시간 동안 배양된 균주 CC4062/5)
맹장이 절제된 어린 수탉(Green et al., 1987)의 아미노산 소화능의 측정은 상기에 기재된 방법과 동일하게 수행된다(실시예 2.3 참조).
소화되는 아미노산의 농도뿐만 아니라 "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 아미노산의 표준화된 회장의 소화능(SID)에 관한 결과는 표 8에 제시된다. 미세조류의 아미노산의 합계 및 질소의 소화능은 각각 85.7 ± 0.7% 및 87.1 ± 0.4%이고, 대조군 대두박에 비해 3.2(p = 0.008) 및 0.9(p = 0.190) 포인트 더 낮다. 49시간 배양과 비교하여, "미세조류, 균주 4, 22시간 배양" 생산의 아미노산의 합계의 소화능은 8.7 포인트로 유의하게 증가한다. 소화되는 라이신, 메티오닌, 아르기닌, 트레오닌 및 발린의 농도는 대조군 대두박에 비하여 더 높다. 이는 대두박에 비해 동등하거나 우수한 시험된 미세조류의 단백질의 좋은 품질을 보여준다.
어린 수탉의 아미노산 소화능 결과는 "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"은 좋은 품질의 단백질 공급원이라는 것을 보여준다. 단백질(아미노산의 합계)의 소화능은 단위동물에게 먹이주는데 전세계적으로 가장 많이 사용되는 대두박과 비슷하다.
더욱이, 라이신에서 측정된 높은 소화능 계수를 고려해보면 사용된 건조 공정은 단백질 품질을 변성시키는 요인으로 보이지 않는다.
"미세조류, 균주 4, 49시간 배양"의 결과와 "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 결과를 비교하였을 때, 단백질의 품질이 상당히 개선되었다는 점을 주목해야할 점이다. 특히, 단백질 소화능은 약 9 포인트로 상승한다.
[AA]
(총 %)
AA(%) AA의 표준화된
회장의 소화능(%)
소화되는 [AA]
(총 %)
SM SM SM p -value SM
건조 물질 94.6 89.5 - - - - - - -
전체
질소
11.5 7.8 - - 85.7 ±
0.7
88.9 ±
0.5
0.008 9.86 6.92
합계 AA 51.7 46.9 - - 87.1 ±
0.4
88.0 ±
0.7
0.190 45.06 41.29
필수적 AA 22.6 21.5
메티오닌 1?10 0.64 2.13 1.36 90.0 ± 0.4 91.5 ± 0.3 0.015 0.99 0.59
라이신 3.07 2.87 5.94 6.12 87.9 ± 0.2 85.6 ± 0.3 0.0001 2.70 2.46
트레오닌 2.21 1.88 4.27 4.01 87.3 ± 0.3 85.2 ± 1.0 0.045 1.93 1.60
트립토판 0.68 0.67 1.32 1.43 86.0 ± 0.2 89.3 ± 1.1 0.013 0.59 0.60
아르기닌 4.90 3.42 9.48 7.29 79.9 ± 1.1 93.0 ± 0.5 < 0.0001 3.92 3.18
이소류신 1.98 2.30 3.83 4.90 88.2 ± 0.3 88.5 ± 0.5 0.526 1.75 2.04
류신 3.31 3.69 6.40 7.87 89.0 ± 0.2 88.5 ± 0.7 0.341 2.95 3.27
발린 2.57 2.35 4.97 5.01 87.1 ± 0.2 85.6 ± 1.2 0.153 2.24 2.01
히스티딘 0.82 1.18 1.59 2.52 88.7 ± 2.1 89.6 ± 0.7 0.578 0.73 1.06
페닐알라닌 1.96 2.48 3.79 5.29 87.4 ± 0.4 89.8 ± 0.7 0.012 1.71 2.23
비필수적 AA 29.1 25.5
시토신 0.65 0.63 1.26 1.34 69.4 ± 1.2 79.1 ± 2.3 0.006 0.45 0.50
세린 2.09 2.52 4.04 5.37 83.0 ± 0.5 87.7 ± 1.0 0.004 1.73 2.21
프롤린 1.66 2.14 3.21 4.56 87.9 ± 0.8 87.2 ± 1.2 0.519 1.46 1.87
알라닌 2.80 2.07 5.42 4.41 88.8 ± 0.3 84.7 ± 1.0 0.005 2.49 1.75
아스파르트산 4.27 5.49 8.26 11.71 n/d 85.7 ± 0.8 n/d n/d 4.71
글루탐산 13.83 8.81 26.75 18.78 84.8 ± 0.7 90.5 ± 0.6 0.001 11.72 7.97
글리신 2.34 2.01 4.53 4.29 81.8 ± 0.9 83.3 ± 0.5 0.125 1.92 1.67
티로신 1.48 1.78 2.86 3.80 86.7 ± 0.1 89.4 ± 0.9 0.016 1.28 1.59
n/d: 측정되지 않음; ㎂: 미세조류; SM: 대두박; [AA]: 아미노산 농도
(시험 14ALG065): 전체 질소 및 아미노산 농도(총 %), 아미노산의 합계에 대한 상대적인 아미노산 농도(% 합계 AA), 맹장이 제거된 어린 수탉에서 측정된 아미노산의 표준화된 회장의 소화능 계수(%) 및 시험된 미세조류 대 대조군 대두박의 소화되는 아미노산 농도(총 %)
실시예 2.6: 22시간 배양된 균주 CC4062/5의 겉보기 대사가능 에너지(AME) 및 질소 보정된 겉보기 대사가능 에너지(AMEn)의 측정
미세조류 "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 겉보기 대사가능 에너지(AME)의 측정은 3주령 닭(Bourdillon et al., 1990)에서 수행하였다. 소위 치환법(substitution method)을 옥수수-대두 베이스 및 프리믹스가 포함된 대조군 식이를 시작으로 적용하였다. 다른 원료와 마찬가지로, 3mm 그리드 위에 놓인 미세조류는 식이에 프리믹스는 일정하게 유지하면서 옥수수-대두 혼합물 대신에 4%, 8%, 12%, 16% 및 20%의 비율로 혼합되었다.
표 9는 대조군 옥수수-대두 사료의 제제 및 그것의 설명(조 단백질 = 18%, 겉보기 대사에너지 = 3200 kcal/kg)에 대해 제시한다. 미세조류로 대체된 사료는 AME, 소화되는 아미노산 및 미세조류를 위해 만들어진 생물학적으로 이용 가능한 인에 관한 가정을 토대로 최적으로 균형(특히 에너지에 대한 그들의 단백질 비율)을 이룬다.
D1
기초 옥수수-대두
옥수수 67.673
대두박 48% 19.742
옥수수 글루텐 60 4.766
대두유 3.139
프리믹스 4.680
미세조류 0
조단백질 18
지방 6.201
조섬유 3.029
무기 물질 2.013
라이신 0.80
메티오닌 0.33
Met+Cys 0.664
트레오닌 0.686
트립토판 0.173
아르기닌 1.066
칼슘 0.1
전체 인 0.333
유효 인 0.078
나트륨 0.092
AME, kcal/kg 3200
(시험 14ALG069): 사용된 실험용 사료 보충물의 제제
식이 1: 기초 옥수수-대두(95.32%) + 비타민 및 무기질 보충제(VMS)(4.68%)
식이 2: 기초 옥수수-대두(91.32%) + VMS(4.68%) + 미세조류(4%)
식이 3: 기초 옥수수-대두(87.32%) + VMS(4.68%) + 미세조류(8%)
식이 4: 기초 옥수수-대두(83.32%) + VMS(4.68%) + 미세조류(12%)
식이 5: 기초 옥수수-대두(79.32%) + VMS(4.68%) + 미세조류(16%)
식이 6: 기초 옥수수-대두(75.32%) + VMS(4.68%) + 미세조류(20%)
이 혼합 구배(incorporation gradient)는 간단한 선형 회귀 분석을 통해 미세조류의 AME 값을 평가할 수 있게 한다. 실험적 설계는 도 1에 기재된다. 식이의 건조 물질 값은 평가의 초기 및 끝 단계에서 분쇄 후 및 사료 펠릿 상에서 측정하였다. 마지막으로, 전체 사료 및 대변을 열량 측정법에 의해 총 에너지 함유량(GE)에 대해 개별적으로 분석하였다.
사료의 AMEn은 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00005
I: 소비된 사료의 양(kg DM); E: 배설물의 양(kg); GEi 및 GEf: 소비된 사료(kcal/kg DM) 및 배설물(kcal/kg)의 총 에너지; WG: 평가기간 동안 체중 증가. AME 값은 먼저 동물 조직에 포함된 18% 단백질을 기준으로 계수 8.22 kcal/kg N(Hill and Anderson, 1958)을 사용하여 질소 보정하였다. 동시에, 질소 보정의 계산은 배설물의 총 질소 분석에 기초하여 수행되었다. 동일한 결과를 보이는 두가지 방법은 이 보고서에서 고려되는 후자의 방법이다. 이상점(outlier)(평균으로부터 ± 2.5 표준편차)은 요인 배치법(factorial design)에 따른 분산 분석(ANOVA, SAS 9.1.3 ⓒ 2002-2003 by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에 의한 처리 전에 제거되었다. 건조 물질 소화능(dDM) 및 질소의 겉보기 소화능 계수(DCa nitrogen), 인(DCa phosphorus), 칼슘(DCa calcium) 및 지방(DCa fat)은 각 식이에서 같은 방법을 계산한다.
이 결과는 다음 모델에 따라 선형 회귀 분석(XLSTAT 2010.4.02 ⓒ Addinsoft 1995-2010)에 의해 분석되었다:
Yi = β0 + βjXij+ εi
Yi = 관측치 i에 대한 종속 변수에 대해 관측된 값
β0 = 절편(intercept)
βj = 회귀선의 기울기
Xij = 관측치 i에 대한 변수 j의 값,(% 미세조류의 통합),
εi = 모델 오류
미세조류의 100% 통합에 대한 매개변수 값은 예측 모델로부터 추론하였다. 따라서, 이는 AME 및 AMEn 및 미세조류의 인의 겉보기 소화능 계수를 예측 가능하게 한다.
표 10은 대조군 옥수수-대두박 사료뿐만 아니라 대체된 식이 D2 내지 D6의 건조 물질 소화능 및 질소 보정된 겉보기 대사가능 에너지(AMEn) 결과를 제시한다. 질소(DCa nitrogen), 인(DCa phosphorus), 칼슘(DCa calcium), 지방(DCa fat)의 겉보기 소화능 계수는 같은 방법에 의해 예측하였다.
실험용 사료 p-값
식이 D1 D2 D3 D4 D5 D6
B C-S B C-S +
4% μA
B C-S +
8% μA
B C-S +
12% μA
B C-S +
16% μA
B C-S +
20% μA
dDM(%)1 75.10 ± 1.20a 74.41 ± 1.09ab 73.53 ± 1.64b 71.64 ± 1.43c 70.17 ± 1.22d 69.56 ± 2.05d < 0.0001
AMEn(kcal/kg DM)2 3398.0 ± 53a 3379.4 ± 42a 3331.8 ± 64b 3273.6 ± 61c 3218.9 ± 53d 3171.4 ± 72e < 0.0001
GE/AMEn(%)3 78.35 ± 1.34a 78.05 ± 1.25a 77.71 ± 1.72a 76.19 ± 1.56b 75.00 ± 1.56c 74.72 ± 1.84c < 0.0001
DCa 질소(%)4 61.79 ± 3.75a 60.24 ± 2.44ab 58.80 ± 4.87b 56.48 ± 3.15c 53.97 ± 2.26d 53.90 ± 3.44d < 0.0001
DCa 인(%)5 38.00 ± 4.67a 40.78 ±4.36b 41.42 ± 4.87b 36.96 ± 4.89a 37.77 ± 3.38a 37.28 ± 3.83a 0.004
DCa 칼슘(%)6 26.84 ± 5.41a 34.32 ± 5.85b 37.86 ± 5.91ab 34.90 ± 4.61bc 36.74 ± 4.55bcd 38.94 ± 5.01d < 0.0001
DCa 지방(%)7 85.88 ± 4.2ab 87.17 ± 1.88ac 88.59 ± 2.53c 85.93 ± 3.33a 83.97 ± 3.37bd 83.86 ± 3.14d < 0.0001
B C-S: 기초 옥수수-대두; ㎂: 미세조류
1: 건조 물질 소화능(%); 2: 질소 보정된 겉보기 대사가능 에너지(AMEn); 3: AMEn에 대하여 상대적인 총 에너지(%); 4: 질소의 겉보기 소화능 계수; 5: 인의 겉보기 소화능 계수; 6: 칼슘의 겉보기 소화능 계수, 7: 지방(%)의 겉보기 소화능 계수
(시험 14ALG069): 각각 0%, 4%, 8%, 12%, 16% 및 20%의 시험된 미세조류로 대체되고, 23일령 닭에서 측정된 실험용 사료의 건조 물질 소화능, 에너지 소화능 및 겉보기 소화능 계수
다양한 식이의 건조 물질 소화능은 그들의 AMEn 값과 밀접한 관련이 있다. 옥수수-대두 식이 D1의 AMEn은 3398 ± 53 kcal/kg DM에서 측정된다. 결과는 식이 D2의 AMEn 값은 옥수수-대두 대조군과 동일함을 보여주고 미세조류로 4% 대체된 것은 식이의 에너지 소화능에 영향이 없음을 보여준다. 대조적으로, 미세조류의 8% 이상 대체에서 시작하여, AMEn 및 DCa 질소는 대체 백분율 증가에 따라 선형적으로 감소한다(p < 0.0001).
4% 내지 16% 미세조류의 첨가는 13-23일 동안 사료 전환 비율(FCR)에 있어 감소를 보인다. 이것은 또한 닭은 유사한 체증 증가를 위해 소비를 적게 하는 경향(D2 제외)이 있지만, 미세조류 통합의 백분율과 관계없이 대조군 옥수수-대두 식이에서 측정된 것보다 더 높음을 주목해야한다(표 11).
실험용 사료
D1 D2 D3 D4 D5 D6
B C-S B C-S +
4% μA
B C-S +
8% μA
B C-S + 12% μA B C-S + 16% μA B C-S + 20% μA
체중 증가(g) 460 ± 58.8 a 496 ± 36.5 b 495 ± 90.0 b 516 ± 56.6 b 510 ± 37.5 b 493 ± 44.1 ab
소비(g) 749 ± 82.9 a 756 ± 50.3 a 713 ± 118.8 ab 722 ± 68.0 ab 701 ± 51.9 bc 665 ± 52.8 c
사료 전환 비율(g/g) 1.63
± 0.063 a
1.53
± 0.048 b
1.44
± 0.067 c
1.41
± 0.060 d
1.37
± 0.043 de
1.35
± 0.042 e
B C-S: 기초 옥수수-대두; ㎂: 미세조류
(시험 14ALG069): 각각 0%, 4%, 8%, 12%, 16% 및 20%의 미세조류로 대체된 것을 먹인 동물의 13-23일 동안의 체중 증가, 소비, 사료 전환 비율.
"미세조류, 균주 4, 22시간 배양"의 AME 및 AMEn 값(표 12)은 각각 2785 kcal/kg DM 및 2296 kcal/kg DM에서 측정한다. 이 값은 각각 단백질 클래스 2303 ± 137, 2348 ± 248, 및 2365 ± 178 kcal/kg DM에 대한 46, 48 및 50의 대두박 AMEn 측정의 평균 생체내 기준값 평균 범위에 있음을 주목해야한다. 따라서 이 미세조류가 제공하는 에너지 공급량은 표준 품질의 대두박과 비슷하다.
미세조류
AME, kcal/kg 2635.0 대두박 대두박 대두박
AME, kcal/kg DM 2785.4 단백질
클래스
46 48 50
AMEn, kcal/kg 2172.0 N n=15 n=27 n=80
AMEn, kcal/kg DM 2296.0 AMEn, kcal/kg DM 2303 ?137 2348 ?248 2365 ?178
A B
(시험 14ALG069):
A: 23일령 닭에서 측정된 시험된 미세조류의 겉보기 대사에너지 및 질소 보정된 겉보기 대사가능 에너지.
B: 다양한 대두박 단백질 클래스를 위한 동일한 모델에 따라 측정된 생체내 기준값(Adisseo, 2012로 부터 참고함).
실시예 2.7: 본 발명에 따른 바이오매스를 포함한 사료의 병아리에서의 선택 및 소비 측정
하기에 제시된 각 시험에서, 다른 원료와 마찬가지로 "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"은 3-mm에 놓았고, 4개의 동등한(iso) 에너지, 동등한 단백질, 동등한 라이신 식이, 표 14에서 주어진 조성을 가지기 위해 제제를 조정하면서 옥수수-대두 식이에 5%, 10% 및 15%로 비율을 높여가면서 통합하였다.
미세조류
소화되는 인(%DM)1 0.86
DCa 인(%)2 35.7
1 신뢰 구간: 0.576% - 1.143%
2 제제에 따라 계산한 값: DCa = 소화되는 P(%)/사료 전체 P(%)
(시험 14ALG069): 23일령 닭에서 선형회귀에 의해 측정된 시험된 미세조류의 인의 겉보기 소화능 매개변수
제공된 % 대조군 사료 5% 미세조류
사료
10% 미세조류
사료
15% 미세조류
사료
옥수수 52.90 54.28 55.67 57.06
대두박 48% 35.40 29.50 23.59 17.69
압출된 대두 4.00 4.00 4.00 4.00
대두유 3.55 3.10 2.65 2.20
인산 이칼슘 1.92 1.78 1.63 1.49
탄산칼슘 1.01 1.13 1.25 1.36
0.36 0.35 0.34 0.32
DL-메티오닌 0.25 0.24 0.23 0.22
L-라이신 HCl 0.01 0.02 0.04 0.06
프리믹스 0.6 0.6 0.6 0.6
미세조류 0 5 10 15
조단백질 22 22 22 22
라이신 1.25 1.25 1.25 1.25
메티오닌 0.58 0.59 0.60 0.61
Met+Cys 0.95 0.96 0.96 0.96
트레오닌 0.86 0.87 0.88 0.88
소화가능(Dig)라이신 1.12 1.12 1.12 1.12
소화가능 메티오닌 0.57 0.58 0.58 0.59
소화가능 Met+Cys 0.85 0.85 0.85 0.85
소화가능 트레오닌 0.74 0.75 0.76 0.77
소화가능 트립토판 0.25 0.24 0.24 0.24
칼슘 0.95 0.95 0.95 0.95
전체 인 0.72 0.77 0.83 0.88
이용가능한 인 0.40 0.40 0.40 0.40
대사에너지, kcal/kg 3000 3000 3000 3000
(시험 14ALG081): 병아리에서 소비 및 선택 검사에서 사용된 실험용 사료의 제제
두개의 실험적 시험은 동시에 수행하였다(도 2). 첫번째 시험에서(선택 시험), 소비는 동물이 미세조류 대체된 사료와 옥수수-대두 스타터 사이의 선택할 때 측정한다. 두번째(소비 측정) 에서, 소비는 동물이 오직 선택적으로 미세조류로 대체된 사료에만 접근 가능할 때 측정한다.
시험 1에서, 7일령 및 9일령의 각 측정 포인트에서 소비 데이터는 하나의 사료 접시에서의 소비는 각 케이지의 다른 접시의 소비에 의존적이라는 점을 고려할때 한 쌍의 시험 절차(XLSTAT 2010.4.02 ⓒ Addinsoft 1995-2010)에 따라 분석하였다.
시험 2의 소비 및 체중 데이터는 95%의 신뢰구간의 다음과 같은 모델에 따라 사료의 효과를 위해 ANOVA 과정(XLSTAT 2010.4.02 ⓒ Addinsoft 1995-2010)에 의해 분석하였다:
Yi = μ + ai + biY = 매개변수
Y = 매개변수
μ = 평균
ai = 사료 효과
bi = 블록 효과
각각의 유의한 차이에 대해, 평균은 쌍으로된 Fisher의 LSD 테스트에 의해 분석된다.
1) 시험 1 - 선택 시험
사료의 선택 시험을 위해, 약 200마리의 1일령 수컷 병아리(Ross PM3) 분리된 대사 케이지로 약 20마리씩 그룹 지어 넣었고, 밀, 옥수수 대두박을 포함한 표준 스타터를 먹였다. 6일령 닭의 중량을 재고 체중 그룹으로 분류되기 전에 2시간 동안 굶주려진다. 따라서 120마리의 닭을 선택하고, 4개의 그룹으로 나누어 30개의 분리된 대사 케이지에 넣고, 그들의 체중에 따라 실험적 처리 중 하나(처리당 10회 반복)를 7일에 할당한다. 각 케이지는 다음과 같은 3가지 실험적 처리에 상응하는 다른 사료를 포함하는 두개의 사료 접시를 포함한다:
ㆍ 처리 1: 옥수수-대두 스타터(사료 접시 1) 및 5% 미세조류(사료 접시 2)
ㆍ 처리 2: 옥수수-대두 스타터(사료 접시 1) 및 10% 미세조류(사료 접시 2)
ㆍ 처리 3: 옥수수-대두 스타터(사료 접시 1) 및 15% 미세조류(사료 접시 2)
시험 동안 사료와 물은 자유롭게 분배된다. 실험용 사료를 3.2-mm-직경 펠렛 형태로 공급한다. 소비는 7일령 및 9일령에 매 시간마다 케이지의 사료 접시를 교체하면서 T0+1h, T0+2h, T0+3h, T0+4h 및 T0+6h에 측정된다. 두개의 소비 측정 사이에(8일), 동물은 밀-옥수수-대두 스타터를 공급받는다.
결과는 어린 동물은 혼합 비율에 관계없이 미세조류 보충된 사료를 거부하지 않았음을 보여준다(도 3-5 참조). 따라서 이 양에서, 미세조류는 기호성(palatability) 문제도 보이지 않는다. 어린 병아리는 심지어 15% 미세조류가 첨가될때 수치상으로 역전되는 통상적인 옥수수-대두 사료에 비하여 5% 및 10% 미세조류로 보충된 사료를 선호하는 경향이 있다(도 5).
2) 시험 2 - 소비 측정
두번째 시험에서, 병아리는 미세조류로 선택적으로 보충된 한가지 유형의 사료에만 접근한다(도 6). 약 400마리의 1일령 수컷 병아리(Ross PM3)는 중량을 재고 체중 그룹에 따라 분류된다. 240마리의 선택된 동물은 실험용 사료(사료당 15회 반복)가 있는 케이지당 하나의 사료 접시가 있는 같은 체중의 블록(4개 케이지의 15개 블록)의 60개의 분리되지 않은 케이지에 1일에 4 그룹으로 넣는다. 각 케이지에서 4마리의 병아리는 개별적으로 식별된다. 사료와 물은 시험 동안 자유롭게 배분된다. 실험용 사료는 0%, 5%, 10% 또는 15% 미세조류로 보충되고, 시험 1에서 사료의 선택으로 사용된 옥수수-대두 스타터이다. 개개의 생체중은 1, 7 및 9일령에 측정한다. 먹지않은 사료는 중량을 재고, 케이지당 소비는 7일령 및 9일령에 측정한다. 0 내지 7일령까지, 10% 미세조류가 포함된 사료를 먹인 동물은 대조군 및 다른 두개의 보충된 식이와 비교하여 체중 증가에 상당히 개선된다. 10% 보충된 식이에서 측정된 사료 전환 비율은 대조군 및 15% 보충된 식이와 비교하여 상당히 개선된다(1.089 vs 1.156). 더욱이, 미세조류의 보충은 옥수수-대두 대조군과 비교하여 사료 소비에 영향이 없다(122.6 g, 125.7 g, 135.6 g 및 124.6 g, 각각 대조군 및 3개의 5% 내지 15%로 보충된 식이).
0 내지 9일령의 전체 측정 기간(도 7) 동안, 10% 미세조류 보충된 사료의 체중 증가 및 사료 전환 비율에 대한 긍정적인 효과를 입증한다.
소비 결과(비선택 조건 하에서)는 시험된 "미세조류, 균주 4, 22시간 배양"이 0 내지 9일령의 병아리의 수행능력에 영향을 주지 않고 균형된 옥수수-대두 사료에서 15%까지 포함할 수 있음을 보여준다.
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Claims (25)

  1. 건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 적어도 35%의 단백질을 포함하는 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 바이오매스.
  2. 제1항에 있어서,
    적어도 45%의 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 바이오매스.
  3. 제1항에 있어서,
    적어도 60%의 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 바이오매스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    건조 물질의 중량과 비교한 중량으로 20% 미만의 지방을 포함함을 특징으로 하는, 바이오매스.
  5. 제4항에 있어서,
    10% 미만의 지방을 포함함을 특징으로 하는, 바이오매스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 오란티오키트리움(Aurantiochytrium), 아플라노키트리움(Aplanochytrium), 보트리오키트리움(Botryochytrium), 자포노키트리움(Japonochytrium), 오블론지키트리움(oblongichytrium), 파리에티키트리움(Parietichytrium), 스키조키트리움(Schizochytrium), 시초이도키트리움(Sicyoidochytrium), 트라우스트키트리움(thraustochytrium) 및 울케니아(Ulkenia)로 구성된 그룹 중에서 선택된 속의 것임을 특징으로 하는, 바이오매스.
  7. 제6항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/2(Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2); 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/3(Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3); 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/4(Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4); 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/5(Aurantiochytrium mangrovei, CCAP 4062/5); 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/6(Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6); 오란티오키트리움 맹그로베이 CCAP 4062/1(Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1); 스키조키트리움 종 4087/3(Schizochytrium sp. 4087/3); 스키조키트리움 종 CCAP 4087/1(Schizochytrium sp. CCAP 4087/1); 스키조키트리움 종 CCAP 4087/4(Schizochytrium sp. CCAP 4087/4); 스키조키트리움 종 CCAP 4087/5(Schizochytrium sp. CCAP 4087/5)의 종 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 바이오매스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    1% 내지 95%의 수분 함량을 가지는 것을 특징으로 하는, 바이오매스.
  9. 제8항에 있어서,
    70% 내지 90%의 수분 함량을 가지는 것을 특징으로 하는, 바이오매스.
  10. 제8항에 있어서,
    1% 내지 10%의 수분 함량을 가지는 것을 특징으로 하는, 바이오매스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 기재된 바이오매스의 제조방법으로서,
    a. 탄소원, 질소원, 인원 및 염을 포함하는 규정된 배양 배지에서 트라우스토키트리드를 배양하는 제1 단계로서, 상기 제1 단계 a)는
    a1) 배지의 탄소원 함량이 20g/L 미만이 될 때까지 적당한 배양 배지에서의 성장의 제1 하위 단계에 이어서,
    a2) 배양 밀도가 적어도 40g/L의 건조 물질이 될 때까지 하나 이상의 탄소원, 질소원 및/또는 인원의 농축 용액이 배양 배지에 동시에 또는 연속적으로 첨가되는 생산의 제2 하위 단계의 2개의 하위 단계로 구분되는, 제1 단계;
    b. 배양 배지로부터 상기 바이오매스를 분리함으로써, 제1 단계에서 수득된 바이오매스를 회수하는 제2 단계
    를 포함하는, 방법
  12. 제11항에 있어서,
    단계 a2)에서 탄소원 함량이 0 내지 50g/L로 유지되고, 질소원 함량이 0.5 내지 5g/L로 유지되고, 인원 함량이 0.5 내지 5g/L로 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    c. 제2 단계에서 회수된 바이오매스를 건조시키는 제3 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득될 수 있는 바이오매스.
  15. 인간 또는 동물의 화장품 또는 식품 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제10항 또는 제14항 중 어느 한 항에 기재되거나 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득된 바이오매스의 용도.
  16. 동물의 수행능력을 향상시키기 위한, 제1항 내지 제10항 또는 제14항 중 어느 한 항에 기재된 트라우스토키트리드 바이오매스.
  17. 제16항에 있어서,
    수행능력의 향상이 소모, 체중 증가, 또는 사료 전환 비율의 측정에 의해 평가되는, 바이오매스.
  18. 제1항 내지 제10항 또는 제14항 중 어느 한 항에 기재되거나 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득된 바이오매스를 포함하는 인간 또는 동물용 화장품 또는 약학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제10항 또는 제14항 중 어느 한 항에 기재되거나 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득된 바이오매스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
  20. 제1항 내지 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재되거나 제13항에 따른 방법으로 수득된 바이오매스를 1% 내지 60%로 포함하는 것을 특징으로 하는 가축 사료.
  21. 제20항에 있어서,
    제1항 내지 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재되거나 제13항에 따른 방법으로 수득된 바이오매스를 1% 내지 20%로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
  22. 제21항에 있어서,
    제1항 내지 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재되거나 제13항에 따른 방법으로 수득된 바이오매스를 3% 내지 8%로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
  23. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재되거나 제11항 또는 제12항에 따른 방법으로 수득된 바이오매스를 1% 내지 40%로 포함하는 것을 특징으로 하는 가축 사료.
  24. 제23항에 있어서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재되거나 제11항 또는 제12항에 따른 방법으로 수득된 바이오매스를 5% 내지 10%로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
  25. 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 또는 제13항 중 어느 한 항에 기재되거나 제11항 또는 제12항에 따른 방법으로 수득된 바이오매스.
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