CN108026503A - 富含蛋白质的破囊壶菌的生物质、培养方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术领域是微藻、特别是破囊壶菌的培养物。本发明涉及富含蛋白质的破囊壶菌的生物质、获得所述生物质的方法及其用途。
Description
技术领域
本发明属于微藻、特别是破囊壶菌的培养领域。本发明的一个目的在于提供一种富含蛋白质的破囊壶菌生物质、获得所述生物质的方法及其在食品中的用途。
背景技术
已知几种植物蛋白质来源直接或作为膳食补充剂用于人或动物消耗的食品中，为动物和人提供其代谢所必需的氨基酸。这些蛋白质源往往作为食品被摄取之后动物或人可用的氨基酸来源。
动物饲料中使用的植物蛋白质的最著名的来源是大豆，通常为粕的形式，即油萃取后剩余的固体残渣。然而，使用大豆粕具有与其来源相关的几个缺点。粕通常从进行集约大豆种植的国家进口，不利于提供生物多样性的其他植物。此外，许多国家推广种植基因修饰的(GM)大豆品种，这些品种与粕中的非GM大豆混合在一起，这无助于满足对植物来源的无基因修饰生物(GMO)的食品日益增长的需求。
WO 2010/051489公开了基于由基因修饰的光合微生物组成的生物质的动物饲料。由GM微生物产生的重组酶的作用是降解所述生物质以使其与动物饲养相容。
已知植物蛋白质的其他来源，特别是螺旋藻和小球藻，其用作人的膳食补充剂。
然而，像小球藻一样，螺旋藻具有低生产力的缺点，这妨碍了高产量发酵罐培养。如果他们的培养使得能够满足传统膳食补充剂的局部地区和有限的需求，但这无助于实现更广泛、经济上可行地工业化生产膳食蛋白质来源的目标，这些蛋白质的品质将使其能够在用于动物和人消耗的食品中替代普通膳食蛋白质来源如大豆。
相反，已知在发酵罐中具有工业生产能力的原生生物已长期用于生产富含多不饱和脂肪酸如DHA或EPA的脂肪，例如WO 97/37032，WO 2015/004402或WO 2012/175027。然而，所获得的(包括在脂肪萃取后获得的)生物质不含足以允许它们用作食品中的蛋白质来源的蛋白质含量，至少在无昂贵的额外蛋白质富集步骤的情况下是如此。此外，用于油萃取的方法有时可能会污染剩余的生物质，特别是掺入了使其不适合消耗的有机溶剂。
本发明的目标之一是提供用于动物或人消耗的蛋白质新来源，其满足广泛的、经济上可行的工业生产的目标，其品质将使其能够代替诸如大豆等常见来源。
本发明表明，在某些培养条件下，已知用于生产具有高的多不饱和脂肪酸含量(特别是DHA，EPA)的油的破囊壶菌是能够产生大量蛋白质的微生物，这能使它们成为类似于大豆的膳食蛋白质来源，特别是用于动物饲料。
发明内容
因此，本发明的第一个目的是一种破囊壶菌生物质，其可包含按重量计至少35％的蛋白质，优选为至少45％的蛋白质，其范围可以为多达多于60％的蛋白质，甚至多于75％的蛋白质，特别是45％至75％的蛋白质，相对于干物质的重量。
蛋白质的重量百分比可以按蛋白质本身来表示或按所述蛋白质中所含的氨基酸来表示。
根据本发明的一个变体，所述生物质可以进一步包含按重量计小于20％的脂肪，优选为小于10％的脂肪，更优选为小于7％的脂肪，相对于干物质的重量。
优选地，根据本发明，所述生物质是破囊壶菌生物质，其可以包含按重量计至少35％的蛋白质、优选为至少45％的蛋白质、非常优选为45％至60％的蛋白质，以及小于20％的脂肪、优选为小于10％的脂肪、更优选为小于7％的脂肪，都相对于干物质的重量。
本发明还涉及一种生产如上下文所定义的生物质的方法，其特征在于所述方法包括：
a.第一步骤，在合适的培养基中和在下述条件下培养破囊壶菌，直到达到至少40g/L干物质、优选至少60g/L干物质、更优选至少80g/L干物质的培养物密度，所述条件能够促进以按重量计相对于干物质的重量至少35％蛋白质的水平生产蛋白质以及任选地将脂肪的生产限制到按重量计相对于干物质的重量低于20％的脂肪的水平；
b.第二步骤，通过从培养基分离所述生物质来回收在第一步骤中获得的生物质(收获)；和如果需要的话的第三步骤
c.第三步骤，将在第二步骤中回收的生物质干燥。
本发明还涉及如上文或下文所定义的生物质在人或动物化妆品和食品(特别是包含这种生物质的食品)领域中的用途。
本发明还涉及根据本发明的生物质，其用于治疗用途。
本发明还涉及包含根据本发明的生物质的用于人或动物的化妆品或药物组合物，以及包含根据本发明的生物质的用于人或动物的食品或食品组合物。
具体实施方式
根据本发明，术语“生物质”有利地指代通过培养上述原生生物产生的一组破囊壶菌细胞，其具有本文中描述的蛋白质和任选的脂肪酸的水平，其细胞可能会或可能不会保持其物理完整性。
因此可以理解，所述生物质可以包含范围为0％至100％的降解的破囊壶菌细胞的量。术语“降解”表明所述破囊壶菌细胞的结构和/或组成可能已被修饰。例如，它们可能已经经历干燥步骤或油收获步骤，重要的是包含这些细胞的生物质具有本文中描述的蛋白质和任选的脂肪酸的水平。
根据本发明的优选实施方式，生物质并未经历在收获期间或收获后修饰其氨基酸组成的处理。即所述生物质在收获后所经历的处理不改变其氨基酸组成。特别是生物质没有经历蛋白质和/或氨基酸富集的步骤。也就是说，包含在根据本发明的生物质中的蛋白质、肽和氨基酸仅源自破囊壶菌的培养。应该注意，不是由破囊壶菌产生的蛋白质或氨基酸也可能存在于培养基中，尤其是在包含酵母提取物的培养基上预培养的情况中更是如此。如果存在的话，存在于生物质中的残留量的这些蛋白质包括不经历蛋白质和/或氨基酸富集的生物质的定义中。
根据本发明的一个更优选的实施方式，生物质未经历改变其氨基酸和脂肪组成的处理。即所述生物质在收获后所经历的处理不改变其氨基酸和脂肪组成。特别地，氨基酸相比于脂肪的相对组成基本保持恒定。
在一些情况下观察到，根据本发明的生物质中的未降解的破囊壶菌相比于降解的破囊壶菌具有较好的防腐和消化性的性质。本发明的优选形式之一是包含基本上主要量的未降解的破囊壶菌的生物质。
根据本发明，术语“降解的”是指其结构和/或化学完整性可能已经改变的破裂壶壶菌，例如裂解的破囊壶菌，例如由均质化过程产生。
但是明显的是，一经产生，所述生物质可以原样使用，可以任选地干燥，或者经历其使用所必需的任何处理，特别是均质化。
根据本发明，所述生物质可以具有按重量计1％至95％的水分含量，相对于干物质的重量。
优选地，根据本发明的第一变体，所述生物质可以具有按重量计70％至90％、优选80％至85％的水分含量，相对于干物质的重量。
更优选地，根据本发明的第二变体，所述生物质可以具有按重量计1％至10％、优选2％至7％的水分含量，相对于干物质的重量。
根据本发明，所述破囊壶菌可以是破囊壶菌目(Thraustochytriales)，优选为亚纲破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)，更优选为可以选自以下属的属：Aurantiochytrium，Aplanochytrium，Botryochytrium，Japonochytrium，Oblongichytrium，Parietichytrium，Schizochytrium，Sicyoidochytrium，Thraustochytrium和Ulkenia。
破囊壶菌非常优选为非基因修饰的微生物。如果使用GM破囊壶菌，它们不含编码一种或多种酶的基因，这些酶可以使其降解或消化用作食品的生物质。
有利地，所述破囊壶菌可以选自如下种：Aplanochytrium kerguelense；Aplanochytrium minuta；Aplanochytrium stocchinoi；Aplanochytrium sp.PR24–1；Aurantiochytrium limacinum；Aurantiochytrium limacinum AB022107；Aurantiochytrium limacinum HM042909；Aurantiochytrium limacinum JN986842；Aurantiochytrium limacinum SL1101JN986842；Aurantiochytrium mangrovei；Aurantiochytrium mangrovei DQ323157；Aurantiochytrium mangrovei DQ356659；Aurantiochytrium mangrovei DQ367049；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5；Aurantiochytrium mangrovei CCAP4062/6；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1；Aurantiochytrium sp.AB052555；Aurantiochytrium sp.AB073308；Aurantiochytrium sp.ATCC PRA276 DQ836628；Aurantiochytrium sp.BL10 FJ821477；Aurantiochytrium sp.LY 2012 PKU Mn5JX847361；Aurantiochytrium sp.LY2012 JX847370；Aurantiochytrium sp.N1–27；Aurantiochytrium sp.SD116；Aurantiochytrium sp.SEK209 AB290574；Aurantiochytrium sp.SEK217 AB290572；Aurantiochytrium sp.SEK 218 AB290573；Aurantiochytrium sp.18W–13a；Botryochytrium radiatum；Botryochytrium radiatumRaghukumar 16；Botryochytrium radiatum SEK353；Botryochytrium sp.；Botryochytrium sp.BUTRBC 143；Botryochytrium sp.Raghukumar 29；Oblongichytriumminutum；Oblongichytrium multirudimentalis；Oblongichytrium sp.；Oblongichytriumsp.SEK347；Parieticytrium sarkarianum；Parieticytrium sarkarianum SEK351；Parieticytrium sarkarianum SEK364；Parieticytrium sp.；Parieticytrium sp.F3–1；Parieticytrium sp.H1–14；Parieticytrium sp.NBRC102984；Phytophthora infestans；Schizochytrium aggregatum DQ323159；Schizochytrium aggregatum DQ356661；Schizochytrium aggregatum；Schizochytrium limacinum；Schizochytrium limacinumOUC166 HM042907；Schizochytrium mangrovei；Schizochytrium mangrovei FB1；Schizochytrium mangrovei FB3；Schizochytrium mangrovei FB5；Schizochytriumminutum；Schizochytrium sp.ATCC20888DQ367050；Schizochytrium sp.KGS2 KC297137；Schizochytrium sp.SKA10JQ248009；Schizochytrium sp.ATCC 20111；Schizochytriumsp.ATCC 20888；Schizochytrium sp.ATCC 20111 DQ323158*；Schizochytrium sp.ATCC20888DQ356660；Schizochytrium sp.ATCC 20889；Schizochytrium sp.ATCC 26185；Schizochytrium sp.BR2.1.2；Schizochytrium sp.BUCAAA 032；Schizochytriumsp.BUCAAA 093；Schizochytrium sp.BUCACD 152；Schizochytrium sp.BUCARA 021；Schizochytrium sp.BUCHAO 113；Schizochytrium sp.BURABQ 133；Schizochytriumsp.BURARM 801；Schizochytrium sp.BURARM 802；Schizochytrium sp.CCAP 4087/3；Schizochytrium sp.CCAP 4087/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/4；Schizochytriumsp.CCAP 4087/5；Schizochytrium sp.FJU–512；Schizochytrium sp.KH105；Schizochytrium sp.KK17–3；Schizochytrium sp.KR–5；Schizochytrium sp.PJ10.4；Schizochytrium sp.SEK 210；Schizochytrium sp.SEK 345；Schizochytrium sp.SEK346；Schizochytrium sp.SR21；Schizochytrium sp.TIO01；Sicyoidochytrium minutumSEK354；Sicyoidochytrium minutum NBRC 102975；Sicyoidochytrium minutum NBRC102979；Thraustochytriidae sp.BURABG162 DQ100295；Thraustochytriidae sp.CG9；Thraustochytriidae sp.LY2012 JX847378；Thraustochytriidae sp.MBIC11093AB183664；Thraustochytriidae sp.NIOS1 AY705769；Thraustochytriidae sp.#32DQ323161；Thraustochytriidae sp.#32 DQ356663；Thraustochytriidae sp.RT49DQ323167；Thraustochytriidae sp.RT49 DQ356669；Thraustochytriidae sp.RT49；Thraustochytriidae sp.Thel2 DQ323162；Thraustochytriidae sp.Thel2；Thraustochytrium aggregatum；Thraustochytrium aggregatum DQ356662；Thraustochytrium aureum；Thraustochytrium aureum DQ356666；Thraustochytriumgaertnerium；Thraustochytrium kinnei；Thraustochytrium kinnei DQ323165；Thraustochytrium motivum；Thraustochytrium multirudimentale；Thraustochytriumpachydermum；Thraustochytrium roseum；Thraustochytrium sp.13A4.1；Thraustochytrium sp.ATCC 26185；Thraustochytrium sp.BL13；Thraustochytriumsp.BL14；Thraustochytrium sp.BL2；Thraustochytrium sp.BL3；Thraustochytriumsp.BL4；Thraustochytrium sp.BL5；Thraustochytrium sp.BL6；Thraustochytriumsp.BL7；Thraustochytrium sp.BL8；Thraustochytrium sp.BL9；Thraustochytriumsp.BP3.2.2；Thraustochytrium sp.BP3.3.3；Thraustochytrium sp.caudivorum；Thraustochytrium sp.CHN–1；Thraustochytrium sp.FJN–10；Thraustochytrium sp.HK1；Thraustochytrium sp.HK10；Thraustochytrium sp.HK5；Thraustochytrium sp.HK8；Thraustochytrium sp.HK8a；Thraustochytrium sp.KK17–3；Thraustochytrium sp.KL1；Thraustochytrium sp.KL2；Thraustochytrium sp.KL2a；Thraustochytrium sp.ONC–T18；Thraustochytrium sp.PJA10.2；Thraustochytrium sp.TR1.4；Thraustochytriumsp.TRR2；Thraustochytrium striatum；Thraustochytrium striatum ATCC24473；Thraustochytrium striatum DQ323163；Thraustochytrium striatum DQ356665；Thraustochytrium visurgense；Ulkenia amoeboidea SEK 214；Ulkenia profunda；Ulkenia profunda BUTRBG 111；Ulkenia sp.；Ulkenia sp.ATCC 28207；Ulkeniavisurgensis；Ulkenia visurgensis BURAAA 141；Ulkenia visurgensis ATCC 28208。
优选根据本发明，破囊壶菌可以选自属Aurantiochytrium和Schyzochitrium，优选来自如下种：
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6，
于2013年6月21日保藏在CCAP的Aurantiochytrium CCAP 4062/1，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/3，
于2012年2月28日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/1，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/4和
于2014年5月20日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/5。
所有的保藏都是根据布达佩斯条约的规定在CCAP(CULTURE COLLECTION OFALGAE AND PROTOZOA(CCAP)、SAMS Research Services Ltd.、Scottish MarineInstitute、OBAN、Argyl PA37 1QA United Kingdom)进行的。
根据本发明的优选变体，所述生物质可以是如下的生物质：
-破囊壶菌的生物质，所述破囊壶菌可选自属Aurantiochytrium和Schizochytrium，优选为选自如下种：Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5；Aurantiochytrium mangrovei CCAP4062/6；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/3；Schizochytrium sp.CCAP 4087/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/4；Schizochytriumsp.CCAP 4087/5；并且具有：
-按重量计的蛋白质含量，为至少35％的蛋白质，优选至少45％的蛋白质，其范围可高达多于60％的蛋白质，甚至多于75％的蛋白质，特别是45％至75％的蛋白质，相对于干物质的重量；
-按重量计的脂肪含量，为低于20％，优选为低于10％，非常优选为7％，相对于干物质重量；和
-在干燥之前的水分含量，为70％至90％，优选为80％至85％，或干燥后的水分含量，为1％至10％，优选为2％至7％。
本发明的目的还包括生产如上所述生物质的方法，该方法包括：
a.第一步骤，在合适的培养基中和在下述条件下培养破囊壶菌，直到达到至少40g/L干物质、优选至少60g/L干物质、更优选至少80g/L干物质的培养物密度，所述条件能够促进以按重量计相对于干物质的重量至少35％的蛋白质、优选45％的蛋白质(其范围可高达多于60％的蛋白质，甚至多于75％的蛋白质，特别是45％至75％的蛋白质)的水平生产蛋白质以及任选地将脂肪的生产限制到按重量计相对于干物质的重量低于20％的脂肪、优选低于10％的脂肪、更优选低于7％的脂肪的水平；
b.第二步骤，通过从培养基分离所述生物质来回收在第一步骤中获得的生物质；和如果需要的话的第三步骤
c.第三步骤，将在第二步骤中回收的生物质干燥。
优选地，培养破囊壶菌的步骤a)在培养基中和适于促进蛋白质生产和限制脂肪生产的条件下进行。
根据本发明，所述合适的培养基优选为化学限定的培养基，其包含碳源、氮源、磷源和盐。
根据本发明，术语“化学限定的培养基”是指其中每种元素的含量是已知的培养基。确切地说，本发明涉及可能不包含富集或复杂的有机物质的培养基。表述“富集或复杂的有机物质”是指未纯化的有机物质，其表现为混合物，其混合物的各种组分的确切组成和浓度未知其精确度、不受控制，并且不同批次之间可能具有显著的可变性。作为富集或复杂的有机物质的例子，可以提及的是酵母提取物或作为蛋白质水解反应产物的蛋白胨，或者也可以是富集的矿物质例如海洋矿物盐或其他复合生长剂，其每个组分不具有固定的浓度。
根据本发明，所述限定的培养基可以包含选自下组的盐：钙盐，钴盐，锰盐，镁盐，锌盐，镍盐，铜盐，钾盐，铁盐和钠盐以及它们的混合物。
有利地，所述盐可以选自氯化钙，氯化钴，氯化锰，硫酸镁，硫酸锌，硫酸镍，硫酸铜，硫酸钾，硫酸铁，钼酸钠，亚硒酸钠，氯化钠及其混合物。
根据本发明的一个变体以及根据使用的菌株，培养基还可以包含氯化钠(NaCl)，特别是对于某些海洋来源的菌株。
根据该变体，可以提及例如可以允许培养基包含氯化钠的海洋菌株，裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的菌株，特别是裂殖壶菌CCAP 4062/3的菌株。
根据本发明的另一个变体以及根据使用的菌株，培养基可以不包含氯化钠(NaCl)，至少可以包含非常少量的氯化钠，其具有小于3.5g/L、优选小于1g/L、更优选小于10mg/L的钠离子和小于1g/L、优选小于500mg/L、更优选200mg/L的氯离子。
根据该变体，可以提及例如可以允许培养基可能不包含氯化钠(NaCl)、至少可以包含非常少量的氯化钠的菌株，Aurantiochytrium mangrovei的菌株，特别是菌株Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5。
根据本发明，所述限定的培养基的碳源可以是一种或多种碳水化合物，一种或多种乙酸盐，一种或多种醇，一种或多种复杂分子，或这些来源中至少两种按任何比例的任何混合物。
根据本发明，所述限定的培养基的所述氮源可以选自一种或多种硝酸盐，一种或多种谷氨酸盐，一种或多种铵盐，脲，氨，或这些来源中至少两种按任何比例的任何混合物。
根据本发明，所述限定的培养基的磷源可以选自磷酸，磷酸盐，有利的是磷酸氢二钠(Na2HPO4)，或磷酸二氢钠(NaH2PO4)，或磷酸二氢钾(KH2PO4)，或磷酸氢二钾(K2HPO4)，或这些来源中至少两种按任何比例的任何混合物。
根据本发明的一个变体，所述培养基可以包含：氯化镁，有利地为四水合物形式(MgCl2·4H2O)；氯化钙，有利地为二水合物形式(MgCl2·4H2O)；氯化钴六水合物(CoCl2·6H2O)；氯化锰(II)四水合物(MnCl2·4H2O)；硫酸镁七水合物(MgSO4·7H2O)；硫酸锌七水合物(ZnSO4·7H2O)；硫酸镍六水合物(NiSO4·6H2O)；合硫酸铜五水合物(CuSO4·5H2O)；硫酸钾(K2SO4)；硫酸亚铁七水合物(FeSO4·7H2O)；硼酸(H3BO3)；以二水合二钠形式的乙二胺四乙酸(Na2EDTA·2H2O)；钼酸钠二水合物(Na2MoO4·2H2O)；亚硒酸钠(Na2SeO3)；作为维生素的硫胺、钴胺素或维生素B12、泛酸或维生素B5；碳源；氮源；磷源。
根据本发明的优选形式，在所述培养基中，氯化镁的浓度可以为0.008至0.012g/L，有利地为0.009至0.011g/L；氯化钙的浓度可以为0.40至0.70g/L，有利地为0.50至0.60g/L；氯化钴六水合物的浓度可以为0.00008至0.00013g/L，有利地为0.00009至0.00012g/L；氯化锰(II)四水合物的浓度可以为0.008至0.013g/L，有利地为0.009至0.012g/L；硫酸镁七水合物的浓度可以为6至10g/L，有利地为7至9g/L；硫酸锌七水合物的浓度可以为0.008至0.013g/L，有利地为0.009至0.012g/L；硫酸镍六水合物的浓度可以为0.004-0.007g/L，有利地为0.005-0.006g/L；硫酸铜五水合物的浓度可以为0.005至0.009g/L，有利地为0.006至0.008g/L；硫酸钾的浓度可以为0.5至3.5g/L，有利地为1至3g/L；硫酸亚铁七水合物的浓度可以为0.03至0.05g/L，有利地为0.035至0.045g/L；硼酸的浓度可以为0.0155至0.0195g/L，有利地为0.0165至0.0185g/L；二水合二钠形式的乙二胺四乙酸的浓度可以为0.10至0.14g/L，有利地为0.11至0.13g/L；钼酸钠二水合物的浓度可以为0.00001至0.0003g/L，有利地为0.00005至0.0002g/L；亚硒酸钠的浓度可以为0.00000015至0.000019g/L，有利地为0.00000016至0.00000018g/L；硫胺的浓度可以为0.015至0.05g/L，有利地为0.025至0.04g/L；钴胺素或维生素B12的浓度可以为0.0004至0.00065g/L，有利地为0.00045至0.00060g/L；泛酸或维生素B5的浓度可以为0.008至0.013g/L，有利地为0.009至0.012g/L；碳源的浓度可以为45至65g/L，有利地为50至60g/L；氮源的浓度可以为7至11g/L，有利地为8至10g/L；磷源的浓度可以为2至6g/L，有利地为3至5g/L。
非常优选地，根据本发明，在所述培养基中，氯化镁的浓度为0.0108g/L；氯化钙的浓度为0.55g/L；氯化钴六水合物(CoCl2·6H2O)的浓度为0.000108g/L；氯化锰(II)四水合物的浓度为0.0108g/L；硫酸镁七水合物的浓度为8.01g/L；硫酸锌七水合物的浓度为0.0108g/L；硫酸镍六水合物的浓度为0.0056g/L；硫酸铜五水合物的浓度为0.0072g/L；硫酸钾的浓度为2.09g/L；硫酸亚铁七水合物的浓度为0.04g/L；硼酸的浓度在0.0155和0.0195g/L之间，为0.0175g/L；二水合二钠形式的乙二胺四乙酸浓度为0.12g/L；钼酸钠二水合物的浓度为0.000108g/L；亚硒酸钠的浓度为0.000000173g/L；硫胺的浓度为0.032g/L；钴胺素或维生素B12的浓度为0.00052g/L；泛酸或维生素B5的浓度为0.0108g/L；碳源的浓度为55g/L；氮源的浓度为9g/L；磷源的浓度为4g/L。
根据本发明，所述方法的第一培养步骤a)可以按所谓的“间歇”不连续模式、“间歇进料”半连续模式、或者按连续模式进行。
根据本发明的一种特定的实施方式，所述第一步骤a)分成两个子步骤，在合适的培养基中的第一生长子步骤a1)，然后是第二生产子步骤a2)，其中将一种或多种碳源、氮源和/或磷源富集溶液同时或接连添加至培养基，以保持培养基中的氮、磷水平不会限制生长。
根据一个优选的实施方式，进行生长子步骤a1)，直到获得小于20g/L的碳源(更具体而言是葡萄糖)的浓度。
根据另一种实施方式，进行生长子步骤a1)，直到获得下述培养物密度：至少20g/L，优选至少40g/L，更优选至少60g/L，甚至更优选至少80g/L。
在步骤a2)中的氮源的非限制性水平有利地为0.5至5g/L、优选0.5至2g/L，磷源的非限制性水平有利地为0.5至5g/L、优选0.5至2g/L。该步骤a2)所需的碳源含量可以是0至200g/L，尤其是5或10至50g/L。优选地，子步骤a2)中的碳源含量为0至50g/L，更优选为0至10g/L。
优选地，将第一步骤a)分成如上定义的两个子步骤a1)和a2)的培养按所谓的“间歇进料”半连续模式进行。
用于使破囊壶菌能以大于20g/L、特别是大于80g/L的密度生长的合适方法和培养基对于本领域技术人员来说是公知的。
根据本发明，培养可以通过任何已知的培养技术进行，例如在烧瓶中或在反应器中进行，但也可以在发酵罐或任何适于原生生物(特别是破囊壶菌)生长的容器例如“滚道(raceway)”型流域中进行，只要所述技术能够实现所需的培养条件即可。
优选地，培养在发酵罐中根据用于在发酵罐中培养原生生物的已知方法进行。
根据本发明，所述方法的用于回收所述生物质的第二步骤b)可以在适于获得可具有所需水分含量的生物质的条件下进行。
所述原生生物的回收可以通过允许回收生物质的任何技术进行，特别是过滤方法，重力或减压方法，离心方法，滗析方法，或甚至是沉淀然后重力过滤的方法。
本发明的目的还在于这样的生物质，其可以通过如上所述的本发明的方法以其所有变体形式获得。
本发明的目的还在于如上所述的生物质在人或动物化妆品、药物和食品领域中的用途。
本发明具体涉及如上下文所述的根据本发明的破囊壶菌生物质用于改善动物性能的用途。性能的改善可以特别通过测量消耗、体重增加或饲料转化比来评估。
在动物饲养方面，牲畜的饲养、特别是集约化畜牧业的饲养将有别于家养动物或宠物或所谓的“消遣(leisure)”动物(例如水族鱼类或鸟舍或笼养的鸟类)的饲养。
术语“牲畜”特别指放牧动物(特别是养来生产肉、奶、奶酪和皮革的牛；养来用于生产肉、羊毛和奶酪的绵羊；山羊)，猪，兔子，家禽(雏鸡，母鸡，火鸡，鸭，鹅等)，马家族成员(小型马，马，驹)，用于支持人类活动(运输，消遣)或其饲养的动物，水生动物(例如鱼，虾，牡蛎和蚌类)。然而，饲养鱼直至仔鱼期可能有别于养成的鱼的饲养，包括用于此目的的饲料和饲料组合物。
家畜、宠物和消遣动物(还包括哺乳动物，反刍动物或不包括)将有别于鸟类和鱼类。它们特别包括狗和猫。
本发明的目的还包括用于人或动物的食品或食品组合物，其可以包含如上所述的根据本发明的生物质。术语“食品”是指可用作人或动物、特别是家畜的食品的任何组合物。
根据本发明，食品可以仅包含任选干燥的、任选转化的生物质，或包含任选干燥的、任选转化的生物质与用于人或动物消耗的食品领域的任何其它添加剂、载剂或支持物的混合物，所述添加剂、载剂或支持物例如为食品防腐剂，染料，增味剂，pH调节剂，或药物添加剂例如生长激素、抗生素。
本发明特别涉及用于动物、更特别是用于牲畜的饲料。这些饲料通常出现为以下形式：掺入根据本发明的生物质的面粉、丸粒、剩菜屑(slop)。术语“饲料”是指可以用来喂养动物的任何东西。
对于集约式动物饲养作业，除藻类生物质之外，饲料还可以包含营养基质和营养添加剂。因此，动物饲料配给量的必要部分由“营养基质”和藻类生物质组成。这种基质例如由谷类、动物和/或植物来源的蛋白质和脂肪的混合物组成。
动物的营养基质适于饲养这些动物，并且是本领域技术人员熟知的。在本发明的上下文中，这些营养基质包含例如玉米，小麦，豌豆和大豆。这些营养基质适于它们预期用于的各种动物物种的需要。这些营养基质可以已经含有营养添加剂，如维生素、矿物盐和氨基酸。
可以添加用于动物饲料的添加剂以改善饲料的某些特性，例如增强饲料的风味，使饲料的原料更易被动物消化，或保护动物。它们经常用于大规模集约化养殖作业。
用于动物饲料的添加剂特别可分为以下子类(来源：EFSA)：
-技术添加剂：例如防腐剂，抗氧化剂，乳化剂，稳定剂，酸度调节剂和青贮饲料添加剂；
-感官添加剂：例如香料，染料，
-营养添加剂：例如维生素，氨基酸，和微量元素；
-畜牧添加剂：例如，消化性增强剂，肠道菌群稳定剂；
-球虫抑制剂和组织滴虫抑制剂(杀虫剂)。
在一种实施方式中，本发明涉及牲畜饲料，其包含1％至60％、优选1％至20％、非常优选3％至8％的通过本发明的方法获得的干燥的生物质。
在另一种实施方式中，本发明涉及牲畜饲料，其包含1％至40％、优选5％至10％的通过本发明的方法获得的非干燥的生物质。
根据本发明的一种特定实施方式，饲料意在用于牲畜，特别是牛，羊，猪，兔，家禽和马。
根据本发明的另一种特定实施方式，饲料意在用于水生动物，特别是鱼类，至少达到仔鱼期，实际上包括养殖鱼。
根据本发明的另一种特定实施方式，饲料意在用于家畜，宠物和/或消遣动物。
最后，根据本发明的另一种实施方式，食品组合物意在用于人。
本发明还有一个目的是用于人或动物的化妆品或药物组合物，其可以包含如上所述的根据本发明的生物质。
根据本发明，化妆品或药物组合物可以仅包含任选干燥的、任选转化的生物质，或包含任选干燥的、任选转化的生物质与化妆品领域中使用的任何其它添加剂、载剂或支持物(例如防腐剂，染料，pH调节剂)的混合物。
本发明还有一个目的是如上所述的生物质在治疗中的用途以及在预防和处理营养不良方面的用途。
附图说明
图1：23日龄雏鸡的表观代谢能(AME)测量的实验设计；(试验14ALG069)
图2：雏鸡的选择和消耗试验的实验设计(7日龄和9日龄)；(试验14ALG081)
图3：在选择条件下(玉米-大豆饲料相对于用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料)测量7日龄时的饲料消耗(试验14ALG081)
图4：在选择条件下(玉米-大豆饲料相对于用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料)测量9日龄时的饲料消耗(试验14ALG081)
图5：在选择条件下(玉米-大豆饲料相对于用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料)的2次试验(在7天和9天)的平均相对饲料消耗的测量(试验14ALG081)
图6：喂食对照玉米-大豆饲料相对于喂食用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料(不在选择条件下)的0至7日龄鸡的生长性能(消耗，体重增加，饲料转化比)的测量(试验14ALG081)
图7：喂食对照玉米-大豆饲料相对于喂食用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料(不在选择条件下)的0至9日龄鸡的生长性能(消耗，体重增加，饲料转化比)的测量(试验14ALG081)
实施例
通过阅读以下实施例和描述其的附图，本发明的其它方面和特征将变得显而易见。
·图1显示了23日龄的鸡的表观代谢能(AME)测量的实验设计；(试验14ALG069)。将约300只1日龄雄性雏鸡(Ross PM3)置于相同的低密度箱中，并喂养含有小麦、玉米和大豆粕的标准起始饲料(starter)。在13日龄时，使鸡饥饿2小时，然后称重并按重量组分配。按此选择120只鸡，置于单独的代谢笼中并根据它们的重量分派其中实验处理之一(对于每次饮食重复20次)。
饲料和水在整个试验过程中随意分发。实验饲料以3.2毫米直径丸粒形式提供。经过对饮食和代谢笼7天的适应之后，从第20天到第23天，进行了3天的总排泄物收集期，该期间的前后都是17小时禁食。每天单独收集排泄物，合并并在-20℃储存。在试验结束时，将收集的排泄物冻干，然后在室温下留待吸水阶段(48小时)，以稳定水分含量，然后是称重、研磨(0.5mm)和分析。
·图2显示了雏鸡(7日龄和9日龄)的选择和消耗试验的实验设计；(试验14ALG081)。平行进行两个实验测试。
1)试验1-选择试验：对于选择饲料的试验，将约200只1日龄雄性雏鸡(Ross PM3)分成约20只一组，置于分开的代谢笼中，并喂食含有小麦、玉米和大豆粕的标准起始饲料。在6日龄时，使鸡饥饿2小时，然后称重并按重量组分配。因此选择120只鸡，按4个一组放置到30个分开的代谢笼中，并在第7天根据它们的重量分配实验处理之一(对于每个处理重复10次)。每个笼子包含两个含有不同饲料的饲养盘，对应于以下三种实验处理：
o处理1：玉米-大豆起始饲料(饲养盘1)和5％微藻(饲养盘2)
o处理2：玉米-大豆起始饲料(饲养盘1)和10％微藻(饲养盘2)
o处理3：玉米-大豆起始饲料(饲养盘1)和15％微藻(饲养盘2)
饲料和水在整个试验过程中随意分发。实验饲料以3.2毫米直径丸粒形式提供。在7日龄和9日龄时，测量在T0+1h、T0+2h、T0+3h、T0+4h和T0+6h的消耗，笼中的饲养盘每小时切换一次。在两次消耗量测量之间(第8天)，动物接受小麦-玉米-大豆起始饲料。
2)试验2-消耗测量：在第二试验中，雏鸡只能获得一种类型的饲料，任选地补充有微藻(图6)。将约400只1日龄雄性雏鸡(Ross PM3)称重并按重量组分配。将240只选择的动物在第1天按照4只一组放置在60个未分开的笼子中，所述笼子在重量均匀的区组中(15个区组，每个区组4个笼子)，每笼具一个饲养盘，每个饲养盘含有实验饲料(对于每个饲料重复15次)。在每个笼中，各自确认4只雏鸡。饲料和水在整个试验过程中随意分发。实验饲料是补充有0％、5％、10％或15％微藻的玉米-大豆起始饲料，也在试验1中用于饲料的选择。在1、7和9日龄测量个体活体重。称重未食用饲料，并在7日龄和9日龄测量每笼的消耗。从0到7日龄，饲喂含有10％微藻的饲料的动物与对照组和其他两种补充饮食相比，体重增加显著改善。
·图3显示了在选择条件下(玉米-大豆饲料相对于用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料)7日龄时的饲料消耗的测量(试验14ALG081)
·图4显示了在选择条件下(玉米-大豆饲料相对于用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料)9日龄时的饲料消耗的测量(试验14ALG081)
·图5显示了在选择条件下(玉米-大豆饲料相对于用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料)的2次试验(在7天和9天)的平均相对饲料消耗的测量(试验14ALG081)
·图6显示了喂食对照玉米-大豆饲料相对于喂食用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料(不在选择条件下)的0至7日龄鸡的生长性能(消耗，体重增加，饲料转化比)的测量(试验14ALG081)
·图7显示了喂食对照玉米-大豆饲料相对于喂食用5％、10％和15％的测试微藻替换的饲料(不在选择条件下)的0至9日龄鸡的生长性能(消耗，体重增加，饲料转化比)的测量(试验14ALG081)
实施例1-菌株培养
菌株预培养物：
在温度受控的外壳(26℃)中的振动台(140rpm)上，在含有4g作为氮源的酵母提取物和30g作为碳源的葡萄糖的预培养基中制备Aurantiochytrium mangrovei预培养物。温育48小时后，将细胞以3000g离心5分钟，并用既不含酵母提取物也不含矿物或有机氮的任何其他来源的预培养基冲洗细胞团块。该操作的目的是避免通过添加酵母提取物而在主要培养物中提供任何Na+。预培养物对应于主要溶液培养体积的1/100(v/v)。在菌株Schizochytrium sp.CCAP 4062/3的情况下，向该培养基中加入27g/L的NaCl。
培养监测：
通过测量干质量来监测总生物质浓度(在GF/F过滤器Whatman上过滤，然后烘在称重之前在105℃烘箱干燥至少24小时)。
总脂质和FAME含量的分析根据文献中经典描述的方法进行(Folch et al.,Asimple method for the isolation and purification of total lipids from animaltissues.Folch J.et al.,J Biol Chem.1957May；226(1):497–509.；Yokoyama et al.,Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based onmorphology,chemotaxonomic characteristics,and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae,Labyrinthulomycetes):emendation for Schizochytrium anderection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.Nov.；Mycoscience,2007Vol.48,pp.199–211)。
(比较)实施例1.1
Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5培养物在与计算机控制的自动化系统联用的1-L至2-L发酵罐(生物反应器)中制备。
培养基的组成和添加溶液的组成如下：
通过加入碱(NaOH或KOH)和/或酸(硫酸溶液)将体系调节至pH为6。培养温度设定为26℃。在整个培养过程中通过振荡速度(250-1200rpm)、空气流速(0.25-1vvm)或氧气流速(0.1-0.5vvm)调节培养基中的溶解氧压力。整合到控制器中的监管参数可以保持5％至30％的恒定pO2。培养时间为20至100小时，优选25至96小时，例如50小时。
在培养过程中，添加三次添加溶液1，以及添加溶液2以保持葡萄糖浓度在200mM和500mM之间。
(本发明)实施例1.2
基本上如实施例1.1中所述，在发酵罐中制备Aurantiochytrium mangrovei CCAP4062/5培养物。
该过程在调节pH的方式方面有所修改，是通过添加氨水(NH4OH)来调节的，这样可以避免通过氢氧化钠或氢氧化钾调节pH时会大量提供Na+或K+，并且这可能在动物饲料开发中引起问题。通过用氨水(NH4OH)调节pH来提供培养细胞所需的部分氮。
下表1中描述了用于该实施例的培养基。与实施例1.1中描述的培养基不同，这种化学限定的培养基使得可以在整个培养过程中维持生长而没有营养限制。
表1
通过集成调节器控制培养过程中的理化参数，其中pH保持设定值5附近，温度设定为30℃，并且pO2维持在30％的设定值附近直到达到最大振荡和空气流速值。
在培养过程中，如下表2中所述添加所述添加培养基以保持培养基中的葡萄糖浓度在20g/L至50g/L。
表2
| 葡萄糖(碳源) | 688g/L |
| 硫酸铵(氮源) | 76g/L |
| 磷酸二氢钾(磷源) | 39g/L |
(本发明)实施例1.3
在基本上如实施例1.1中所述的培养条件下在发酵罐中制备Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/5培养物。
该过程在培养基及其添加模式方面有所修改。
在下表3中列出的培养基上以间歇模式开始培养。
表3
一旦生物质在培养基中达到20g/L，就开始连续培养模式。连续供应的进料溶液在下表4中描述。
表4
初步试验表明，使用的稀释速率直接影响生物质的蛋白质含量(未显示结果)。对于该实施例，使用的稀释速率为0.13h-1，这对应于在所用培养条件下菌株最大生长速率的一半。
(比较)实施例1.4
基本上如实施例1.1所述在发酵罐中制备Schizochytrium sp.CCAP 4062/3培养物，对于初始发酵罐培养基和添加培养基，培养基分别补充有27g/L和35.6g/L NaCl。
(本发明)实施例1.5
基本上如实施例1.2所述在发酵罐中制备Schizochytrium sp.CCAP 4062/3培养物，对于初始发酵罐培养基和添加培养基，培养基分别补充有27g/L和35.6g/L NaCl。
结果
| DM(g/L) | AA/DM(％) | 脂肪/DM(％) | |
| 大豆(豆)* | – | 40.43 | 21.80 |
| 大豆(粕)* | – | 48.80 | 0.55 |
| (对比)实施例1.1 | 90.0 | 30.00 | 34.30 |
| (本发明)实施例1.2 | 67.0 | 57.90 | 6·10 |
| (本发明)实施例1.3 | 60.1 | 35.23 | 6.56 |
| (对比)实施例1.4 | 87.0 | 20.44 | 45.97 |
| (本发明)实施例1.5 | 79.9 | 49.66 | 13.6 |
DM：干物质；AA：氨基酸；
*：根据USDA给出的数值，相对于100％DM的百分比值
应注意的是，旨在用于生产富含多不饱和脂肪酸的脂肪的领域的培养方法不能获得具有高蛋白质含量(以相对于干物质的氨基酸的wt％表示)的组合物。
实施例2-动物营养
实施例2.1(材料和方法)
在实施例1.2的条件下培养菌株Aurantiochytrium Mangrovei CC4062/5。除另有说明外，这些条件是在以下实例中使用的条件。
2.1.1-生物质组成：
首先分析微藻生物质的近似组成((水分(EAU-H内部方法，改编适用于2009年1月27日的规定EC 152/2009(103℃/4h)-SN)，水解脂肪(2009年1月27日的规定EC 152/2009-规程B-SN)，基于总氨基酸浓度的加和估测的粗蛋白质(指令98/64/EC，9/3/99-标准NF ENISO 13903)，矿物质(2009年1月27日的规定EC 152/2009-SN))，和总能量(NF EN 14918)，总纤维(AOAC 985.29-SN)，不溶性壁(根据Carré和Brillouet的方法(1989，Determinationof water-insoluble cell walls in feed：interlaboratory study，JournalAssociation of Official Analytical Chemists，72,463-467)，钙(NF EN ISO 6869-2002年3月-CT)，磷(2009年1月27日的EC 152/2009-CT)，氯(改编自ISO 1841-2的内部方法-1996年7月-SN)，钾(内部方法-ICP 05/07-SN)，钠(内部方法-ICP 05/07-SN)和总氨基酸浓度。
2.1.2–测量去盲肠公鸡的氨基酸消化率：
平行地，在体内评估这种微藻用于测量去盲肠公鸡的氨基酸消化率(Green等，1987)。对动物(成年伊莎褐鸡)强制饲喂由测试的成分之一(测试的微藻或对照大豆粕)组成并且补充有小麦淀粉的糊状物，以获得对应于动物需要的18％的蛋白质水平。针对每个处理使用12只笼养在单独笼中的公鸡。在饥饿24小时后，每只动物平均接受171.2±14.5g糊状物。强制喂养后最多到48小时从4只公鸡组收集排泄物，使得针对每个处理将3次排泄物冻干。然后将排泄物置于室温下进行吸水阶段(48h)以稳定水分含量，然后称重，研磨(0.5mm)，并用Terpstra法(Terpstra和de Hart，1974)对其进行分析，分析其非尿酸氮含量和其总氨基酸浓度(JEOL AminoTac JLC-500/V)。事先通过评估基于相同实验设计的无蛋白饮食来确定氨基酸的内源性损失。因此基础内源性损失的校正结果表示为氨基酸的标准化回肠消化率系数，计算并进行如下统计分析：
其中DIS(X)F：原料F的氨基酸X的标准化回肠消化率系数(％)；XF：原料中氨基酸的浓度(g/100g)；XE：排泄物中氨基酸的浓度(g/100g)；ID：消耗的饲料量(g)；QE：排泄的量(g)；LF：饲料中原料的掺入比率；XEND：氨基酸X的内源性损失(g/100g)。
根据以下模型，根据ANOVA规程(XLSTATAddinsoft 1995-2010)首先分析实验结果的成分效应，其中95％置信区间为：
Yi＝μ+ai
其中：Y＝参数
μ＝平均值
ai＝成分效应
对于每一个显著差异，通过成对Fisher的LSD试验分析平均值。
实施例2.2：培养49小时的菌株CC4062/5的组成。
如上所述培养菌株CC4062/5。在49小时停止培养，产生数千克的微藻生物质，用于在动物中进行初步消化率试验。该生物质在干燥筒上干燥并且为薄片形式。其确定为“菌株4，49小时培养物”。
“微藻，菌株4，49小时培养物”的生物化学组成结果列于下表5中，并表示为总干物质(DM)含量和校正的干物质(DM)含量两者。
表5(试验14ALG058)：测试的微藻(菌株4，49小时培养物)的组成相比于对照大豆粕的组成
n/d：未测定
n/a：不适用
μA：微藻
这些结果表明，微藻具有的总氮物质(氨基酸总和)和矿物质组成略高于对照大豆粕的那些。所测试的生物质的矿物质含量与已公布的最低浓度相当，范围为7％至43％DM，这取决于微藻的家族、属和种。微藻中磷和钙的含量成反比，与对照大豆粕相比，在微藻中磷多2.3倍，钙少3.3倍。与常规用于动物营养的原料相比，所测试的“菌株4，49小时培养物”不含淀粉储备，其总糖浓度保持较低(1.4％DM)。相比之下，它的脂肪含量是大豆粕的两倍(11.2％DM相比于5.6％DM)，其总能量高125千卡/千克DM。
微藻壁具有与植物来源的原材料不同的组成和结构，使其不适合常规使用的纤维分析。此外，总膳食纤维(TDF)的分析(Prosky等人，1988)的优点是限制性较小，并且“微藻，菌株4，49小时培养物”具有17.4％DM的总纤维百分比(其通过比较方式，约为在黑麦或大麦籽粒中分析的)，其中测量的水不溶性细胞壁(WICW)残余物为5.2％DM。
表4至8中报道的总蛋白质浓度来自根据上述方法测定的氨基酸本身的总和。氨基酸总和-作为“微藻，菌株4，49小时培养物”的总蛋白质的估量值-对应于53.4％DM，更确切地说21.5％必需氨基酸的DM和32.0％非必需氨基酸的DM。表6显示了在微藻和大豆粕中分析的氨基酸浓度，并且表示为总值或相对于氨基酸的总和。
结果反映出微藻具有相对平衡的氨基酸谱，这与将不同微藻的氨基酸谱与所谓的常规蛋白质源的氨基酸谱进行比较的工作(Becker，2007)一致。
通常，微藻的必需氨基酸浓度略高于大豆粕中测得的浓度(分别为21.5％DM和24.0％DM)。
表6(试验14ALG058)：总氮和氨基酸浓度(总量％)，相对于氨基酸总和的氨基酸浓度(总AA％)，在去盲肠公鸡中测量的氨基酸的标准化回肠消化率系数，和测试的微藻相对于对照大豆粕的可消化氨基酸浓度(总量％)。
μA：微藻；SM：大豆粕；[AA]：氨基酸浓度
实施例2.3：测量生物质氨基酸消化率(培养49小时的菌株CC4062/5)
表6中示出了关于在去盲肠公鸡中测量的氨基酸的标准化回肠消化率(SID)以及可消化氨基酸浓度的结果。氮的消化率和微藻的氨基酸总和分别为80.1±0.3％和78.4±1.0％，分别比对照大豆粕低9.5和10.1个百分点。微藻的精氨酸和胱氨酸SID具有最低的结果，分别为61.0±0.8％和60.9±3.7％。通常，微藻的必需氨基酸的消化率系数为80.7±1.8％(苏氨酸SID)至88.7±0.6％(组氨酸SID)。赖氨酸消化率测定为85.6±1.3％。这些系数比对照大豆粕测得的值低约1.2个百分点(组氨酸SID)至7.4个百分点(色氨酸SID)。然而，它们反映了高消化率系数，使得可以将评估的微藻认为是优品质蛋白质来源(即，它们显著高于文献中报道的微藻蛋白质消化率值，高约55％至77％(Henman等人，2012)。
实施例2.4：培养22小时的菌株CC4062/5的组成
在相同的条件下培养菌株CC4062/5，但是培养22小时。其确定为“菌株4，22小时培养物”。
与以前一样，这种生物质在干燥筒上干燥并且物理形式为薄片。
分析了其近似组成，总能量，总纤维，不溶性壁，钙，磷，氯，钾，钠和总氨基酸浓度。
这种“微藻，菌株4，22小时培养物”的生物化学组成在表7中给出。结果表示为总干物质(DM)含量和校正的干物质(DM)含量两者。
“微藻，菌株4，22小时培养物”的总氮物质组成(氨基酸总和)比对照大豆粕和“微藻，菌株4，49小时培养物”的所述组成高2.3个百分点和1.3个百分点。
其矿物质含量相对于较长的培养物而言增加，但保持在仍处于文献(Skrede等人，2011)中公布的值的较低范围内的浓度水平。
磷/钙比率是不平衡的。微藻中磷和钙的含量成反比，与对照大豆粕相比，在微藻中磷多3.6倍，钙少3.6倍。经过优化的菌株4(22小时培养物)总磷含量比经历49小时培养过程的菌株总磷含量多1.5倍。其脂肪含量高于大豆粕的脂肪含量(8％DM相比于5.6％DM)，并且结果证实淀粉和总糖都不代表该菌株4中的能量储存形式。其总能量测量相比于对照大豆粕少4641千卡/千克DM、或371千卡/千克DM。
“微藻，菌株4，22小时培养物”的总膳食纤维(TDF)代表12.7％的DM，水不溶性细胞壁(WICW)残余物测量为2.1％DM。平行地，残余物如下推导：R(％)＝100-矿物质(％)-总氮物质(％)-脂肪(％)-淀粉(％)-糖(％)表明TDF含量比R含量低15.1个百分点，因此估计为27.8％DM。这些观察与其他工作一致(Lieve等，2012)，所述工作报道了干燥生物质的量的约20％到30％不由矿物质、脂质、蛋白质和碳水化合物的含量总和解释。
“微藻，菌株4，22小时培养物”的脂肪比大豆粕的脂肪高2个百分点(表7)。
表7(试验14ALG065)：测试的微藻(菌株4，22小时培养物)的组成相对于对照大豆粕的组成
n/d：未测定；n/a：不适用；μA：微藻
氨基酸的总和总计为54.7％DM，更精确地为必需氨基酸的23.9％DM和非必需氨基酸的30.8％DM。表8给出了在微藻和大豆粕中分析的氨基酸浓度，并且表示为总量值或相对于氨基酸总和。结果反映出，与对照大豆粕相比，微藻具有相对平衡的氨基酸谱。“微藻，菌株4，22小时培养物”的谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸以较高的比例存在，其值(总AA％)分别为26.75％、9.48％和8.26％。其赖氨酸含量(总AA％)为5.94％，相比之下对照大豆粕的该含量为6.12％。精氨酸、蛋氨酸和在较小程度上的苏氨酸对测试的微藻蛋白质影响要比对大豆粕的影响强(分别为9.48％相比于7.29％，2.13％相比于1.36％，和4.27％相比于4.01％)。培养22小时的微藻具有的必需氨基酸比49小时培养物多2.4个百分点，或与对照大豆粕具有相同的含量。除精氨酸外，必需氨基酸在氨基酸总和中以较大比例存在。
“微藻，菌株4，22小时培养物”的甲硫氨酸、精氨酸和苏氨酸含量高于大豆的那些含量，而赖氨酸和缬氨酸含量在微藻生物质中相当或略高。
实施例2.5：测量生物质氨基酸消化率(培养22小时的菌株CC4062/5)
等同于上述(参见实施例2.3)地进行去盲肠公鸡的氨基酸消化率的测量(Green等，1987)。
表8中示出了关于在去盲肠公鸡中测量的“微藻，菌株4，22小时培养物”的氨基酸的标准化回肠消化率(SID)以及可消化氨基酸浓度的结果。氮的消化率和微藻的氨基酸总和分别为85.7±0.7％和87.1±0.4％，或比对照大豆粕低3.2个百分点(p＝0.008)和0.9个百分点(p＝0.190)。与49小时培养物相比，“微藻，菌株4，22小时培养物”这种产生的氨基酸总和的消化率显著增加了8.7个百分点。可消化的赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸和缬氨酸的浓度高于对照大豆粕的那些浓度。它们反映出所测试的微藻的蛋白质的良好品质，优于或等同于大豆粕的蛋白质品质。
公鸡氨基酸消化率的测量结果表明，“微藻，菌株4，22小时培养物”是良好品质的蛋白质来源。蛋白质(氨基酸总和)的消化率与大豆粕的消化率相似，大豆粕是世界上最常用于喂养单胃动物的蛋白质来源。
此外，考虑到对赖氨酸测量的高消化率系数，所使用的干燥过程似乎不是使蛋白质品质变差的因素。
值得注意的是，当将“微藻，菌株4，49小时培养物”的结果与“微藻，菌株4，22小时培养物”的结果进行比较时，蛋白质的品质显著改善。尤其是，蛋白质消化率增加了约9个百分点。
表8(试验14ALG065)：测试的微藻相比于对照大豆粕的总氮和氨基酸浓度(总量％)、相对于氨基酸总和的氨基酸浓度(总AA％)、在去盲肠公鸡中测量的氨基酸的标准化回肠消化率系数(％)和可消化氨基酸浓度(总量％)。
n/d：未测定；μA：微藻；SM：大豆粕；[AA]：氨基酸浓度
实施例2.6：培养22小时的菌株CC4062/5的表观代谢能(AME)和氮校正的表观代谢能(AMEn)的测定。
在3周龄鸡中进行微藻“微藻，菌株4，22小时培养物”的表观代谢能(AME)的测量(Bourdillon等，1990)。所谓的替代方法是从由玉米-大豆基质和预混料组成的对照饮食开始应用的。与其他原材料一样，在3毫米网格上研磨的微藻以4％、8％、12％、16％和20％这种逐渐增加的比例替代玉米-大豆混合物，同时保持饮食中的预混料不变。
表9列出了对照玉米-大豆饲料的配方及其规格(粗蛋白质＝18％，表观代谢能＝3200千卡/千克)。根据对有关微藻进行的AME、可消化氨基酸和生物可利用磷的假设，用微藻替代的饲料是最佳平衡的(特别是其蛋白质能量比)。
表9(试验14ALG069)：使用的实验饲料补充剂的配方
饮食1：基础玉米大豆(95.32％)+维生素和矿物质补充剂(VMS)(4.68％)
饮食2：基础玉米-大豆(91.32％)+VMS(4.68％)+微藻(4％)
饮食3：基础玉米-大豆(87.32％)+VMS(4.68％)+微藻(8％)
饮食4：基础玉米-大豆(83.32％)+VMS(4.68％)+微藻(12％)
饮食5：基础玉米-大豆(79.32％)+VMS(4.68％)+微藻(16％)
饮食6：基础玉米-大豆(75.32％)+VMS(4.68％)+微藻(20％)
这种掺入梯度使得可以通过简单的线性回归评估微藻的AME值。实验设计在图1中描述。在研磨之后和在评估期开始和结束时在饲料丸粒上测定饮食的干物质值。最后，通过量热法单独分析完整饲料和粪便的总能量(GE)含量。
饲料的AMEn如下计算：
其中I：摄入的饲料的量(kg DM)；E：排泄物的量(kg)；GEi和GEf：摄入的饲料的总能量(kcal/kg DM)和粪便的总能量(kcal/kg)；WG：评估期间的体重增加。首先基于动物组织中含有的18％蛋白质和通过使用因子8.22千卡/千克N(Hill和Anderson，1958)对AME值进行氮校正。平行地，还根据排泄物中的总氮测定进行氮校正计算。这两种方法给出了相同的结果，本报告中考虑的是后一种方法。根据因子设计，在通过方差分析(ANOVA，SAS2002-2003，由SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)进行处理前除去离群值(平均值±2.5标准差)。以相同的方式计算每种饮食的干物质消化率(dDM)以及氮(DCa氮)、磷(DCa磷)、钙(DCa钙)和脂肪(DCa脂肪)的表观消化率系数。
根据以下模型，通过线性回归分析这些结果(XLSTATAddinsoft1995-2010)：
Yi＝β0+βjXij+εi
其中：Yi＝对观测值i的因变量的观察的值，
β0＝截距
βj＝回归线的斜率
Xij＝观测值i的变量j的值(微藻的掺入百分比)，
εi＝模型误差。
从预测模型中外推出100％掺入微藻的参数值，从而可以估计微藻的AME和AMEn以及磷的表观消化率系数。
表10给出了对照玉米-大豆饲料以及替代的饮食D2至D6的干物质消化率和氮校正的表观代谢能(AMEn)结果。通过相同的方法估计氮(DCa氮)、磷(DCa磷)、钙(DCa钙)和脂肪(DCa脂肪)的表观消化率系数。
表10(试验14ALG069)：分别用0％、4％、8％、12％、16％和20％测试的微藻(菌株4，22小时培养物)替代的、且在23日龄鸡中测量的实验饲料的干物质消化率、能量消化率和表观消化率系数
B C-S：基础玉米-大豆；μA：微藻
1：干物质消化率(％)；2：氮修正的表观代谢能量(AMEn)；3：相对于AMEn的总量能量(％)；4：氮的表观消化系数；5：磷的表观消化系数；6：钙的表观消化率系数，7：脂肪的表观消化率系数(％)
各种饮食的干物质消化率与它们的AMEn值密切相关。玉米-大豆饮食D1的AMEn测量为3398±53kcal/kg DM。结果表明，饮食D2的AMEn值等于玉米-大豆对照的AMEn值，并反映用微藻进行4％的替代不会影响饮食的能量消化率。相比之下且从8％或更高的微藻替代开始，AMEn和DCa氮随着替代百分比的增加而线性下降(p<0.0001)。
添加4％至16％的微藻在13-23天期间显示饲料转化比(FCR)降低。还然而，应该注意的是，无论微藻的掺入百分比如何，对于相似的体重增加，鸡往往消耗的较少(除了D2)，并且高于对照玉米-大豆饮食所测量的值(表11)。
表11(试验14ALG069)：在喂食分别用0％、4％、8％、12％、16％和20％测试的微藻(菌株4，22小时培养物)替代的饲料13至23天期间动物的体重增加、消耗和饲料转化比。
B C-S：基础玉米-大豆；μA：微藻
“微藻，菌株4，22小时培养物”的AME和AMEn值(表12)分别测量为2785kcal/kg DM和2296kcal/kg DM。应该注意的是，这些值分别在蛋白质等级46、48和50的大豆粕的AMEn测量的平均体内参考值范围2303±137kcal/kg DM、2348±248kcal/kg DM和2365±178kcal/kg DM内。因此，这种微藻提供的能量供应与标准品质的大豆粕相当。
表12(试验14ALG069)：
A：在23日龄鸡中测试的微藻的表观代谢能和氮校正的表观代谢能。
B：对于各种大豆粕蛋白质等级根据相同模型测量的体内参考值(来自Adisseo，2012的参考文献)。
实施例2.7：对喂食根据本发明的包含生物质的饲料的雏鸡的选择和消耗测量试验
在下面所示的每个试验中，与其他原材料一样，将“微藻，菌株4，22h培养物”在3mm网格上研磨并以5％、10％和15％这种增加的比例掺入到玉米-大豆饮食中，同时调整制剂以具有四种能量相同、蛋白质相异和赖氨酸相异的饮食(表13)，其组成在表14中给出。
表13(试验14ALG069)：通过线性回归在23日龄鸡中测量的测试微藻的磷的表观消化率系数
| 微藻 | |
| 可消化磷(％DM)1 | 0.86 |
| DCa磷(％)2 | 35.7 |
1置信区间：0.576％-1.143％
2根据公式计算：DCa＝可消化P(％)/饲料总P(％)
表14(试验14ALG081)：用于雏鸡消耗和选择试验的实验饲料的配方
平行进行两个实验性试验(图2)。在第一次试验(选择测试)中，当动物在微藻补充的饲料和玉米-大豆起始饲料之间进行选择时测量消耗。在第二试验(消耗测量)中，当动物只能获得一种任选地补充微藻的饲料时，测量消耗。
在试验1中，考虑到来自一个饲养盘的消耗取决于来自每个笼子里另一个饲养盘的消耗的假设，根据成对的测试程序(XLSTATAddinsoft 1995-2010)分析在7日龄和9日龄的每个测量点的消耗数据。
根据以下具有95％置信区间的模型根据ANOVA规程(XLSTATAddinsoft 1995-2010)分析来自试验2的消耗和重量数据的饲料效果：
Yi＝μ+ai+biY＝参数
其中：Y＝参数
μ＝平均值
ai＝饲料效应
bi＝区组效应
对于每一个显著差异，通过成对Fisher的LSD试验分析平均值。
1)试验1-选择试验
对于选择饲料的试验，将约200只1日龄雄性雏鸡(Ross PM3)以约20只一组放入分开的代谢笼中，并喂食含有小麦、玉米和大豆粕的标准起始饲料。在6日龄时，使鸡饥饿2小时，然后称重并按重量组分配。因此选择120只鸡，按4只一组放进30个分开的代谢笼中，并在第7天根据它们的重量分配实验处理之一(对于每次处理重复10次)。每个笼子包含两个含有不同饲料的饲养盘，对应于以下三种实验处理：
·处理1：玉米-大豆起始饲料(饲养盘1)和5％微藻(饲养盘2)
·处理2：玉米-大豆起始饲料(饲养盘1)和10％微藻(饲养盘2)
·处理3：玉米-大豆起始饲料(饲养盘1)和15％微藻(饲养盘2)
饲料和水在整个试验过程中随意分发。实验饲料以3.2毫米直径丸粒形式提供。在7日龄和9日龄时，测量在T0+1h、T0+2h、T0+3h、T0+4h和T0+6h的消耗，笼中的饲养盘每小时切换一次。在两次消耗量测量之间(第8天)，动物接受小麦-玉米-大豆起始饲料。
结果表明(参见图3-5)，幼龄动物不拒绝微藻补充的饲料，并且这与掺入率无关。在这些量中，微藻因此不呈现出口味问题。与传统的玉米-大豆饲料相比，幼龄鸡甚至偏爱补充有5％和10％微藻的饲料(图5)，当添加15％微藻时，数值开始出现反比。
2)试验2-消耗测量
在第二试验中，雏鸡只能获得一种类型的饲料，任选地补充有微藻(图6)。将约400只1日龄雄性雏鸡(Ross PM3)称重并按重量组分配。将240只选择的动物在第1天按照4只一组放置在60个未分开的笼子中，所述笼子在重量均匀的区组中(15个区组，每个区组4个笼子)，每笼具一个饲养盘，每个饲养盘含有实验饲料(对于每个饲料重复15次)。在每个笼中，各自确认4只雏鸡。饲料和水在整个试验过程中随意分发。实验饲料是补充有0％、5％、10％或15％微藻的玉米-大豆起始饲料，也在试验1中用于饲料的选择。在1、7和9日龄测量个体活体重。称重未食用饲料，并在7日龄和9日龄测量每笼的消耗。从0到7日龄，饲喂含有10％微藻的饲料的动物与对照组和其他两种补充饮食相比，体重增加显著改善。相对于对照和15％补充饮食，针对10％补充饮食测量的饲料转化比显著改善(1.089相比于1.156)。此外，与玉米大豆对照相比，补充有微藻对饲料消耗没有影响(对于对照和补充5％至15％微藻的三种饮食，饲料消耗分别为122.6g，125.7g，135.6g和124.6g)。
在0至9日龄的总测量期间(图7)，证实了补充有10％微藻的饲料对体重增加和饲料转化比的正面影响。
消耗结果(在非选择条件下)表明，测试的“微藻，菌株4，22小时培养物”在平衡的玉米-大豆饲料中的含量可以高达15％，而不影响0日龄至9日龄雏鸡的性能。
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Claims (25)
1.一种破囊壶菌生物质，其包含按重量计至少35％的蛋白质，相对于干物质的重量。
2.权利要求1的生物质，其特征在于所述生物质包含至少45％的蛋白质。
3.权利要求1的生物质，其特征在于所述生物质包含至少60％的蛋白质。
4.权利要求1-3任一项的生物质，其特征在于所述生物质包含按重量计少于20％的脂肪，相对于干物质的重量。
5.权利要求4的生物质，其特征在于所述生物质包含少于10％的脂肪。
6.权利要求1-5任一项的生物质，其特征在于所述破囊壶菌是选自下组的属的破囊壶菌：Aurantiochytrium、Aplanochytrium、Botryochytrium、Japonochytrium、Oblongichytrium、Parietichytrium、Schizochytrium、Sicyoidochytrium、Thraustochytrium和Ulkenia。
7.权利要求6的生物质，其特征在于所述破囊壶菌选自下组的种：Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/2；Aurantiochytrium mangrovei CCAP4062/3；Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/4；Aurantiochytrium mangrovei,CCAP 4062/5；Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/6；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1；Schizochytriumsp.4087/3；Schizochytrium sp.CCAP 4087/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/4；Schizochytrium sp.CCAP 4087/5。
8.权利要求1-7任一项的生物质，其特征在于所述生物质具有1％至95％的水分含量。
9.权利要求8的生物质，其特征在于所述生物质具有70％至90％的水分含量。
10.权利要求8的生物质，其特征在于所述生物质具有1％至10％的水分含量。
11.一种用于生产如权利要求1-10任一项的生物质的方法，其特征在于所述方法包括：
a.第一步骤，在包含碳源、氮源、磷源和盐的限定培养基中培养破囊壶菌，所述第一步骤a)分为两个子步骤，先是第一子步骤：
a1)在合适的培养基中生长，直到获得低于20g/L的培养基中的碳源含量，然后是第二子步骤：
a2)同时或接连生产，直到获得至少40g/L干物质的培养物密度，其中将一种或多种碳源、氮源和磷源富集溶液添加至所述培养基；
b.第二步骤，通过从所述培养基分离所述生物质来回收在第一步骤中获得的生物质。
12.权利要求11的方法，其特征在于在步骤a2)中，碳源含量维持在0至50g/L，氮源含量维持在0.5至5g/L，磷源含量维持在0.5至5g/L。
13.权利要求11或12的方法，其特征在于所述方法包括第三步骤：
c.将在第二步骤中回收的生物质干燥。
14.一种生物质，其可以通过权利要求11-13任一项的方法获得。
15.权利要求1-10任一项或权利要求14所述的生物质或通过权利要求11-13任一项所述方法获得的生物质用于制备人或动物化妆品或食品组合物的用途。
16.权利要求1-10任一项或权利要求14所述的破囊壶菌生物质，其用于改善动物性能。
17.权利要求16的生物质，其中所述性能的改善通过测量消耗、体重增加或饲料转化比来评估。
18.一种用于人或动物的化妆品或药物组合物，其包含权利要求1至10任一项或权利要求14所述的生物质或通过权利要求11至13任一项所述方法获得的生物质。
19.一种食品，其特征在于所述食品包含权利要求1至10任一项或权利要求14所述的生物质或通过权利要求11至13任一项所述的方法获得的生物质。
20.一种牲畜饲料，其特征在于所述牲畜饲料包含1％至60％的权利要求1至8、10任一项所述的生物质或通过权利要求13的方法获得的生物质。
21.根据权利要求20所述的饲料，其特征在于，所述饲料包含1％至20％的权利要求1至8、10任一项所述的生物质或通过权利要求13的方法获得的生物质。
22.根据权利要求21所述的饲料，其特征在于，所述饲料包含3％至8％的权利要求1至8、10任一项所述的生物质或通过权利要求13的方法获得的生物质。
23.一种牲畜饲料，其特征在于所述牲畜饲料包含1％至40％的权利要求1至9任一项所述的生物质或通过权利要求11至12所述的方法获得的生物质。
24.权利要求23所述的饲料，其特征在于所述饲料包含5％至10％的权利要求1至9任一项所述的生物质或通过权利要求11至12所述的方法获得的生物质。
25.权利要求1至10任一项或权利要求13所述的生物质或通过权利要求11至12任一项所述的方法获得的生物质，其用于治疗的用途。
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