CN109072169A - 富含油和蛋白质的破囊壶菌生物质、培养方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术领域是微藻、特别是破囊壶菌的培养物。本发明涉及包含多不饱和脂肪酸例如DHA的富含蛋白质的破囊壶菌的生物质、获得所述生物质的方法及其用途。
Description
技术领域
本发明属于微藻、特别是破囊壶菌的培养领域。本发明的一个目的在于提供一种富含蛋白质和脂质且任选地包含类胡萝卜素的破囊壶菌生物质、获得所述生物质的方法及其在食品中的用途。
背景技术
已知几种植物来源的蛋白质和脂质来源直接或作为膳食补充剂用于人或动物消耗的食品中，为动物和人提供其代谢所必需的氨基酸。术语“蛋白质来源”是指一旦食物被摄取，动物或人可获得的氨基酸来源。脂质，尤其是多不饱和脂肪酸(PUFA)，可用作能量源，它们的治疗性质也是有用的。在多不饱和脂肪酸中，某些ω-3系列的高度不饱和脂肪酸(HUFA)(ω-3PUFA)特别是二十碳五烯酸(EPA或ω-3C20:5)和二十二碳六烯酸(DHA或ω-3C22:6)，以及某些ω-6系列的高度不饱和脂肪酸(ω-6PUFA)特别是花生四烯酸(ARA或AA或ω-6C20:4二十碳四烯酸)，具有公认的营养重要性以及在治疗应用方面具有巨大的潜力。因此，期望能够提供用于动物和人类营养的蛋白质和PUFA的新来源。包含蛋白质以及脂质特别是PUFA的来源将具有相当大的优势。
蛋白质来源包括鱼粉，这是一种渔业副产品，其蛋白质含量相对较高但脂质含量较低(可引证的含量为约8％干物质)。
动物饲料中使用的植物蛋白质的最著名的来源是大豆，通常为粕的形式，即油萃取后剩余的固体残渣。然而，使用大豆粕具有与其来源相关的几个缺点，特别是来自基因修饰的(GM)大豆品种。此外，大豆与许多植物蛋白质来源一样，并不是PUFA等脂质的来源。
已知植物蛋白质的其他来源，特别是螺旋藻和小球藻，其用作人的膳食补充剂。
然而，像小球藻一样，螺旋藻具有低蛋白质生产力的缺点，这妨碍了高产量发酵罐培养。它们的培养无助于实现更广泛、经济上可行地工业化生产膳食蛋白质来源的目标，这些蛋白质的品质将使其能够在用于动物和人消耗的食品中替代普通膳食蛋白质来源如大豆。此外，小球藻和螺旋藻的PUFA含量非常低。
与蛋白质和脂质一样，类胡萝卜素也用于动物和人的营养。
通常，这些色素的大规模生产需要大量人力和大的生产表面积。
此外，现今所能列举的蛋白质或脂肪酸来源都不含有大量的类胡萝卜素。
因此，为了满足对这些分子日益增长的市场需求，必须寻找类胡萝卜素的新来源，所述类胡萝卜素特别是叶黄素，岩藻黄素，虾青素，玉米黄素，角黄素，海胆酮，β-胡萝卜素和芬尼黄质。
已知在发酵罐中具有工业生产能力的原生生物已长期用于生产富含多不饱和脂肪酸如DHA或EPA的脂肪，例如WO 97/37032，WO 2015/004402或WO 2012/17027。某些原生生物能够在某些条件下生产类胡萝卜素。然而，迄今为止，所获得的(包括在脂肪萃取后获得的)生物质并不包含足以允许它们用作食品中的蛋白质来源的蛋白质含量，至少在无昂贵的额外蛋白质富集步骤的情况下是如此。
本发明的目标之一是提供用于动物或人消耗的蛋白质和脂质特别是PUFA的新来源，其满足广泛的、经济上可行的工业生产的目标。这种蛋白质和PUFA的来源还可以包含类胡萝卜素，特别是胡萝卜素(α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，ε-胡萝卜素，γ-胡萝卜素，δ-胡萝卜素或ζ-胡萝卜素，番茄红素和八氢番茄红素)和胡萝卜醇(虾青素，环氧玉米黄素，桔黄素，隐黄素，角黄素，硅甲藻黄素，硅藻黄素，毛茛黄素，岩藻黄素、叶黄素、新叶黄素，芬尼黄质，紫松果黄素，玉红黄素，管藻黄素，紫黄素，玉米黄素)。
本发明表明，在某些培养条件下，已知用于生产具有高的多不饱和脂肪酸含量(特别是DHA和EPA)的油的破囊壶菌是能够产生大量用于动物饲料的蛋白质以及用于人体营养的高品质蛋白质来源的微生物。本发明人能够确定可获得高蛋白质含量同时保持至少20％(相对于干物质)的脂质含量(包括25％至60％的PUFA)的培养条件。本发明人也能够确定下述培养条件，该条件使得除了蛋白质和多不饱和脂肪酸外，还可以引导细胞生产类胡萝卜素。
发明内容
因此，本发明的第一个目的是一种破囊壶菌生物质，其可包含按重量计至少20％的蛋白质，优选为至少30％的蛋白质，其范围可以为多达大于40％的蛋白质，甚至大于60％的蛋白质，相对于干物质的重量。生物质通常可含有35％至65％的蛋白质，特别是45％至55％的蛋白质，相对于干物质的重量。
蛋白质的重量百分比可以按蛋白质本身来表示或按所述蛋白质中所含的氨基酸来表示。此处所示的百分比是通过将生物质(标准ISO 13903:2005)中包含的总氨基酸进行加和来计算的，而不是来自总氮。例如，氨基酸分析仪可以用于测量总氨基酸。单独测定色氨酸，然后将其值加到其他氨基酸的总和中以获得总氨基酸的总和。
此外，所述生物质可以包含至少20％的脂肪，优选至少30％的脂肪，相对于干物质的重量。这种脂肪可以含有25％至60％、优选40％至60％的PUFA，如ARA，DHA和/或EPA。根据本发明的一种实施方式，DHA可以是优选的PUFA。
根据本发明的某些实施方式，所述生物质还可以包含5至250ppm(ng/mg干物质)、优选150至200ppm的类胡萝卜素。
本发明还涉及一种生产如上下文所定义的生物质的方法，其特征在于所述方法包括：
a.第一步骤，在异养或兼养条件下，在合适的培养基中，在约24℃至35℃的温度范围，和在能够促进以按重量计相对于干物质的重量至少35wt％蛋白质的水平生产蛋白质的条件下培养破囊壶菌；
b.第二培养步骤，其在异养或兼养条件下，在约18℃至25℃且低于步骤a)的温度，在下述条件下培养，直到获得至少40g/L干物质、优选至少60g/L干物质、更优选至少80g/L干物质的培养物密度，所述条件能够促进多达至少20wt％、优选至少30％的脂肪积累且能够促进多达脂肪的至少25％、优选至少35％的脂肪中的DHA积累；
c.第三步骤，通过将在第二步骤中获得的生物质从所述培养基分离来回收所述生物质(收获)；该步骤之后可以进行均质化；和如果需要的话
d.第四步骤，将在第三步骤中回收的生物质干燥。
培养时间通常可以是40至100小时，优选65至96小时，例如70小时，84小时或96小时。本发明所涉及的培养方法使其通常可以达到高于100g/L、甚至120g/L的生物质浓度。
在第一步骤a)中，可以将细胞培养约18-30小时，优选24小时。在该第一培养步骤之后，例如当在进行约24小时的培养时，温度可以降低到约18-24℃(以开始步骤b))。这种温度的降低可以促进产生脂肪酸和潜在产生类胡萝卜素。低温培养通常可以持续高达约50至70小时的培养，且在任何情况下都优选进行到培养结束时为止。
可以任选地在培养过程中、优选在步骤b)的过程中诱导类胡萝卜素的产生。为此，可以应用兼养(mixotrophic)条件，其优选使用在约435-475nm、优选455nm的蓝光。可以用这些波长产生类胡萝卜素，如虾青素，角黄素，β-胡萝卜素和芬尼黄质。光通常可以施用至少18小时，优选至少24小时。
根据本发明的一种优选实施方式，可以从培养了24到50小时、更优选45小时开始直到培养结束时，将光施用于培养物。
本发明还涉及如上文或下文所定义的生物质在用于人或动物消费的食品领域、特别是在水产养殖领域中的用途。本发明还涉及如上文或下文所定义的生物质用于改善动物性能的用途。所述性能可以通过测量消耗指数、体重增加或饲料转化比来评估，这些全都是本领域技术人员已知的。
本发明还涉及包含此类生物质的食品，该生物质可以提高食品的营养价值和密度。
本发明还涉及根据本发明的生物质，其用于治疗、特别是用于治疗和预防营养不良的用途。
本发明还涉及用于人或动物的化妆品或药物组合物以及用于人或动物消耗的食品或食品组合物，其包含根据本发明的生物质。
具体实施方式
术语“突变体”是指源自原始菌株的生物体，其基因库已经通过天然过程或通过本领域技术人员已知的物理化学方法或通过基因工程技术加以修饰，所述物理化学方法可以产生随机突变(UV等)。
术语“兼养条件”或“以兼养模式”是指提供光且在黑暗中提供有机含碳底物的培养。
术语“异养占优势的兼养条件”是指这样的照射条件，其中细胞生长的大部分能量由有机碳源提供，但是其中光对细胞生长和/或组成有影响。该光可以在有或没有强度变化的情况下连续提供，或者以在光周期之间具有黑暗期来不连续性地提供，只要对暴露于所述照射的细胞的代谢有影响即可。强度的变化或间断的周期性可以有规律地随时间变化，或可随着细胞生长的各个阶段不同而变化。异养占优势的兼养使得可以通过将自养和异养两者的优点结合来产生有用的分子。在这些条件下，如在异养中，有机底物会滋养微藻，从而产生大量生物质，而细胞的叶绿体和其他光能捕获细胞器则被激活。光用作可以诱导代谢反应(例如色素的合成)的信号。
胡萝卜素(α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，ε-胡萝卜素，γ-胡萝卜素，δ-胡萝卜素或ζ-胡萝卜素，番茄红素和八氢番茄红素)和胡萝卜醇(虾青素，环氧玉米黄素，桔黄素，隐黄素，角黄素，硅甲藻黄素，硅藻黄素，毛茛黄素，岩藻黄素、叶黄素、新叶黄素，紫松果黄素，玉红黄素，管藻黄素，紫黄素，玉米黄素)。
根据本发明，术语“生物质”有利地指代通过培养上述原生生物产生的一组破囊壶菌细胞，其具有本文中描述的蛋白质、脂肪酸和任选的类胡萝卜素的水平，其细胞可能会或可能不会保持其物理完整性。
因此可以理解，所述生物质可以包含范围为0％至100％的降解的破囊壶菌细胞的量。术语“降解”表明所述破囊壶菌细胞的结构和/或组成可能已被修饰。例如，它们可能已经经历干燥步骤或油收获步骤，重要的是包含这些细胞的生物质具有本文中描述的蛋白质、脂肪酸和任选的类胡萝卜素的水平。
根据本发明的优选实施方式，生物质并未经历在收获期间或收获后修饰其氨基酸组成的处理，即所述生物质在收获后所经历的处理不改变其氨基酸组成。特别是生物质没有经历蛋白质和氨基酸富集的步骤。后者来自细胞在其培养基中的生长。这是一种被称为“无添加的蛋白质”的生物质。
根据本发明的一个更优选的实施方式，生物质未经历改变其氨基酸、脂肪和(如果适用的话)类胡萝卜素组成的处理，即所述生物质在收获后所经历的处理不改变其氨基酸、脂肪和任选的类胡萝卜素组成。特别地，氨基酸相比于脂肪的相对组成基本保持恒定。与蛋白质一样，脂肪酸只来自细胞在其培养基中的培养物。没有脂肪酸的富集，生物质也称为“无添加的脂肪酸”。
在一些情况下观察到，根据本发明的生物质中的未降解的破囊壶菌相比于降解的破囊壶菌可以具有较好的防腐和消化性的性质。本发明的优选形式之一是包含基本上主要量的未降解的破囊壶菌的生物质。
根据本发明，术语“降解的”是指其结构和/或化学完整性可能已经改变的破裂壶壶菌，例如裂解的破囊壶菌，例如由均质化产生。
但是明显的是，一经产生，所述生物质可以原样使用，可以任选地干燥，或者经历其使用所必需的任何处理，特别是均质化。
根据本发明，所述生物质可以具有按重量计1％至95％的水分含量，相对于干物质的重量。
优选地，根据本发明的一种实施方式，所述生物质可以具有按重量计70％至90％、优选80％至85％的水分含量，相对于干物质的重量。
更优选地，根据本发明的第二实施方式，所述生物质可以具有按重量计1％至10％、优选2％至7％的水分含量，相对于干物质的重量。
根据本发明，所述破囊壶菌可以是破囊壶菌目(Thraustochytriales)，优选为亚纲破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)，更优选为可以选自以下属的属：Aurantiochytrium，Aplanochytrium，Botryochytrium，Japonochytrium，Oblongichytrium，Parietichytrium，Schizochytrium，Sicyoidochytrium，Thraustochytrium和Ulkenia。
破囊壶菌是非基因修饰的微生物，或者也可以是遗传修饰的微生物。如果使用基因修饰的破囊壶菌，它们不含编码一种或多种酶的基因，这些酶可以使其降解或消化用作食品的生物质。
有利地，所述破囊壶菌可以选自如下种：Aplanochytrium kerguelense；Aplanochytrium minuta；Aplanochytrium stocchinoi；Aplanochytrium sp.PR24–1；Aurantiochytrium limacinum；Aurantiochytrium limacinum AB022107；Aurantiochytrium limacinum HM042909；Aurantiochytrium limacinum JN986842；Aurantiochytrium limacinum SL1101JN986842；Aurantiochytrium mangrovei；Aurantiochytrium mangrovei DQ323157；Aurantiochytrium mangrovei DQ356659；Aurantiochytrium mangrovei DQ367049；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5；Aurantiochytrium mangrovei CCAP4062/6；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1；Aurantiochytrium sp.AB052555；Aurantiochytrium sp.AB073308；Aurantiochytrium sp.ATCC PRA276 DQ836628；Aurantiochytrium sp.BL10 FJ821477；Aurantiochytrium sp.LY 2012 PKU Mn5JX847361；Aurantiochytrium sp.LY2012 JX847370；Aurantiochytrium sp.N1–27；Aurantiochytrium sp.SD116；Aurantiochytrium sp.SEK209 AB290574；Aurantiochytrium sp.SEK217 AB290572；Aurantiochytrium sp.SEK 218 AB290573；Aurantiochytrium sp.18W–13a；Botryochytrium radiatum；Botryochytrium radiatumRaghukumar 16；Botryochytrium radiatum SEK353；Botryochytrium sp.；Botryochytrium sp.BUTRBC 143；Botryochytrium sp.Raghukumar 29；Oblongichytriumminutum；Oblongichytrium multirudimentalis；Oblongichytrium sp.；Oblongichytriumsp.SEK347；Parieticytrium sarkarianum；Parieticytrium sarkarianum SEK351；Parieticytrium sarkarianum SEK364；Parieticytrium sp.；Parieticytrium sp.F3–1；Parieticytrium sp.H1–14；Parieticytrium sp.NBRC102984；Phytophthora infestans；Schizochytrium aggregatum DQ323159；Schizochytrium aggregatum DQ356661；Schizochytrium aggregatum；Schizochytrium limacinum；Schizochytrium limacinumOUC166 HM042907；Schizochytrium mangrovei；Schizochytrium mangrovei FB1；Schizochytrium mangrovei FB3；Schizochytrium mangrovei FB5；Schizochytriumminutum；Schizochytrium sp.ATCC20888 DQ367050；Schizochytrium sp.KGS2 KC297137；Schizochytrium sp.SKA10 JQ248009；Schizochytrium sp.ATCC 20111；Schizochytriumsp.ATCC 20888；Schizochytrium sp.ATCC 20111 DQ323158*；Schizochytrium sp.ATCC20888DQ356660；Schizochytrium sp.ATCC 20889；Schizochytrium sp.ATCC 26185；Schizochytrium sp.BR2.1.2；Schizochytrium sp.BUCAAA 032；Schizochytriumsp.BUCAAA 093；Schizochytrium sp.BUCACD 152；Schizochytrium sp.BUCARA 021；Schizochytrium sp.BUCHAO 113；Schizochytrium sp.BURABQ 133；Schizochytriumsp.BURARM 801；Schizochytrium sp.BURARM 802；Schizochytrium sp.CCAP 4087/3；Schizochytrium sp.CCAP 4087/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/4；Schizochytriumsp.CCAP 4087/5；Schizochytrium sp.FJU–512；Schizochytrium sp.KH105；Schizochytrium sp.KK17–3；Schizochytrium sp.KR–5；Schizochytrium sp.PJ10.4；Schizochytrium sp.SEK 210；Schizochytrium sp.SEK 345；Schizochytrium sp.SEK346；Schizochytrium sp.SR21；Schizochytrium sp.TIO01；Sicyoidochytrium minutumSEK354；Sicyoidochytrium minutum NBRC 102975；Sicyoidochytrium minutum NBRC102979；Thraustochytriidae sp.BURABG162 DQ100295；Thraustochytriidae sp.CG9；Thraustochytriidae sp.LY2012 JX847378；Thraustochytriidae sp.MBIC11093AB183664；Thraustochytriidae sp.NIOS1 AY705769；Thraustochytriidae sp.#32DQ323161；Thraustochytriidae sp.#32 DQ356663；Thraustochytriidae sp.RT49DQ323167；Thraustochytriidae sp.RT49 DQ356669；Thraustochytriidae sp.RT49；Thraustochytriidae sp.Thel2 DQ323162；Thraustochytriidae sp.Thel2；Thraustochytrium aggregatum；Thraustochytrium aggregatum DQ356662；Thraustochytrium aureum；Thraustochytrium aureum DQ356666；Thraustochytriumgaertnerium；Thraustochytrium kinnei；Thraustochytrium kinnei DQ323165；Thraustochytrium motivum；Thraustochytrium multirudimentale；Thraustochytriumpachydermum；Thraustochytrium roseum；Thraustochytrium sp.13A4.1；Thraustochytrium sp.ATCC 26185；Thraustochytrium sp.BL13；Thraustochytriumsp.BL14；Thraustochytrium sp.BL2；Thraustochytrium sp.BL3；Thraustochytriumsp.BL4；Thraustochytrium sp.BL5；Thraustochytrium sp.BL6；Thraustochytriumsp.BL7；Thraustochytrium sp.BL8；Thraustochytrium sp.BL9；Thraustochytriumsp.BP3.2.2；Thraustochytrium sp.BP3.3.3；Thraustochytrium sp.caudivorum；Thraustochytrium sp.CHN–1；Thraustochytrium sp.FJN–10；Thraustochytrium sp.HK1；Thraustochytrium sp.HK10；Thraustochytrium sp.HK5；Thraustochytrium sp.HK8；Thraustochytrium sp.HK8a；Thraustochytrium sp.KK17–3；Thraustochytrium sp.KL1；Thraustochytrium sp.KL2；Thraustochytrium sp.KL2a；Thraustochytrium sp.ONC–T18；Thraustochytrium sp.PJA10.2；Thraustochytrium sp.TR1.4；Thraustochytriumsp.TRR2；Thraustochytrium striatum；Thraustochytrium striatum ATCC24473；Thraustochytrium striatum DQ323163；Thraustochytrium striatum DQ356665；Thraustochytrium visurgense；Ulkenia amoeboidea SEK 214；Ulkenia profunda；Ulkenia profunda BUTRBG 111；Ulkenia sp.；Ulkenia sp.ATCC 28207；Ulkeniavisurgensis；Ulkenia visurgensis BURAAA 141；Ulkenia visurgensis ATCC 28208。
优选根据本发明，破囊壶菌可以选自属Aurantiochytrium和Schyzochitrium，优选来自如下种：
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6，
于2013年6月21日保藏在CCAP的Aurantiochytrium CCAP 4062/1，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/3，
于2012年2月28日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/1，
于2014年5月20日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/4和
于2014年5月20日保藏在CCAP的Schizochytrium sp.CCAP 4087/5。
所有的保藏都是根据布达佩斯条约的规定在CCAP(CULTURE COLLECTION OFALGAE AND PROTOZOA(CCAP)、SAMS Research Services Ltd.、Scottish MarineInstitute、OBAN、Argyl PA37 1QA United Kingdom)进行的。
根据本发明的优选实施方式，生物质可以具有按重量计至少30％、优选至少40％、非常优选35％至55％的蛋白质含量，相对于干物质的重量。根据本发明的优选实施方式，所述生物质可以具有35wt％至65wt％的蛋白质含量，相对于干物质的重量。
根据本发明的优选实施方式，生物质可以具有按重量计至少20％、优选至少30％的脂肪含量，包括25％至60％、优选40％至60％的PUFA，相对于干物质的重量。特别地，DHA:蛋白质比率(相对于干物质的重量，按重量计)可以是1:1.5至1:9，优选1:2至1:7，更优选1:5至1:6。
根据本发明的某些优选实施方式，生物质可以任选地具有5ppm至250ppm、优选150ppm至200ppm的类胡萝卜素含量，相对于干物质的重量。类胡萝卜素含量可能取决于照明条件，但也取决于培养基和过程的实施。因此，相同的微藻菌株可根据培养条件的不同而产生不同量的色素。
根据本发明的优选实施方式，所述生物质可以是如下的生物质：
-破囊壶菌的生物质，所述破囊壶菌可选自属Aurantiochytrium和Schizochytrium，优选为选自如下种：Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5；Aurantiochytrium mangrovei CCAP4062/6；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/3；Schizochytrium sp.CCAP 4087/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/4；Schizochytriumsp.CCAP 4087/5；并且其可以具有：
-按重量计至少30％、优选至少40％、非常优选35％至55％、或45％至55％的蛋白质含量，相对于干物质的重量；
-按重量计至少20％、优选至少30％的脂肪含量，包括25％至60％、优选40％至60％的PUFA，相对于干物质的重量；
-任选的5ppm至250ppm、优选150ppm至200ppm的类胡萝卜素含量，相对于干物质的重量；和
-在干燥之前的水分含量为70％至90％、优选为80％至85％，或干燥之后的水分含量为1％至10％、优选为2％至7％。
所获得的类胡萝卜素的含量和类型可以通过选择入射光的波长和照射条件来控制。可以根据本发明的实施方式生产类胡萝卜素，如叶黄素，岩藻黄素，虾青素，玉米黄素，角黄素，海胆酮，β-胡萝卜素和芬尼黄质。为了诱导产生选自虾青素、角黄素、β-胡萝卜素和芬尼黄质的类胡萝卜素，使培养物暴露于蓝光(约435-475nm，优选455nm)。根据一种实施方式，类胡萝卜素可具有5％至30％的虾青素含量、15％至30％的芬尼黄质含量和0％至30％的β-胡萝卜素含量，相对于脂肪。
本发明还有生产如上所述生物质的方法的目的，该方法包括：
a.第一步骤，在异养或兼养条件下，在合适的培养基中，在约24℃至35℃的温度范围，和在能够促进以按重量计相对于干物质的重量至少35wt％蛋白质的水平生产蛋白质的条件下培养破囊壶菌；
b.第二步骤，其在约18℃至25℃且低于步骤a)的温度、在下述条件下进行异养或兼养培养，直到获得至少40g/L干物质、优选至少60g/L干物质、更优选至少80g/L干物质的培养物密度，所述条件能够促进多达至少20wt％、优选至少30％的脂肪积累、且能够促进多达脂肪的至少25％、优选至少35％的脂肪中的DHA和/或EPA和/或ARA积累、和任选地促进类胡萝卜素的产生；
c.第三步骤，通过将在第二步骤中获得的生物质从所述培养基分离来回收所述生物质(收获)；和如果需要的话
d.第四步骤，将在第三步骤中回收的生物质干燥。
优选地，培养破囊壶菌的步骤a)可以在培养基中和适于促进蛋白质生产的条件下进行。
通常，所述合适的培养基可以是本领域技术人员已知用于培养破囊壶菌的培养基，同时使其适用于在步骤a)过程中不缺氮的细胞。举例来说，可以提及基于补充有碳源的海盐的培养基。例如，可以提及改良的Verduyn培养基(15g/L海盐；3g/L(NH4)2SO4；1g/LKH2PO4；0.5g/L MgSO4·7H2O；24mg/L Na2EDTA；3mg/L ZnSO4·7H2O；3mg/L MnCl2·2H2O；0.04mg/L Na2MoO4·2H2O；10mg/L FeSO4·7H2O；3.2mg/L泛酸盐；9.5mg/L盐酸硫胺素；0.15mg/L维生素B12)。还可以提及ATCC790MB2216或F/2型培养基。
根据本发明的一种实施方式，所述合适的培养基可以优选为化学限定的培养基，其可以包含碳源、氮源、磷源和盐。
根据本发明，术语“化学限定的培养基”是指其中每种元素的含量是已知的培养基。确切地说，本发明涉及可能不包含富集或复杂的有机物质的培养基。表述“富集或复杂的有机物质”是指未纯化的有机物质，其表现为混合物，其混合物的各种组分的确切组成和浓度未知其精确度、不受控制，并且不同批次之间可能具有显著的可变性。作为富集或复杂的有机物质的例子，可以提及的是酵母提取物或作为蛋白质水解反应产物的蛋白胨，或者也可以是富集的矿物质例如海洋矿物盐或其他复合生长剂，其每个组分不具有固定的浓度。
根据本发明，所述限定的培养基可以包含选自下组的盐：钙盐，钴盐，锰盐，镁盐，锌盐，镍盐，铜盐，钾盐，铁盐和钠盐以及它们的混合物。
有利地，所述盐可以选自氯化钙，氯化钴，氯化锰，硫酸镁，硫酸锌，硫酸镍，硫酸铜，硫酸钾，硫酸铁，钼酸钠，亚硒酸钠，氯化钠及其混合物。
根据本发明的一种实施方式以及根据使用的菌株，培养基还可以包含氯化钠(NaCl)，特别是对于某些海洋来源的菌株。
根据该实施方式，可以提及例如可以允许培养基包含氯化钠的海洋菌株，裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的菌株，特别是裂殖壶菌CCAP 4062/3和CCAP4087/4的菌株。
根据本发明的另一种实施方式以及根据使用的菌株，培养基可以不包含氯化钠(NaCl)，至少可以包含非常少量的氯化钠，其具有小于3.5g/L、优选小于1g/L、更优选小于10mg/L的钠离子和小于1g/L、优选小于500mg/L、更优选200mg/L的氯离子。
根据该实施方式，可以提及例如可以允许培养基可能不包含氯化钠(NaCl)、至少可以包含非常少量的氯化钠的菌株，Aurantiochytrium mangrovei的菌株，特别是菌株Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4和CCAP 4062/1。
根据本发明的一种实施方式，所述限定的培养基的碳源可以是一种或多种碳水化合物，一种或多种乙酸盐，一种或多种醇，一种或多种复杂分子，或这些来源中至少两种按任何比例的任何混合物。
表述“这些来源的至少两种按任何比例的混合物”是指按任何比例的如下混合物中的至少一种：一种或多种碳水化合物和一种或多种乙酸盐，一种或多种碳水化合物和一种或多种醇，一种或多种碳水化合物和一种或多种复杂分子，一种或多种乙酸盐和一种或多种醇，一种或多种乙酸盐和一种或多种复杂分子和一种或多种醇和一种或多种复杂分子，一种或多种碳水化合物和一种或多种乙酸盐和一种或多种醇，一种或多种碳水化合物和一种或多种乙酸盐和一种或多种复杂分子，一种或多种碳水化合物和一种或多种乙酸盐和一种或多种醇和一种或多种复杂分子。
根据本发明，所述限定的培养基的所述氮源可以选自一种或多种硝酸盐，一种或多种谷氨酸盐，一种或多种铵盐，脲，氨，或这些来源中至少两种按任何比例的任何混合物。
表述“这些来源的至少两种按任何比例的任何混合物”是指按任何比例的如下混合物中的至少一种：一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐和脲和氨；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐和脲；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐和氨；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和脲和氨；一种或多种硝酸盐和一种或多种铵盐和脲和氨；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和脲；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐和氨；一种或多种硝酸盐和一种或多种铵盐和脲；一种或多种硝酸盐和一种或多种铵盐和氨；一种或多种硝酸盐和脲和氨；一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐和脲和氨；一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐和脲；一种或多种谷氨酸盐和一种或多种铵盐和氨；一种或多种谷氨酸盐和脲和氨；一种或多种铵盐和脲和氨；一种或多种硝酸盐和一种或多种谷氨酸盐；一种或多种硝酸盐和一种或多种铵盐；一种或多种硝酸盐和脲。
根据本发明的一种实施方式，所述限定的培养基的磷源可以选自磷酸，磷酸盐，有利的是磷酸氢二钠(Na2HPO4)，或磷酸二氢钠(NaH2PO4)，或磷酸二氢钾(KH2PO4)，或磷酸氢二钾(K2HPO4)，或这些来源中至少两种按任何比例的任何混合物。
根据本发明的一种实施方式，所述培养基可以包含：氯化镁，有利地为四水合物形式(MgCl2·4H2O)；氯化钙，有利地为二水合物形式(MgCl2·4H2O)；氯化钴六水合物(CoCl2·6H2O)；氯化锰(II)四水合物(MnCl2·4H2O)；硫酸镁七水合物(MgSO4·7H2O)；硫酸锌七水合物(ZnSO4·7H2O)；硫酸镍六水合物(NiSO4·6H2O)；合硫酸铜五水合物(CuSO4·5H2O)；硫酸钾(K2SO4)；硫酸亚铁七水合物(FeSO4·7H2O)；硼酸(H3BO3)；以二水合二钠形式的乙二胺四乙酸(Na2EDTA·2H2O)；钼酸钠二水合物(Na2MoO4·2H2O)；亚硒酸钠(Na2SeO3)；作为维生素的硫胺、钴胺素或维生素B12、泛酸或维生素B5；碳源；氮源；磷源。
根据本发明的优选形式，在所述培养基中，氯化镁的浓度可以为0.008至0.012g/L，有利地为0.009至0.011g/L；氯化钙的浓度可以为0.40至0.70g/L，有利地为0.50至0.60g/L；氯化钴六水合物的浓度可以为0.00008至0.00013g/L，有利地为0.00009至0.00012g/L；氯化锰(II)四水合物的浓度可以为0.008至0.013g/L，有利地为0.009至0.012g/L；硫酸镁七水合物的浓度可以为6至10g/L，有利地为7至9g/L；硫酸锌七水合物的浓度可以为0.008至0.013g/L，有利地为0.009至0.012g/L；硫酸镍六水合物的浓度可以为0.004-0.007g/L，有利地为0.005-0.006g/L；硫酸铜五水合物的浓度可以为0.005至0.009g/L，有利地为0.006至0.008g/L；硫酸钾的浓度可以为0.5至3.5g/L，有利地为1至3g/L；硫酸亚铁七水合物的浓度可以为0.03至0.05g/L，有利地为0.035至0.045g/L；硼酸的浓度可以为0.0155至0.0195g/L，有利地为0.0165至0.0185g/L；二水合二钠形式的乙二胺四乙酸的浓度可以为0.10至0.14g/L，有利地为0.11至0.13g/L；钼酸钠二水合物的浓度可以为0.00001至0.0003g/L，有利地为0.00005至0.0002g/L；亚硒酸钠的浓度可以为0.00000015至0.000019g/L，有利地为0.00000016至0.00000018g/L；硫胺的浓度可以为0.015至0.05g/L，有利地为0.025至0.04g/L；钴胺素或维生素B12的浓度可以为0.0004至0.00065g/L，有利地为0.00045至0.00060g/L；泛酸或维生素B5的浓度可以为0.008至0.013g/L，有利地为0.009至0.012g/L；碳源的浓度可以为45至65g/L，有利地为50至60g/L；氮源的浓度可以为7至11g/L，有利地为8至10g/L；磷源的浓度可以为2至6g/L，有利地为3至5g/L。
非常优选地，根据本发明，在所述培养基中，氯化镁的浓度为0.0108g/L；氯化钙的浓度为0.55g/L；氯化钴六水合物(CoCl2·6H2O)的浓度为0.000108g/L；氯化锰(II)四水合物的浓度为0.0108g/L；硫酸镁七水合物的浓度为8.01g/L；硫酸锌七水合物的浓度为0.0108g/L；硫酸镍六水合物的浓度为0.0056g/L；硫酸铜五水合物的浓度为0.0072g/L；硫酸钾的浓度为2.09g/L；硫酸亚铁七水合物的浓度为0.04g/L；硼酸的浓度在0.0155和0.0195g/L之间，为0.0175g/L；二水合二钠形式的乙二胺四乙酸浓度为0.12g/L；钼酸钠二水合物的浓度为0.000108g/L；亚硒酸钠的浓度为0.000000173g/L；硫胺的浓度为0.032g/L；钴胺素或维生素B12的浓度为0.00052g/L；泛酸或维生素B5的浓度为0.0108g/L；碳源的浓度为55g/L；氮源的浓度为9g/L；磷源的浓度为4g/L。
根据本发明，所述方法的第一培养步骤a)可以按所谓的“间歇”不连续模式、“间歇进料”半连续模式、或者按连续进料模式进行。
根据本发明的一种特定的实施方案，所述第一步骤a)分成两个子步骤，在合适的培养基中的第一生长子步骤a1)，然后是第二生产子步骤a2)，其中将一种或多种碳源、氮源和/或磷源富集溶液同时或接连添加至培养基，以保持培养基中的氮、磷水平不会限制生长。
根据一个优选的实施方案，进行生长子步骤a1)，直到获得小于20g/L的碳源(更具体而言是葡萄糖)的浓度。
根据另一个实施方案，进行生长子步骤a1)，直到获得下述培养物密度：至少20g/L，优选至少40g/L，更优选至少60g/L，甚至更优选至少80g/L。
在步骤a2)中的氮源的非限制性水平有利地为0.5至5g/L、优选0.5至2g/L，磷源的非限制性水平有利地为0.5至5g/L、优选0.5至2g/L。该步骤a2)所需的碳源含量可以是0至200g/L，尤其是5或10至50g/L。优选地，子步骤a2)中的碳源含量为0至50g/L，更优选为0至10g/L。
优选地，将第一步骤a)分成如上定义的两个子步骤a1)和a2)的培养按所谓的“间歇进料”半连续模式进行。
通常，子步骤a1)和a2)在24℃至35℃、优选在25℃至30℃的温度进行。
方法的第二步骤b)通常在培养开始24小时后开始。一般在18℃至25℃的温度进行。这种温度的下降使生产朝着长链多不饱和脂肪酸(PUFA)、特别是DHA、ARA和EPA进行，而不是朝着生产蛋白质进行。生产的脂肪酸谱通常取决于培养的菌株。
通常在步骤b)期间，正如对步骤a2)所做的一样，可以将一种或多种碳源和/或氮源和/或磷源富集溶液同时或接连地添加到培养基中，以维持培养基中碳源含量为5至200g/L、优选10至50g/L，氮源含量为0.5至5g/L、优选为0.5至2g/L，磷源含量为0.5至5g/L、优选0.5-2g/L。
培养一般在50到70小时后停止。
培养期间类可以任选地诱导生产胡萝卜素，优选在步骤b)期间，但是也可以在整个培养过程中进行。为了诱导生产类胡萝卜素，应用兼养条件，其优选使用约435-475nm、优选455nm的蓝光。因此培养是兼养模式。用这些波长生产类胡萝卜素，如虾青素，角黄素，β-胡萝卜素和芬尼黄质。光通常施用至少18小时，优选至少24小时。根据本发明的一种优选实施方式，从培养了24小时至50小时开始、更优选从培养了45小时开始将光施用于培养物。通常优选地，这种照射一直持续到培养结束。也可以在培养即将结束之前(例如结束前15分钟、30分钟、45分钟或者1小时)停止照射。
根据本发明的某些实施方式，在培养结束前，通常使培养物暴露于光至少18小时、优选至少24小时。根据本发明的一种实施方式，从开始(即在培养步骤a)和b)期间)照射培养物。根据本发明的一种优选实施方式，从步骤b)开始的那一刻开始照亮培养物。根据本发明的一种优选实施方式，在培养的至少最后18小时期间，优选至少在培养的最后24小时期间，照射培养物。
可以使用白光，但是本发明人通过使用波长为约435-475nm、优选为455nm的蓝光注意到较高的类胡萝卜素含量。通常，从培养了40至50小开始(即培养开始后的40至50小时)，优选为从培养了45小时开始，直至培养结束(培养之间50和70小时)，将培养物暴露于光。在这些条件下，获得约150-250ppm(ng/mg)、优选180-200ppm(干物质)的类胡萝卜素含量。根据一种实施方式，类胡萝卜素的虾青素含量为5％至30％。根据一种实施方式，类胡萝卜素的芬尼黄质含量为15％至30％。根据一种实施方式，类胡萝卜素的β-胡萝卜素含量为0％至30％。
通常，方法的步骤a)和b)可以在异养条件下和/或在兼养条件下进行。为了获得类胡萝卜素，在步骤b)中，培养在兼养条件下在培养结束前进行至少24小时。
根据本发明的一种实施方式，例如当不生产类胡萝卜素时，培养完全在异养条件下进行。通常，在培养过程中使用兼养条件对于脂质(特别是PUFA)的生产以及类胡萝卜素的生产具有积极影响，并且使得可以提供生物质和脂肪酸(特别是PUFA，特别是DHA)和类胡萝卜素的产量。
步骤a1)、a2)和b)可以在异养条件下或在兼养条件下独立进行。根据本发明的一种实施方式，步骤a1)和a2)在异养条件下进行，然后步骤b)完全或部分在兼养条件下进行。根据本发明的一种优选实施方式，步骤a1)在异养条件下进行，步骤a2)在兼养条件下进行。
根据本发明的另一种实施方式，在步骤b)期间，使培养物在兼养条件下暴露于白光。根据本发明的另一种实施方式，在步骤b)期间，使培养物在兼养条件下暴露于白光，至多到培养的40至50小时、优选45小时，然后使培养物暴露于波长为约435-475nm、优选455nm的蓝光至少24小时。
根据本发明的一种实施方式，在以兼养模式进行培养时，照射是可变的和/或不连续的。闪光形式的照射对于原生生物的发育是特别有利的，并且可以提高它们的生产力，特别是在它们生产脂质和类胡萝卜素方面。
术语“不连续照射”是指穿插黑暗期的照射。黑暗期可能占培养藻类的时间的25％以上、优选50％以上。
根据本发明的优选方面，照射是不连续的，且更优选为闪光的形式。在本发明的意义上，闪光是短持续时间(即少于30分钟)的照射。持续时间可以少于15分钟，优选少于5分钟，或甚至更优选少于1分钟。根据本发明的某些实施方式，闪光的持续时间可以小于1秒。例如，闪光的持续时间可以是1/10秒，或者2/10秒，或者3/10秒，或者4/10秒，或者5/10秒，或者6/10秒，或7/10秒，或8/10秒，或9/10秒。照射或闪光通常持续时间超过15秒。其通常是5秒至10分钟，优选10秒至2分钟，更优选20秒至1分钟。这些闪光持续时间适用于“低频”光源。
根据该最后的实施方式，在照射体系(光源)处于“低频”的情况下，闪光次数可以是每小时约2至3600次。例如，其可以是每小时100至3600次闪光。其也可以是每小时120至3000次闪光、或400至2500次闪光、或600至2000次闪光、或800至1500次闪光。其也可以是每小时2至200次闪光、优选10至150次闪光、更优选15至100次闪光、甚至更优选20至50次闪光。
根据一种实施方式，闪光灯可以具有1/150000秒至1/1000秒的持续时间。这些闪光持续时间适合于“高频”照射体系，即闪光频率分别为150kHz至1kHz。
根据该实施方式，在照射体系(光源)为“高频”的情况下，闪光可以每小时发生3.6×105至5.4×109次。在这种情况下，光变化的频率为1kHz至150kHz，即每秒闪光1000至150,000次。根据本发明的该最后实施方式的光源称为“高频”。
每小时的闪光次数可以根据闪光的强度和持续时间来选择(见下文)。通常，以闪光形式提供的光的强度可以是5至1000μmol·m–2·s–1，优选5至500μmol·m–2·s–1或50至400μmol·m–2·s–1，更优选为150至300μmol·m–2·s–1。1μmol·m–2·s–1对应于文献中经常使用的单位1μE m–2·s–1(爱因斯坦)。
根据本发明的另一种实施方式，照射可以是可变的，这意味着照射不被黑暗期中断，而是光强度随时间变化。光强度的这种变化可以是规则的，并且可以是周期性的或循环的。根据本发明，还可以将连续和不连续照射的相位组合来提供光。
根据本发明的一种优选实施方式，使用异养占优势的兼养条件。破囊壶菌不具有叶绿体。因此，用于生长的大部分能量来自培养基的碳源。在这种情况下，光诱导细胞中的某些代谢途径，但不能通过光合作用固定碳。
根据一种优选的实施方式，对培养物的照明可以通过发酵器内部的照射装置来保证。因此，相对于光从设置在外部的光源穿过窗的配置，上述照射的效果更好。照射装置可以布置在配备有叶片的旋转组件上，或者布置在浸没在待处理物质的管状部分上，或者布置在箱的底部或顶部。根据本发明的优选实施方式，照射装置可以位于发酵罐内的挡板上。这样的装置描述于法国专利申请1353641中。因此，发酵罐可配备有由挡板承载的多个照射源，挡板的功能是防止在旋转混合组件的作用下在生物质内形成涡流。这些照射源优选地被部分地或完全地封装在这些挡板的至少一个部分中，挡板的材料与生物质相容且厚度使得能够将所述光在箱内散射。
根据本发明，培养可以通过任何已知的培养技术进行，例如在烧瓶中或在反应器中进行，但也可以在发酵罐或任何适于原生生物(特别是破囊壶菌)生长的容器例如“滚道(raceway)”型流域中进行，只要所述技术能够实现所需的培养条件即可。
优选地，培养可以在发酵罐中根据用于在发酵罐中培养原生生物的已知方法进行。
根据本发明，所述方法的用于回收所述生物质的第三步骤c)可以在适于获得可具有所需水分含量的生物质的条件下进行。
所述原生生物的回收可以通过允许回收生物质的任何技术进行，特别是过滤方法，重力或减压方法，离心方法，滗析方法，或甚至是沉淀然后重力过滤的方法。
本发明的目的还在于这样的生物质，其可以通过如上所述的本发明的方法以其所有变体形式获得。
本发明的目的还在于如上所述的生物质在化妆品、药物和食品(用于人或动物消费)领域中的用途。
在动物饲养方面，牲畜的饲养、特别是集约化畜牧业的饲养将有别于家养动物或宠物或所谓的“消遣(leisure)”动物(例如水族鱼类或鸟舍或笼养的鸟类)的饲养。
术语“牲畜”特别指放牧动物(特别是养来生产肉、奶、奶酪和皮革的牛；养来用于生产肉、羊毛和奶酪的绵羊；山羊)，猪，兔子，家禽(雏鸡，母鸡，火鸡，鸭，鹅等)，马家族成员(小型马，马，驹)，用于支持人类活动(运输，消遣)或其饲养的动物，水生动物(例如鱼，虾，牡蛎和蚌类)。然而，饲养鱼直至仔鱼期可能有别于养成的鱼的饲养，包括用于此目的的饲料和饲料组合物。
会区分家畜、宠物和消遣动物。它们也包括哺乳动物，反刍动物，鸟类和鱼类。它们特别包括狗和猫。
本发明的目的还包括用于人或动物的食品或食品组合物，其可以包含如上所述的根据本发明的生物质。术语“食品”是指可用作人或动物、特别是家畜的食品的任何组合物。
根据本发明的一种实施方式，食品可以由任选干燥的、任选转化的生物质组成，或是由任选干燥的、任选转化的生物质与用于人或动物消耗的食品领域的任何其它添加剂、载剂或支持物的混合物组成。作为添加剂的例子，可以提及食品防腐剂，染料，增味剂，pH调节剂，填充剂，增稠剂，纹理剂或粘合剂。还可以提及维生素，益生菌和益生元，或者药物添加剂例如生长激素、抗生素。
根据本发明的一种实施方式，任选干燥的、任选转化的生物质本身可以在意欲用于人或动物消耗的食品中用作媒介物或支持物，添加剂，食品防腐剂，染料，增味剂，填充剂，增稠剂，纹理剂或粘合剂。
本发明特别涉及用于动物的饲料，更具体地涉及用于牲畜的饲料。这种饲料通常可以出现为以下形式：掺入根据本发明的生物质的简单的混合物、面粉、丸粒、剩菜屑(slop)或草料(新鲜草料，青贮饲料，干草等)。饲料可由饲养员自己制备或由动物饲料专家生产。术语“饲料”是指可以用来喂养动物的任何东西。
对于集约式动物饲养作业，除藻类生物质之外，饲料还可以包含营养基质和营养添加剂。因此，动物饲料配给量的必要部分可以由“营养基质”和藻类生物质组成。这种基质可以由例如谷类、动物和/或植物来源的蛋白质和脂肪的混合物组成。
动物的营养基质适于饲养这些动物，并且是本领域技术人员熟知的。在本发明的上下文中，这些营养基质可以包含例如鱼粉，玉米的衍生物，小麦，豌豆和大豆，以及其他谷物。这些营养基质可以适于它们预期用于的各种动物物种的需要。这些营养基质可以已经含有营养添加剂，如维生素、矿物盐和氨基酸。
用于动物饲料的添加剂可以添加到营养基质或藻类生物质中。可以添加这些添加剂以改善饲料的某些特性，例如增强饲料的风味，使饲料的原料更易被动物消化，更有效地保藏饲料或保护动物。它们经常用于大规模集约化养殖作业。
可用于动物饲料的添加剂特别可分为以下子类(来源：EFSA)：
-技术添加剂：例如防腐剂，抗氧化剂，乳化剂，稳定剂，酸度调节剂和青贮饲料添加剂；
-感官添加剂：例如香料，染料，
-营养添加剂：例如维生素，氨基酸，微量元素；
-畜牧添加剂：例如，消化性增强剂，肠道菌群稳定剂，如益生菌和益生元；
-球虫抑制剂和组织滴虫抑制剂(杀虫剂)。
在一种实施方式中，本发明涉及牲畜饲料，其可以包含1％至60％、优选1％至20％、非常优选3％至8％的通过本发明的方法获得的干燥的生物质。
在另一种实施方式中，本发明涉及牲畜饲料，其可以包含1％至40％、优选5％至10％的通过本发明的方法获得的非干燥的生物质。
根据本发明的一种特定实施方式，饲料可以意在用于牲畜，特别是牛，羊，猪，兔，家禽和马。
根据本发明的另一种特定实施方式，食品可以意在用于水生动物，特别是鱼类，至少达到仔鱼期，实际上包括养殖鱼。使用在生长阶段结束时具有高含量的蛋白质和PUFA且含有色素的生物质使得可以改善肉质(由于存在PUFA和色素)。
根据本发明的另一种特定实施方式，饲料可以意在用于家畜，宠物和/或消遣动物。
最后，根据本发明的另一种实施方式，食品组合物可以意在用于人，特别是该组合物可以适用于儿童，青少年，成人或老年人。
本发明还有一个目的是用于人或动物的化妆品或药物组合物，其可以包含如上所述的根据本发明的生物质。
根据本发明，化妆品或药物组合物可以仅包含任选干燥的、任选转化的生物质，或包含任选干燥的、任选转化的生物质与化妆品领域中使用的任何其它添加剂、载剂或支持物(例如防腐剂，染料，pH调节剂)的混合物。
本发明还有一个目的是如上所述的生物质在治疗中的用途，例如在预防和治疗营养不良中的用途。已知在治疗营养不良方面，蛋白质缺乏是危害最大和治疗最昂贵的。根据本发明的一种实施方式，生物质可以构成所选用于预防和/或治疗营养不良(特别是在儿童和老年人中)的完整解决方案。生物质可以构成平衡和可消化的蛋白质来源(蛋白质缺乏是危害最大和最昂贵的)。其蛋白质部分可以与儿童正常健康发育所需的高营养品质脂质的来源相结合。根据本发明的生物质也可以适于由老年人用于预防和/或治疗营养不良和其他老龄化相关疾病。在本文中，根据本发明的生物质的类胡萝卜素供应对于这些人群(正面临诸如老龄化相关的黄斑变性(AMD)等疾病的风险的老年人)的健康也是高度有益的。
因此可以将生物质掺入到完整的食物中(以湿的形式或作为粉末进行再水合)；小吃，如谷物棒，烤面包，饼干，蛋糕或糖果；烹饪产品如奶油；粉末混合物；乳制品；谷物或饮料。生物质可以存在于膳食补充剂中，例如以粉末、涂抹酱或酱汁的形式添加到日常饮食中。
实施例
通过阅读以下实施例，本发明的其它方面和特征将变得显而易见。
实施例1：在25℃的培养方法
Aurantiochytrium CCAP4062/1培养物在与计算机控制的自动化系统联用的1-L至2-L发酵罐(生物反应器)中制备。通过加入碱(NH4OH)来调节体系的pH。培养温度设定为25℃，然后在培养24h时降至18℃。在整个培养过程中通过振荡速度(220-1200rpm)、空气流速(0.6-2vvm)或氧气流速(0-2vvm)调节培养基中的溶解氧压力。整合到控制器中的监管参数使得可以保持5％至30％的恒定pO2。培养时间为72小时。
培养过程中使用的培养基的组成如下表所示：
以碳与磷摩尔比(C:P)为530:1的富集溶液的形式制备葡萄糖添加物。
在温度受控的外壳(26℃)中的振动台(140rpm)上制备预培养物，首先24小时，然后70小时。
培养监测：
通过测量干质量来监测总生物质浓度(在GF/F过滤器Whatman上过滤，然后烘在称重之前在105℃烘箱干燥至少24小时)。生物质外观呈浅米色。
总脂质和脂肪酸含量的分析根据文献中经典描述的方法进行[Folch J.et al.,Asimple method for the isolation and purification of total lipids from animaltissues.J Biol Chem.1957May；226(1):497–509]。
结果：
| 参比试验 | 培养时间 | DM(g/L) | ％脂肪/DM | ％AA/DM | ％DHA/脂肪 |
| 试验A | 71h | 95 | 25.8 | 44.6 | 29 |
| 试验B | 71h | 105 | 27.9 | 45.2 | 32 |
实施例2：在30℃处用步骤a)的培养方法
Aurantiochytrium CCAP4062/4培养物在与计算机控制的自动化系统联用的1-L至2-L发酵罐(生物反应器)中制备。通过加入碱(NH4OH)将体系调节至pH 6。将培养温度设定为30℃，然后在培养24h时降至18℃。在整个培养过程中通过振荡速度(220-1200rpm)、空气流速(0.3-1vvm)或氧气流速(0-1vvm)调节培养基中的溶解氧压力。整合到控制器中的监管参数使得可以保持5％至30％的恒定pO2。培养时间为40至100小时(试验A：69小时，试验B：51小时)
培养基与实施例1的培养基相同。
对于试验A，以碳:氮:磷(C:N:P)摩尔比为190.5:7.3:1的富集溶液的形式添加葡萄糖。对于试验B，富集溶液的C:N:P摩尔比为95.3:3.2:1
在温度受控的外壳(26℃)中的振动台(140rpm)上进行预培养物链接(Preculturechaining)，首先24小时，然后70小时。
培养监测：
通过测量干质量来监测总生物质浓度(在GF/F过滤器Whatman上过滤，然后烘在称重之前在105℃烘箱干燥至少24小时)。生物质外观呈浅米色。
总脂质和脂肪酸含量的分析根据文献中经典描述的方法进行[Folch J.et al.,Asimple method for the isolation and purification of total lipids from animaltissues.J Biol Chem.1957May；226(1):497–509]。
实施例3：在步骤b)的最后25小时期间使用蓝光照射的培养方法
Aurantiochytrium CCAP4062/4培养物在与计算机控制的自动化系统联用的5-L发酵罐(生物反应器)中制备。通过加入碱(NaOH)将体系调节至pH 5。将培养温度设定为30℃，然后在培养24h时降至18℃。整合到控制器中的监管参数使得可以保持5％至30％的恒定pO2。培养时间为70小时。从培养了45小时开始，使培养物暴露于蓝光(455nm波长)。将光源(LED)安装在生物反应器内的两个挡板上。
培养基与实施例1的培养基相同。
葡萄糖的添加以C:N:P摩尔比为37:4:1的富集溶液的形式进行。
在温度受控的外壳(26℃)中的振动台(140rpm)上进行预培养物链接，首先24小时，然后70小时。随后在发酵罐中预培养24小时。
培养监测：
通过测量干质量来监测总生物质浓度(在GF/F过滤器Whatman上过滤，然后烘在称重之前在105℃烘箱干燥至少24小时)。
总脂质含量的分析根据文献中经典描述的方法进行[Folch J.et al.,A simplemethod for the isolation and purification of total lipids from animaltissues.J Biol Chem.1957年5月；226(1):497–509]。
生物质外观呈黄色/橙色。与产生白色/浅奶油色生物质的实施例1和2相比，本实施例的颜色差异是由于在左边的烧瓶中存在类胡萝卜素(主要是β-胡萝卜素，角黄素，芬尼黄质和虾青素)造成的。
在试验A中测得的类胡萝卜素：199ppm。
| 虾青素 | 芬尼黄质 | 角黄素 | |
| ppm* | 32 | 50.9 | 116 |
| 总胆固醇的％ | 16％ | 26％ | 58％ |
*ppm＝ng/mg DM
Claims (25)
1.一种包含蛋白质和脂肪酸的破囊壶菌生物质，其特征在于所述破囊壶菌生物质包含按重量计至少35％的蛋白质和至少20％的脂肪，相对于干物质的重量，以及特征在于所述生物质是无添加的蛋白质或脂肪酸的生物质。
2.权利要求1的破囊壶菌生物质，其特征在于所述破囊壶菌生物质包含至少45％的蛋白质。
3.权利要求1或2的破囊壶菌生物质，其特征在于所述破囊壶菌生物质包含至少30％的脂肪。
4.权利要求1-3任一项的生物质，其特征在于所述脂肪具有25％至60％含量的选自AA、DHA和EPA的多不饱和脂肪酸。
5.权利要求1-4任一项的生物质，其任选地包含5至250ppm、优选150至200ppm的类胡萝卜素。
6.权利要求1的生物质，其特征在于类胡萝卜素具有相对于脂肪5％至30％的虾青素含量、15％至30％的芬尼黄质含量、和0％至30％的β-胡萝卜素含量。
7.权利要求1-6任一项的生物质，其特征在于所述破囊壶菌是选自下组的属：Aurantiochytrium、Aplanochytrium、Botryochytrium、Japonochytrium、Oblongichytrium、Parietichytrium、Schizochytrium、Sicyoidochytrium、Thraustochytrium和Ulkenia。
8.权利要求7的生物质，其特征在于所述破囊壶菌选自以下的种：Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/2；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3；Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/4；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5；Aurantiochytriummangrovei CCAP 4062/6；Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1；Schizochytriumsp.4087/3；Schizochytrium sp.CCAP 4087/1；Schizochytrium sp.CCAP 4087/4；Schizochytrium sp.CCAP 4087/5。
9.用于生产如权利要求1-8任一项限定的生物质的方法，其特征在于所述方法包括：
a.第一步骤，在异养或兼养条件下，在包含碳源、氮源、磷源和盐的限定培养基中，在约24℃至35℃的温度范围，和在能够促进以按重量计相对于干物质的重量至少35wt％蛋白质的水平生产蛋白质的条件下培养破囊壶菌；
b.第二培养步骤，其在异养或兼养条件下，在约18℃至25℃且低于步骤a)的温度，在能够促进相对于干物质的重量多达至少20wt％的脂肪积累的条件下培养，且直到获得至少40g/L干物质的培养物密度；
c.第三步骤，通过将在第二步骤中获得的生物质从所述培养基分离来回收所述生物质(收获)，任选地然后进行均质化；和如果需要的话
d.第四步骤，将在第三步骤中回收的生物质干燥。
10.权利要求6的方法，其特征在于用波长为435nm至475nm的光照射所述培养物。
11.权利要求11的方法，其特征在于在培养的至少最后18个小时的期间照射所述培养物。
12.权利要求11的方法，其特征在于从培养了约24-50小时开始且直到培养结束时照射所述培养物。
13.权利要求9-12任一项的方法，其特征在于所述第一培养步骤a)按所谓的“间歇”模式、按所谓的“间歇进料”模式、或按连续模式进行。
14.权利要求13的方法，其特征在于所述培养包括分成两个子步骤的第一步骤a)：在合适的培养基中进行的第一生长子步骤a1)，其进行直到获得低于20g/L的培养基中的碳源含量；然后是第二生产子步骤a2)，其中将一种或多种碳源、氮源和磷源富集溶液同时或接连添加至所述培养基。
15.权利要求14的方法，其特征在于，在步骤a2)中，碳源含量保持在0-50g/L，氮源含量保持在0.5-5g/L，磷源含量保持在0.5-5g/L。
16.权利要求9至15任一项的方法，其特征在于，所述照射是不连续的，其为闪光形式。
17.一种生物质，其可以通过权利要求9至16任一项所述的方法获得。
18.权利要求1至8任一项或权利要求17所述的生物质在人或动物化妆品和食品领域中的用途。
19.权利要求1至8任一项或权利要求17所述的破囊壶菌生物质用于改善动物性能的用途，所述性能通过测量消耗指数、体重增加或饲料转化比来评估。
20.一种用于人或动物的化妆品或药物组合物，其包含权利要求1至8任一项或权利要求17所述的生物质。
21.一种食品，其特征在于所述食品包含权利要求1至8任一项或权利要求17所述的生物质。
22.权利要求21的食品，其特征在于所述食品预期用于人消耗。
23.一种牲畜饲料，其特征在于所述牲畜饲料包含1％至60％的权利要求1至8任一项或权利要求17所述的生物质。
24.权利要求1至8任一项或权利要求17的生物质，其用于治疗用途。
25.一种用于水产养殖的饲料，其特征在于所述饲料包含1％至60％的权利要求1至8任一项或权利要求17所述的生物质。
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