CN102839129A - 一种裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的裂殖壶菌变异株。特别是，本发明涉及DHA含量提高和/或生长速度快的裂殖壶菌变异株，以及利用该菌株生产DHA的方法。此外，本发明还涉及产生本发明所述菌株的方法，包括采用紫外线对裂殖壶菌进行诱变，以及在脂肪合成关键酶(乙酰辅酶A羧化酶)抑制剂(例如喹禾灵)的选择压力下，筛选生长速度快和DHA含量高的株系。

Description

一种裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株
技术领域
本发明属于微生物遗传育种技术和发酵生物技术领域，尤其涉及用于生产DHA(二十二碳六烯酸，22:6，n-3)的诱变菌株。 
背景技术
DHA(Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸，22:6，n-3)是一种必需脂肪酸，即人体不能自生合成，又具有重要生理功能的长链脂肪酸。DHA是人的大脑和视网膜的主要组成成分，在大脑皮层中含量达20％，在视网膜中含量高达50％，因此，对胎婴儿的神经系统和视觉系统的发育起重要作用，是维持正常智力和视力的重要的保障，还具有防治心血管疾病、抗癌、抗炎等重要的生理功能。另外，DHA还是多种海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，可以提高鱼苗的成活率和降低白化病发病率。传统上DHA从深海鱼油中获得，但从鱼油中提取的多不包含脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)存在着产量不稳、得率低、成本高及含有其它的ω-6PUFAs等问题，且随着渔业资源的日益紧张，传统的DHA资源已无法满足日益增长的市场需求。因此，开发DHA的新生资源已成为新的研究热点。 
裂殖壶菌(Schizochytrium sp)是一种已经开发为生产DHA和其他多饱和脂肪酸的商业资源海洋微藻或真菌样微生物，目前已被用来生产DHA。该菌使用安全，Hammond等人用其对白鼠、兔子进行了一系列的安全性检测，没有发现任何毒副作用。 
但是，在发酵生产的过程中，裂殖壶菌难免发生种质退化，从而导致DHA产率下降。因此，亟需改良该种质，从而提高生长率，尤其是提高DHA含量。 
乙酰辅A羧化酶[Acetyl-Co A carboxylase，ACC，(EC6.4.1.2)]是一种脂肪合成的关键酶，而除草剂喹禾灵{2-[4-(6-氯-2-喹恶啉氧基)-苯氧基] 丙酸乙酯}是该酶的抑制剂。在喹禾灵存在的情况下，细胞往往会因脂肪合成途径受阻变得生长缓慢甚至死亡。 
近年来，一些研究表明喹禾灵能够诱导微藻诱变，可以进一步筛选得到EPA含量提高的诱变株。 
例如，Chaturvedi等(2004)用MNNG对微绿球藻(Nannochloropsis oculata)诱变，再筛选抗除草剂喹禾灵藻株，EPA含量明显提高。 
Chaturvedi等(2006)用EMS对微绿球藻(Nannochloropsis oculata)进行诱变处理，再筛选浅蓝菌素(cerulenin)及红霉素(erythromycin)抗性藻株，EPA含量分别提高了29％和12％。 
Cao Xiaohong等(2007)先后用二甲基亚砜和喹禾灵处理硅藻菱形藻属(Nitzschia laevis)，其EPA的含量从3.00％提高到3.58％。 
已知裂殖壶菌不同于微绿球藻或硅藻菱形藻属，而且EPA的含量较低，到目前为止，还不清楚是否存在抗喹禾灵的诱变裂殖壶菌。而且如果存在这种突变株，也不清楚，经喹禾灵突变株筛选后是EPA的含量还是DHA的含量得到提高。尤其是，到目前为止，并不清楚，经UV诱变的裂殖壶菌是否能够在喹禾灵的筛选中活存。 
发明内容
本申请的发明人惊奇发现，用紫外诱变技术对裂殖壶菌实施诱变，然后利用关键脂肪合成酶(例如乙酰辅酶A羧化酶)抑制剂，例如但不限于喹禾灵，进行定向筛选，能够得到DHA含量增加的裂殖壶菌变异株。此外，根据以上获得的变异株DHA含量高，而且生长速度快。 
据此，第一方面，本发明提供生产具有增加的DHA含量的裂殖壶菌变异株的方法，包括(a)利用紫外线照射(UV)诱导裂殖壶菌突变，以及(b)将步骤(a)获得的菌株与乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂接触，来筛选具有增加的DHA含量的裂殖壶菌突变株。 
在本发明的一个实施方案中，所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂是喹禾灵。在本发明的一个优选的实施方案中，所述DHA含量增加的变异株还具有快的生长速度，从而使得DHA的生产效率提高。 
在本发明的另一实施方案中，所述裂殖壶菌突变株的DHA含量的提 高是相对于其母体或起始菌株比较而言，优选地，该DHA含量高于经UV突变而未经乙酰辅酶A羧化酶抑制剂筛选的菌株。 
在第二方面，本发明提供裂殖壶菌的变异株，例如于2011年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏号为CCTCC M2011024的菌株裂殖壶菌2010-0321(Schizochytrium limacinum2010-0321)。 
在另一实施方案中，所述变异株通过本发明公开的方法获得，该方法包括(a)利用紫外线照射诱导裂殖壶菌突变，以及将步骤(b)获得的菌株与乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂接触，来筛选具有增加的DHA含量的裂殖壶菌突变株。 
在第三方面，本发明提供生产DHA的方法，包括在培养基中培养本发明公开的裂殖壶菌变异株。在一个实施方案中，还涉及由此方法产生的生物量(biomass)。 
在另一方面，本发明还提供食品，优选所述食品含有本发明的生物量或根据本发明方法生产的DHA。 
附图简要说明 
图1显示紫外线对裂殖壶菌的致死作用。 
图2显示喹禾灵浓度与裂殖壶菌致死率的关系。 
图3显示对照菌株和变异株的生长速度和DHA含量。 
图4显示对照菌株和变异株在50L发酵罐实验中的生长速度和DHA含量。 
图5显示对照菌株与变异株321-3的18S rRNA序列的比对结果。 
具体实施方式
本文所使用的术语“菌株”在本发明中指从单一细胞或分离菌落获得的微生物的任何培养物，通常为纯的培养物。 
本文所使用的术语菌株X的“变异株”或“突变株”，在本发明的内涵之中，指任何从参照菌株X得到的菌株。在本发明的上下文中，术语“变异株”更特别地用于指主要通过从参照菌株X突变和选择而得到的菌株，而术语“突变株”更特别的指通过随机或定向诱变技术应用于菌株X上得到的菌株。 
一旦本发明的菌株的突变株或变异株具有本发明的基本方面，尤其是具有高的或增加的DHA含量时，其当然被包括在本发明的保护范围中。 
本文所使用的术语“食品”，在本发明中指任何用于人类或动物营养的产品。特别的，食品包括用于给食婴儿、儿童、青少年和成人的产品。全部或部分的本发明的食品含有至少一种本发明的生物量或DHA。本发明的食品也能含有其他通常用于农业和食品工业的成分，如添加剂、防腐剂、果类或果类提取物、调味剂、着色剂、增稠剂、谷类、巧克力等。在一个具体的实施方案中，食品是乳制品。本文所用术语“乳制品”指，除了奶之外，还包括任何奶衍生的产物，如奶粉、乳酪、冰淇淋、黄油、干酪、酸奶酪、发酵牛奶；副产物，如抗乳血清和干酪素以及各种制备的含有奶或奶成分作为主要成分的食品。所述奶通常是奶牛的奶，但是也能是其他哺乳动物的奶，如山羊、母羊、母马、骆驼或水牛。这些乳制品均添加了本发明方法生产的DHA或生物量。 
适于本发明的突变或诱变以及筛选的起始菌株包括异养的微藻类，其包括裂殖壶菌属(Schizochytrium sp)的成员。优选的裂殖壶菌属成员是裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)。可从许多公开可利用的来源，包括通过从自然环境收集而获得合适的生物量。用于本发明中的裂殖壶菌株的例子包括，裂殖壶菌SR21(Schizochytrium limacinum SR21)、Schizochytrium sp.(S8)(ATCC 20889)、Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC 18915)和Schizochytrium limacinum IFO 32693(Honda et Yokochi，日本大阪微生物研究所(IFO，Institute for Fermentation.Osaka，Japan)，优选Schizochytrium limacinum SR21或Schizochytrium limacinum IFO 32693菌株。本文所用的任何微生物或生物体的任何具体类型，包括野生菌株、突变株或重组类型。 
在裂殖壶菌突变的实施方案中，将裂殖壶菌暴露于紫外线辐射约10秒-140秒(S)，优选约20秒-120秒，更优选约30秒至100秒，最优选约70秒至90秒。在一具体的实施方案中，将裂殖壶菌暴露于紫外线辐射的时间选自约70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89和90秒。收集活存的Schizochytrium菌落用于乙酰辅酶A羧 化酶抑制剂，例如喹禾灵的定向筛选。 
在一个具体的实施方案，一定浓度的喹禾灵被加入到培养基中来筛选喹禾灵抗性株。在筛选中使用的喹禾灵的浓度范围为约5μmol/L至100μmol/L，优选约10μmol/L至90μmol/L，更优选约50μmol/L至80μmol/L培养基。在一个具体的实施方案中，所述喹禾灵的浓度选自约51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79和80μmol/L培养基。在一个优选的实施方案中，所述喹禾灵的分子式为{(R)-2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]-丙烯酸酯}。 
在一个优选的实施方案中，所述抗喹禾灵的Schizochytrium菌落的筛选首先在含有喹禾灵的固体培养基中实施，然后从该固体培养基中挑选活存的菌落，并将其进一步培养在含有喹禾灵的液体或半固体培养基中，以验证该菌落具有喹禾灵的抗性。 
优选地，基于菌株的生长速率和DHA含量进一步筛查所挑选的抗喹禾灵的菌落。 
由此，通过包括UV暴露和喹禾灵筛选的本发明的方法获得的裂殖壶菌变异株与正常或起始的裂殖壶菌比较，可以产生较高或增加的DHA量。所述裂殖壶菌变异株产生DHA的量，在7天培养物或生物量中，优选在5天的培养物或生物量中，至少高于正常对照株或起始株约10，20，25，30，35，40％，优选至少高于正常对照株或起始株约20，25，30，35，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70％。在另一优选的实施方案中，所述裂殖壶菌变异株产生DHA的量为至少1.0％(w/w)，2.0％(w/w)，3.0％(w/w)，3.5％(w/w)，4.0％(w/w)，4.5％(w/w)，5.0％(w/w)，5.5％(w/w)，6.0％(w/w)，或6.5％(w/w)的裂殖壶菌变异株的生物量干重，优选为占裂殖壶菌变异株的生物量干重的3.0％-6.5％(w/w)。 
在另一实施方案中，所筛选的裂殖壶菌变异株具有高于正常对照或起始菌种至少约3，4，5，6，7，8，9，10％的生长速度，优选在7天，更优选在5天的培养期内。 
在优选的实施方案中，所筛选的裂殖壶菌变异株在不同的培养条件 在，其生长速度和产生高含量DHA的能力均是稳定的。这些不同培养条件例如不同的葡萄糖浓度、不同的氮源以及不同的pH值等。 
在任选的实施方案中，可以对所述裂殖壶菌变异株的18S RNA进行分析，以鉴定相对于正常对照菌株的遗传变异。 
在一个实施方案中，所述裂殖壶菌变异株的例子包括但不限于菌株321-1，321-3和303-11，更优选菌株321-3。 
在另一实施方案中，为生产具有较高含量的DHA生物量，将本发明的裂殖壶菌变异株在适合裂殖壶菌培养的条件下进行培养，优选地，该变异株选自菌株321-1，321-3，303-11或其组合，更优选菌株321-3。 
在本发明的实施方案中，所述培养条件可由本领域公知的方法来实现，这些方法包括在美国专利5,130,242和美国专利7,022,512公开的方法(其全部以引用的方式并入本文)，而且本领域技术人员可容易地确定最佳条件。简言之，可以在任何适合的发酵罐，优选在提供氧来源的搅拌釜发酵罐或气升式发酵罐中完成培养。应将微生物的搅拌保持在一定的水平以使在溶解氧浓度足够支持培养物生长和DHA产生的同时，所述搅拌不剪切或以其它方式损害微生物。优选的溶解氧水平为至少10％的空气饱和水平，更优选将溶解氧水平保持在大约10％至约50％的空气饱和水平。本发明示例性的发酵罐可以提供1VVM通气比率，转速为70～100RPM。 
适合的发酵罐的体积为至少10至60公升，例如10，20，30，40，50，或60公升。高达100至150公升也可以使用。 
可以在任何维持微生物活存的温度下进行培养。通常，可在约15℃至约34℃温度下培养微生物，优选将培养稳定保持在约20℃至约28℃，更优选约22℃至约27℃。 
发酵过程中的培养基的pH为4-10，例如5-8，优选6-7。 
发酵的时间通常持续10天或更少，优选9天或更少，更优选8天或更少。可以是或至少是4、5、6或7天。 
任选的发酵时间可以持续150-200小时，例如，160-190小时，优选170-180小时。 
在本发明的实施方案中，所述方法中使用的培养裂殖壶菌变异株的培养基优选为液体培养基，并优选包含本领域已知的在商业可行的水平上促进生长和DHA产生的组分，可以包括美国专利5,130,242和美国专利7,022,512中列出的组分。更优选地，本发明的用于培养裂殖壶菌变异株以生产DHA的培养基包含碳源和有机或无机氮源。在本发明的一个实施方案中，所述培养基包含10g/L至80g/L的碳源，优选50g/L至70g/L的碳源。在本发明的另一个实施方案中，所述培养基包含10g/L至60g/L的氮源，优选15g/L至40g/L的氮源。 
在一实施方案中，所述碳源包括葡萄糖、各种淀粉、糖蜜、粉碎的玉米等。所述培养基中的氮源可以是例如硝酸盐、尿素、铵盐、氨基酸、酵母提取物或浸膏等。所述培养基中还可以包含可同化的磷和/或硫，例如，磷酸和硫酸。 
所述培养基还可以含有其它的辅助发酵的物质，例如螯合剂(例如柠檬酸)，抗发泡剂(例如大豆油)，维生素(例如硫胺和/或核黄素)，以及必要的催化金属(例如碱土金属，例如镁、钙、锌或铁和/或诸如铜或钴的其他金属)。 
用于裂殖壶菌生长的具体的培养基的例子可以参见Jiang and Chen，Process Biochemistry 35(2000)1205-1209；Jiang and Chen，Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，(1999)Vol.23，508-513；Vazhappilly and Chen，Journal of the American Oil Chemists Society，(1998)Vol.75，No.3p 393-397. 
作为一个例子，用于本发明的突变、筛选以及生产DHA方法中的培养基包含：葡萄糖40-60g/L；酵母浸膏10-15g/L；谷氨酸钠4-8g/L；氯化钠2.4-4.0g/L；硫酸镁3.0-6.0g/L；硫酸铵3.0-6.0g/L。优选地，用于本发明所述方法中的培养基的成分由葡萄糖40-60g/L；酵母浸膏10-15g/L；谷氨酸钠4-8g/L；氯化钠2.4-4.0g/L；硫酸镁3.0-6.0g/L；以及硫酸铵3.0-6.0g/L组成。 
可以通过本领域技术人员已知的常规手段来收获生物量，所述手段例如离心、絮凝或过滤，并可立即处理或干燥后用于以后加工。无论那一种方式均可以提取脂质。如本文中使用的，术语“脂质”包括磷脂、 游离脂肪酸、脂肪酸的酯类、三酰甘油、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、溶血磷脂、磷脂、固醇和固醇酯、类胡萝卡素、叶黄素(例如，氧合类胡萝素)、碳氢化合物、以及本领域的普通技术人员已知的其他脂质。如本领域技术人员充分理解的，本发明涉及的DHA可为这些不同脂质的形式，并且不限于游离的脂肪酸。依赖于使用的提取技术，可提取脂质的不同形式或组分。 
可用有效量的溶剂提取脂质。本领域的那些技术人员可确定合适的溶剂。通常用极性溶剂(例如，氯仿/甲醇)提取极性脂质(例如，磷脂)，而且通常用非极性溶剂(例如，己烷)提取中性脂质(例如，三酰甘油)。优选的溶剂是纯己烷。己烷与干生物量的合适的比例为大约4升己烷每千克干生物量。优选将己烷与生物量在搅拌反应容器在大约50℃的温度混合大约2小时。混合后，将生物量过滤并与含油的己烷分离。通过本领域的技术人员已知的蒸馏技术从油中移除己烷。如果具体应用要求或需要，可进行本领域的技术人员已知的附加的加工步骤。在如下的参考文献中描述了脂质回收的可替换的方法，所述参考文献整体并入作为参考：PCT国际申请公开号WO 01/76715；PCT国际申请公开号WO 01/76385；PCT国际申请公开号WO 00/153512。 
本发明虽然以具体的生物体和方法为例子进行了公开，但并不意欲将本发明严格限于所述具体的生物体和方法，本领域技术人员可以根据本发明的教导，对所公开的技术方案进行替换、修改和优化，这是本本领域技术人员根据本发明的精神能够容易做到的。而且，上述技术方案中的所涉及的步骤、条件以及菌种等元件可根据需要，任意组合，从而实现本发明的目的。 
以下实施例仅仅是对本发明实施方案的示例性说明，并不是所要求保护发明的限制。 
实施例
实施例1 紫外线对裂殖壶菌的突变作用 
将裂殖壶菌SR21涂布于培养皿上，置于紫外灯下进行辐照，辐照时间分为0秒(S)(对照组)、30S、40S、50S、60S、70S、80S、90S和 100S(实验组)。辐照后在黑暗中放置24h，待菌落出现时统计数量。对照组的菌落数为100％，计算各实验组的致死率(图1)。从图1可以看出，随着紫外辐照时间的延长，裂殖壶菌的致死率随之增高，显示明显的剂量效应。选用70S-90S辐照时间(裂殖壶菌的致死率为60％-80％)，可对裂殖壶菌实施有效的诱变处理。 
所用培养基为： 
葡萄糖55g/L 
酵母浸膏10g/L 
谷氨酸钠5g/L 
氯化钠2.4g/L 
硫酸镁4g/L 
硫酸铵4gL。 
培养温度：22-27℃。 
初始pH：5.0-7.0。 
实施例2 喹禾灵对裂殖壶菌的筛选 
在裂殖壶菌培养基中加入脂肪合成关键酶(乙酰辅酶A羧化酶)的抑制剂喹禾灵(Quizalofop ethyl){(R)-2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]-丙烯酸酯}，添加浓度分别为0μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L、80μmol/L和90μmol/L。以对照组(0μmol/L)的菌落数为100％，统计各组菌落数，计算致死率(图2)。从图2可以看出，在实验范围内，裂殖壶菌的致死率与喹禾灵的浓度呈正相关关系。选用喹禾灵浓度为50μmol/L到80μmol/L进行抗性菌株筛选。 
为方便操作，在培养基中添加喹禾灵，涂布裂殖壶菌，对紫外线抗性菌株进行进一步的定向筛选。 
所筛选出的菌株可在含有喹禾灵的液体或半固体培养基中进行培养以确认其具有喹禾灵的抗性。 
上述培养条件为 
a.培养基配方为(g/L)： 
葡萄糖60g/L 
酵母浸膏15g/L 
谷氨酸钠4g/L 
氯化钠3g/L 
硫酸镁5g/L 
硫酸铵5g/L。 
b.培养温度：22-27℃。 
c.初始pH：5.0-7.0。 
实施例3 对照菌株及不同的突变菌株的生长率和DHA含量的差异 
经过实施例2的筛选和确认，选出具有喹禾灵抗性的菌株200余株。然后，以菌株的生长速度和DHA含量为指标，进一步对所挑选的喹禾灵抗性的菌株进行筛选。第一次复筛选出20-50株，第二次复筛从中选出3株，筛选出的三株菌株其生长速率和DHA含量都高出对照10％以上。 
其培养的条件为 
a.培养基配方为(g/L)： 
葡萄糖60g/L 
酵母浸膏15g/L 
谷氨酸钠4g/L 
氯化钠3g/L 
硫酸镁5g/L 
硫酸铵5g/L。 
b.培养温度：22-27℃。 
c.初始pH：5.0-7.0。 
图3表示经过紫外辐照诱变后在喹禾灵筛选压力下选的部分突变菌株的生物量和DHA含量。图中最左边是对照菌株。从图中看出，有的突变菌株在生长速度和DHA含量两个性状都低于对照菌株，如321-6、321-7和321-8；有的这两个性状变化不明显，如321-4、321-5、321-19。在突变体中DHA含量提高的较多，如321-1、321-3、321-12、321-13、321-14、 321-15、321-16、321-17和321-18。在突变菌株中，321-1和321-3表现最最突出，比对照菌株的生长速度分别提高了10.5％和31.5％，DHA含量分别提高了64.5％和66.4％。 
除这两个突变菌株之外，还有一个突变菌株303-11，在生物量和DHA含量上也具有良好的表现。 
挑选321-1、321-3、和303-11这3个突变菌株作为例子，经过以下实施例5、实施例6和实施例7的一系列的测试、比较和鉴定来验证本发明突变方法所筛选的菌株DHA含量高、生长速度快的特性，并能够在不同的培养条件下保持稳定。 
以下实施例4-7是对所筛选的菌株进行系统的分析和鉴定，包括在不同葡萄糖浓度下、不同氮源条件下、不同pH条件下进行培养，多层次多角度比较对照菌株与突变菌株在生长速度和DHA积累能力，并且在50升发酵罐发酵培养，在突变菌株中确定选育菌株，以确认通过本发明的方法所筛选的裂殖壶菌变异株在不同的生长条件下，表现出稳定的生长速度快、DHA含量高的特性。 
通用的培养条件为： 
培养温度22-27℃，初始pH 5.0-7.0，1VVM通气比率，转速为70～100RPM，培养周期4-7天。 
通用培养基含有(g/L)： 
葡萄糖60g/L 
酵母浸膏15g/L 
谷氨酸钠4g/L 
氯化钠3g/L 
硫酸镁5g/L 
硫酸铵5g/L，加水至1L。 
实施例4 对照菌株与321-1、321-3及303-11在不同葡萄糖浓度条件下的生长率和DHA含量 
为了比较对照菌株和突变菌株321-1、321-3和303-11在不同培养条 件下的反应特性，并进一步确认筛选出的菌株比对对照菌株的优越性，进行了一系列测试和比较。本实施例就是比对在不同碳源浓度的条件下对照菌株和突变菌株的生长率和DHA含量，即利用不同浓度的碳源替换通用培养基中的碳源来观察所述菌株的特性。从表1可以看出，在不同的葡萄糖浓度(50g/l、60g/l和70g/l)条件下，3个突变菌株表型优于对照菌株，在3个突变菌株中最好的是321-3，其次是321-1，303-11。 
表1 对照菌株和3个突变菌株在不同葡萄糖浓度(g/l培养基)条件下的生长率(生物量的每天每升培养基克重量，g/l.d)和DHA占干细胞的含量w/w，％) 
实施例5 对照菌株与321-1、321-3及303-11在不同氮源条件下生长率和DHA含量 
本实施例是比对在不同氮源条件下对照菌株和突变菌株321-1、321-3和303-11的生长率和DHA含量，即利用不同的氮源替换通用培养基中的氮源来观察其特性。具体而言，分别用以下四种氮源(g/l培养基)：(a)酵母浸膏(20g/l)、(b)酵母浸膏(20g/l)+谷氨酸钠(10g/l)、(c)酵母浸膏(40g/l)+谷氨酸钠(10g/l)、以及(d)玉米浆(40g/l)+谷氨酸钠(10g/l)，检测这3个菌株生物量增长和DHA积累的情况。可以看出，通过不同氮源培养实验，突变菌株321-1和321-3在生长速度和DHA积累都优于对照菌株，在DHA含量方面321-3优于321-1，而303-11只在DHA含量上比对照菌株有优势(表2)。 
表2 对照菌株和3个突变菌株在不同氮源(10g/l)条件下的生长率(生物量的每天每升培养基克重量，g/l.d)和DHA占干细胞的含量w/w，％) 
实施例6 对照菌株与321-1、321-3及303-11在不同pH条件下生长率与DHA含量 
本实施例是对照菌株与3株突变菌株在不同pH值条件下生长率和DHA含量。在初始pH为5.0-7.0的范围内，这些菌株在不同pH条件下利用通用培养基进行摇瓶实验，检测生物量增长和DHA积累情况。表3的数据显示，321-1和321-3两个突变菌株的生长速度和DHA积累高于对照菌株；而突变菌株303-11在本组实验中的生长速度上没有优势，在DHA积累上呈现微弱优势。 
表3 对照菌株和3个突变菌株在不同pH条件下的生长率(生物量的每天每升培养基克重量，g/l.d)和DHA占干细胞的含量w/w，％) 
实施例7 对照菌株与321-1、321-3及303-11在50升发酵罐中生长率与DHA含量 
本实施例是对照菌株和3个突变菌株在50L发酵罐条件下的生长和DHA积累特性。结果表明(图4)，与对照菌株相比，321-1生物量提高了9.5％，DHA含量提高了16.7％；321-3生物量提高了6.7％，DHA含量提高了48.1％；而303-11的生物量与对照菌株基本相同，DHA含量仅提高了7.9％。综合比较，在3个突变菌株中表现最突出的是321-3，尤其是 在DHA含量这个性状上，321-3比对照菌株有非常显著地提高，是本专利筛选出的裂殖壶菌优良品种。 
实施例8 对照菌株与321-3生化组成的差异 
表4和表5表示对照菌株与321-3生化组成的差异，包括蛋白质、氨基酸和脂肪酸组成的差异。蛋白质测定用凯氏定氮法，用氨基酸分析仪分析氨基酸含量，脂肪含量测定仪测定脂肪含量。 
从表4看出，321-3菌株的蛋白含量(23.8％)高于对照菌株(22.3％)，与此相符的是，321-3的大多数氨基酸的含量也高于对照菌株。 
从表5看出，突变菌株321-3与对照菌株在脂肪酸组成上的变异是很明显的：首先是321-3的C16:0含量(8.2％)高于对照菌株(7.7％)；其次，321-3的C16:1缺失，而对照菌株C16:1的含量为1.0％；第三，321-3的DHA(C22:6)含量显著高于对照菌株。 
表4 对照菌株和321-3品系蛋白质含量及氨基酸组成的差异 
Figure BSA00000526694100141
Figure BSA00000526694100151
表5 对照菌株和321-3品系脂肪酸组成的差异(％) 
Figure BSA00000526694100152
实施例9 对照菌株与321-318S rRNA基因序列比对 
裂解法提取裂殖壶菌的总RNA，扩增引物为18S正向引物F：5’-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’和18S反向引物：5’-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3’，PCR扩增产物回收后，转化E.coli DH 5α感受态细胞，阳性克隆测序，用Blast软件进行序列比对。 
图5为对照菌株与突变菌株321-3的18S rRNA基因同源性比对。对照菌株的18S rRNA基因全长1757bp，而321-3菌株的18S rRNA基因有6个碱基对缺失，全长1751bp，还有9个碱基对发生了变异，同源性为99％。 

Claims (10)

1.裂殖壶菌变异株321-3，其于2011年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号：CCTCC M 2011024，优选地，上述裂殖壶菌变异株具有DHA含量提高和/或生长速度快的特性，更优选地，所述变异株在蛋白质含量、蛋白质的氨基酸组成和/或脂肪酸组成有差异。
2.产生裂殖壶菌变异株的方法，所述裂殖壶菌变异株具有DHA含量提高和/或生长速度快的特性，所述方法包括将起始裂殖壶菌暴露于紫外线以进行诱变，以及将所述经紫外线诱变的菌株与脂肪合成关键酶(乙酰辅酶A羧化酶)抑制剂(例如喹禾灵)接触，从中筛选出DHA含量提高和/或生长速度快的变异株，更优选地，所述变异株在蛋白质含量、蛋白质的氨基酸组成和/或脂肪酸组成有差异。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述紫外线的辐照时间为30秒-100秒，优选为70秒-90秒。
4.如权利要求2或3所述的方法，所述喹禾灵为{(R)-2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]-丙烯酸酯}，其浓度为10μmol/L-90μmol/L，优选为50μmol/L-80μmol/L。
5.培养裂殖壶菌变异株以生产DHA的方法，包括
将权利要求1所述的裂殖壶菌变异株，优选为裂殖壶菌变异株321-3，在适合培养裂殖壶菌以产生DHA的培养条件进行培养，优选地，所述培养条件包括：(a).含有50-70g/L的碳源和10-20g/L氮源的培养基；(b).培养温度：22-27℃；(c).初始pH：5.0-7.0。
6.权利要求5所述的方法其中所述的培养基包含(g/L)：
葡萄糖      50-70，
酵母浸膏    20-30，
谷氨酸钠    10-20；优选地还包含：
氯化钠      2.4-4.0，
硫酸镁      3.0-6.0，
硫酸铵      3.0-6.0。
7.由权利要求5或6所述方法产生的生物量。
8.包含权利要求7所述生物量或其中提取的DHA的食品，优选地，食品包括用于给食婴儿、儿童、青少年和成人的产品，更优选地所述食品是乳制品。
9.如权利要求1所述的裂殖壶菌变异株或权利要求2-4任一项所述的方法，其中所述裂殖壶菌变异株与常规的或起始的裂殖壶菌比较，所述裂殖壶菌变异株产生DHA的量，至少高于常规菌株或起始菌株约10，20，25，30，35，40％，优选至少高于常规菌株或起始菌株约41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70％，优选在7天的培养期内。
10.如权利要求1或9所述的裂殖壶菌变异株或权利要求2-4和9任一项所述的方法，所筛选的裂殖壶菌变异株具有高于常规或起始菌种至少约3，4，5，6，7，8，9，10％的生长速度，优选在7天的培养期内。
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