CN104995291B - 生产二十二碳六烯酸的微生物及其利用 - Google Patents
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Abstract
根据本发明，能够提供具有由序列号1～5中的任意一个所示的碱基序列构成的18S rRNA基因的属于裂殖壶菌属的微生物、裂殖壶菌OH4株、作为以这些微生物作为亲本株得到的突变株且DHA的生产能力比该亲本株高的微生物或者裂殖壶菌LTR23株。另外，能够提供通过使用这些微生物的发酵法来制造含DHA的组合物、DHA和DHA烷基酯的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生产二十二碳六烯酸(以下称为DHA)的新的微生物、使用该微生物的含DHA的组合物、DHA和DHA烷基酯的制造方法。
背景技术
已知DHA是包括人在内的哺乳类的大脑等的磷脂中富含的多元不饱和脂肪酸，对脑功能的维持、发展发挥着重要作用。已知人具有由亚麻酸合成DHA的能力，但其量与所需量相比绝对性地少，需要从外部摄取DHA。因此，含有DHA的食品、营养补充剂、婴儿配方奶在大量销售。
这些制品中含有的DHA可以列举从鱼油中提取得到的DHA。鱼油价格低廉且富含DHA，因此是优良的DHA的供给源，但考虑到近来DHA的需求增高，以及伴随海洋污染产生的PCB、重金属在鱼中的蓄积等，要求更安全且稳定供给的DHA。
除了从鱼油提取得到的DHA以外，还可以列举通过使用微生物的发酵法制造的DHA。早就已知海洋性的微藻类生产含有DHA的脂质(非专利文献1)。但是，微藻类中含有的DHA量为微量、难以进行高密度培养等成为问题，未能进行商业水平的生产。
作为商业水平的DHA的利用发酵的制造方法，使用涡鞭藻类寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)的例子成为首例(专利文献1以及非专利文献2和3)。之后，还发现了具有DHA的生产能力的多种微生物，但显示出最高的DHA的生产能力的微生物为网粘菌类微生物，作为这样的微生物，可以列举裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)ATCC20888株及其衍生株(专利文献2和3)、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum，原来分类为Schizochytrium limacinum)SR21株(专利文献4～6和非专利文献4)、网粘菌类微生物12B株(专利文献7)、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)LEF株(专利文献8)等。
这些网粘菌类微生物中，显示出最高的DHA的生产能力的微生物是微藻裂殖壶菌S31株(ATCC20888株)(专利文献9)。该微生物的DHA的生产能力与其他报道相比绝对性的高，使用该微生物的DHA的发酵法可以说是成本最低的发酵生产的工艺。
但是，即使以该发酵生产的工艺进行生产，与从鱼油提取的方法相比，成本也高，要求进一步提高生产率。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平5-503425号
专利文献2：日本特表平8-502405号
专利文献3：日本特表平8-509355号
专利文献4：日本特开平9-000284号
专利文献5：日本特开平10-072590号
专利文献6：日本特开平10-310556号
专利文献7：日本特开2006-230403号
专利文献8：日本特开2005-102680号
专利文献9：日本特表2004-501603号
非专利文献
非专利文献1：J.Protozoal(1970),Vol.17,p213-219
非专利文献2：Single Cell Oils AOCS Press(2005),Vol.6,p.86-98
非专利文献3：Single Cell Oils AOCS Press(2005),Vol.8,p.107-123
非专利文献4：Appl.Microbiol.Biotechnol.(1998),Vol.49,p.72-76
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供DHA的生产能力比以往高的微生物，并且提供使用该微生物的有效的含DHA的组合物、DHA和DHA烷基酯的制造方法。
用于解决问题的方法
本发明涉及以下的[1]～[7]。
[1]一种属于裂殖壶菌(Aurantiochytrium)属的微生物，具有由序列号1～5中的任意一个所示的碱基序列构成的18S rRNA基因。
[2]裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)OH4株(保藏编号FERM BP-11524)。
[3]一种微生物，其为以上述[1]或[2]的微生物作为亲本株得到的突变株，DHA的生产能力比该亲本株高。
[4]裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)LTR23株。
[5]一种含DHA的组合物的制造方法，其特征在于，将上述[1]～[4]中任一项所述的微生物在培养基中培养，在培养物中生成、蓄积含DHA的组合物，并从该培养物中收集含DHA的组合物。
[6]一种DHA的制造方法，其特征在于，从上述[5]中收集的含DHA的组合物中分离并收集DHA。
[7]一种DHA烷基酯的制造方法，其特征在于，从上述[5]中收集的含DHA的组合物中分离并收集DHA烷基酯。
发明效果
根据本发明，能够提供具有由序列号1～5中的任意一个所示的碱基序列构成的18S rRNA基因的属于裂殖壶菌属的微生物，并且能够提供通过使用该微生物的发酵法来制造含DHA的组合物、DHA和DHA烷基酯的方法。
附图说明
图1是表示从冲绳沿海区收集的生产DHA的微生物的DHA生产量和DHA相对于总脂肪酸的比率的图。
图2是裂殖壶菌OH4株的显微镜照片。
图3是在图1中增加了裂殖壶菌LTR23株的DHA生产量和DHA相对于总脂肪酸的比率的图。
具体实施方式
1.本发明的微生物
本发明的微生物是属于裂殖壶菌属的微生物，其具有1个以上、优选2个以上、更优选3个以上、进一步优选4个以上的由序列号1～5中的任意一个所示的碱基序列构成的18SrRNA基因，最优选为属于具有所有由序列号1～5所示的碱基序列构成的18S rRNA基因的裂殖壶菌属的微生物。根据后述的形态学性质和分子生物学性质，认为本发明的微生物属于假菌界(Kingdom Chromista)、不等鞭毛门(Phyrum Heterokonta)，并属于网粘菌纲(ClassLabyrinthulea)、网粘菌目(Order Labyrinthulida)。关于科(Family)以下的分类群，考虑到其生理形态的性质和18S rRNA基因的碱基序列，认为属于破囊壶菌科(FamilyThraustochytriaceae)、裂殖壶菌属(Genus Aurantiochytrium)。
作为本发明的微生物的例子，可以列举裂殖壶菌OH4株(保藏编号FERM BP-11524)等。另外，作为以本发明的微生物作为亲本株得到的突变株且DHA的生产能力比该亲本株高的微生物也包含在本发明的微生物中。作为这样的微生物的例子，可以列举裂殖壶菌LTR23株等。
上述的裂殖壶菌OH4株保藏于位于日本茨城县筑波市东1丁目1番地中央第六(邮编305-8566)的独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)的专利微生物保藏中心。接受日(保藏日)为平成25年(西历2013年)1月11日，保藏编号为FERM BP-11524。
本说明书中，亲本株是指作为突变导入或利用重组DNA技术的基因置换等的对象的原株。作为利用重组DNA技术的基因置换等的对象的原株也称为宿主株。
本说明书中，突变株是指能够以本发明的微生物作为亲本株并使用通常的突变导入法、利用重组DNA技术的基因置换法等来获取的微生物。
本说明书中，DHA的生产能力比亲本株高的微生物是指，在将亲本株和突变株在相同的培养条件下进行培养时从全部培养物中能够获取的含DHA的组合物或DHA的量多的微生物。
作为含DHA的组合物的例子，可以列举含DHA的油脂或含DHA的磷脂，优选含DHA的油脂。
关于属于裂殖壶菌属的微生物，到目前为止已发现了数量众多的种，但本发明的微生物与这些微生物在18S rRNA基因的碱基序列有所不同，并且如后述的实施例所示，培养该微生物后的干燥微生物重量和DHA含量比作为DHA高生产微生物报道的已知的微生物显著的高，因此，可以与已知的属于裂殖壶菌属的微生物明确区分开。
2.本发明的微生物的获取方法
本发明的微生物可以通过以下的方法来获取。
从海洋中、优选从半咸水区域、最优选从取自红树林枯枝落叶层的落叶中采集样品。
将该样品浸渍到含有抗生素、优选含有青霉素G和链霉素的人工海水中，然后，将人工海水的上清置于含有该抗生素的琼脂培养基上，在20～40℃下、优选25℃下培养数天。由此，在环境中大量存在的原核生物无法增殖，因此，能够对作为真核生物的本发明的微生物进行浓缩。
分离出菌落，通过常规方法从在液体培养基中培养后的培养物中提取基因组DNA。以该基因组DNA作为模板，使用能够对18S rRNA基因进行扩增的具有序列号6和7所示的碱基序列的寡聚DNA作为引物对，进行PCR反应。
在此，对于上述引物对中的一个，根据“高速シーケンス解析受託アプリケーションNo.0116SrRNAPCRサンプルの解析(高速测序分析委托应用No.0116S rRNA PCR样品的分析)”(宝生物公司的小册子)，附加用于同时分析多个分析物的由3～6个碱基、优选4～5个碱基、最优选4个碱基构成的标签。另外，在每个引物上均附加用于利用GS FLX测序仪(罗氏诊断公司)进行分析所需的寡核苷酸。
使用上述的PCR反应产物，利用GS FLX测序仪进行序列确定，由此，在例如将上述标签设定为4个碱基而使用最多256种标签序列的情况下，能够通过一次测序对256种18SrRNA基因进行序列确定而不需要进行克隆操作。具体而言，将256种PCR产物混合，利用GSFLX测序仪确定碱基序列，以标签序列作为指标，将确定后的碱基序列分类为256种。
用作PCR反应的模板的基因组DNA可以是从单一菌株中提取出的基因组DNA，也可以将从多种菌株中提取出的基因组DNA混合，但将从多种菌株中提取出的基因组DNA混合的方法通过组合后述的方法，能够简便地筛选多种菌株。
例如，将从100种菌株中提取出的基因组DNA混合，将其作为PCR反应的模板使用，使用上述的引物对对18S rRNA基因的区域进行扩增。
对于该PCR产物，利用GS FLX测序仪确定碱基序列，在存在由序列号1～5中的任意一个所示的碱基序列构成的18S rRNA基因的情况下，可知在该100种菌株中存在至少1株本发明的微生物。另一方面，在不存在该18SrRNA基因的情况下，可知在该100种菌株中不存在本发明的微生物。
在该100种菌株中存在本发明的微生物的情况下，对该微生物进行特定时，可以通过上述的使用GS FLX测序仪的方法利用一次测序进行特定。
即，如果使用上述方法，则在将标签序列设定为4个碱基的情况下，通过第一次测序能够进行最多256种混合基因组DNA的分析，通过第二次测序能够从最多256种微生物中特定本发明的微生物，因此，对于最多65536种微生物，仅通过两次测序就能够判定是否是本发明的微生物，而并不需要进行克隆操作。
需要说明的是，在将标签序列设定为5个碱基的情况下，通过第一次测序能够进行最多1024种混合基因组DNA的分析，通过第二次测序能够从最多1024种微生物中特定本发明的微生物，因此，对于最多1048576种微生物，仅通过两次测序就能够判定是否是本发明的微生物，而并不需要进行克隆操作。
可以预先对供于上述的测序分析的微生物进行生产DHA的确认。由此，在分析对象株少的情况下，通过以往的利用桑格法的测序也能够判定是否是本发明的微生物。
关于本发明的突变株，以本发明的微生物作为亲本株，使用通常的突变处理法，例如通过N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理、紫外线照射处理进行突变处理以使微生物的死亡率为98％、优选99％、最优选99.9％，分离残存下来的菌落，考察DHA的生产率，由此，能够获取DHA生产能力比亲本株高的突变株。
DHA生产率可以通过如下方法考察：使用Bligh&Dyer法(Bligh EG and Dyer WJ,Can.J.Biochem.Physiol.37911(1959))从培养液中提取出脂质，在减压下干燥后，使用脂肪酸甲基化试剂盒(ナカライテスク公司)对干燥后的脂质进行脂肪酸的甲基化，利用正己烷提取所得到的脂肪酸甲酯，使用气相色谱进行分析。
3.本发明的含DHA的组合物的制造方法
将本发明的微生物在培养基中培养，在培养物中生成、蓄积含DHA的组合物，从该培养物中收集含DHA的组合物，由此，能够制造含DHA的组合物。
本发明的微生物的培养物可以通过将该微生物接种到适当的培养基中并根据常规方法进行培养来得到。
作为培养基，可以使用含有碳源、氮源和无机盐等的公知的培养基中的任意一种。例如，作为碳源，可以例示葡萄糖、果糖、半乳糖等碳水化合物，以及油酸、大豆油等油脂类，甘油，乙酸钠等。这些碳源例如可以以每1升培养基中为20～300g的浓度使用。根据特别优选的方式，在初始的碳源消耗完之后再供给碳源，由此能够进行持续培养。通过在这样的条件下进行培养，能够增大所消耗的碳源的量，从而能够增大含DHA的组合物的生产量。
另外，作为氮源，可以使用酵母提取物、玉米浆、多价蛋白胨、谷氨酸钠、尿素等有机氮，或者乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、氨等无机氮。
作为无机盐，可以适当组合使用磷酸钾等。
含有上述各成分的培养基优选通过添加适当的酸或碱而将pH调节至4.0～9.5的范围内之后，利用高压釜进行灭菌后使用。
培养温度通常为10～45℃，优选为20～37℃。培养温度优选控制为能够生产含DHA的组合物的培养温度。培养时的pH通常为3.5～9.5，优选为pH4.5～9.5。特别优选的pH根据目的而不同，为了大量生产油脂，为5.0～8.0。
培养时间例如可以设定为2～7天，可以在通气搅拌培养等条件下进行培养。
通过以上述方式对本发明的微生物进行培养，能够得到以每1升培养基中的干燥微生物重量计通常含有50～200g、优选100～200g的培养物。
从培养物中分离培养液与微生物的方法可以通过本领域技术人员公知的常规方法来进行，例如，可以通过离心分离法、过滤等进行。
将从上述的培养物中分离出的微生物利用例如超声波、戴诺砂磨机(DYNO-MILL)等破碎后，利用例如氯仿、己烷、丁醇等进行溶剂提取，由此能够得到含DHA的组合物。
本发明的含DHA的组合物的制造方法中，能够得到每100g干燥微生物重量中的含DHA的组合物为5～100g、优选为10～80g的含DHA的组合物。
通过上述的制造方法制造的含DHA的组合物例如可以通过低温溶剂分离法[高桥是太郎，油化学，40:931-941(1991)]或利用磷脂酶等水解酶游离除去短链的脂肪酸的方法[高桥是太郎，油化学，40:931-941(1991)]等方法对含DHA的组合物进行浓缩，从而得到DHA含量高的含DHA的组合物。
4.本发明的DHA的制造方法
本发明的DHA的制造方法的特征在于，从通过上述3的制造方法得到的含DHA的组合物中分离并收集DHA。
从含DHA的组合物中分离并收集DHA可以通过如下方法进行：通过例如水解法由含DHA的组合物制备含有DHA的混合脂肪酸后，通过例如尿素附加法、冷却分离法、高效液相色谱法或超临界色谱法等分离并收集DHA。
5.本发明的DHA烷基酯的制造方法
本发明的DHA烷基酯的制造方法的特征在于，从通过上述3的制造方法得到的含DHA的组合物中分离并收集DHA烷基酯。
DHA烷基酯只要是DHA烷基酯则没有特别限定，可以优选列举DHA甲酯或DHA乙酯，更优选列举DHA乙酯。
从含DHA的组合物中分离并收集DHA烷基酯可以通过如下方法进行：通过例如醇解法由含DHA的组合物制备含有DHA烷基酯的混合脂肪酸烷基酯后，通过例如尿素附加法、冷却分离法、高效液相色谱法或超临界色谱法等分离并收集DHA烷基酯。
以下示出本申请发明的实施例，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本发明的微生物的获取(1)
1.本发明的微生物的分离
作为分离出本发明的微生物的试样，使用从冲绳县沿海区附近的红树林枯枝落叶层(半咸水区域)采集的落叶。将落叶浸渍到含有300mg/L的青霉素G和链霉素的人工海水中，然后，将人工海水的上清置于含有青霉素G和链霉素(各300mg/L)的分离用琼脂培养基上，在25℃下培养数天。
分离用琼脂培养基使用以0.2％葡萄糖、0.02％酵母提取物、50％人工海水、0.05％谷氨酸钠、1.5％琼脂糖作为组成的琼脂培养基。
在琼脂板上确认到出现多个菌落后，分离菌落，在评价用液体培养基中在30℃下培养48小时。
评价用液体培养基使用以9％葡萄糖、1％酵母提取物、1％蛋白胨、50％人工海水作为组成的液体培养基。
使用Bligh&Dyer法(Bligh EG and Dyer WJ,Can.J.Biochem.Physiol.37911(1959))从培养液中提取出脂质，在减压下干燥。使用ナカライテスク公司的脂肪酸甲基化试剂盒进行干燥后的脂质的脂肪酸的甲基化，利用正己烷提取通过该处理得到的脂肪酸甲酯。通过气相色谱对脂肪酸甲酯进行分析，考察培养液中的脂肪酸量和组成。
气相色谱的条件如下设定。
·柱：HR-SS-10(信和化工)0.25mm×25m
·载气：He 30ml/分钟
·柱温：190℃
·检测器：FID
通过上述操作，能够从5000株以上的红树来源的生物中得到1239株DHA生产微生物。
将此时得到的DHA生产微生物的培养物中的DHA含量和DHA相对于总脂肪酸的比率示于图1。由图1确认到，一般而言，DHA比率提高时，生长恶化，总脂质量降低，DHA含量有降低的倾向，并确认到，如到目前为止所已知的那样，脂质生产量多的菌株的DHA比率集中于30％至40％前后。其中，挑选出生长良好且DHA生产率高的菌株，将其命名为OH4株。
2.OH4株的形态学性质
OH4株为单细胞性，在青霉素G和链霉素存在下能够生长，因此，得出OH4株为单细胞性真核生物的结论。进而，从来源于红树林的枯枝落叶层的试样中分离出，并且DHA含量非常高，因此预测为属于不等鞭毛类(Heteroconta)的破囊壶菌类(thraustochytrid)。
OH4株在上述的分离用琼脂培养基中，能够观察到从直径10～20μm的球状细胞伸出的外质网，确认属于假菌界(Kingdom Chromista)网粘菌纲(Class Labyrinthulea)破囊壶菌科(Family Thraustochytriaceae)。另外，确认到营养细胞为球形，通过微生物的二分裂进行增殖。这样的生活史是裂殖壶菌属(Genera Aurantiochytrium)特征性的(YokoyamaR et.al.Mycoscience 48:329-341；本多大辅，网粘菌类的系统与分类。海洋与生物23：7-18，2001)。将OH4株的显微镜照片示于图2。
3.OH4株的分子生物学性质
将使用上述的评价用液体培养基培养后的OH4株在对数增殖期进行回收，使用玻璃珠和苯酚-氯仿，通过常规方法提取出总基因组DNA。以所得到的基因组DNA作为模板，使用由序列号6和7所示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物对，进行PCR反应，对18S rRNA基因进行扩增。通过桑格法对所得到的PCR产物确定碱基序列。
在此，在确定OH4株的18S rRNA基因的碱基序列的过程中发现，该分子具有多态性。网粘菌类微生物的18S rRNA基因的序列具有多态性是已知的现象(专利文献7)。将OH4株的18S rRNA基因的碱基序列分别示于序列号1～5。
另外，在表1中示出各多态序列的差异。碱基的编号以作为最长序列的序列号4作为标准。
[表1]
表1.0H4株的18S rRNA基因序列的比较
| 碱基的编号 | 250 | 251 | 252 | 253 | 254 | 255 | 256 | 257 | 258 | 259 |
| 序列号1 | C | T | A | T | T | T | T | G | ||
| 序列号2 | C | T | T | T | T | T | T | G | ||
| 序列号3 | C | - | T | A | T | T | T | T | T | G |
| 序列号4 | C | A | T | T | T | T | T | I | A | G |
| 序列号5 | C | - | T | T | T | T | T | A | A | G |
通过Karlinand Altschul的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)]对序列号1～5所示的碱基序列进行检索。结果，与裂殖壶菌属KRS101株和裂殖壶菌属BL11株的18S rRNA基因的碱基序列分别显示出99％的同一性(identity)。
另一方面，NCBI的数据库中未发现与序列号1～5所示的任一碱基序列完全一致的序列。
基于以上的形态学性质和分子生物学性质，得出OH4株为属于裂殖壶菌属的新微生物的结论，将其命名为裂殖壶菌OH4株，在2013年1月11日以FERM BP-11524保藏编号保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)的专利微生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第六)。
需要说明的是，关于分类，今后也可能会随着研究的发展而改变，但本发明的微生物为新的微生物是不变的。
实施例2
本发明的微生物的获取(2)
1.以裂殖壶菌OH4株作为亲本株的突变株的获取
将裂殖壶菌OH4株利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)进行突变处理以使死亡率达到99.9％，分离残存的菌落，在评价用液体培养基中在30℃下培养48小时。结果，能够获取DHA比率提高至约1.6倍、随之DHA含量提高至约3倍的菌株。将该菌株命名为裂殖壶菌LTR23株。
图3是在图1中增加了裂殖壶菌LTR23株的培养物中的DHA含量和DHA相对于总脂肪酸的比率的图。由图3可以确认，裂殖壶菌LTR23株即使在与自然分离株比较的情况下，DHA比率也高，并且DHA含量也高。
实施例3
本发明的含DHA的组合物的工业制造
1.裂殖壶菌OH4株和LTR23株的培养
将裂殖壶菌OH4株和LTR23株在发酵罐中进行培养。另外，为了进行比较，将作为DHA高生产微生物被报道的裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21株(专利文献4-6和非专利文献4)、和微藻裂殖壶菌S31株(专利文献9)在相同条件下进行培养。
裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21株(ATCC MYA-1381)和微藻裂殖壶菌S31株(ATCC 20888)从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
将冷冻保存的上述的微生物株接种到实施例1中使用的分离用琼脂培养基上，确认到充分生长后，刮取微生物，接种到实施例1中使用的评价用液体培养基中，进行种子培养。在种子培养中确认到充分生长后，接种到3L发酵罐中。3L发酵罐的培养基组成依照专利文献9。
即，制作由硫酸钠12g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、Hodag K-60消泡剂0.35g/L、K2SO4 0.65g/L、KH2PO4 1g/L、(NH4)2SO4 1g/L、CaCl2·2H2O 0.17g/L、MnCl2·4H2O3mg/L、ZnSO4·7H2O 3mg/L、CoCl2·6H2O 0.04mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.04mg/L、CuSO4·5H2O2mg/L、NiSO4·6H2O 2mg/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、硫胺素9.5mg/L、维生素B120.15mg/L和泛酸钙3.2mg/L构成的培养基。
作为改变点，由于裂殖壶菌OH4株和LTR23株的糖消耗旺盛，因此，将葡萄糖的浓度设定为120g/L，并且使用28％NH4OH溶液作为氮源。在培养基中的120g/L的葡萄糖消耗完全的阶段，追加供给65％浓度的葡萄糖溶液，连续培养至85小时。
与实施例1同样地通过Bligh-Dyer法从所得到的培养物提取出脂质，进行甲基化，通过气相色谱进行脂质的分析。
将所得到的微生物在-80℃下冷冻来进行冷冻干燥，由此得到干燥微生物。测定该干燥微生物的重量，并换算为原来的培养液量，由此，计算出培养物中的干燥微生物重量(Dry Cell Weight，DCW)。
将培养的结果示于以下的表2。
[表2]
表2.发酵罐培养的结果
| 单位 | OH4 | LTR23 | SR21 | S31 | |
| 干燥微生物重量 | g/L | 145.3 | 133.8 | 118.3 | 90 |
| DHA含量 | g/L | 26 | 44 | 18 | 8.7 |
| DHA/总脂肪酸 | ％ | 27 | 52 | 26 | 44 |
| DHA生产率 | g/L/小时 | 0.294 | 0.505 | 0.211 | 0.402 |
培养的结果为，裂殖壶菌OH4株是干燥微生物重量为145.3g/升培养物，是DHA含量为26g/升培养物，结果显著高于作为DHA高生产微生物被报道的微生物。由于DHA在微生物的细胞中蓄积，干燥微生物重量高具有能够最终收集的DHA量增多这样的优点。
此外，裂殖壶菌LTR23株的DHA含量为44g/升培养物，总脂肪酸中的DHA组成为52％，DHA的生产率为0.505g/升/小时，表明超过裂殖壶菌OH4株和作为DHA高生产微生物被报道的微生物。
2.裂殖壶菌OH4株和LTR23株的脂肪酸组成
将用发酵罐培养后的裂殖壶菌OH4株和LTR23株的脂肪酸组成示于以下的表3。微藻裂殖壶菌S31株的值从非专利文献2转载过来。
[表3]
表3.脂肪酸组成
| OH4 | LTR23 | S31(文献值) | |
| 12：0 | 1.9 | 1.8 | 0-0.5 |
| 14：0 | 5.1 | 1.4 | 9-15 |
| 16：0 | 59.8 | 26.3 | 24-28 |
| 16：1 | 0.3 | 0.3 | 0.2-0.5 |
| 18：0 | 1.7 | 1.1 | 0.5-0.7 |
| 20：3(n-6) | 0.0 | 0.3 | 0-0.5 |
| 20：4(n-3) | 0.9 | 0.3 | 0.5-1 |
| 20：5(n-3) | 0.3 | 0.3 | - |
| 22：5(n-6) | 4.4 | 16.0 | 11-14 |
| 22：6(DHA) | 25.6 | 52.1 | 35-40 |
由以上的结果表明，裂殖壶菌LTR23株的脂肪酸组成中，棕榈酸、短链的饱和脂肪酸减少，DHA、22：5(n-6)等多元不饱和脂肪酸增加。已知饱和脂肪酸使LDL胆固醇和总胆固醇/HDL胆固醇比升高，并被指出使糖尿病的风险升高的可能性，因此，从营养学观点考虑，也显示出裂殖壶菌LTR23株的显著性。
3.裂殖壶菌LTR23株的稳定性
裂殖壶菌LTR23株通过突变的导入来获取，因此担心其转化不稳定。因此，反复进行多次传代，使用传代后的菌株，通过与上述1同样的方法进行培养，由此考察转化的稳定性。将结果示于以下的表4。
[表4]
表4.裂殖壶菌LTR23株的稳定性
| DHA含量 | DHA/总脂肪酸 | |
| 单位 | (g/L) | (％) |
| 第一次传代 | 47 | 52 |
| 第二次传代 | 37 | 51 |
| 第三次传代 | 41 | 53 |
| 第四次传代 | 44 | 51 |
| 第五次传代 | 44 | 52 |
| 平均 | 42.6 | 51.8 |
| 标准偏差 | 3.8 | 0.8 |
| 变异系数(％) | 8.9 | 1.6 |
DHA的生产量、DHA比率的变异系数均为10％以下，表明裂殖壶菌LTR23株的稳定性没有问题。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供DHA的生产能力比以往高的微生物。另外，能够提供使用该微生物的有效的含DHA的组合物、DHA和DHA烷基酯的制造方法。
标号说明
图1和3中，○表示从冲绳县沿海区附近的红树林枯枝落叶层(半咸水区域)采集的生产DHA的微生物。
图3中，■表示裂殖壶菌LTR23株。
序列表自由文本
序列号6-人工序列的说明：合成DNA
序列号7-人工序列的说明：合成DNA
Claims (4)
1.裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)OH4株，其保藏编号为FERM BP-11524。
2.一种含DHA的组合物的制造方法，其特征在于，将权利要求1所述的微生物在培养基中培养，在培养物中生成、蓄积含DHA的组合物，并从该培养物中收集含DHA的组合物。
3.一种DHA的制造方法，其特征在于，从权利要求2中收集的含DHA的组合物中分离并收集DHA。
4.一种DHA烷基酯的制造方法，其特征在于，从权利要求2中收集的含DHA的组合物中分离并收集DHA烷基酯。
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