KR101187813B1

KR101187813B1 - 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101187813B1
Application number: KR1020100094965A
Authority: KR
Inventors: 조영일; 설혜영; 최인석; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2012-10-05
Also published as: KR20120033452A

Abstract

본 발명은 미세조류로부터 고도불포화지방산를 생산하는 방법 및 고도불포화지방산 생산능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 미세조류 배지에 전단응력 보호제를 첨가함으로써 미세조류의 생육속도 또는 당소모속도가 증가하여 발효시간이 단축됨에 따라 미세조류로부터 고도불포화지방산를 생산하는데 소요되는 원가를 효과적으로 절감시킬 수 있다. 본 발명은 미세조류의 배지의 스케일업(scale-up)으로 인하여 발생하는 전단응력의 증가를 매우 효과적으로 억제시킴으로써 전단응력에 민감한 고도불포화지방산 생산능을 가지는 미세조류로부터 대량으로 고도불포화지방산(특히, DHA)을 수득할 수 있는 장점을 가진다. 또한, 본 발명은 고도불포화지방산을 생산하는 미세조류를 배양하는 경우, 고비용의 추가적인 배양 설비 및 공정 단계(예컨대, 미세조류를 형질 전환시키는 공정) 개선 없이도 배지 성분의 첨가만으로도 고효율의 고도불포화지방산(특히, DHA)을 생산할 수 있는 장점을 가진다.

Description

미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법{Methods for Producting Highly Unsaturated Fatty Acids from Microalgae}

본 발명은 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

동물, 식물 및 미세조류와 같이 크기가 큰 세포들은 교반 또는 통기에 의해 발생되는 전단응력(Shear stress)에 생육 저해를 받으며, 세포의 크기가 작은 박테리아 또는 효모보다 더 적은 전단응력에도 더 많은 생육 저해를 받는다.

이러한 전단응력으로부터 세포의 생존력을 증가시키기 위해 배양 배지에 전단응력으로부터 세포를 보호할 수 있는 물질을 첨가하여 배양한 바가 있다.

그 예를 살펴보면, Michaels JD 등(Michaels JD et al., Jounal of Biotechnology, 19, 241-257(1991))은 동물세포의 전단응력에 대한 보호제로서 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)과 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이 효과 있음을 보고한 바 있으며, Lee 등(Sang-Yoon Lee, Dong-Il Kim, Biotechnology Letters, 24, 1779-1783(2002))은 플루로닉 F-68(Pluronic F-68)과 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 배양 배지에 첨가함으로써 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물세포의 생육과 목표 산물인 mGM-CSF의 생산 증가를 이룬 바 있다. 또한 미세조류인 두날리엘라(Dunaliella)는 전단응력에 매우 민감하였으며, 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose) 또는 한천(agar)을 배양 배지에 첨가시 세포의 생존률이 증가된 바 있다(Silva HJ, Cortinas T, Ertola RJ, J Chem Technol Biotechnol, 40, 41-49(1987)). 미세조류인 패오닥틸룸 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) 및 포르피리디움 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 또한 교반속도를 증가시킴에 따라 균체량 감소가 일어났으며 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 첨가 농도 증가에 따라 균체량이 증가하였음이 보고된 바 있다(T. Mazzuca Sobczuk, Bioprocess Biosyst Eng, 28, 243-250(2006)).

고도불포화지방산 중에 하나인 DHA(docosahexaenoic acid: DHA)을 생산할 수 있는 미세조류들도 이러한 전단응력에 생육 저해를 받는 것으로 알려져 있다. 트라우스토카이트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum)은 임펠러 교반을 하는 발효조 배양이 플라스크 배양보다 더 낮은 생육속도를 보였으며(Ewao Iida et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, 81, 76-78(1996)), 쉬조카이트리움 속(Schizochytrium sp.)균주는 교반속도 증가 또는 임펠러 타입에 따라 생육저해를 받는다고 보고된 바 있다(T.Yaguchi, S.Tanaka, JAOCS, vol 74, no 11(1997)).

이러한 DHA 생성능을 갖는 미세조류 중 전단응력에 민감한 균주의 배양을 위해 기포탑(Bubble column) 또는 공기부양식 발효조(Airlift fermenter)를 사용하거나 교반식 발효조(Stirred fermenter)에서 교반속도 또는 통기량을 감소시켜 배양하는 등의 기계ㆍ물리적 방법을 사용하는 것으로 알려져 있다.

현재, 고도불포화지방산(특히, DHA)을 생산하는 미세조류에 전단응력 보호제를 첨가 배양하여 고도불포화지방산의 생산 증가시키는 방법에 대하여 보고된 바는 없으며, 고도불포화지방산의 소비가 증가함에 따라 미세조류로부터 고도불포화지방산을 고효율로 생산할 수 있는 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 미세조류의 배양 시간을 단축시킬 뿐 만 아니라 고효율로 고도불포화지방산을 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 종래 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하기 위하여 고비용 생산 설비 확장 및 형질전환과 같은 불필요한 공정대신에 배지에 전단응력 보호제를 배지에 첨가함으로써 짧은 배양 시간 동안 미세조류로부터 고효율로 고도불포화지방산을 생산할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 미세조류의 고도불포화지방산 생산능을 향상시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 고도불포화지방산을 생산하는 미세조류(microalgae)의 배양 방법에 있어서, 미세조류 배지에 전단응력(shear stress) 보호제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 고도불포화지방산을 생산하는 미세조류(microalgae)의 배양 방법에 있어서, 미세조류 배지에 전단응력 보호제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 고도불포화지방산 생산능을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 미세조류의 배양 시간을 단축시킬 뿐 만 아니라 고효율로 고도불포화지방산을 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과, 종래 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하기 위하여 고비용 생산 설비 확장 및 형질전환과 같은 불필요한 공정대신에 배지에 전단응력 보호제를 배지에 첨가함으로써 짧은 배양 시간 동안 미세조류로부터 고효율로 고도불포화지방산을 생산할 수 있음을 규명하였다.

본 발명은 자연계에 존재하는 고도불포화지방산의 생산능을 가지는 미세조류로부터 고효율로 불포화지방산을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법을 개시하면서 사용하는 용어 “고도불포화지방산”은 탄소수 18개 이상을 포함하는 지방산으로서 이중결합(π)이 2개 이상을 포함하는 불포화지방산을 의미한다.

본 발명은 미세조류로부터 짧은 배양 시간을 통하여 고도불포화지방산, 특히 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA)를 고효율로 생산할 수 있는 장점을 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의하여 미세조류로부터 고효율로 생산할 수 있는 고도불포화지방산은 오메가-3 불포화지방산이며, 보다 바람직하게는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid: EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid: ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid: DPA) 및 α-리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 고도불포화지방산이고, 보다 더 바람직하게는 DHA 또는 EPA이며, 가장 바람직하게는 DHA이다.

본 발명은 자연계에서 고도불포화지방산을 생산할 수 있는 미세조류라면 어떤 미세조류를 이용하더라도 고효율로 고도불포화지방산을 생산할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 미세조류는 쉬조카이트리움(Schizochytrium) 속, 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium) 속, 아우란티오카이트리움(Aurantiochytrium) 속, 자포노키트리움(Japonochytrium) 속, 울케니아(UIkenia) 속, 크립테코디니움(Crypthecodinium) 속 또는 할리프토로스 (Haliphthoros) 속 균주이며, 보다 바람직하게는 제 5 항에 있어서, 상기 미세조류는 쉬조카이트리움(Schizochytrium)속 또는 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium)속 균주이고, 보다 더 바람직하게는 미생물국제기탁번호 KCTC 11566BP 및/또는 ATCC(American Type Culture Collection) 34304 균주이며, 가장 바람직하게는 미생물국제기탁번호 KCTC 11566BP 균주이다.

본 발명은 종래 고도불포화지방산의 생산능을 가지는 미세조류를 배양하는데 이용되는 어떠한 배지라도 이용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하고 해수 및 염화나트륨을 포함하지 않는 배지에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 탄소원으로는 포도당, 과당, 갈락토스, 글루코스, 글리세롤 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 질소원으로는 글루타민산나트륨, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 질산나트륨, 황산암모늄, 구연산 암모늄 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 상기 배지에 포함된 탄소원은 2-20 (중량/부피)%, 보다 바람직하게는 9-15 (중량/부피)%의 농도로 함유된다. 또한, 상기 배지에 포함된 질소원은 0.1-5 (중량/부피)%로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1-2.5 (중량/부피)%의 농도로 함유될 수 있다.

예컨대, 본 발명이 이용될 수 있는 배지는 OF-9 배지로서, 포도당 90 g/ℓ, 글루타민산 나트륨 10 g/ℓ, 황산암모늄 2 g/ℓ, 염화칼륨 1 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O) 10 g/ℓ, 탄산수소나트륨 0.2 g/ℓ, 인산이수소칼륨 5 g/ℓ, 미량 성분Ⅰ 5 ㎖/ℓ, 미량 성분Ⅱ 5 ㎖/ℓ 및 염화칼슘 3 g/ℓ로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 미량 성분 Ⅰ은 염산티아민 200 ㎖/ℓ, 바이오틴 0.5 ㎖/ℓ, 비타민 B1 250 ㎍/ℓ, 니코틴산 100 ㎖/ℓ, 판토텐산칼슘 100 ㎖/ℓ, 리보플라빈 5 ㎖/ℓ, 염산피리독신 40 ㎖/ℓ, 파라아미노벤조산 10 ㎖/ℓ, 이노시톨 1000 mg/ℓ, 오로트산 260 mg/ℓ, 엽산 2.5 mg/ℓ (pH 7.2)이며; 미량 성분 Ⅱ는 이디티에이 나트륨 6 g/ℓ, 염화철(FeCl₃6H₂O) 0.29 g/ℓ, 붕산 6.84 g/ℓ, 염화망간(MnCl₂4H₂O) 0.86 g/ℓ, 염화아연(ZnCl₂) 0.06 g/ℓ, 염화코발트(CoCl₂6H₂O) 0.026 g/ℓ, 황산동(CuSO₄5H₂O) 0.002 g/ℓ(pH 7.2)이다.

본 발명은 고도불포화지방산의 생산능을 가지는 미세조류를 배양하는 방법에 있어서, 배지에 전단응력 보호제를 첨가함으로써 미세조류의 배양시간을 단축시킬 뿐 만 아니라 짧은 배양시간 동안 고농도의 고도불포화지방산을 고효율로 생산할 수 있는 장점을 가진다.

본 발명의 명세서에서 용어 “전단응력 또는 전단 스트레스(shear stress)”는 물리학적 의미로 가해진 응력에 대해 평행한 평면을 따라서 미끄러지는 정도에 의해 물질에 변형을 일으키는 힘에 의한 스트레스를 의미하며, 본 발명에서는 미세조류를 배양하는 공정 중 생물반응기(bioreactor) 또는 발효조(fermenter)에서의 교반 및 통기에 의한 스트레스를 의미한다.

본 발명은 전단응력 또는 전단 스트레스에 의한 미세조류의 고도불포화지방산의 생산능의 저하를 억제시키기 위하여 배지에 전단응력 보호제를 첨가함으로써 미세조류의 배양 시간을 단축시키고 단기간에 미세조류로부터 고농도 고도불포화지방산의 생산 및 미세조류의 고도불포화지방산의 생산능을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 전단응력 보호제는 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 플루오닉(pluronic), 폴록사머(poloxamer), 메틸 셀루로즈(methyl cellulose), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose), 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch), 폴리비닐 피롤리딘(polyvinyl pyrrolidine) 및 덱스트란스(dextrans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전단응력 보호제이며, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜, 플루오닉 F-68, 메틸셀룰로오즈 및 카르복시메틸 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전단응력 보호제이고, 가장 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 및/또는 플루오닉 F-68이다.

본 발명은 미세조류 배지에 전단응력 보조제를 첨가하여 배양함으로써 고도불포화지방산 생산능을 가지는 미세조류로부터 고도불포화지방산을 고효율로 수득하는 것을 특징으로 하며, 미세조류 배지에 첨가하는 전단응력 보호제의 농도는 제한되지 아니한다. 그러나, 미세조류를 배양하는데 있어서 전단응력 보호제를 첨가하는 경우 배양 조건에 따라 당업자에 의하여 최적의 농도를 선택하여 배지에 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 미세조류 배지에 첨가하는 전단응력 보호제의 농도는 0.1-10 g/ℓ이며, 보다 바람직하는 0.5-6 g/ℓ이고, 보다 더 바람직하게는 1-5 g/ℓ이다.

본 발명에 의하여 생산된 고도불포화지방산을 배지로부터 수득하는 방법은 당업계에 공지된 고도불포화지방산의 분리 및 정제하는 방법을 이용하여 수득된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 미세조류로부터 고도불포화지방산를 생산하는 방법 및 고도불포화지방산 생산능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명은 미세조류 배지에 전단응력 보호제를 첨가함으로써 미세조류의 생육속도 또는 당소모속도가 증가하여 발효시간이 단축됨에 따라 미세조류로부터 고도불포화지방산를 생산하는데 소요되는 원가를 효과적으로 절감시킬 수 있다.

(ⅲ) 본 발명은 미세조류의 배양의 스케일업(scale-up)으로 인하여 발생하는 전단응력의 증가를 매우 효과적으로 억제시킴으로써 전단응력에 민감한 고도불포화지방산 생산능을 가지는 미세조류로부터 대량으로 고도불포화지방산(특히, DHA)을 수득할 수 있는 장점을 가진다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 고도불포화지방산을 생산하는 미세조류를 배양하는 경우, 고비용의 추가적인 배양 설비 및 공정 단계(예컨대, 미세조류를 형질 전환시키는 공정) 개선 없이도 배지 성분의 첨가만으로도 고효율의 고도불포화지방산(특히, DHA)을 생산할 수 있는 장점을 가진다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 쉬조카이트리움 속 균주의 플라스크에서의 폴리에틸렌 글리콜 첨가 배양

쉬조카이트리움 sp. CC44(Schizochytrium sp. CC44; 미생물국제기탁번호 KCTC 11566BP)를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜의 첨가 배양을 시도하였다. 상기 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol: PEG)은 시그마 사의 폴리에틸렌 글리콜(Sigma, P-5413, MW 8000)을 사용하였다.

GPY(glucose-peptone-yeast) 배지(포도당 20 g/ℓ, 펩톤 10 g/ℓ, 효모추출물 5 g/ℓ 및 해수염(Sea salt) 20 g/ℓ) 250 ㎖을 2 ℓ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 각 균주를 백금이로 1 loop 접종하고 28℃에서 140 rpm으로 24시간 진탕 배양하여 종균 배양액으로 하였다. OF-9 배지(포도당 90 g/ℓ, 글루타민산 나트륨 10 g/ℓ, 황산암모늄 2 g/ℓ, 염화칼륨 1 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO₄?7H₂O) 10 g/ℓ, 탄산수소나트륨 0.2 g/ℓ, 인산이수소칼륨 5 g/ℓ, 미량 성분Ⅰ 5 ㎖/ℓ, 미량 성분Ⅱ 5 ㎖/ℓ 및 염화칼슘 3 g/ℓ) 50 ㎖을 500 ㎖ 엘렌마이어 배플 플라스크에 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 5 ㎖을 접종하였다. PEG 0 g/ℓ, 0.5 g/ℓ, 1 g/ℓ 및 5 g/ℓ을 배양액에 각각 첨가한 후 28℃에서 200 rpm으로 72시간 진탕 배양하였다. 건조 균체량은 배양액을 세척하여 105℃에서 건조한 후 무게를 측정하였다. 또한, 상기와 같이 배양한 균체를 원심분리하여 수집하고 폴치(Folch) 용액(클로로포름 : 메탄올 = 2:1, 부피비)으로 30℃에서 1시간 추출하여 Alltech사의 Meth-PrepⅡ로 메틸에스터화시킨 뒤, HP사의 기체크로마토그래피(Medel 6890)를 이용하여 DHA의 농도를 계산하고, 검출된 고도불포화지방산 피크와의 면적비로 전체 고도불포화지방산을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다.

표 1 의 결과로부터, 쉬조카이트리움 sp. CC44는 폴리에틸렌 글리콜 1 g/ℓ까지는 첨가할수록 균체량과 DHA 생성이 증가하였음을 알 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 1 g/ℓ를 첨가하였을 때 무첨가시보다 균체량은 21%, DHA 생성은 40% 증가하였으며, 또한 균체당 DHA와 균체당 고도불포화지방산이 각각 16%, 20% 증가하여 폴리에틸렌 글리콜의 첨가가 단순한 생육 증가 이외에도 균체 내의 고도불포화지방산과 DHA 함량을 증가시켰음을 알 수 있다.

상기 방법과 동일한 방법으로 분자량이 다른 폴리에틸렌 글리콜의 첨가 배양을 시도하였으며 그 결과는 표 2와 같다.

표 2의 결과로부터, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 10000보다 8000인 것을 사용하였을 때 더 높은 DHA의 증가가 있었음을 알 수 있다. 따라서 이후 실시예에서는 분자량이 8000인 폴리에틸렌 글리콜을 사용하였다.

실시예 2: 트라우스토카이트리움 속 균주의 플라스크에서의 폴리에틸렌 글리콜 첨가 배양

실시예 1과 동일한 방법으로 트라우스토카이트리움 아우레움 ATCC 34304 (Thraustochytrium aureum ATCC 34304)를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜의 첨가 배양을 시도하였다. 이 때, 폴리에틸렌 글리콜의 농도는 0, 2, 4 및 6 g/ℓ를 각각 첨가하였다. 배양 후 포도당 농도는 YSI 모델 2700 SELECT(YSI사, USA)로 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.

표 3의 결과로부터, 트라우스토카이트리움 아우레움 ATCC 34304는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol) 2 g/ℓ를 첨가 배양하였을 때 무첨가시보다 DHA 26%, 균체당 DHA 25%, 균체당 고도불포화지방산 함량 26%의 증가를 보여 상기 균주에서도 폴리에틸렌 글리콜의 첨가가 균체 내의 고도불포화지방산과 DHA 함량을 증가시켰음을 알 수 있다.

실시예 3: 쉬조카이트리움 속 균주의 플라스크에서의 플루로닉 F-68 첨가 배양

실시예 1과 동일한 방법으로 쉬조카이트리움 sp. CC44를 사용하여 플루로닉 F-68의 첨가 배양을 시도하였다.

상기 플루로닉 F-68은 시그마 사의 제품(Sigma, P7061)을 사용하였으며, 첨가 농도는 0, 0.5, 1 및 5 g/ℓ이었다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.

표 4의 결과로부터, 쉬조카이트리움 sp. CC44는 플루로닉 F-68 1 g/ℓ를 첨가하였을 때, 무첨가시보다 균체량 3%, DHA 12%, 균체당 DHA 9%, 균체당 고도불포화지방산 함량 11%의 증가를 보여 플루로닉 F-68(Pluronic F-68)의 첨가가 균체 내의 고도불포화지방산과 DHA 함량을 증가시켰음을 알 수 있다.

실시예 4: 쉬조키트리움 속 균주의 5 ℓ 발효조에서의 폴리에틸렌 글리콜 첨가 배양

쉬조키트리움 sp. CC44는 사용하여 5 ℓ 발효조에서 폴리에틸렌 글리콜의 첨가 배양을 시도하였다.

GPY 배지(포도당 20 g/ℓ, 펩톤 10 g/ℓ, 효모추출물 5 g/ℓ 및 해수염(Sea salt) 20 g/ℓ) 250 ㎖을 2 ℓ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 각 균주를 백금이로 1 loop 접종하고 28℃에서 140 rpm으로 24시간 진탕배양하여 1차 종균 배양액으로 하였다. 2차 종균 배지(포도당 20 g/ℓ, 효모 액상추출물 10 g/ℓ, 염화나트륨 6 g/ℓ, 염화칼슘 0.4 g/ℓ, 황산마그네슘 2 g/ℓ, 글루타민산 나트륨 5 g/ℓ, 황산암모늄 1 g/ℓ, 인산이수소칼륨 1 g/ℓ, 베타인 0.5 g/ℓ, 염산티아민 1 ㎎/ℓ, 황산철 1 ㎎/ℓ, 황산아연 1 ㎎g/ℓ) 2.5 ℓ를 5 ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 1차 종균 배양액 25 ㎖을 접종하여 28℃, 300 rpm, 1 vvm(volume per volume per minute)으로 24시간 배양하여 2차 종균 배양액으로 하였다. OF-4배지(포도당 40 g/ℓ, 글루타민산 나트륨 10 g/ℓ, 황산암모늄 2 g/ℓ, 염화칼륨 1 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO4?7H2O)10g/ℓ,탄산수소나트륨 0.2 g/ℓ, 인산이수소칼륨 5 g/ℓ, 미량 성분 Ⅰ 5 ㎖/ℓ, 미량 성분 Ⅱ 5 ㎖/ℓ, 염화칼슘 3 g/ℓ) 2.1 ℓ를 5 ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 2차 종균 배양액 210 ㎖을 접종하였다. 종균을 접종시킨 배양액에 0 g/ℓ, 1 g/ℓ 및 2 g/ℓ PEG를 각각 첨가한 후, 교반속도(500, 600rpm), 28℃, 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다. 배지 중 포도당이 10 g/ℓ의 농도로 잔존되는 상태에서 포도당 농도가 380 g/ℓ인 포도당액 150 ㎖을 5회 첨가하여 총 포도당 농도가 129 g/ℓ가 되도록 하였다. 배양된 균체는 실시예 1과 동일하게 균체를 수집하여 건조 균체량 및 지방산을 분석하였으며, 그 결과는 표 5 및 6과 같다.

표 5 의 결과로부터, 쉬조키트리움 sp. CC44는 500 rpm의 교반속도 조건에서 폴리에틸렌 글리콜 5 g/ℓ를 첨가하였을 때 무첨가시보다 DHA 생성은 26% 증가하였으며, 균체당 DHA와 균체당 고도불포화지방산이 각각 25%, 25% 증가하여 폴리에틸렌 글리콜의 첨가가 균체 내의 고도불포화지방산과 DHA 함량을 증가시켰음을 알 수 있다. 또한 당소모속도가 34% 증가하여 DHA 생산성이 59% 증가하였음을 알 수 있다.

표 6 의 결과로부터, 쉬조키트리움 sp. CC44는 600 rpm의 교반속도 조건에서 폴리에틸렌 글리콜 2 g/ℓ를 첨가하였을 때 무첨가시보다 균체량은 11%, DHA 생성은 49% 증가하였으며, 균체당 DHA와 균체당 고도불포화지방산이 각각 34% 및 34% 증가하여 폴리에틸렌 글리콜의 첨가가 균체 내의 고도불포화지방산과 DHA 함량을 증가시켰음을 알 수 있다. 또한 당소모속도가 30% 증가하여 DHA 생산성이 94% 증가하였음을 알 수 있다.

실시예 5: 쉬조카이트리움 속 균주의 5 ℓ 발효조에서의 교반속도별 배양

기계ㆍ물리적 방법에 의한 전단응력 감소가 배양에 미치는 효과와 본 발명의 전단응력 보호제에 의한 전단응력 감소가 배양에 미치는 효과를 비교하기 위하여 실시예 4와 동일한 방법으로 쉬조키트리움 sp. CC44를 사용하여 교반속도별(250, 300, 400, 500 및 600rpm) 배양을 시도하였으며, 그 결과는 하기 표 7과 같다.

표 7 의 결과로부터, 쉬조키트리움 sp. CC44는 300 rpm의 교반속도로 배양하였을 때 600 rpm 배양시보다 균체량은 33%, DHA 생성은 46% 증가하였으며, 균체 당 DHA는 11% 증가하였으나 균체당 고도불포화지방산은 증가하지 않았다. 또한 당소모속도가 23% 감소하였고 DHA 생산성은 11% 증가하였다.

또한 300 rpm의 교반속도로 배양하였을 때 500 rpm 배양시보다 균체량은 23%, DHA 생성은 22% 증가하였으나, 균체당 DHA는 증가하지 않았고 균체당 고도불포화지방산은 24% 감소하였다. 또한 당소모속도가 24% 감소하였고 DHA 생산성은 7% 감소하였다.

상기의 결과 표 5, 6 및 7로부터 선행 기술로서 기계ㆍ물리적 방법에 의한 전단응력 감소가 배양에 미치는 효과와 본 발명의 전단응력 보호제에 의한 전단응력 감소가 배양에 미치는 효과를 비교하였으며, 그 결과는 표 8과 같다.

표 8의 결과로부터 교반속도 감속에 의한 전단응력 감소는 균체량과 DHA생성을 모두 증가시켰으나 폴리에틸렌 글리콜 첨가에 의한 전단응력 감소는 DHA 생성쪽이 크게 증가하여 선행 기술에 비하여 본 발명이 균체당 DHA와 균체당 고도불포화지방산 함량이 크게 증가하였음을 알 수 있다. 또한 교반속도 감속은 용존산소량을 감소시켜 당소모속도가 감소됨으로써 DHA 생산성이 감소하였으나 폴리에틸렌 글리콜 첨가 배양은 당소모속도를 증가시켜 DHA 생산성이 크게 증가하였음을 알 수 있다.

실시예 6: 쉬조카이트리움 속 균주의 50 ℓ 발효조에서의 폴리에틸렌 글리콜 첨가 배양

쉬조카이트리움 sp. CC44을 사용하여 50 ℓ 발효조에서 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol)의 첨가 배양을 시도하였다.

GPY배지 250 ㎖을 2 ℓ 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 각 균주를 백금이로 1 loop 접종하고 28℃에서 140 rpm으로 24시간 진탕배양하여 1차 종균 배양액으로 하였다. 2차 종균 배지 2.5 ℓ를 5 ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 1차 종균 배양액 25 ㎖을 접종하여 28℃, 300 rpm 및 1 vvm으로 24시간 배양하여 2차 종균 배양액으로 하였다. OF-4배지 21 ℓ를 50 ℓ 발효조에 넣고 미리 준비한 2차 종균 배양액 2.1 ℓ를 접종하였다. 종균을 접종시킨 배양액에 0 g/ℓ, 2 g/ℓ 및 4 g/ℓ PEG를 각각 첨가한 후, 교반속도 550 rpm, 28℃ 및 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다. 배지 중 포도당이 10 g/ℓ의 농도로 잔존되는 상태에서 포도당 농도가 380 g/ℓ인 포도당액 1.5 ℓ를 5회 첨가하여 총 포도당 농도가 129 g/ℓ가 되도록 하였다. 배양된 균체는 실시예 1과 동일하게 균체를 수집하여 건조 균체량 및 지방산을 분석하였으며, 그 결과는 표 9와 같다.

표 9 의 결과로부터, 쉬조키트리움 sp. CC44는 50 ℓ 발효조, 550 rpm의 교반속도 조건에서 폴리에틸렌 글리콜 4 g/ℓ를 첨가하였을 때 무첨가시보다 DHA 생성은 26% 증가하였으며, 균체당 DHA와 균체당 고도불포화지방산이 각각 24%, 33% 증가하여 폴리에틸렌 글리콜의 첨가가 균체 내의 고도불포화지방산과 DHA 함량을 증가시켰음을 알 수 있다. 또한 당소모속도가 10% 증가하여 DHA 생산성이 33% 증가하였음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

고도불포화지방산을 생산하는 미세조류(microalgae)의 배양 방법에 있어서, 미세조류 배지에 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 플루오닉(pluronic), 폴록사머(poloxamer), 메틸 셀루로즈(methyl cellulose), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose), 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch), 폴리비닐 피롤리딘(polyvinyl pyrrolidine) 및 덱스트란스(dextrans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전단응력(shear stress) 보호제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법.
고도불포화지방산을 생산하는 미세조류(microalgae)의 배양 방법에 있어서, 미세조류 배지에 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 플루오닉(pluronic), 폴록사머(poloxamer), 메틸 셀루로즈(methyl cellulose), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose), 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch), 폴리비닐 피롤리딘(polyvinyl pyrrolidine) 및 덱스트란스(dextrans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전단응력 보호제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 고도불포화지방산 생산능을 향상시키는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 고도불포화지방산은 오메가-3 불포화지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 고도불포화지방산은 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid: EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid: ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid: DPA) 및 α-리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 고도불포화지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 미세조류는 쉬조카이트리움(Schizochytrium) 속, 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium) 속, 아우란티오카이트리움(Aurantiochytrium)속, 자포노키트리움(Japonochytrium) 속, 울케니아(UIkenia) 속, 크립테코디니움(Crypthecodinium) 속 또는 할리프토로스 (Haliphthoros) 속 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 미세조류는 쉬조카이트리움(Schizochytrium)속 또는 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium) 속 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 전단응력 보호제는 폴리에틸렌글리콜, 플루오닉 F-68, 메틸셀룰로오즈 및 카르복시메틸 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전단응력 보호제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법은 미세조류 배지에 0.1-10 g/ℓ 농도의 전단응력 보호제를 첨가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.