CN101932696B - 培养破囊壶菌目微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明大体上涉及微生物细胞培养领域。发明了一种破囊壶菌目微生物的细胞培养基及破囊壶菌目微生物的培养方法，特别地用于生产ω-3脂肪酸。此外，发明了使用酒石酸铵作为氮源来培养破囊壶菌目微生物。
Description
技术领域
本发明大体上涉及微生物细胞培养领域。发明了一种破囊壶菌(Thraustochytriales)目微生物的细胞培养基及破囊壶菌目微生物的培养方法，特别地用于生产ω-3脂肪酸。此外，发明了使用酒石酸铵作为氮源来培养破囊壶菌目微生物（Thraustochytriidea）。
背景技术
本发明披露了通过改进细胞培养基提高在破囊壶菌目微生物生物量中的PUFA总量的方法，特别是提高ω-3二十二碳六烯酸（DHA）总量的方法。当特殊的盐，尤其是酒石酸铵，存在于细胞培养基中时，生物量中的DHA量提高。由于不仅提高了DHA总量，而且提高了脂质总量，简化了这些产物的生产过程，从而获得更高的DHA收率。
目前，有多种不同的培养破囊壶菌目海洋微生物（尤其是属于Ulkenia种的微生物）的细胞培养基。EP0935667记载了在含有磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸钠和不同氯化物的培养基中培养Ulkenia细胞。US2007/0141686A1记载了培养破囊壶菌的方法，其中细胞培养基是使用碳酸钙pH稳定的。US2007/0054384A1记载了不添加钠盐和盐酸盐的低盐培养基中培养破囊壶菌的方法。US6,410,281B1记载了使用含非含氯钠盐（特别是硫酸钠）的细胞培养基培养破囊壶菌的方法。
已知，属于破囊壶菌（Thraustochytriidea）目和（尤其是）属于Ulkenia属的微生物用来生产含ω-3二十二碳六烯酸（亦已知为DHA）和/或ω-3二十二碳五烯酸（亦已知为DPA）的脂质。
不同的多不饱和脂肪酸（PUFA）和（尤其是）ω-3脂肪酸是已知的人体营养和有益的食品添加剂的主要成分。例如，已知，PUFA能降低血清中甘油三脂浓度，由此作为降脂剂使用。
DHA和DPA均是用做食品添加剂的多不饱和脂肪酸。
目前通过培养Ulkenia来生产DHA和/或DPA的方法会引起令人不满意的脂质产率，尤其是较低的DHA和/或DPA的产率或包括复杂的生产步骤。仍存在改善培养破囊壶菌目微生物的方法需求。
发明内容
因此，本发明的一个目的就是发明一种新的简单且经济的培养破囊壶菌目微生物的方法，以提高PUFA的产量。
本发明的一个目的是避免现有技术的缺点。本发明的另一个目的是发明一种不同的提高PUFA产率的方法，尤其是在破囊壶菌细胞培养中提高DHA和/或DPA的产率的方法。本发明的另一个目的是发明一种不同的生产高纯度PUFA（尤其是DHA和/或DPA）的方法。
根据本发明的主张的主题，将解决上述这些目的和其他的目的（其未予以明确地叙述，但通过本说明书的上下文也披露给本领域技术人员）。
通过提供主张的方法、细胞培养基、使用酒石酸铵和制品，本发明解决了本发明提到的技术问题。
本发明解决了本发明提到的技术问题，特别是通过提供一种培养破囊壶菌目微生物的方法解决了技术问题，该方法包括：步骤a）转移微生物至细胞培养基中；b）在细胞培养基中培养微生物，其中细胞培养基不包含硫酸铵。
在一种优选的本发明的实施方式中，细胞培养基包含至少一种不是硫酸铵的铵盐。在一种优选的本发明的实施方式中，细胞培养基包含酒石酸铵。在一种优选的本发明的实施方式中，细胞培养基包含酒石酸铵而不包含硫酸铵。
此外，通过提供一种培养破囊壶菌目微生物的方法（该方法包括：步骤a）转移微生物至细胞培养基中；b）在细胞培养基中培养微生物，其中细胞培养基不包含硫酸铵但包含酒石酸铵），本发明解决了本发明提到的技术问题。
此外，通过提供一种培养破囊壶菌目微生物的方法（该方法包括：步骤a）转移微生物至细胞培养基中；b）在细胞培养基中培养微生物，其中细胞培养基包含酒石酸铵），本发明解决了本发明提到的技术问题。
在一种上述方法的特别地优选的实施方式中，预知后续步骤d）以从培养基或微生物中收获，尤其是分离多不饱和脂肪酸，特别是DHA和/或DPA。
此外，通过提供一种生产至少一种多不饱和脂肪酸的方法（该方法包括：步骤a）转移破囊壶菌目微生物至细胞培养基中；b）在细胞培养基中培养微生物；和c）从微生物和/或细胞培养物中收获所述的多不饱和脂肪酸，其中细胞培养基包含酒石酸铵），本发明解决了本发明提到的技术问题。
在本发明的一种实施方式中，多不饱和脂肪酸是从微生物和/或细胞培养物中以包含各种脂质的油的形式收获的。
根据本发明，脂肪酸是一种脂肪族的一元羧酸。脂质是包含连同有关的磷脂、醇、乙醇、烃、酮和有关化合物的脂肪酸甘油酯脂类的脂肪或油。
根据本发明，多不饱和脂肪酸（PUFA）为链长大于C12的包含至少2个双键的多不饱和的长链脂肪酸。可以根据本发明的方法生产的PUFA优选为n-3脂肪酸和n-6脂肪酸，更优选n-3脂肪酸。
从本发明的意义上说，n-3脂肪酸（ω-3脂肪酸）为链长大于C12的包含至少2个双键的多不饱和脂肪酸。
在本发明的一种优选的实施方式中，在进一步步骤d）中从其他脂质中分离出至少一种多不饱和脂肪酸（PUFA）。
在本发明的一种优选的实施方式中，至少一种多不饱和脂肪酸（PUFA）为高纯度的PUFA。
在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸包含ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）和/或ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸包含ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸包含ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸包含ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）和ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸为ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）和/或ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸为ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）和ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸为ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）。在本发明的一种优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸为ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。
本发明提供意外的启示为在培养基中使用酒石酸铵以培养破囊壶菌目海洋生物来生产PUFA，其出乎意料地显著增加了DHA量。使用其他氮源，如氯化铵，能增加如脂质含量的量，但另一方面降低了总生产率，进而降低了总生物量的量，这样没有经济上的利益。鉴于此，意外地获得高DHA和总脂质的量的同时，总生物量仍在常规的范围之内。不期望本发明的在破囊壶菌目微生物中生产PUFA的方法能增加DHA的总含量。
在本发明的一种优选的实施方式中，破囊壶菌目微生物包含至少28%（重量），更优选大于28%（重量），仍更优选大于30%（重量），最优选大于31%（重量）ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含至少28%（重量）ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含大于28%（重量）ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含大于30%（重量）ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含大于31%（重量）ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）（基于微生物的总干重）。
在本发明的一种优选的实施方式中，破囊壶菌目微生物包含至少60%（重量），更优选大于60%（重量）脂质（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，破囊壶菌目微生物包含大于65%（重量），更优选大于70%（重量）脂质（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含至少60%（重量）脂质（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含大于60%（重量）脂质（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含大于65%（重量）脂质（基于微生物的总干重）。在本发明的一种优选的实施方式中，在步骤c）中破囊壶菌目微生物包含大于70%（重量）脂质（基于微生物的总干重）。
在本发明的一种优选的实施方式中，破囊壶菌目微生物属于Ulkenia属。在本发明的一种优选的实施方式中，破囊壶菌目微生物属于Thraustochytrium属，特别是Thraustochytrium aureum种或Schizochytrium属或2者的混合物。在另一种优选的实施方式中，本发明方法中使用的微生物为甲藻，如Crypthecodinium，特别是Crypthecodinium cohnii。在本发明的一种优选的实施方式中，破囊壶菌目微生物属于Ulkenia sp.SAM2179或Ulkenia sp.SAM2180。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基不包含硫酸铵。在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含至少0.6g/升且不大于4.0g/升的硫酸根离子。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基不包含氯化铵。在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含氯化铵。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含氮源。在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含除酒石酸铵外的氮源。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含氮源，氮源选自蛋白胨、酵母提取液、麦芽浸膏、肉浸出物、络蛋白氨基酸、玉米浆、豆饼、谷氨酸钠、乙酸铵、氯化铵、硝酸铵及其混合物。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基中的酒石酸铵用作氮源。在本发明的一种优选的实施方式中，在细胞培养基中酒石酸铵为唯一的氮源。在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含的氮源有酒石酸铵和选自乙酸铵、氯化铵、硝酸铵及其混合物的另一种盐。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含或不包含天然的或人造的海水。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基碳源。在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含碳源，碳源选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶淀粉、海藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、油酸、脂肪，优选如大豆脂肪、油、谷氨酸、糖蜜、甘油、甘露醇、乙酸钠及其混合物。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基，更优选如微量营养素、选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸镁、氯化钙、维生素及其混合物的物质。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含葡萄糖、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、氯化钠和酒石酸铵。
在本发明的一种优选的实施方式中，在细胞培养基中碳源的浓度可以为15-250g每升细胞培养基。氮源，包括酒石酸铵，的浓度可以为0.5-13g/升，更优选7g每升细胞培养基。在一种优选的实施方式中，细胞培养基中的酒石酸铵在0.5-10g每升，优选0.5-7每升，最优选2-7g每升细胞培养基。优选情况下，氮源量的增加随着碳源量的增加而相应地增加。优选情况下，氮源的量，尤其是铵盐，最优选酒石酸铵，根据碳源的量调节。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含DHA和/或DPA的前体。在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基包含选自十四烷、十六烷、十八烷、油酸、亚油酸、α-亚油酸及其混合物。
在本发明的一种优选的实施方式中，碳源、氮源、前体等等在培养之前或培养期间加入至细胞培养基中。这些成分的加入可以是一次性、重复地或连续地。
在本发明的一种优选的实施方式中，在微生物培养之前，细胞培养基的pH值在3.0到8.0之间，更优选4.0到7.0之间。
在本发明的一种优选的实施方式中，在细胞培养基中培养微生物之前，细胞培养基是灭菌的，更优选高压灭菌。
在本发明的一种优选的实施方式中，微生物在细胞培养基中培养时间为1-12天，更优选2-10天。在本发明的一种优选的实施方式中，在细胞培养基中培养微生物的温度为10℃-40℃，更优选18℃-32℃，仍更优选22℃-30℃，最优选27℃-29℃。在本发明的一种优选的实施方式中，微生物于28℃下在细胞培养基中培养。在本发明的一种优选的实施方式中，微生物使用通气搅拌培养。在本发明的一种优选的实施方式中，微生物使用振摇法培养。在本发明的一种优选的实施方式中，微生物在稳定期培养。在本发明的另一种优选的实施方式中，微生物在搅拌釜反应器中培养。
破囊壶菌目微生物优选通过接种一种本发明的细胞培养基使用预培养微生物培养。
培养可以优选地以补料分批模式或连续地进行分批发酵。合适培养方法对本领域技术人员是已知的。
通过本发明描述的培养方法，在破囊壶菌目微生物的细胞中生产和蓄积了含PUFA脂质，尤其是DHA和/或DPA。如使用的是脂质培养基，在培养期间从培养物或灭菌培养物，在培养结束时从培养物或灭菌培养物，或者从上述任一种培养物收集的培养细胞，或干细胞中，可以回收含PUFA脂质。在此，术语“培养物”指的是破囊壶菌目微生物的细胞培养物，且其包含培养细胞、干培养细胞和已处理的培养细胞以及包含细胞和培养上清液的培养肉汤。
DHA和/或DPA可以优选地从培养细胞中回收的含有DHA和/或DPA的脂质中分离出来，如下文所述。优选情况下，培养后，通过常规的固体/液体分离手段如离心法和过滤法从培养物中收集细胞。优选情况下，细胞经充分水洗，且优选情况下，然后予以干燥。优选地通过冷冻干燥、风干等等方法干燥细胞。优选情况下，然后破坏干的细胞，例如，通过球磨机或超声粉碎，然后优选地使用有机溶剂从细胞中提取脂质，更优选在氮流下。有机溶剂如乙醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷或石油醚都是优选使用的。使用甲醇和石油醚交替提取或使用氯仿/甲醇/水的混合溶剂系统提取也是优选使用的。减压条件下通过从提取物中蒸发有机溶剂的方法，可以获得高浓度的含有DHA和/或DPA的脂质。在本发明的另一种优选的实施方式中，含DHA和/或DPA的脂质可以通过直接的压榨干或湿细胞生物量的方法获得。
或者，提取可以优选地使用湿细胞进行。该情况下，与水相容的溶剂如甲醇或乙醇，或者与水相容的由乙醇和水组成的混合溶剂和/或其他溶剂是优选使用的。其他的操作步骤优选同上所述。
在本发明的一种优选的实施方式中，PUFA高产率的获得。在本发明的一种优选的实施方式中，PUFA高纯度地获得。在本发明的一种优选的实施方式中，从微生物中获得PUFA。在本发明的一种优选的实施方式中，从培养后的细胞培养基中获得。在本发明的一种优选的实施方式中，PUFA从微生物和从培养后的细胞培养基中获得。
生产的PUFA优选是通常可以中性脂肪的形式获得和收获，例如，甘三脂，或极性脂质如卵磷脂、脑磷脂或磷脂酰肌醇。
在本发明的一种优选的实施方式中，生产的PUFA，尤其是DHA和/或DPA，是以中性脂质组分的形式收获。在另一种优选的实施方式中，PUFA，尤其是DHA和/或DPA，是以极性脂质组分的形式收获。在另一种优选的实施方式中，生产的PUFA，尤其是DHA和/或DPA，是以总脂质组分的形式收获。
在一种特别优选的实施方式中，本发明也涉及根据本发明收获的油，尤其是含PUFA的油或其组分，如含有本发明的PUFA的极性脂质组分，总脂质组分或中性脂质组分，尤其是DHA或DPA。
对于本发明的目的，术语PUFA、n-3脂肪酸或n-3活性物质可以理解成所有可能的形式，其中可以存在相应的脂肪酸，例如游离脂肪酸和脂、甘油三脂、磷脂或其他衍生物。所有这些物质都概述于本说明中，且术语可以同义地使用。此外，PUFA可以优选通过化学或生物催化转酯基作用的方法进行转换和浓缩，例如，在合适的酶（优选脂肪酶）的帮助下，在从培养物中分离之前或之后进行转换。
使用本领域技术人员已知的常用步骤，从发酵的微生物或培养基或油中分离PUFA和分析脂肪酸谱。
此外，通过提供一种培养破囊壶菌目微生物的细胞培养基，本发明解决了本发明提到的技术问题，其中细胞培养基包含酒石酸铵作为氮源。
在本发明的一种优选的实施方式中，细胞培养基是上述方法的描述的培养基。
此外，通过提供酒石酸铵在一种培养破囊壶菌目微生物的细胞培养基中作为氮源的用途，本发明解决了本发明提到的技术问题。
此外，在通过在细胞培养基中培养破囊壶菌目微生物生产至少一种多不饱和脂肪酸的细胞培养基中，通过提供酒石酸铵作为氮源的用途，本发明解决了本发明提到的技术问题。
在本发明的一种优选的实施方式中，至少一种多不饱和脂肪酸是ω-3-二十二碳六烯酸（DHA）和/或ω-3-二十二碳五烯酸（DPA）。
在本发明的一种优选的实施方式中，酒石酸铵用于上述方法中。在本发明的一种优选的实施方式中，酒石酸铵用于上述的细胞培养基中。
此外，通过提供含有至少10%（重量）DHA，优选至少20%（重量）DHA和最优选至少30%（重量）DHA的使用本发明方法生产的油，本发明解决了本发明提到的技术问题。优选情况下，油随后从通过本发明的方法可获得的细胞培养物或细胞培养基中分离。
此外，通过提供使用本发明的方法生产的DHA，本发明解决了本发明提到的技术问题。优选情况下，DHA随后从通过本发明的方法可获得的细胞培养物或细胞培养基中分离。
此外，通过提供使用本发明的方法生产的DPA，本发明解决了本发明提到的技术问题。优选情况下，DPA随后从通过本发明的方法可获得的细胞培养物或细胞培养基中分离。
此外，通过提供使用本发明的方法生产的生物量，本发明解决了本发明提到的技术问题。
本发明的另一些优选实施方式是次要主张的主题。
具体实施方式
实施例1：含酒石酸铵的细胞培养基（培养基A）:
实施例2：含氯化铵的细胞培养基（培养基B）:
实施例3：培养破囊壶菌目微生物
使用本发明的2种不同的细胞培养基（培养基A和B）培养破囊壶菌目微生物与现有技术（培养基C）比较，在细胞培养基中培养同类微生物。在培养基A和B中使用的铵盐（酒石酸铵和氯化铵）的量可获得培养基C中相同的铵离子的量。
微生物细胞使用的是Ulkenia sp.SAM2179。
为生产PUFA，微生物根据如下方法培养：
1.预备培养：
如下的预备培养物用于所有的3中培养基中：
葡萄糖 (g/L)30,0
酵母浸出物(g/L) 10,0(Sensient)
Tropic Marin(g/L) 16,65
(Dr.Bienert GmbH,Wartenberg)
使用HCl调节pH值至6.0。
微生物在2升的不带挡板的锥形瓶中培养，其包含350ml的预备培养基，25℃下转速为160rpm培养48h。
2.主要培养基
培养预备培养基后，培养基转移至细胞培养基A（本发明的）、培养基B（本发明的）或C（现有技术）中：
细胞培养基A：参见实施例1。
细胞培养基B：参见实施例2。
细胞培养基C：
所有的3种细胞培养基含有1.36g/L的铵离子。
pH值>4，通过NaOH（20%（重量）(w/v)）或KOH（20%（重量）(w/v)）调节。
微生物在10L的培养基中培养，温度为28℃，通气为0.75vvm.
直至培养基中无葡萄糖，停止培养微生物。
表1显示了不同培养基的结果。
表1：培养的结果
DBM：干生物量
*:12个单独培养的均值
**最低值26.0%（重量）;最高值28.7%（重量）
培养基A和B使用了不同的铵源，但绝对的铵量在培养基A、B和C中是相等。
培养基A使用酒石酸铵，培养基B是使用氯化铵，培养基C使用硫酸铵，结果培养基A、B显著增加了DHA质量-%（重量），增加至少15%（重量）（DHA占干生物量的比例），而脂肪酸谱的特性无影响（相似的DHA面积%（重量）值）。
使用酒石酸铵增加了在细胞培养基中的DHA总量。该结果特别出现于与使用培养基C培养的相比总干生物量相近时，因为当DHA含量提高时，这导致了总DHA量的增加。
使用酒石酸铵替代硫酸铵，干生物量中的总油含量也提高。
Claims (7)
1.一种生产ω-3-二十二碳六烯酸的方法，其包括步骤
a）转移破囊壶菌目微生物至细胞培养基中，其中所述破囊壶菌目微生物是Ulkenia sp.SAM2179，
b）在细胞培养基中培养微生物，
c）从微生物和/或细胞培养物中收获多不饱和脂肪酸，
其中，该细胞培养基包含酒石酸铵、葡萄糖、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙和氯化钠，且其中在步骤c）中基于总的微生物干重，该破囊壶菌目微生物包含至少28%（重量）的ω-3-二十二碳六烯酸。
2.权利要求1的方法，其中该至少一种多不饱和脂肪酸是在进一步的步骤d）中从其他脂质中分离的。
3.权利要求1或2的方法，其中该多不饱和脂肪酸包含ω-3-二十二碳六烯酸和/或ω-3-二十二碳五烯酸。
4.权利要求1或2的方法，其中在步骤c）中基于总的微生物干重，该破囊壶菌目微生物包含至少60%（重量）的脂质。
5.权利要求1或2的方法，其中细胞培养基中的酒石酸铵作为氮源使用。
6.权利要求1或2的方法，其中酒石酸铵是细胞培养基中的唯一氮源。
7.权利要求1或2的方法，其中该细胞培养基包含0.6g/升-4.0g/升的硫酸根离子。
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