JP6351328B2

JP6351328B2 - 高付加価値脂質の生産方法

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Publication number: JP6351328B2
Application number: JP2014066844A
Authority: JP
Inventors: 秋　庸裕; 庸裕秋; 豊中島田; 好子岡村; 幸彦松村
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2018-07-04
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: JP2015188342A

Description

本発明は高付加価値脂質の生産方法に関する。

ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アスタキサンチン、スクアレン等の高付加価値脂質の需要が高まっている。しかし、これらの高付加価値脂質は、天然から安全に且つ安定的に得ることが難しいことから、微生物によって高付加価値脂質を発酵生産する方法が検討されている。

例えば、引用文献１には、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース等のポリオール類を有する培地で、クリプテコディニウム・コーニー等の海洋性微細藻類を培養することによって、藻体が安定して増殖し、藻体の脂質中のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の含量が顕著に上昇することが記載されている。

高付加価値脂質の発酵生産に利用する微生物として、高付加価値脂質の生産能力に優れることから、ラビリンチュラ類オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属微生物が注目されている。

例えば、引用文献２には、オーランチオキトリウム属微生物等の従属栄養微生物を、窒素および炭素の含有量が異なる２種類の培地を用いて段階的に培養することによって、従属栄養微生物に効率よく油脂を生産させることができ、より短期間で大量に油脂を生産することができることが記載されている。引用文献３には、オーランチオキトリウム属微生物等の従属栄養微生物を、糖類およびグリセリンの含有量が異なる２種類の培地を用いて段階的に培養することによって、より短期間で大量に油脂を生産できることが記載されている。

特開平７−８７９８８号公報（１９９５年４月４日公開）特開２０１３−１２６４０４号公報（２０１３年６月２７日公開）特開２０１３−１８３６８７号公報（２０１３年９月１９日公開）

ところで、大型藻類は海洋に多量に存在する未利用資源であり、低炭素かつ持続可能な資源として注目されている。大型藻類は、穀物等の食糧供給と競合しないため、資源として安定的な供給が可能である。また、土地利用の観点でも、大型藻類は穀物等の食糧供給と競合しない上に、外洋や海岸線の有効利用にも繋がる。このため、海洋バイオマスとしての大型藻類の有効活用が望まれている。コンブ等の褐藻綱藻類は、アルギン酸塩やマンニトールを多く含んでいる（図１の（ａ））。これまでに、海洋バイオマスとして、アルギン酸塩を利用する試みはあるが、マンニトールはあまり利用されていない。

上述したように、高付加価値脂質の発酵生産に利用する微生物として、オーランチオキトリウム属微生物が注目されているが、オーランチオキトリウム属微生物は、マンニトールを炭素源として直接利用することができない。高付加価値脂質の発酵生産においてマンニトールを炭素源として利用することが可能となれば、高付加価値脂質の高まる需要を満たす供給源として大型藻類に由来するマンニトールを利用できる上に、高付加価値脂質の低価格化によるさらなる需要増大も期待できる。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、マンニトールを炭素源として利用して、オーランチオキトリウム属微生物において高付加価値脂質を生産する方法を提供することにある。

本発明者らは、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを組み合わせて培養することにより、マンニトールを炭素源として利用して、オーランチオキトリウム属微生物において高付加価値脂質を生産することができること、およびフルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを組み合わせて培養する際に、これらの微生物の塩類要求性の差を利用することによって、フルクトース生成微生物の生育を制御しつつ、オーランチオキトリウム属微生物を増殖させるような複合培養系を容易に実現できることを初めて見出し、かかる新規知見に基づいて本発明を完成させるに至った。

つまり、上記の課題を解決するために、本発明に係る高付加価値脂質の生産方法は、（ａ）マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地に、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを植菌して培養するか、または（ｂ）当該培養培地に当該フルクトース生成微生物を植菌し培養した後に、当該オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養する、培養工程と、
塩化ナトリウムを上記培養培地に添加する、塩化ナトリウム添加工程と、
を包含し、
上記フルクトース生成微生物は、マンニトールをフルクトースに変換し、且つ当該フルクトースを菌体外に分泌可能な微生物であり、
上記塩化ナトリウム添加工程は、上記培養培地中の上記マンニトールのフルクトースへの変換率が５０％以上になったときに行われ、
上記塩化ナトリウムは、上記培養培地における最終濃度が、上記オーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度で、且つ上記フルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度となるように、上記培養培地に添加されることを特徴としている。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記フルクトース生成微生物は、グルコノバクター属細菌であることが好ましい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記塩化ナトリウム添加工程では、上記塩化ナトリウムは、上記培養培地における最終濃度が１〜４％（ｗ／ｖ）となるように、上記培養培地に添加されてもよい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記フルクトース生成微生物に作用する抗生物質を上記培養培地に添加する抗生物質添加工程をさらに包含し、
上記抗生物質添加工程は、上記培養培地中の上記マンニトールのフルクトースへの変換率が５０％以上になったときに行われてもよい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記培養工程において、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地において前培養された、フルクトース生成微生物を培養培地に植菌することが好ましい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記培養培地は、マンニトールのみを炭素源として含有していることが好ましい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記培養培地は、褐藻綱藻類抽出物を含有していてもよい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記褐藻綱藻類は、コンブ科藻類であり得る。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記培養工程が（ｂ）である場合において、上記塩化ナトリウム添加工程後に、上記オーランチオキトリウム属微生物を上記培養培地に植菌してもよい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記培養工程が（ｂ）である場合において、上記フルクトース生成微生物の培養上清に、上記オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養してもよい。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法では、上記オーランチオキトリウム属微生物は、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium sp. KH105、受領番号：ＦＥＲＭＡＰ−２２２６７）であり得る。

本発明に係る高付加価値脂質の生産方法によれば、マンニトールを炭素源として利用して、オーランチオキトリウム属微生物によって高付加価値脂質を生産することができる。このため、大型藻類に由来するマンニトールを、高付加価値脂質を生産するための原料として利用することができる。これにより、未利用資源であった大型藻類の有効活用が可能となるという効果を奏する。さらには、原料の低価格化により高付加価値脂質の供給価格の低減が可能となるという効果を奏する。

また、本発明に係る高付加価値脂質の生産方法によれば、培地に添加する塩化ナトリウムの濃度および添加のタイミングを制御するだけで、フルクトース生成微生物の生育を制御しつつ、オーランチオキトリウム属微生物を増殖させるような複合培養系を容易に実現することができる。これにより、高付加価値脂質を、より簡単且つ効率よく生産することができるようになり、その結果、高付加価値脂質の大量生産が可能となるという効果を奏する。

（ａ）は、褐藻綱藻類に特異的な糖類および単糖類の成分を示す図であり、（ｂ）は、Aurantiochytrium sp. KH105の各糖類を資化する能力を示すグラフである。（ａ）は、マンニトールを含有している培養培地における Gluconobacter oxydans（NBRC 14819）の増殖、糖類の消費量および糖類の生成量を示すグラフであり、（ｂ）は、異なる培養時間に回収したG. oxydans（NBRC 14819）の培養上清を含む培地中でのAurantiochytrium sp. KH105の増殖を示すグラフである。（ａ）は、異なる濃度のマンニトールを含有しているグルコノバクター培地中でG. oxydans（NBRC 14819）を増殖させた場合の６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）を示すグラフであり、（ｃ）は、その時の培地のｐＨの変化を示すグラフである。（ｂ）は、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖に対する人工海水の塩濃度の影響を示すグラフであり、（ｄ）は、その時の培地のｐＨの変化を示すグラフである。（ａ）は、マンニトール−ＰＹ培地またはコンブ抽出物−ＰＹ培地中でG. oxydans（NBRC 14819）を培養した後の培養液を用いてAurantiochytrium sp. KH105を培養した場合の、フラスコスケールの試験におけるAurantiochytrium sp. KH105の脂肪酸生産量を示すグラフであり、（ｂ）は、カロテノイドの生産量を示すグラフである。（ａ）は、コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いてジャー・ファーメンタースケールでの二段階発酵を行った場合の、吸光度、細胞の乾燥重量、マンニトール濃度およびフルクトース濃度の変化を示すグラフであり、（ｂ）は、脂肪酸の濃度の変化を示すグラフであり、（ｃ）は、カロテノイドの濃度の変化を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また本書における「％」は特記しない限りにおいて、「％（ｗ／ｖ）」を意味する。

〔１．高付加価値脂質の生産方法〕
本発明に係る高付加価値脂質の生産方法（以下、「本発明の高付加価値脂質の生産方法」と称する。）は、（ａ）マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地に、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを植菌して培養するか、または（ｂ）当該培養培地に当該フルクトース生成微生物を植菌し培養した後に、当該オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養する、培養工程と、塩化ナトリウムを上記培養培地に添加する、塩化ナトリウム添加工程と、を少なくとも包含している。

ここで、本明細書において「高付加価値脂質」とは、オーランチオキトリウム属微生物によって生産可能な脂質の内、特に機能性が高いものを意味し、例えば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、オレイン酸（ＯＡ）、リノール酸（ＬＡ）、リノレン酸、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ジホモ-γ-リノレン酸（ＤＧＬＡ）等の不飽和脂肪酸；アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、β−カロテン、リコペン等のカロテノイド；スクアレン、ステロール等の炭化水素化合物等が、高付加価値脂質として挙げられる。

（１−１．培養工程）
培養工程は、（ａ）マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地に、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを植菌して培養するか、または（ｂ）当該培養培地に当該フルクトース生成微生物を植菌し培養した後に、当該オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養する工程である。

ここで、上記「フルクトース生成微生物」としては、マンニトールをフルクトースに変換し、且つ当該フルクトースを菌体外に分泌可能な微生物であれば特に限定されない。なお、上記「微生物」は、原核生物であってもよく、真核生物であってもよい。

対象微生物がマンニトールをフルクトースに変換し、且つ当該フルクトースを菌体外に分泌可能な微生物であるか否かを確認する方法（フルクトース生成微生物確認方法）としては、例えば、マンニトールを含有している培地中で対象微生物のみを培養し、培養終了後の培地に含まれているマンニトールおよびフルクトースの量を測定する。その結果、培養終了後の培地中に含まれているマンニトールの量が、培養開始前の培地中に含まれているマンニトールの量よりも減少しており、且つ培養終了後の培地中に含まれているフルクトースの量が、培養開始前の培地中に含まれているフルクトースの量よりも増加している場合に、対象微生物がマンニトールをフルクトースに変換し、且つ当該フルクトースを菌体外に分泌可能な微生物であると判断することができる。

培地中のマンニトールおよびフルクトースの量は、例えば、Sugar-D Cosmosilカラム（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いて、オーブン温度を４０℃、検出器温度を３９℃に設定し、溶離液として１．０ｍｌ／分の流速に設定したアセトニトリル：Ｈ_２Ｏ（７５：２５，ｖ／ｖ）を用いて測定することができる。

フルクトース生成微生物確認方法において対象微生物を培養する培地は、マンニトール以外に、対象微生物が増殖するために必要な成分を少なくとも含有しているものであれば特に限定されない。培養条件（温度、時間等）は、対象微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、対象微生物の増殖曲線が対数増殖期から定常期に移行する前に培養を終了することが好ましい。

このような「フルクトース生成微生物」としては、特に限定されないが、例えば、グルコノバクター属細菌、アセトバクター属細菌（参考文献：米国特許4734366）、グルコノアセトバクター属細菌（参考文献：Oikawa et al. (1997) Biosci Biotechnol Biochem, 61, 1778-82）等を挙げることができる。グルコノバクター属細菌は、フルクトースの菌体外への放出率が高いため好ましい。

上記「グルコノバクター属細菌」としては、特に限定されないが、例えば、Gluconobacter oxydansを挙げることができる。Gluconobacter oxydansとしては、特に限定されるものではなく、保存機関（ＮＢＲＣ、ＪＣＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に保存され、当業者が入手可能な株を利用することが可能である。例えば、NBRC 14819株、JCM 7642株、 IFO 12528株、ATCC 15163株等が本発明において利用可能である。

また、上記「オーランチオキトリウム属微生物」としては、ラビリンチュラ類オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に分類される微生物であれば特に限定されない。例えば、Aurantiochytrium sp. KH105（受領番号：ＦＥＲＭＡＰ−２２２６７）を挙げることができる。なお、上記「オーランチオキトリウム属微生物」は、「シゾキトリウム（Schizochytrium）属微生物」とも称される。

上記「培養工程」において使用する上記「培養培地」は、フルクトース生成微生物の培養開始時点で、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有していればよい。上記「培養培地」は、特に限定されないが、大量培養に適していること、培養条件を制御しやすいこと等の理由から、液体培地であることが好ましい。

上記「マンニトール」としては、マンニトールの単体であってもよく、マンニトールと他の物質との混合物であってもよい。また、上記「マンニトール」は、天然供給源より抽出されたものであってもよく、化学合成されたものであってもよく、微生物等によって生産されたものであってもよい。

培養培地に添加するマンニトールの濃度は、５〜２００ｇ／Ｌであることが好ましく、３０〜２００ｇ／Ｌであることがより好ましい。培養培地中のマンニトール濃度が５ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物の培養上清を利用してオーランチオキトリウム属微生物が成育することができる。また、培養培地中のマンニトール濃度が３０ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物の培養上清を利用してオーランチオキトリウム属微生物が成育し、高濃度の高付加価値脂質を生産することができる。なお、培養培地におけるマンニトールの上記濃度は、フルクトース生成微生物の培養開始前の濃度である。

マンニトールは、炭素源として培養培地に添加されるが、上記「培養培地」は、マンニトールの他の炭素源を含んでいてもよい。上記「他の炭素源」としては、フルクトース生成微生物および／またはオーランチオキトリウム属微生物が資化し得るものであれば特に限定されず、例えば、炭水化物（単糖、オリゴ糖、多糖、糖アルコール等）、有機酸、アルコール類、脂質類等を挙げることができる。他の炭素源としては、一種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。他の炭素源を培養培地に添加する場合は、培養培地に添加する他の炭素源の濃度は、５〜１００ｇ／Ｌであることが好ましく、５０〜１００ｇ／Ｌであることがより好ましい。培養培地中の他の炭素源の濃度が５ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物が当該炭素源のみを利用して生育することができる。また、培養培地中の他の炭素源の濃度が５０ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物が当該炭素源のみを利用してより高度に生育することができる。なお、培養培地における他の炭素源の上記濃度は、フルクトース生成微生物の培養開始前の濃度である。他の炭素源として、複数種類を組み合わせて用いる場合は、複数種類の他の炭素源の総濃度が上記範囲になるように、他の炭素源を培養培地に添加すればよい。

培養培地がマンニトール以外の炭素源を含有している場合に、フルクトース生成微生物が、その炭素源をマンニトールよりも優先的に利用することによって、マンニトールからフルクトースへの転換率が低下する場合がある。このため、フルクトース生成微生物によってマンニトールをフルクトースに効率よく転換させる観点から、上記「培養培地」は、フルクトース生成微生物によってマンニトールよりも優先的に利用される炭素源を含有していないことが好ましい。フルクトース生成微生物によってマンニトールよりも優先的に利用される炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース等を挙げることができる。よって、上記「培養培地」は、グルコース、ガラクトース、マンノース等を含有していないことが好ましく、グルコースを含有していないことがより好ましく、炭素源としてマンニトールのみを含有していることがさらに好ましい。これにより、培養培地に含まれているマンニトールを、フルクトース生成微生物によってフルクトースに効率よく転換させることができる。ただし、フルクトース生成微生物によって、優先的に利用されうるマンニトール以外の炭素源が完全に枯渇するまで培養し、その後にマンニトールを添加すれば、マンニトールからフルクトースへの転換率を低下させずに目的を達成することも可能である。

上記「窒素源」としては、フルクトース生成微生物および／またはオーランチオキトリウム属微生物が資化し得るものであれば特に限定されず、例えば、ポリペプトン、酵母エキス、ペプトン、大豆粉、コーンスティープリカー等の含窒素化合物；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩等を挙げることができる。窒素源としては、一種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。

培養培地に添加する窒素源の濃度は、１〜５０ｇ／Ｌであることが好ましく、５〜２０ｇ／Ｌであることがより好ましい。培養培地中の窒素源濃度が１ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物が良好に成育することができる。また、培養培地中の窒素源濃度が５ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物が良好に成育することができる。なお、培養培地における窒素源の上記濃度は、フルクトース生成微生物の培養開始前の濃度である。窒素源として、複数種類を組み合わせて用いる場合は、複数種類の窒素源の総濃度が上記範囲になるように、窒素源を培養培地に添加すればよい。

上記「培養培地」には、炭素源および窒素源以外の他の成分を含有していてもよい。上記「他の成分」としては、微生物の培養に一般的に用いられるものであれば特に限定されず、例えば、無機塩類、ビタミン等の補酵素、色素類等を挙げることができる。培養培地における上記「他の成分」の濃度は、適宜設定することができる。

上述したような「培養培地」としては、例えば、後述する実施例で用いたマンニトール−ＰＹ培地（３０ｇ／Ｌマンニトール，１０ｇ／Ｌポリペプトン，５ｇ／Ｌ酵母エキス（ｐＨ６．０））を好適に用いることができる。

上記「培養培地」は、褐藻綱藻類抽出物を含有していてもよい。上記「褐藻綱藻類抽出物」とは、褐藻綱藻類由来の成分として少なくともマンニトールを含有しているものであればよい。上記褐藻綱藻類抽出物中のマンニトールの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いて確認することができる。

上記「褐藻綱藻類抽出物」の調製方法としては、褐藻綱藻類からマンニトールを抽出可能な方法であれば特に限定されない。例えば、Khomtimchenko, S.V. & Kulikova, I.V. 1999. Lipids of two species of brown algae of the genus Laminaria. Chem Nat Prod, 35(1), 17-20.に記載された方法の改変法に従って調製することができる。具体的には、褐藻綱藻類の乾燥粉末を蒸留水に添加し、２０分間撹拌した後に、遠心分離し、上清を回収することによって褐藻綱藻類抽出物を調製することができる。褐藻綱藻類の乾燥粉末は、例えば、褐藻綱藻類を風乾したのちに粉砕することによって調製することができる。褐藻綱藻類は風乾したのちにブレンダーによって断片化したものでもよく、また、風乾せずに湿藻体のまま用いてもよい。褐藻綱藻類抽出物は、一種類の褐藻綱藻類のみから調製されたものを用いてもよく、複数種類の褐藻綱藻類から調製されたものを組み合わせて用いてもよい。

また、上記「褐藻綱藻類抽出物」におけるマンニトールの純度は特に限定されない。しかし、褐藻綱藻類抽出物中には、フルクトース生成微生物および／またはオーランチオキトリウム属微生物に対して特定の作用を及ぼす成分が含まれている可能性がある。例えば、後述する実施例では、コンブ抽出物には、グルコノバクター属細菌のマンニトールからフルクトースへの変換効率に負の影響を及ぼす成分や、オーランチオキトリウム属微生物の増殖を促進する成分が含まれている可能性が示唆された。よって、高付加価値脂質の生産において、褐藻綱藻類抽出物中に含まれているマンニトール以外の成分の影響を低減させるために、褐藻綱藻類抽出物は、さらなる精製を行ってマンニトールの純度を高めたものを用いてもよい。

上記「培養培地」が、褐藻綱藻類抽出物を含有している場合は、マンニトール源として褐藻綱藻類抽出物のみを含有していてもよく、褐藻綱藻類抽出物以外のものに由来するマンニトールをさらに含有していてもよい。

培養培地に添加する褐藻綱藻類抽出物の濃度は、褐藻綱藻類抽出物に含まれているマンニトール換算で、５〜２００ｇ／Ｌであることが好ましく、３０〜２００ｇ／Ｌであることがより好ましい。培養培地中の褐藻綱藻類抽出物の濃度が５ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物の培養上清を利用してオーランチオキトリウム属微生物が成育することができる。また、培養培地中の褐藻綱藻類抽出物の濃度が３０ｇ／Ｌ以上であれば、フルクトース生成微生物の培養上清を利用してオーランチオキトリウム属微生物が成育し、高濃度の高付加価値脂質を生産することができる。なお、培養培地における褐藻綱藻類抽出物の上記濃度は、フルクトース生成微生物の培養開始前の濃度である。

褐藻綱藻類抽出物の原料となる「褐藻綱藻類」としては、マンニトールを抽出可能な藻類であれば特に限定されず、例えば、コンブ目コンブ科藻類、コンブ目チガイソ科、ヒバマタ目ホンダワラ科等を挙げることができる。

上記「コンブ目コンブ科藻類」としては、特に限定されず、例えば、マコンブ（Laminaria japonica）等のカラフトコンブ属のほか、ゴヘイコンブ属、ネコアシコンブ属等に属する藻類を挙げることができる。

培養工程では、以下の２種類の培養法の内のどちらかを行えばよい。

（ｉ）第１の実施形態（培養法（ａ））
第１の実施形態では、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地に、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを植菌して培養する。つまり、第１の実施形態では、フルクトース生成微生物の培養開始時には、培養培地中にオーランチオキトリウム属微生物が存在している。

第１の実施形態では、上記培養培地に対して、フルクトース生成微生物をオーランチオキトリウム属微生物よりも先に植菌してもよいし、オーランチオキトリウム属微生物をフルクトース生成微生物よりも先に植菌してもよいし、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを同時に植菌してもよい。

（ｉｉ）第２の実施形態（培養法（ｂ））
第２の実施形態では、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地にフルクトース生成微生物を植菌し培養した後に、オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養する。つまり、第２の実施形態では、フルクトース生成微生物の培養開始時には、培養培地中にオーランチオキトリウム属微生物が存在しておらず、フルクトース生成微生物の培養開始から一定時間経過した後に、フルクトース生成微生物を培養している培養液に、オーランチオキトリウム属微生物を植菌する。

この場合、オーランチオキトリウム属微生物を植菌するタイミングとしては特に限定されないが、塩化ナトリウム添加工程（後述する）後に、オーランチオキトリウム属微生物を培養培地に植菌することが好ましい。オーランチオキトリウム属微生物は、０．５〜４％、好ましくは１．５〜３％の塩化ナトリウムを含有している培地中で好適に増殖することができる。このため、塩化ナトリウム添加工程後に、オーランチオキトリウム属微生物を培養培地に植菌することによって、増殖により適した条件でオーランチオキトリウム属微生物の培養を開始することができる。

また、第２の実施形態では、フルクトース生成微生物の培養上清に、オーランチオキトリウム属微生物を植菌して培養してもよい。

なお、培養培地中のマンニトールおよび窒素源は、フルクトース生成微生物によって消費されるので、追加供給しない限りは、フルクトース生成微生物の培養の間に培養培地中のマンニトールおよび窒素源は減少する。このため、第２の実施形態では、オーランチオキトリウム属微生物を植菌した時点では、培養培地中にマンニトールおよび窒素源が含まれていなくてもよい。

培養工程では、必要に応じて、培養培地に窒素源を適宜追加供給してもよい。

培養工程では、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地において前培養された、フルクトース生成微生物を培養培地に植菌することが好ましい。フルクトース生成微生物の前培養に用いる培養培地は、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有していれば特に限定されないが、培養工程に用いる培養培地と同じ組成の培地であることが好ましい。また、前培養に用いる培養培地は、炭素源としてグルコースを含有していないものであることが好ましい。これにより、培養工程において、フルクトース生成微生物によってマンニトールをより効率よくフルクトースに変換させることができる。

また、培養工程では、前培養されたオーランチオキトリウム属微生物を培養培地に植菌してもよい。オーランチオキトリウム属微生物の前培養に用いる培養培地は、特に限定されないが、グルコースと窒素源とを少なくとも含有している培養培地であることが好ましい。例えば、３％ＧＰＹ培地（３０ｇ／Ｌグルコース，６ｇ／Ｌポリペプトン，２ｇ／Ｌ酵母エキス，２０ｇ／Ｌ海塩，２０ｇ／Ｌ寒天）を用いることができる。また、オーランチオキトリウム属微生物の前培養する際の培養条件は特に限定されないが、例えば、上記３％ＧＰＹ培地中で、２８℃にて、振とうしながら２日間培養すればよい。

（１−２．塩化ナトリウム添加工程）
塩化ナトリウム添加工程は、塩化ナトリウムを上記培養培地に添加する工程である。なお、培養培地中のマンニトールはフルクトース生成微生物によって消費され、培養培地中の窒素源はフルクトース生成微生物およびオーランチオキトリウム属微生物によって消費されるので、追加供給しない限りは、これらの微生物の培養の間に培養培地中のマンニトールおよび窒素源は減少する。このため、塩化ナトリウム添加工程において、塩化ナトリウムを上記培養培地に添加した時点では、培養培地中にマンニトールおよび窒素源が含まれていなくてもよい。

塩化ナトリウム添加工程は、上記培養培地中のマンニトールのフルクトースへの変換率が５０％以上になったときに行われる。「マンニトールのフルクトースへの変換率」は、フルクトース生成微生物の培養時のマンニトール初期濃度に対する、フルクトース生成量を意味する。

ここで、フルクトース生成微生物の培養を開始してｔ時間後のマンニトールのフルクトースへの変換率（以下、「変換率」と称する。）は、以下の式（１）で表される。

変換率（％）＝フルクトース生成量／マンニトールの初発濃度×１００ … （１）
（上記式（１）中、「フルクトース生成量」は、フルクトース生成微生物の培養を開始してｔ時間後のフルクトース生成量を意味し、「マンニトールの初発濃度」は、フルクトース生成微生物の培養開始前の培養培地中のマンニトールの濃度を意味する。）
上記「マンニトールの初発濃度」および上記「ｔ時間後のフルクトース濃度」は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置等を用いて従来公知の方法により確認することができる。

塩化ナトリウム添加工程では、塩化ナトリウムは、上記培養培地における最終濃度が、オーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度で、且つフルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度となるように、上記培養培地に添加される。

ここで、上記「オーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度」とは、その濃度の塩化ナトリウムを含んでいる培養培地中でオーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度であればよく、オーランチオキトリウム属微生物が活発に増殖できる濃度でなくともよい。例えば、ａ％の塩化ナトリウムを含んでいる培養培地中でオーランチオキトリウム属微生物を一定期間（例えば、１２時間）培養した後に、培養液中のオーランチオキトリウム属微生物の細胞数が培養前よりも増加していれば、この濃度「ａ％」が「オーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度」であるといえる。

また、上記「フルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度」とは、塩化ナトリウムを含んでいない培養培地におけるフルクトース生成微生物の増殖率を１００％とした場合に、その濃度の塩化ナトリウムを含んでいる培養培地中におけるフルクトース生成微生物の増殖率が、８０％以下となる濃度、好ましくは５０％以下となる濃度、より好ましくは２０％以下となる濃度、さらに好ましくは１％以下となる濃度、最も好ましくは限りなく０％に近くなる濃度であればよい。

「オーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度で、且つフルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度」は、特に限定されないが、１〜４％（ｗ／ｖ）、好ましくは１．５〜３％（ｗ／ｖ）、より好ましくは２〜２．５％（ｗ／ｖ）である。培養培地に添加する塩化ナトリウムの最終濃度が上記範囲であれば、オーランチオキトリウム属微生物を生育させつつ、フルクトース生成微生物の生育を阻害することができる。その結果、高付加価値脂質を効率よく生産することができる。

上記「塩化ナトリウム」としては、塩化ナトリウムの単体であってもよく、塩化ナトリウムと他の物質との混合物であってもよい。上記「塩化ナトリウムと他の物質との混合物」としては、例えば、海塩、岩塩等を挙げることができる。オーランチオキトリウム属微生物が天然において生育する海水では、ナトリウム以外のミネラルも存在することから、海塩を用いることが好ましい。

なお、上記「塩化ナトリウム」として塩化ナトリウムと他の物質との混合物を添加する場合は、塩化ナトリウム換算で、培養培地における最終濃度が上記範囲となるように添加すればよい。

海塩や岩塩等は、一種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。海塩や岩塩等を複数種類組み合わせて用いる場合は、塩化ナトリウムの総濃度が上記範囲になるように培養培地に添加すればよい。

グルコノバクター属細菌等のフルクトース生成微生物は、高濃度塩類の存在下では生育できないが、オーランチオキトリウム属微生物は、むしろ、海水塩濃度か、その半量程度の塩類を要求する。本発明の高付加価値脂質の生産方法では、この塩類要求性の差を利用して塩化ナトリウム添加工程を包含することによって、グルコノバクター属細菌等のフルクトース生成微生物の生育を制御しつつ、オーランチオキトリウム属微生物を増殖させるような複合培養系を容易に実現することができる。

（１−３．抗生物質添加工程）
本発明の高付加価値脂質の生産方法は、フルクトース生成微生物に作用する抗生物質を上記培養培地に添加する、抗生物質添加工程をさらに包含していてもよい。フルクトース生成微生物に作用する抗生物質を上記培養培地に添加することによって、フルクトース生成微生物の生育を阻害することができる。一方、オーランチオキトリウム属微生物は、抗生物質耐性である。このため、本発明の高付加価値脂質の生産方法では、この抗生物質の作用性の差を利用して抗生物質添加工程をさらに包含することによって、グルコノバクター属細菌等のフルクトース生成微生物の生育を制御しつつ、オーランチオキトリウム属微生物を増殖させるような複合培養系を容易に実現することができる。

ここで、上記「フルクトース生成微生物に作用する抗生物質」としては、フルクトース生成微生物に作用するものである限り特に限定されないが、例えば、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質；ペニシリン、アンピシリン等のβ−ラクタム系抗生物質等を挙げることができる。上記抗生物質としては、一種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。ただし、オーランチオキトリウム属微生物に作用する抗生物質を作用濃度以上に用いることはできない。

培養培地に添加する上記抗生物質の濃度は、フルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度であれば特に限定されず、使用する抗生物質の種類によって適宜設定することができる。上記「フルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度」とは、上記抗生物質を含んでいない培養培地におけるフルクトース生成微生物の増殖率を１００％とした場合に、その濃度の上記抗生物質を含んでいる培養培地中におけるフルクトース生成微生物の増殖率が、８０％以下となる濃度、好ましくは５０％以下となる濃度、より好ましくは２０％以下となる濃度、さらに好ましくは１％以下となる濃度、最も好ましくは限りなく０％に近くなる濃度であればよい。

抗生物質添加工程は、上記培養培地中の上記マンニトールのフルクトースへの変換率が５０％以上になったときに行われる。上記「マンニトールのフルクトースへの変換率」は、上記「２．塩化ナトリウム添加工程」の項で説明したとおりである。

抗生物質添加工程は、上記塩化ナトリウム添加工程の前に行ってもよく、上記塩化ナトリウム添加工程の後に行ってもよく、上記塩化ナトリウム添加工程と同時に行ってもよい。

（１−４．その他の工程）
本発明の高付加価値脂質の生産方法は、上述した工程以外の工程をさらに包含していてもよい。

（ｉ）前培養工程
本発明の高付加価値脂質の生産方法は、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地においてフルクトース生成微生物を前培養する、前培養工程を包含していてもよい。

前培養工程で用いる上記培養培地としては、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有していれば特に限定されないが、培養工程に用いる培養培地と同じ組成の培地であることが好ましい。また、前培養工程で用いる上記培養培地は、炭素源としてグルコースを含有していないものであることが好ましい。これにより、マンニトールをフルクト―スに変換する酵素がフルクト―ス生成微生物においてより多く生産されることが期待され、培養工程において、当該フルクトース生成微生物によってマンニトールをより効率よくフルクトースに変換させることができる。

前培養工程におけるフルクトース生成微生物の培養条件は特に限定されないが、例えば、マンニトール−ＰＹ培地（３０ｇ／Ｌマンニトール，１０ｇ／Ｌポリペプトン，５ｇ／Ｌ酵母エキス（ｐＨ６．０））中で、２８℃にて、振とうしながら２４時間培養すればよい。

（ｉｉ）高付加価値脂質回収工程
本発明の高付加価値脂質の生産方法は、高付加価値脂質を回収する、高付加価値脂質回収工程をさらに含有していてもよい。高付加価値脂質回収工程では、（ａ）高付加価値脂質をオーランチオキトリウム属微生物の菌体外に取り出してもよく、（ｂ）高付加価値脂質がオーランチオキトリウム属微生物の菌体内に蓄積された状態で回収してもよい。

上記（ａ）の場合、高付加価値脂質の回収方法は、高付加価値脂質をオーランチオキトリウム属微生物の菌体外に取り出すことができる限りは特に限定されない。例えば、ヘキサンやクロロホルム／メタノール混液（２：１，ｖ／ｖ）を用いることによって、オーランチオキトリウム属微生物から脂肪酸を抽出することができる。抽出した脂肪酸は、その後エステル化してもよい。また、例えば、アセトン／メタノール混液（７：３，ｖ／ｖ）を用いることによって、オーランチオキトリウム属微生物からカロテノイドを抽出することができる。また、例えば、ヘキサンやクロロホルム／メタノール混液（２：１，ｖ／ｖ）を用いることによって、オーランチオキトリウム属微生物からスクアレンを抽出することができる。

上記（ｂ）の場合、回収方法は、高付加価値脂質がオーランチオキトリウム属微生物の菌体内に蓄積された状態で回収できる限りは特に限定されない。例えば、オーランチオキトリウム属微生物を培養した培養液を遠心分離し、培養上清を廃棄することによって、高付加価値脂質含有菌体を回収することができる。

（ｉｉｉ）高付加価値脂質精製工程
本発明の高付加価値脂質の生産方法は、高付加価値脂質を精製する工程をさらに含有していてもよい。高付加価値脂質を精製する方法としては特に限定されないが、例えば、溶媒分画、超臨界流体抽出、吸着クロマトグラフィー等の方法によって、高付加価値脂質を精製することができる。

〔２．高付加価値脂質〕
本発明によって生産された高付加価値脂質は、高付加価値脂質を素材として利用する食品、化粧品および医薬品製造分野；炭化水素（テルペン類）を燃料として利用する産業分野；高付加価値脂質含有菌体を飼料として利用する水産分野および畜産分野；等に利用することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

＜培地＞
・グルコノバクター培地：４０ｇ／Lマンニトール、５ｇ／L酵母エキス、２．５ｇ／L硫酸マグネシウム７水和物、１ｇ／L硫酸アンモニウム、１ｇ／Lリン酸一カリウム二水素
・マンニトール培地（マンニトール−ＰＹ培地）：３０ｇ／Ｌマンニトール，１０ｇ／Ｌポリペプトン，５ｇ／Ｌ酵母エキス（ｐＨ６．０）
・３％グルコース−ポリペプトン−酵母エキス培地（３％ＧＰＹ培地）：３０ｇ／Ｌグルコース，６ｇ／Ｌポリペプトン，２ｇ／Ｌ酵母エキス，２０ｇ／Ｌ海塩，２０ｇ／Ｌ寒天（ただし、寒天は固体培地の場合のみ添加する）
・コンブ抽出物−ＰＹ培地：１０％（ｗ／ｖ）コンブ抽出物，１０ｇ／Ｌポリペプトン，５ｇ／Ｌ酵母エキス，ｐＨ６．０
・ポリペプトン−酵母エキス培地（ＰＹ培地）：６ｇ／Ｌポリペプトン，２ｇ／Ｌ酵母エキス，２０ｇ／Ｌ海塩
・１％グルコース−ポリペプトン−酵母エキス培地（１％ＧＰＹ培地）：１０ｇ／Ｌグルコース，６ｇ／Ｌポリペプトン，２ｇ／Ｌ酵母エキス，２０ｇ／Ｌ海塩
・濃縮ＰＹ培地：０．６ｇポリペプトン，０．２ｇ酵母エキス，２ｇ海塩，７０ｍｌ蒸留水，ｐＨ６．０，１ｍｌ抗生物質：抗真菌剤混合物
なお、上記培地に添加したマンニトールは、ナカライテスク社製の２１３０３−３２（品番）を使用し、ポリペプトンは、和光純薬製の３９２−０２１１５（品番）を使用し、酵母エキスは、極東製薬製の５５１−０１３１０−８（品番）を使用し、海塩は、シグマ・アルドリッチ社製のＳ９８８３（品番）を使用し、グルコースは、ナカライテスク社製の１６８０５−６４（品番）を使用し、抗生物質：抗真菌剤混合物は、ナカライテスク社製の０９３６６−４４（品番）を使用した。

なお上記海塩に含まれるナトリウムが全て塩化物として存在するとすれば、１ｇの海塩に含まれる塩化ナトリウムは０．７２ｇとなる。

また、上記培地に添加したコンブ抽出物は、Khomtimchenko, S.V. & Kulikova, I.V. 1999. Lipids of two species of brown algae of the genus Laminaria. Chem Nat Prod, 35(1), 17-20.に記載された方法の改変法に従って調製した。具体的には、蒸留水に濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるように乾燥コンブ粉末を添加し、２０分間撹拌した後に、遠心分離し、上清を回収した。抽出物のマンニトール濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いて測定した。乾燥コンブ粉末は、マコンブを風乾したのちに粉砕することによって調製した。

＜微生物＞
グルコノバクター属細菌としては、Biological Resource Center, NITE（ＮＢＲＣ）から取得したGluconobacter oxydans（NBRC 14819）を用いた。G. oxydans（NBRC 14819）は、試験培養を行う前に、マンニトール−ＰＹ培地中で、２８℃にて、振とうしながら２４時間前培養した。

オーランチオキトリウム属微生物としては、Aurantiochytrium sp. KH105株（受領番号：ＦＥＲＭＡＰ−２２２６７）を用いた。Aurantiochytrium sp. KH105は、試験培養を行う前に、３％ＧＰＹ培地中で、２８℃にて、振とうしながら２日間前培養した。

〔試験例１〕
図１の（ａ）は、褐藻綱藻類に特異的な糖類および単糖類の成分を示す図である。図１の（ａ）に示した褐藻綱藻類に由来する１２種類の糖類を、最終濃度が１％（ｗ／ｖ）となるように、それぞれＰＹ培地に添加した。Aurantiochytrium sp. KH105の発酵能は、２８℃にて、４日間振とう培養した後の６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）を測定することによって評価した。試験は、三つ組みの試験管にて行った。吸光度は、吸光度計（ＣＯ７５００、バイオクロム社製）を用いて測定した。

結果を図１の（ｂ）に示す。図１の（ｂ）は、Aurantiochytrium sp. KH105の各糖類を資化する能力を示すグラフである。Aurantiochytrium sp. KH105は、褐藻綱藻類に由来する１２種類の糖類の内、グルコースを含む４種類の単糖類をそれぞれ含有している培地中で良好に増殖した。これに対して、多糖類であるアルギン酸塩、フコイダンおよびラミナランをそれぞれ含有している培地中でAurantiochytrium sp. KH105を培養した場合は、糖類を全く含有していないＰＹ培地中で培養した場合（陰性対照）と比較して、吸光度に有意な差が認められなかった。また、Aurantiochytrium sp. KH105を、グルクロン酸塩を含有している培地中で培養した場合は、より低い吸光度を示した。これに対して、Aurantiochytrium sp. KH105を、フルクトースを含有している培地中で培養した場合は、グルコースを含有している培地中で培養した場合と比較して、有意に高い吸光度を示した。

〔試験例２〕
Aurantiochytrium sp. KH105を、G. oxydans（NBRC 14819）の培養上清（濃縮ＰＹ培地を添加したもの）中で増殖させた。

まず、G. oxydans（NBRC 14819）を、５００ｍｌのバッフル付フラスコを用いて、１７５ｍｌのグルコノバクター培地中で培養した。培養上清の吸光度（ＯＤ６００）の変化をモニタリングすることによって、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖を測定し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いて糖類の消費量、および糖類の生成量を測定した。具体的には、糖類の濃度は、Sugar-D Cosmosilカラム（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）を備えたＨＰＬＣを用いて、オーブン温度を４０℃、検出器温度を３９℃に設定し、溶離液として１．０ｍｌ／分の流速に設定したアセトニトリル：Ｈ_２Ｏ（７５：２５，ｖ／ｖ）を用いて行った。定量のための内部標準として、マルトースを使用した。

異なる培養時間において４．５ｍｌの培養上清を回収し、回収した培養上清を、それぞれ、１０．５ｍｌの濃縮ＰＹ培地に添加して混合した後に、３本の試験管に等量ずつ分注した。その後、Aurantiochytrium sp. KH105を植菌した。Aurantiochytrium sp. KH105を２８℃、１４０ｒｐｍにて４日間（９６時間）インキュベートした後に、吸光度（ＯＤ６００）を測定することによってAurantiochytrium sp. KH105の増殖を測定した。

結果を図２に示す。図２の（ａ）は、マンニトールを含有している培養培地におけるG. oxydans（NBRC 14819）の増殖、糖類の消費量および糖類の生成量を示すグラフである。図２の（ｂ）は、異なるタイムポイントで回収したG. oxydans（NBRC 14819）の培養上清中でのAurantiochytrium sp. KH105の増殖を示すグラフである。

１８時間培養後に、マンニトール（初発濃度：３２．０ｇ／Ｌ）は完全に消費され、フルクトース濃度は２８．０ｇ／Ｌの最大値となった（図２の（ａ））。これは、G. oxydans（NBRC 14819）によるマンニトールからフルクトースへの変換率が８７．５％であることを示している。

９時間培養後の培養上清中で、Aurantiochytrium sp. KH105は良好に増殖した。この時の培養上清中のフルクトース濃度は２０．５ｇ／Ｌ（濃縮ＰＹ培地を添加して２倍希釈する前の濃度）であった。９時間培養後の培養上清、１２時間培養後の培養上清、１５時間培養後の培養上清、１８時間培養後の培養上清、および２４時間培養後の培養上清におけるAurantiochytrium sp. KH105の最終的な吸光度は、ほぼ同じであった（図２の（ｂ））。

〔試験例３〕
G. oxydans（NBRC 14819）を、異なる濃度（４０ｇ／Ｌ，８０ｇ／Ｌ，１２０ｇ／Ｌ，１６０ｇ／Ｌ）のマンニトールを含有しているグルコノバクター培地中で培養して増殖速度への影響を調べた。３つのバッフル付きフラスコを用いて、前培養したG. oxydans（NBRC 14819）を５０ｍｌの上記培地に植菌し、その後、G. oxydans（NBRC 14819）を２８℃、１４０ｒｐｍにてインキュベートした。

結果を図３に示す。図３の（ａ）は、異なる濃度のマンニトールを含有しているグルコノバクター培地中でG. oxydans（NBRC 14819）を増殖させた場合の吸光度（ＯＤ６００）を示すグラフであり、図３の（ｃ）は、その時の培地のｐＨの変化を示すグラフである。図３の（ａ）のグラフ中に記載したエラーバーは、３回の反復試験の標準偏差を表している。

マンニトールの濃度を増加させても、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖速度は速くならず、実際は、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖が定常期に達するまでに要する培養時間が長くなった（図３の（ａ））。増殖が定常期に達した時点で、マンニトールが完全に消費されたと推測される。

また、培地中のマンニトールの濃度に関わらず、培地のｐＨは、培養期間に応じて同程度に低下した（図３の（ｃ））。これは、おそらく、培地中のマンニトールの濃度に関わらず、G. oxydans（NBRC 14819）による酢酸の生成量が同じであることを示唆している。

さらに、マンニトール培地（４０ｇ／Ｌマンニトール，１０ｇ／Ｌポリペプトン，５ｇ／Ｌ酵母エキスを含有）に種々の濃度の海塩を添加し、G. oxydans(NBRC 14819)の増殖に対する影響を調べた。

結果を図３に示す。図３の（ｂ）は、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖に対する海塩濃度の影響を示すグラフであり、図３の（ｄ）は、その時の培地のｐＨの変化を示すグラフである。図３の（ｂ）のグラフ中に記載したエラーバーは、３回の反復試験の標準偏差を表している。

海塩は、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖を阻害し、海塩の濃度が高くなるとその影響が強くなることが明らかになった（図３（ｂ））。培地中のｐＨの変化は、同じ傾向を示したが、海塩の濃度が１．８％（ｗ／ｖ）である場合に、培地中のｐＨはほとんど変化しなかった（図３（ｄ））。これは、海塩の濃度が１．８％（ｗ／ｖ）である場合に、G. oxydans（NBRC 14819）の増殖率が低下することを示唆している。

〔試験例４〕
５０ｍｌのマンニトール−ＰＹ培地またはコンブ抽出物−ＰＹ培地をバッフル付フラスコに入れ、G. oxydans（NBRC 14819）を植菌して、２８℃、１４０ｒｐｍにて、１２時間培養した。コントロールとして、G. oxydans（NBRC 14819）を植菌していないＰＹ培地および１％ＧＰＹ培地をインキュベートした。ここまでの工程を「ステージ１」とした。

ステージ１の後に、４％（ｗ／ｖ）の海塩溶液を、等量の各培養液に添加した。十分に混合した後に、混合物のｐＨを６〜７になるように調整した。試験管スケールの試験を行うために、各培養液の培養上清（G. oxydans（NBRC 14819）を取り除いた、遠心分離した培地）を試験管に移した。また、フラスコスケールの試験を行うために、各培養液（G. oxydans（NBRC 14819）を含む培地）をフラスコに移した。前培養および洗浄を行ったAurantiochytrium sp. KH105を、これらの培地に植菌して、２８℃、１４０ｒｐｍで振とうしながら４日間培養を行った。ここまでの工程を「ステージ２」とした。

６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）は、培養後に測定した。一方、糖類の濃度変化をモニタリングするために、全培養期間にわたって培地をサンプリングした。フラスコスケールの試験では、脂肪酸の生成およびカロテノイドの生成を確認した。

試験管スケールの試験の結果を表１に示す。表１は、マンニトール−ＰＹ培地またはコンブ抽出物−ＰＹ培地中でG. oxydans（NBRC 14819）を培養した後の培養上清を用いてAurantiochytrium sp. KH105を培養した場合の、試験管スケールの試験におけるAurantiochytrium sp. KH105の増殖および糖類の消費量を示している。

また、フラスコスケール試験の結果を表２に示す。表２は、マンニトール−ＰＹ培地またはコンブ抽出物−ＰＹ培地中でG. oxydans（NBRC 14819）を培養した後の培養液を用いてAurantiochytrium sp. KH105を培養した場合の、フラスコスケールの試験におけるAurantiochytrium sp. KH105の増殖および糖類の消費量を示している。誤差は、２回の反復試験の値に基づいている。

ステージ１では、マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合には、G. oxydans（NBRC 14819）によるマンニトールの消費率は、試験管スケールの試験では７３．８％であり、フラスコスケール試験では７６．９％であり、同程度の消費率でマンニトールを消費した（表１および２）。一方、コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合は、G. oxydans（NBRC 14819）によるマンニトールの消費率は、試験管スケールの試験では６７．８％であったのに対して、フラスコスケールの試験では８６．４％と、わずかに高かった。また、マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合には、G. oxydans（NBRC 14819）によってマンニトールがほぼ完全に消費されたのに対して、コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合には、消費されていないマンニトールが残存していた（表１および２）。

一方、Aurantiochytrium sp. KH105を植菌したステージ２では、試験管スケールの試験において、４日間の培養後にAurantiochytrium sp. KH105によって消費されたフルクトースは、マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合には７６．６％であったのに対して、コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合には９６．９％であり、より多くのフルクトースが消費されていた（表１および２）。

フラスコスケールの試験では、この効果は認められず、マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合およびコンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合の両方において、４日間のインキュベーション後にAurantiochytrium sp. KH105によってフルクトースが完全に消費されていた。この結果は、コンブ抽出物培地中の特定の成分が、G. oxydans（NBRC 14819）のマンニトールからフルクトースへの変換効率に負の影響を及ぼすのに対して、Aurantiochytrium sp. KH105の増殖は促進する可能性があることが考えられた。

４日間のインキュベーション後に、最終的な吸光度（ＯＤ６００）を測定した。フラスコスケールの試験では、試験管スケールの試験と比較して、吸光度が高かった。マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合およびコンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合の両方において、陽性対照（１％ＧＰＹ培地）と比較して、Aurantiochytrium sp. KH105の最終的な吸光度が高かった（フラスコスケールの試験では、陽性対照では、最終的な６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）は３．６３であった。）。

しかし、フラスコスケールの試験では、マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合の最終的な吸光度は４．９２であり、コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合の最終的な吸光度は５．０９であり、Aurantiochytrium sp. KH105の最終的な吸光度は同程度であった。ＨＰＬＣ解析の結果、フラスコスケールの試験では、培地中のフルクトースが完全に消費されていた（表２）。これに対して、試験管スケールの試験では、培地中にフルクトースが残存していた（表１）。

〔試験例５〕
フラスコスケールの試験において、異なる培地（マンニトール−ＰＹ培地およびコンブ抽出物−ＰＹ培地）を用いた場合の、Aurantiochytrium sp. KH105における脂肪酸およびカロテノイドの生産性の違いを確認した。

試験例４で得られたAurantiochytrium sp. KH105の培養液５ｍｌを遠心分離して上清を廃棄した。Aurantiochytrium sp. KH105を回収し、細胞を蒸留水で１回洗浄した。

回収、洗浄した細胞から、クロロホルム／メタノール混液（２：１，ｖ／ｖ）を用いて総脂肪酸（ＴＦＡ）を抽出し、メタノールで希釈した１０％塩酸を用いてエステル化したのち、窒素（Ｎ_２）ガス下で乾燥させた。これをヘキサンに溶解して、ガスクロマトグラフ装置（GC-17A; Shimadzu, Kyoto, Japan）に注入した。内部標準としてアラキジン酸（２０：０）を用いた。ガスクロマトグラフ装置は、スプリットインジェクターと、１９０℃に設定したキャピラリーカラム（TC-70, 0.25 mm x 30 m; GL Science, Tokyo, Japan）と、２７０℃に設定した水素炎イオン化検出器とを備えたものを使用した。

カロテノイドは、アセトン／メタノール混液（７：３，ｖ／ｖ）を用いて複数回抽出し、濃縮し、その後、アセトンに溶解した。抽出物をシリカゲルプレート（Kieselgel 60; Merck Chemicals, Darmstadt, Germany）にスポットし、アセトン：ヘキサン（３：７，ｖ／ｖ）を用いて展開したのち、デンシトグラフィー解析によって定量した。標準物質として、β−カロテンおよびアスタキサンチンをスポットした。

結果を図４に示す。図４の（ａ）は、マンニトール−ＰＹ培地またはコンブ抽出物−ＰＹ培地中でG. oxydans（NBRC 14819）を培養した後の培養液を用いてAurantiochytrium sp. KH105を培養した場合の、フラスコスケールの試験におけるAurantiochytrium sp. KH105の脂肪酸生産量を示すグラフであり、図４の（ｂ）は、カロテノイドの生産量を示すグラフである。

コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合の吸光度および総脂肪酸量は、マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合の吸光度および総脂肪酸量よりも低かった（図４の（ａ））。マンニトール−ＰＹ培地において培養したAurantiochytrium sp. KH105から、２２．７ｍｇ／Ｌの脂肪酸が抽出された。一方で、コンブ抽出物−ＰＹ培地において培養したAurantiochytrium sp. KH10５から、１４．２ｍｇ／Ｌの脂肪酸が抽出された。陽性対照（１％ＧＰＹ培地）では、陰性対照（ＰＹ培地）と同程度の量の総脂質生産量であった（図４の（ａ））。

多価不飽和脂肪酸のうち、エイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）の生産量（ＴＦＡの約１０％）は、ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）の生産量（ＴＦＡの約２０％）よりも少なかった。ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）の生産量は、ＴＦＡの約４０％であり、最も多かった。マンニトール−ＰＹ培地におけるＤＨＡおよびＥＰＡ生産量は、それぞれ、９．４ｍｇ／Ｌおよび２．４ｍｇ／Ｌであった。これに対して、コンブ抽出物−ＰＹ培地におけるＤＨＡおよびＥＰＡの生産量は、それぞれ、５．９ｍｇ／Ｌおよび１．８ｍｇ／Ｌであった（図４の（ａ））。

カロテノイドの生産量は、薄層クロマトグラフィー法によって測定した。コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合に、カロテノイドの生産量が最も多く、１５．９ｍｇ／Ｌであった。これは、陽性対照（１％ＧＰＹ培地）でのカロテノイドの生産量（４．５ｍｇ／Ｌ）の３倍以上の量であった。マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合のカロテノイドの生産量は、９．１ｍｇ／Ｌであった。

カロテノイドの組成分析によって、陽性対照（１％ＧＰＹ培地）と、マンニトール含有培地（マンニトール−ＰＹ培地、コンブ抽出物−ＰＹ培地）を用いた場合とでは、組成が異なることが明らかになった。β−カロテンの割合は同程度（約１５％）であったが、陽性対照（１％ＧＰＹ培地）では、アスタキサンチンの割合が最も多く（６３％）、カンタキサンチンの割合が最も少なかった（９．７％）。これに対して、マンニトール−ＰＹ培地またはコンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合は、アスタキサンチンの割合が少なかった（それぞれ、総カロテノイドの２６％および１２％）。コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合は、カンタキサンチンは総カロテノイドの３２％であり、アスタキサンチンは総カロテノイドの１２％であった。マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合は、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの生産量は、ほぼ同程度であった（それぞれ、２２％および２６％）。

マンニトール−ＰＹ培地を用いた場合に、アスタキサンチンおよびβ−カロテンの生産量は、それぞれ、２．３ｍｇ／Ｌおよび１．４ｍｇ／Ｌであった。コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いた場合は、アスタキサンチンおよびβ−カロテンの生産量は、それぞれ、２．０ｍｇ／Ｌおよび２．５ｍｇ／Ｌであった。

〔試験例６〕
コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いて、ジャー・ファーメンタースケールでの二段階発酵を行った。試験例４に記載した試験管スケールの試験と同じ実験系に従い、１０Ｌ容量のジャー・ファーメンター（BE Marubishi, MDL-10L）を用いて、３Ｌのコンブ抽出物−ＰＹ培地にG. oxydans（NBRC 14819）を植菌し、その後、２８℃、８００ｒｐｍにて、ｐＨ６．０となるよう制御しながら５Ｓｌ／分の割合で給気して、１２時間培養した（ステージ１）。その後、３Ｌの４％海塩溶液を、最終的な海塩濃度が２％となるように添加した。したがって、糖類の濃度は半分に希釈された。その後、Aurantiochytrium sp. KH105を植菌し、３００ｒｐｍより遅く撹拌しながら、さらに７日間（１６８時間）培養した（ステージ２）。

異なる培養時間において培養液をサンプリングし、吸光度、糖類の濃度、並びに脂肪酸およびカロテノイドの濃度の変化を確認した。

ジャー・ファーメンター培養の間に、G. oxydans（NBRC 14819）およびAurantiochytrium sp. KH105の両方の増殖をモニタリングするために、吸光度および細胞の乾燥重量（cell dry weight：ＣＤＷ）を測定した。さらに、糖類の消費量をモニタリングした。コンブ抽出物−ＰＹ培地は、G. oxydans（NBRC 14819）の植菌前（０時間培養後）には、２４．２ｇ／Ｌのマンニトールを含有していた。

結果を図５に示す。図５の（ａ）は、コンブ抽出物−ＰＹ培地を用いてジャー・ファーメンタースケールでの二段階発酵を行った場合の、吸光度、細胞の乾燥重量、マンニトール濃度およびフルクトース濃度の変化を示すグラフであり、図５の（ｂ）は、脂肪酸の濃度の変化を示すグラフであり、図５の（ｃ）は、カロテノイドの濃度の変化を示すグラフである。

ステージ１では、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１２時間後に、吸光度が最大値（２．８５）に達した。この時、２０．９ｇ／Ｌのフルクトースが生産されていた。

ステージ２では、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１２０時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して１０８時間後）に、吸光度および細胞の乾燥重量が最大値に達した（それぞれ、９．４および４．３ｇ／Ｌ）（図５の（ａ））。
この時点から、培養が終了するまで、吸光度および細胞の乾燥重量は急激に減少した。これは、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１３２時間後に、マンニトールおよびフルクトースが消失（０ｇ／Ｌ）した結果と一致していた。

脂肪酸およびカロテノイドの生産量に関して測定した。G. oxydans（NBRC 14819）の植菌前（０時間培養後）では、培地中に含まれている総脂肪酸は４１．１ｍｇ／Ｌであった。この時点での脂肪酸組成を解析すると、オレイン酸（ＯＡ，１８：１ｎ−９）、リノール酸（ＬＡ，１８：２ｎ−６）、ジホモ-γ-リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）およびＥＰＡ（２０：５ｎ−３）等の不飽和脂肪酸が、脂肪酸の大部分を占めており、それぞれ、ＴＦＡの３５．８％、８．５％、２５．８％および６．２％であった。これらの脂肪酸はコンブに由来するものであると推測された。

総脂肪酸量（ＴＦＡ）は、培養開始後から増加し、ステージ１の終わりには、最大値（１７６．１ｍｇ／Ｌ）に達した（図５の（ｂ））。

ステージ２では、ＴＦＡは、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１３２時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して１２０時間後）に、最大値（１１８．１ｍｇ／Ｌ）に達し、その後、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１８０時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して１６８時間後）に最小値（２０．９ｍｇ／Ｌ）になった。

ステージ１では、α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ｎ−３）が０．８ｍｇ／Ｌから１．４ｍｇ／Ｌに増加し、ＤＧＬＡは、１０．５ｍｇ／Ｌから２５．９ｍｇ／Ｌに増加した。しかし、α−リノレン酸およびＤＧＬＡは、Aurantiochytrium sp. KH105の植菌後に減少し、その後、完全に消失した。

ＥＰＡは、培養０時間の時点で存在している（１．４ｍｇ／Ｌ）。しかし、ステージ２において急激に増加し、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して６０時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して４８時間後）に、最大値（２２．２ｍｇ／Ｌ）となった（図５の（ｂ））。

ＤＰＡおよびＤＨＡは、ステージ２において蓄積し始めた。ＤＰＡおよびＤＨＡは、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して６０時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して４８時間後）に最大値に達した。生産されたＤＰＡの最大値は１４．９ｍｇ／Ｌであり、生産されたＤＨＡの最大値は５３．７ｍｇ／Ｌであった。

総カロテノイド量は、培養０時間の時点で、１０．２ｍｇ／Ｌであった。これは、アスタキサンチンと、ＴＬＣにおける２つの未知のスポット（Ｒｆ＝０．５５および０．５１）とに由来する。

アスタキサンチンは、G. oxydans（NBRC 14819）を植菌する前にも存在していたが、G. oxydans（NBRC 14819）の植菌によって一時的に消失した。２つの未知のスポットは、ステージ１の間にも存在していたが、Aurantiochytrium sp. KH105を添加したステージ２で消失した。

総カロテノイドの生産量は、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１５６時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して１４４時間後）に最大値（９５．４ｍｇ／Ｌ）に達した。アスタキサンチンは、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１３２時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して１２０時間後）に最高濃度（１８．０ｍｇ／Ｌ）となり、β−カロテンは、G. oxydans（NBRC 14819）の培養を開始して１５６時間後（Aurantiochytrium sp. KH105の培養を開始して１４４時間後）に、最高濃度（１２．６ｍｇ／Ｌ）となった（図５（ｃ））。

本発明によれば、マンニトールを炭素源として利用して高付加価値脂質を生産することができる。本発明によって生産された高付加価値脂質は、高付加価値脂質を素材として利用する食品、化粧品および医薬品製造分野；炭化水素（テルペン類）を燃料として利用する産業分野；高付加価値脂質含有菌体を飼料として利用する水産分野および畜産分野；等に利用することができる。

Claims

（ａ）マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地に、フルクトース生成微生物とオーランチオキトリウム属微生物とを植菌して培養するか、または（ｂ）当該培養培地に当該フルクトース生成微生物を植菌し培養した後に、当該オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養する、培養工程と、
塩化ナトリウムを上記培養培地に添加する、塩化ナトリウム添加工程と、
を包含し、
上記フルクトース生成微生物は、マンニトールをフルクトースに変換し、且つ当該フルクトースを菌体外に分泌可能な微生物であり、
上記塩化ナトリウム添加工程は、上記培養培地中の上記マンニトールのフルクトースへの変換率が５０％以上になったときに行われ、
上記塩化ナトリウムは、上記培養培地における最終濃度が、上記オーランチオキトリウム属微生物が生育可能な濃度で、且つ上記フルクトース生成微生物の生育を阻害する濃度となるように、上記培養培地に添加されることを特徴とする、高付加価値脂質の生産方法（ここで、上記高付加価値脂質は、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、β−カロテン、リコペン、スクアレン、または、ステロールである。）。
上記フルクトース生成微生物は、グルコノバクター属細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記塩化ナトリウム添加工程では、上記塩化ナトリウムは、上記培養培地における最終濃度が１〜４％（ｗ／ｖ）となるように、上記培養培地に添加されることを特徴とする、請求項２に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記フルクトース生成微生物に作用する抗生物質を上記培養培地に添加する抗生物質添加工程をさらに包含し、
上記抗生物質添加工程は、上記培養培地中の上記マンニトールのフルクトースへの変換率が５０％以上になったときに行われることを特徴とする、請求項１から３の何れか１項に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記培養工程において、マンニトールと窒素源とを少なくとも含有している培養培地において前培養された、フルクトース生成微生物を培養培地に植菌することを特徴とする、請求項１から４の何れか１項に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記培養工程における培養培地は、マンニトールのみを炭素源として含有していることを特徴とする、請求項１から５の何れか１項に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記培養培地は、褐藻綱藻類抽出物を含有していることを特徴とする、請求項１から６の何れか１項に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記褐藻綱藻類は、コンブ科藻類であることを特徴とする、請求項７に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記培養工程が（ｂ）である場合において、
上記塩化ナトリウム添加工程後に、上記オーランチオキトリウム属微生物を上記培養培地に植菌することを特徴とする、請求項１に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記培養工程が（ｂ）である場合において、
上記フルクトース生成微生物の培養上清に、上記オーランチオキトリウム属微生物を植菌し培養することを特徴とする、請求項１から９の何れか１項に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記オーランチオキトリウム属微生物は、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium sp. KH105、受領番号：ＦＥＲＭＡＰ−２２２６７）であることを特徴とする、請求項１から１０の何れか１項に記載の高付加価値脂質の生産方法。
上記前培養における培養培地は、上記培養工程における培養培地と同じ組成であることを特徴とする、請求項５に記載の高付加価値脂質の生産方法。