CN103992959A - 长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用，其解决了现有长链二元酸菌种改造效果不显著的技术问题，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC016，其保藏编号为：CGMCC No.8928。本发明可广泛用于长链二元酸的制备领域。

Description

长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种菌种及其制备方法和应用，具体说是一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。

背景技术

长链二元酸是重要化工原料，具有极其广泛的用途，能够合成香料、特种尼龙、高级润滑油等一系列高附加值的化学品。长链二元酸可应用在军用领域、航空航天器的涂层、管路、汽车的表面涂层及油管等；在民用领域，可应用于汽车、日化香料、工程塑料、尼龙行业等十多个高新科技行业，可开发出更多的下游产业，形成新兴的产业链。

以往，长链二元酸采用化学合成法生产，其专利技术被国外所拥有。化学合成法生产长链二元酸，不仅产品种类单一，且合成工艺复杂、成本高、污染大。我国是世界上唯一能够采用微生物发酵技术实现多种长链二元酸大规模工业化生产的国家。此前，我国二元酸生产菌种的改良均是通过不同方式诱变等传统育方法实现的。传统育种方法具有很大随机性，筛选复杂。通过传统育种的方法已经很难进一步提高菌株的性能。当前长链二元酸工业化生产过程中仍有许多瓶颈问题，如底物转化率有待提高、生产能耗非常巨大等等。

代谢工程技术可以在基因水平上有针对性的进行菌种分子改造，获得性能更加优良的新菌株。如图1、图2所示，二元酸代谢途径主要包括ω-氧化途径和β-氧化途径，其中前者为二元酸合成途径，后者涉及二元酸降解途径。代谢工程的目的是通过分子改造手段来提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。国际上，Henkel公司(后来的Cognis公司)有专利报道(US005254466A)，用基因敲除方式来优化二元酸生产菌株，依次将4个POX基因敲除，达到完全阻断β-氧化，使底物转化率提高为100％。在此基础上，该公司进一步通过代谢工程手段共表达CYP单加氧酶和还原酶，以达到增强ω-氧化的目的，产量提高30％(World PatentWO/91/06660)。

但是利用该菌株进行批式发酵实验，其工艺仍无法与当时其他二元酸生产工艺竞争，而最终没有进行规模化生产。Henkel公司对菌种进行分子改造所使用的筛选标记为尿嘧啶营养缺陷型。Henkel公司发明专利的缺点为：1、出发菌株不是工业化生产所用的高产菌株；2、发酵法生产长链二元酸所用的假丝酵母为二倍体，即每个细胞具有两套染色体，每个基因都有对应的等位基因，而且催化每步体内生化反应的酶往往由多个基因编码。因此，通过代谢工程手段来增强或减弱某个体内生化反应的活性，需要对编码该酶的关键基因进行分子改造才有显著效果。否则，改造后效果也不会显著。

发明内容

本发明就是为了解决现有菌株生产长链二元酸效果不显著的技术问题，提供一种生产效率高的长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。

为此，本发明提供一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC016，所述菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏编号为：CGMCC No.8928。

本发明中的长链二元酸生产菌株基因组里增加了一个拷贝的CYP单加氧酶基因，其碱基序列如序列表的序列7所示。该基因为该菌株基因组中编码该酶的多个基因中对于长链二元酸生产最为关键的一个。

本发明同时提供一种长链二元酸生产菌株的制备方法，其包括如下步骤：(1)准备引物CandidaCYP-F、CYP-R、GEMura-F和Ura-R；(2)准备长链二元酸生产菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株，并制备感受态细胞；(3)使用步骤(1)中的引物进行扩增分别得到CYP单加氧酶基因片段(CandidaCYP-F和CYP-R)和Ura3基因片段(GEMura-F和Ura-R)，再经过一轮重叠PCR将两个片段连接起来，再将此重叠PCR扩增的产物整合到尿嘧啶营养缺陷型菌株基因组里；(4)通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到长链二元酸生产菌株，为尿嘧啶自养型菌株。

优选地，本发明中长链二元酸生产菌株的制备方法，筛选步骤中使用的筛选标记为Ura3。

优选地，长链二元酸生产菌株的制备方法，步骤(2)中的长链二元酸生产菌株假丝酵母(Candida sp.)DC12，并制备尿嘧啶营养缺陷型菌株。

本发明同时提供长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。

优选地，发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃；再将pH调至9～9.5，除去菌体沉淀，保留上清；脱色，温度保持在70～90℃，得到滤清液，用酸酸化至pH2.5，70～90℃保温，冷却，离心或压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到长链二元酸。

本发明中的长链二元酸是指含有十个以上碳原子的直链二羧酸，是一种重要的精细化工中间原料，特别是十二碳二元酸(DC12)、十四碳二元酸(DC14)、十六碳二元酸(DC16)和十八碳二元酸(DC18)。

本发明的有益效果是，为了突破生产菌种遗传改造的瓶颈，本发明通过解析生产菌株的基因组学和转录组学特征，分析ω-氧化和β-氧化代谢途径，在基因组全局水平上确立了二元酸代谢相关的一些关键靶位点，再通过代谢工程手段对这些位点进行分子改造，并经过发酵实验验证，获得了性能更加优良的菌株。本发明的TDTC016菌株(保藏号：CGMCC No.8928)，相比DC12菌株，转化率得到显著提高，而且相较DC12和脂酰辅酶A合成酶单拷贝敲除的TDTC002菌株，TDTC016对甲醇的耐受性明显加强，对月桂酸甲酯的转化率明显提高，而且发酵周期缩短，为规模化生产带来有益效果。

附图说明

图1为本发明涉及到的长链二元酸合成相关ω-氧化代谢途径；

图2为本发明涉及到的长链二元酸降解相关β-氧化代谢途径；

图3为本发明涉及到的基因整合流程图；

图4为本发明涉及到的尿嘧啶自养型菌株的筛选；

图5为HPLC分析DC12发酵生产的长链二元酸；

图6为HPLC分析TDTC016发酵生产的长链二元酸。

本发明的长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candidasp.)TDTC016；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年3月18日，保藏号编号为：CGMCC No.8928。

具体实施方式

本发明的序列表中序列名称如下：序列1：GEMura-F；序列2：Ura-R；序列3：CandidaCYP-F；序列4：CYP-R；序列5：Int-U；序列6：Int-D；序列7：CandidaA06129(CYP单加氧酶编码区、上游启动子和下游终止子序列)；序列8：质粒pGEM-ura3。

以下实施例中观察到的菌落及菌体形态归纳如下：

固体培养基平板上，菌落奶酪状，表面光滑，乳白色，饱满凸起，菌落直径约为2mm。酵母样单细胞,大小约为10x6μm。大多情况下，以酵母样单细胞形式，同时会有假菌丝体形成，如在某些生长阶段或某种外界条件刺激下，假菌丝比例会显著增加。

以下实施例中使用了下面所列的培养基：

1、YPD培养基，其配方为：1％的酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，若制固体培养基，加入2％琼脂粉。上述百分比为质量体积百分比，即每100毫升培养基所需该组分的克数。若要添加抗生素，液体培养基在使用时加入至相应终浓度。固体培养基在高压灭菌后冷却至50摄氏度左右时，加入抗生素至相应终浓度，混匀后立刻倒如无菌的培养皿中，待凝固后倒置，放于4摄氏度冰箱，两周内使用。

2、种子培养基的配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～25g/L，KH₂PO₄4～12g/L，尿素0.5～4g/L，重蜡40～70g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。

3、发酵罐培养基配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～30g/L，KH₂PO₄4～15g/L，尿素0.5～4g/L，KNO₃5～15g/L，NaCl0.5～2.5g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75％葡萄糖溶液，105℃灭菌20分钟，发酵初期进行流加。

以下实施例中使用了下面所列的菌体培养及发酵液处理方式：

1、平板培养：在YPD平板上划线或涂布后倒置于30℃培养箱内，2-3天即可观察到大而饱满的乳白色菌落形成。

2、摇床培养：平板上接种单菌落至液体培养基中，或从液体培养基转接过来，30℃摇床培养，转速保持在220转/分钟。

3、发酵罐培养：可以比较实时精确控制发酵条件，如补料控制、pH控制、溶氧控制和通气搅拌强度控制等等。第一阶段，发酵液pH控制在5～6.8，同时流加葡萄糖溶液，为菌体生长阶段；第二阶段，发酵液pH控制在7.0～7.8，同时流加底物(烷烃、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等)，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不产菌体，根据发酵情况继续流加底物(烷烃、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等)。整个发酵过程用10M NaOH溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在20～40％。

4、发酵液处理：发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃，并维持60分钟；再加入10M NaOH将pH调至9～9.5，用管式离心机或压滤除去菌体沉淀，保留上清；加入适量活性炭脱色，温度保持在70～90℃，保温时间为60分钟；除去活性炭后，得到滤清液，用浓盐酸或浓硫酸连续酸化至pH2.5，70～90℃保温2小时，冷却至30℃，离心或压滤，清水洗一遍，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到白色二元酸。

实施例1：菌株代谢工程改造

1)基因组测序

利用宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒(Yeast DNAiso Kit)制备长链二元酸生产菌株假丝酵母基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。基因组DNA再经过文库构建、新一代测序技术测序分析和数据组装等步骤。通过基因组注释和数据分析，获得了生产菌株在二元酸生产相关的基因信息，挖掘了该菌在ω-氧化和β-氧化代谢途径相关基因的编码序列。对于酵母，β-氧化主要发在在过氧化物酶体内，特别是长链脂肪酸的β-氧化，只发生于过氧化物酶体这种细胞器里。在ω-氧化代谢途径中，烷烃经过CYP单加氧酶、脂肪醇氧化酶及脂肪醛脱氢酶三步酶催化反应，烷烃的一个末端被氧化成羧基，生成脂肪酸。脂肪酸再经过一轮ω-氧化过程(同样的三步酶催化反应)，烷烃的两个末端都被氧化成羧基，生成二元酸。研究表明(Appl.Environ.Microbiol.69:5992-5999,2003)，ω-氧化的第一步反应为限速步骤，由CYP单加氧酶和CYP还原酶催化。序列分析发现，二元酸生产菌株基因组含有超过十个基因编码CYP单加氧酶。CandidaA06129为其中一个编码基因,编码区长度为1569bp。

2)转录组测序

利用德国凯杰公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)制备长链二元酸生产菌株假丝酵母的总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。得到的总RNA再经过文库构建、转录组测序及表达量分析。通过转录组数据分析，发现CandidaA06129的转录水平为20503.5RPKM，为全部基因里转录水平最高的一个。一方面说明，该长链二元酸生产菌株具有很强的ω-氧化活性，另一方面说明，CandidaA06129在ω-氧化过程中是十分重要的CYP单加氧酶基因。这里，RPKM是基因表达量的一个计算方法，表示Reads Per Kb Per Million Reads。其计算公式为

$\mathrm{RPKM}=\frac{{10}^{6}C}{\mathrm{NL}/{10}^3}$

设RPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为基因A编码区的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可以直接用于比较基因表达差异。

由于ω-氧化是长链二元酸合成相关的代谢途径，菌种改造的目的是增强ω-氧化活性，以提高菌株合成二元酸的能力。本发明通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因来增强ω-氧化活性。所选的CYP单加氧酶基因由CandidaA06129编码，其表达水平是整个基因组里在二元酸发酵条件下表达水平最高的一个基因。通过增强CYP单加氧酶活性，来解除ω-氧化过程中限速步骤的限制，从而达到更加有效合成二元酸的目的。

3)基因整合实验流程如图3所示。使用CandidaCYP-F和CYP-R为引物，二元酸生产菌株基因组DNA为模版，进行PCR扩增得到CYP单加氧酶基因(CandidaA06129)片段，包括启动子和终止子部分。使用GEMura-F和Ura-R为引物，质粒pGEM-ura3为模版，进行PCR扩增得到Ura3基因片段，包括启动子和终止子部分。再以上述扩增到的CYP单加氧酶基因片段和Ura3基因片段为模版，以CandidaCYP-F和GEMura-F为引物，经过一轮重叠PCR将两个片段连接起来，再将此重叠PCR扩增的产物整合到尿嘧啶营养缺陷型菌株基因组里。其中引物CandidaCYP-F和GEMura-F的5’端为同源臂序列，对应于基因组整合位点的上游和下游序列。这样，经过重叠PCR扩增后得到的DNA片段，两头分别带上下游同源臂，中间CYP单加氧酶基因和Ura3筛选标记。

扩增的DNA片段经纯化后进行电转化导入菌体细胞内，DNA片段的上下游同源臂与菌体染色体上的靶位点发生双交换，达到整合的目的。由于这种双交换是小概率事件，需要建立方法来进行筛选。这里所使用到的筛选标记为Ura3,编码乳清苷5-磷酸脱羧酶,在尿嘧啶核苷酸的合成过程中，该酶催化其中一个关键的反应。尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株的乳清苷5-磷酸脱羧酶失活，除非在培养基中加入尿苷或尿嘧啶，否则无法生长。如果你向营养缺陷菌株中转化进Ura3基因，这些营养缺陷株便能正常生长(阳性选择)。相反，如果你向培养基中加入5-FOA(5-氟乳清酸)，那么正常原养型酵母细胞的乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-FOA转化为有毒物质，导致细胞死亡(阴性选择)。

验证时，使用到一对检测引物Int-U和Int-D，分别与靶位点的上游和下游区域配对。如果没有同源重组发生，通过这基因组DNA为模版扩增出来的片段在长度上是一样的，在琼脂糖电泳中只能观察到一条带。如果重叠PCR扩增的片段通过同源重组整合到靶位点，那么经过扩增得到的片段长度就发生变化，在琼脂糖电泳中可以观察到两条带。经过验证的菌株，再通过发酵实验验证代谢工程改造获得新菌株在二元酸生产方面是否有性能上的优势。

4)PCR扩增

其中，质粒为质粒pGEM-ura3，参考文献为：J.Bacteriol.181，1868-1874(1999)，GeneBank数据库的登录号为：AF173954，来源于中国科学院微生物研究所。

使用CandidaCYP-F和CYP-R为引物1和引物2，二元酸生产菌株基因组DNA为模版，进行PCR扩增得到CYP单加氧酶基因片段。使用GEMura-F和Ura-R为引物1和引物2，质粒pGEM-ura3为模版，进行PCR扩增得到Ura3基因片段。再以上述扩增到的CYP单加氧酶基因片段和Ura3基因片段为模版，以CandidaCYP-F和GEMura-F为引物，经过一轮重叠PCR将两个片段连接起来。DNA聚合酶是宝生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/μl。

PCR循环条件为：

94度2分钟                       (预变性阶段)

94度20秒，58度20秒，72度1～6分钟(30个循环扩增阶段，1kb/分钟)

72度10分钟                       (最后延伸阶段)

5)DNA纯化

重叠PCR反应结束后，取5μl上述PCR样品进行琼脂糖电泳检测，证明扩增所得的DNA片段大小与预计的一样，而且没有杂带，进行两步纯化和浓缩，为后面的转化准备DNA样品。

第一步是利用PCR纯化试剂盒(购自Omega公司)，按照说明书进行。一般是50μl体系，做4管，总体积共200μl，PCR纯化的最后一步用50或100μl TE缓冲液洗脱柱子。纯化后的DNA，用NanoDrop仪器测浓度，计算得到的DNA总量约为20μg。

第二步是将纯化的DNA再用乙醇/醋酸钠/糖原处理进行沉淀。具体做法是：往上述溶在TE缓冲液的DNA溶液加入1μl糖原(20mg/ml)、100μl醋酸钠(3M,pH5.2)和1ml预冷的无水乙醇；放置-80摄氏度冰箱冷却30分钟；4度离心机，14000转/分的转速下，离心10分钟，留沉淀；沉淀再用75％预冷的乙醇洗两遍；超净台里风干；4摄氏度冰箱储存，电转之前重悬在10μl超纯水备用。

6)尿嘧啶营养缺陷型菌株感受态制备及电转

出发菌株为假丝酵母Candia sp.(参见《微生物学报》20(1)：88-93,1980，正烷烃发酵生产长链混合二羧酸，可从中国科学院微生物研究所购买)。先通过基因敲除方式敲除Ura3基因的一个拷贝，再将Ura3基因单拷贝敲除的菌株涂布到含5-FOA的固体培养基平板，筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。从新鲜活化的平板上挑出尿嘧啶营养缺陷型菌株的单菌落于3ml液体YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，转速为220转/分钟；2％转接于20ml YPD,30℃摇床培养，220转/分钟,至OD600达到1.8；将菌液置于冰上静置15分钟，使其停止生长，4000转/分钟，4℃离心3分钟，留菌体沉淀；用4ml预冷无菌水洗一次；4000转/分钟，4℃离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml TE/0.1M LiOAc,150转/分钟，30℃的摇床内振荡90分钟；加入0.1ml1M DTT，继续150转/分钟、30℃的摇床箱内振荡30分钟；4000转/分钟，4℃离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml预冷无菌水，洗3次；加入2ml1M山梨醇，洗1次,4000转/分钟，4℃离心3分钟；弃上清，加入120μl山梨醇将细胞悬起；取出40μl的细胞悬液于1.5ml离心管，加入5μl上述纯化后重悬在无菌水的PCR扩增产物(约10μg)，混匀，置于冰上5分钟；转入预冷的电转杯中，擦干电转杯，进行电转(电转条件为：2mm狭缝的电转杯，电压为1800伏，电击时间为5毫秒)；电转后立刻加入1ml山梨醇，混匀后吸出放到1.5ml的离心管中；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加入1mlYPD培养基，37℃的摇床内培养2小时；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加100μl YPD重悬菌体，涂布平板(SD-ura)，放到30℃培养箱内培养至单菌落出现。

7)筛选尿嘧啶自养型菌落

将上述平板(SD-ura)上长出的单菌落分别划线到YPD固体培养基平板上进行纯化获得单菌落，再将每个单菌落同时划到YPD平板和SD-ura平板上，放置于30℃培养箱里培养。YPD平板为对照，所有菌落在上面均能生长。在SD-ura平板上能够生长，说明外源Ura3基因已经整合到基因组里，使得尿嘧啶营养缺陷型菌株变成尿嘧啶自养型的。这部分菌落用于下一步验证，看看CYP单加氧酶基因是否也整合到靶位点了。

8)鉴定

上面出现生长的尿嘧啶自养型菌落，接种YPD液体培养基培养过夜，吸取500μl菌液，利用宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒制备基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。以获得的基因组DNA为模版，Int-U和Int-D为引物进行PCR扩增，具体反应体系及反应条件参照本实施例1的第4)条。如果外源片段没有整合到靶位点上，从两条等位染色体上扩增出来的DNA片段大小一样，在琼脂糖电泳上表现为一条带。如果外源片段整合到靶位点上，从两条等位染色体上扩增出来的DNA片段大小不一样，在琼脂糖电泳上表现为两条带(见图3)，鉴定为CYP单加氧酶基因CandidaA06129整合到基因组里，得到本发明的长链二元酸生产菌株TDTC016。

实施例2：长链二元酸的发酵生产

菌种通过常规的斜面培养后，接入50ml一级种子培养16小时，然后将一级种子培养转接入500ml二级种子培养16小时。

种子培养基的配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～25g/L，KH₂PO₄4～12g/L，尿素0.5～4g/L，重蜡40～70g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。

二级种子发酵完成后，转接入5L发酵罐。发酵罐培养基配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～30g/L，KH₂PO₄4～15g/L，尿素0.5～4g/L，KNO₃5～15g/L，NaCl0.5～2.5g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75％葡萄糖溶液，105℃灭菌20分钟，发酵初期进行流加。基础培养基为4L。在30℃以1：0.5的通气体积，控制pH5.5～6.5，在第16小时后开始以50ml/h的速度流加十二碳直链烷烃，发酵时间为144-156小时。整个发酵过程用10M NaOH溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在30％。

如图5和图6所示，HPLC分析表明出发菌株DC12和改造菌株TDTC016发酵得到的长链二元酸产物一致，纯度约为99％(分别为98.6％和99.1％)。

从下表可以看出，改造后的菌株，转化率提高5％以上。

实施例3

按照实施例2的方法，只是底物从十二碳直链烷烃改为月桂酸甲酯。

实施例4

按照实施例2的方法，只是底物从十二碳直链烷烃改为月桂酸乙酯。

Claims (8)

1.一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candidasp.)TDTC016，其保藏编号为：CGMCC No.8928。

2.根据权利要求1所述的长链二元酸生产菌株，其特征在于所述假丝酵母菌基因组里增加了一个拷贝的CYP单加氧酶基因。

3.根据权利要求2所述的长链二元酸生产菌株，其特征在于所述CYP单加氧酶基因碱基序列如序列表的序列7所示。

4.如权利要求1所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)准备引物CandidaCYP-F、CYP-R、GEMura-F和Ura-R；

(2)准备长链二元酸生产菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株，并制备感受态细胞；

(3)使用步骤(1)中的引物进行扩增分别得到CYP单加氧酶基因片段CandidaCYP-F、CYP-R和Ura3基因片段GEMura-F、Ura-R，再经过一轮重叠PCR将两个片段连接起来，再将此重叠PCR扩增的产物整合到尿嘧啶营养缺陷型菌株基因组里；

(4)通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到尿嘧啶自养型长链二元酸生产菌株。

5.根据权利要求4所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于所述筛选步骤中使用的筛选标记为Ura3。

6.据权利要求4所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的长链二元酸生产菌株为假丝酵母(Candida sp.)DC12的尿嘧啶营养缺陷型菌株。

7.如权利要求1所述的长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。

8.如权利要求7所述的长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用，其特征在于发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃；再将pH调至9～9.5，除去菌体沉淀，保留上清；脱色，温度保持在70～90℃，得到滤清液，用酸酸化至pH2.5，70～90℃保温，冷却，离心或压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到长链二元酸。