CN110343675A - Cyp52a12基因的定向进化及其在二元酸生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用定向进化和同源重组方法制备长链二元酸菌株的方法、利用该方法所获得的可以在酸性条件下生产长链二元酸的菌株及所述菌株的用途。具体而言，本发明涉及通过定向进化CYP52A12基因和同源重组方法制备长链二元酸菌株的方法、利用该方法所获得的可以在酸性条件下生产长链二元酸的菌株及所述菌株的用途。

Description

CYP52A12基因的定向进化及其在二元酸生产中的应用

技术领域

本发明涉及利用定向进化和同源重组方法制备长链二元酸菌株的方法、利用该方法所获得的可以在酸性条件下生产长链二元酸的菌株及所述菌株的用途。具体而言，本发明涉及通过定向进化CYP52A12基因和同源重组方法制备长链二元酸菌株的方法、利用该方法所获得的可以在酸性条件下生产长链二元酸的菌株及所述菌株的用途。

背景技术

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。长链二元酸作为重要的单体原料，广泛用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、防腐剂、香料、润滑剂、塑化剂等。

长期以来，长链二元酸经由石油通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法面临多种挑战，化学合成法得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物，因此需要复杂的后续提取纯化步骤，对于生产工艺和生产成本而言，都是巨大的障碍。采用微生物发酵技术生产长链二元酸，因其产生的污染低、环境友好、能够合成化学合成方法难以合成的产物如12碳以上的长链二元酸且纯度高等特点，较传统的化学合成法具有明显的优势。

采用生物法合成二元酸是以长链烷烃为底物，通过微生物如假丝酵母转化得到。其生产过程为常温、常压，可以规模化生产C9到C18等长链二元酸。目前的发酵工艺依赖于高pH碱性环境，公开的专利申请或专利如CN 1071951A、CN 1067725C、CN 1259424C、200410018255.7、200610029784.6等都要求在产酸期将发酵液的pH值调整到7.0以上，原因包括：1)热带假丝酵母二元酸代谢途径中的关键酶P450在碱性环境中有较高的酶活力；2)在碱性环境下，可以使得长链二元酸以溶解于水的二元酸的盐形式存在，使得发酵过程中，保持良好的传质。为保持产酸期发酵体系pH值大于7.0，需要添加大量的碱来中和生成的长链二元酸。而后续二元酸的提取纯化过程又需要大量的酸将体系中长链二元酸盐转化为长链二元酸，造成酸化母液体系中盐的浓度高达50-70g/L，这些高盐废水的存在对环境带来了巨大的挑战，严重影响了生物法长链二元酸产业的发展。

专利US 6569670B2也报道了在pH值5.8的环境下用脂肪酸为原料生产长链二元酸的方法，其主要原因是在pH值7.0以上，脂肪酸会以脂肪酸盐的形式存在，特别容易起泡，导致发酵无法进行，所以必须在较低的pH值下进行发酵，但较低的pH值下P450酶的活力较低，代谢缓慢，生产效率低。

此前，二元酸菌种的改良大多通过传统的随机诱变或采用基因工程的手段得以实现。主要的改造目的为提高二元酸的转化率。由于诱变本身随机性的特点，对筛选通量有很高的要求，而且每一次对于性状改变都要求新一轮的诱变筛选，在技术上已经成为重要的限制因素。采用基因工程的手段可以对菌株进行有针对性的遗传改造，从而获得产率更高的优良菌株。长链二元酸微生物发酵法生产方法主要为烷烃经ω-氧化生成。继而又可以经过β-氧化途径而被降解。以往的研究表明，可以通过增强ω-氧化途径并抑制β-氧化途径的手段来提高长链二元酸的产率。Coginis公司的Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)报导敲除POX4和POX5各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率。进一步过量表达ω-氧化途径中的限速步骤的两个关键酶P450及氧化还原酶CYP52A12基因，可以使产量得到有效提升(Biotechnology,10,894-898,1992)。赖小勤等(中国发明专利CN103992959B)报道向二元酸生产菌株中引入一个拷贝的CYP52A14基因也可以有效提高二元酸的转化率和生产效率。另外Cao等人(Biotechnol.J.,1,68-74,2006)发现敲除乙酰辅酶A由过氧化物酶体向线粒体运输过程中的关键基因CAT中的一个拷贝，从而部分阻断乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，也可以有效降低二元酸的降解。

易错PCR是Leung等(Technique,1,11-15,1989)最早提出的构建基因文库进行定向研究的技术。通过改变PCR反应条件，如调整反应体系中四种脱氧核糖核酸的浓度、改变Mg²⁺的浓度以及使用低保真度的DNA聚合酶等方法，使碱基错配而引入突变。过高或过低的突变率都会影响构建突变库的效果，理想的碱基突变比例是每个DNA片段1-3个。因此利用易错PCR产生随机突变，并结合同源重组的方法进行基因的定向遗传学改造，可以帮助筛选对菌株产能进一步提高有帮助的有益突变。以往对于二元酸菌株的改造大都集中于随机诱变或过量表达上游合成途径的基因或阻断下游β-氧化途径，对于代谢途径中基因的定向进化尚未有报道或应用。

采用定向进化的方法改造二元酸生产菌株使之适应酸性发酵条件的研究尚未见有报道，本领域依然存在对适应酸性发酵条件的菌株以及其制备方法的需求。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种突变的CYP52A12基因、其同源基因或其变体，其相对于GenBank登录号AY230498所示的基因(SEQ ID NO：19)，以起始密码子ATG第一位碱基(SEQID NO：19所示的第1177位碱基)为1计，发生了以下碱基突变：c.226A>G、c.960C>A、c.1408G>A；并且其中所述变体与突变的CYP52A12基因、其同源基因具有至少或至少约70％的序列同一性，例如至少或至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的同一性。

在一些实施方案中，所述的突变的CYP52A12基因的序列如SEQ ID NO：10或11所示或与其具有至少或至少约70％的序列同一性，例如至少或至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的同一性的序列。

本发明的第二方面涉及一种含有如第一方面所述的突变的CYP52A12基因、其同源基因或其变体的微生物，其相对于含有未突变的CYP52A12基因或其同源基因的微生物可以在酸性培养条件下生产长链二元酸，优选地，其中所述微生物选自棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Canddia)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)；更优选地，其中所述微生物是酵母菌；更优选地，其中所述微生物是热带假丝酵母(Candidatropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。在一个实施方案中，所述微生物是热带假丝酵母CCTCC M 2011192或CCTCC M 203052(保藏于中国典型培养物保藏中心)。

在一些实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选地，选自C9～C18的长链二元酸，更优选地，选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种，更优选地，所述长链二元酸选自十二碳至十六碳二元酸中的至少一种或者正十二碳至十六碳二元酸中的至少一种。

在一些实施方案中，所述酸性培养条件是指控制发酵体系的pH值为7.0以下，优选地，4.0～6.8，更优选地，5.0～6.5；所述控制发酵体系的pH值优选为控制发酵体系转化期时的pH值。

本发明的第三方面涉及一种利用如上述第二方面所述的微生物产生长链二元酸的方法，其包括培养如第二方面所述的微生物的步骤，任选地，其还包括从培养产物分离、纯化长链二元酸的步骤。

本发明的第四方面涉及一种通过定向进化长链二元酸合成途径的关键基因改造长链二元酸生产菌株的方法，其中改造后的长链二元酸生产菌株相对于改造前的菌株可以在酸性培养条件下生产长链二元酸，优选地，所述长链二元酸合成途径的关键基因是CYP52A12基因。

在一些实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选地，选自C9～C18的长链二元酸，更优选地，选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种，更优选地，所述长链二元酸选自十二碳至十六碳二元酸中的至少一种或者正十二碳至十六碳二元酸中至少一种；和/或其中改造后的长链二元酸生产菌株相对于改造前的菌株可以在pH为7.0以下，优选地，4.0～6.8，更优选地，5.0～6.5下生产长链二元酸。

在一些实施方案中，所述的方法包括步骤：

1)通过易错PCR制备带有突变的目的基因片段；

2)制备同源重组所需的目的基因上下游片段作为同源重组的模板以及抗性标记基因，优选地，所述抗性标记基因是潮霉素B抗性基因；

3)通过PCR重叠延伸制备完整的重组片段；

4)利用同源重组将所述重组片段引入菌株；

5)利用抗性标记筛选阳性菌株；

6)筛选长链二元酸产率得以提高和/或可以在酸性pH下生产长链二元酸的菌株；

7)任选地，筛选到的菌株进一步经过同源重组去除抗性筛选标记。

换言之，本发明的出发菌株为热带假丝酵母菌CATN145(保藏号为CCTCC M2011192，于2011年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心)，其为碱性生产菌株，在发酵制备二元酸的产酸阶段，发酵过程中，尤其是发酵体系转化期时需要往发酵培养基中补充碱液以维持碱性培养条件才能生产二元酸。本发明采用易错PCR的方法对CYP52A12基因进行随机突变，并通过同源重组的方法对该基因进行定向进化，以此筛选出了可以在酸性条件下生产长链二元酸的菌株。

通过筛选，本发明得到一株可以在酸性培养条件下生产长链二元酸的菌株，而且其发酵周期明显缩短，命名该菌株为突变株540。通过测序分析发现，与亲代菌株CCTCC M2011192相比，突变株540的CYP52A12基因，以起始密码子ATG第一位碱基为1计，发生了以下碱基突变：c.226A>G、c.960C>A、c.1408G>A。

优选的，根据本发明，热带假丝酵母突变株的CYP52A12基因的序列如SEQ ID NO：10或11所示。

本发明通过对CYP52A12基因进行定向进化，筛选到一株在该基因的启动子区域发生碱基突变的菌株，其可以在酸性培养条件下生产长链二元酸，酸性培养条件的建立使得在产酸过程中无需添加大量的碱来维持碱性环境，简化了二元酸产品的后期提取工艺，避免了发酵过程大量高盐废水的产生，大大减轻了给环境带来的不利影响。另外，该菌株产酸浓度高，同时还大大缩短了发酵周期，与现有生产工艺相比，不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业化价值优势。

本发明的第五方面涉及一种分离的修饰的CYP52A12蛋白，其中参照SEQ ID NO：20的氨基酸编号，所述修饰的CYP52A12蛋白与未修饰的CYP52A12蛋白相比，在相应于SEQ IDNO：20的第76位的位置包括Asp和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置包括Ile。

在一个实施方案中，所述未修饰的CYP52A12蛋白包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述修饰的CYP52A12蛋白包含与SEQ ID NO：20具有至少70％，例如至少或至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或更高的序列同一性的氨基酸序列，并且包括在相应于SEQ ID NO：20的第76位的位置用Asp置换Asn和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置用Ile置换Val。

在一个实施方案中，所述修饰的CYP52A12蛋白包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。

本发明的第六方面提供了含有编码本发明所述的修饰的CYP52A12蛋白的核苷酸序列的分离的核酸分子。

本发明的第七方面提供了包含含有编码本发明所述的修饰的CYP52A12蛋白的核苷酸序列的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体可以是原核载体、病毒载体或者真核载体，例如SEQ ID NO：3所示的载体pCIB2。

本发明的第八方面涉及一种修饰的微生物，其包含本发明所述的修饰的CYP52A12蛋白、含有编码本发明所述的修饰的CYP52A12蛋白的核苷酸序列的核酸分子和/或包含含有编码本发明所述的修饰的CYP52A12蛋白的核苷酸序列的核酸分子的载体。

在一个实施方案中，所述微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、耶氏酵母属；更优选地，其中所述微生物是酵母菌；更优选地，其中所述微生物是热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

本发明得到一株可以在酸性培养条件下生产长链二元酸的菌株，而且其发酵周期明显缩短，命名该菌株为突变株540。通过测序分析发现，与亲代菌株CCTCC M 2011192相比，突变株540含有本发明所述的修饰的CYP52A12蛋白，其中参照SEQ ID NO：20的氨基酸编号，所述修饰的CYP52A12蛋白在相应于SEQ ID NO：20的第76位的位置包括Asp和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置包括Ile。

优选地，本发明所述热带假丝酵母突变株含有的修饰的CYP52A12蛋白包含SEQ IDNO：21所示的氨基酸序列。

本发明的第九方面涉及一种利用如上述第八方面所述的修饰的微生物产生长链二元酸的方法，其包括培养所述修饰的微生物的步骤，优选在酸性培养条件下生产长链二元酸，任选地，其还包括从培养产物分离、纯化长链二元酸的步骤。

在一个实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选选自C9～C18的长链二元酸，更优选选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种，更优选所述长链二元酸选自十二碳至十六碳二元酸中的至少一种或者正十二碳至十六碳二元酸中至少一种；和/或其中修饰的微生物相对于修饰前的微生物可以在pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5下生产长链二元酸。

本发明的第十方面涉及一种通过定向进化CYP52A12基因改造长链二元酸生产菌株的方法，其中改造后的长链二元酸生产菌株相对于改造前的菌株可以在酸性培养条件下生产长链二元酸，其中改造后的长链二元酸生产菌株与改造前的菌株相比，包含突变的CYP52A12基因，所述突变的CYP52A12基因编码修饰的CYP52A12蛋白，其中参照SEQ ID NO：20的氨基酸编号，所述修饰的CYP52A12蛋白与未修饰的CYP52A12蛋白相比，在相应于SEQID NO：20的第76位的位置包括Asp和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置包括Ile。

在一个实施方案中，所述未修饰的CYP52A12蛋白包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述修饰的CYP52A12蛋白包含与SEQ ID NO：20具有至少或至少约70％、例如至少或至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或更高的序列同一性的氨基酸序列，并且包括在相应于SEQ ID NO：20的第76位的位置用Asp置换Asn和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置用Ile置换Val。

在一个实施方案中，所述修饰的CYP52A12蛋白包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。

附图说明

图1为通过同源重组的方式整合进带有突变位点的CYP52A12基因并去除潮霉素筛选标记的示意图，“*”代表可能存在于CYP52A12任意区域(包括启动子、编码区和终止子)的突变。

图2为本发明的突变菌株与原始菌株的CYP52A12基因核苷酸序列的比对结果，突变位点用黑框标出。

具体实施方式

定义

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。参见例如，Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。

长链烷烃：本发明的发酵底物包括长链烷烃，长链烷烃属于饱和链烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，其包括化学式CH3(CH2)nCH3的烷烃，其中n≥7。优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸、以下或简称为二元酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7。优选的，所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。优选地，所述长链二元酸为十二碳至十六碳二元酸中至少一种，优选地，正十二碳至十六碳二元酸中至少一种。

产长链二元酸的微生物：已报道的可产生和积累二元酸的菌株包括细菌、酵母以及霉菌等，如：棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、耶氏酵母属等。其中假丝酵母属的许多种类是发酵生产二元酸的优良菌种。所述发酵的菌种优选包括：热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

CYP52A12是指细胞色素氧化酶P450家族CYP52亚族中的一种，其参与发酵产酸过程中烷烃和脂类ω-氧化。本领域技术人员知晓，在其他产长链二元酸的微生物中也存在CYP52A12或其同源基因，其序列可能存在差异但发挥的作用一致，其同样落入本发明的范围内。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基聚合物，其中所述聚合物可以任选地缀合于一个不是由氨基酸组成的部分。所述术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应天然发生的氨基酸的人工化学模拟物，所述术语还适用于天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。

如本文所用，除非特别指出，任何核苷酸、氨基酸及其它化合物的缩写是根据其常用的公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature((1972)Biochem.11:1726)。氨基酸残基的缩写在下表中示出：

应注意本文示出的氨基酸序列均是从左至右方向是常规的氨基末端至羧基末端的方向。本领域熟知一个氨基酸可由一或多个相应密码子编码，而在不同生物体中，可以选择合适的密码子编码所需的氨基酸，这都在本领域技术人员的能力范围内。

术语“分离的”当用于核酸或蛋白质时，是指所述核酸或者蛋白质基本上不含其在天然状态下结合的其它细胞组分。其可以是例如均质状态，并且可以是干燥的或者在水溶液中。纯度和均质性典型地用分析化学技术确定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。是制备物中存在的主要种类的蛋白质是基本上纯化的。

如本文所用，碱基突变“c.XXX N0>N1”是指在编码区第XXX位的碱基N0突变为N1。例如，碱基突变c.226A>G是指以编码区起始密码子ATG的碱基A为第1位，编码区第226位的碱基A突变为G。在一个实施方案中，本发明所述的CYP52A12基因编码区的序列如SEQ IDNO：19的第1177-2748位核苷酸序列所示。在本文中，提及碱基时，G指鸟嘌呤，T指胸腺嘧啶，A指腺嘌呤，C指胞嘧啶，U指尿嘧啶。

如本文所用，“未修饰的CYP52A12蛋白”是指在本发明中选择的用于修饰的起始蛋白。所述起始蛋白可以是天然发生的、野生型形式蛋白，例如GenBank中登录号为AAO73952.1的CYP52A12蛋白。举例的未修饰的CYP52A12蛋白如SEQ ID NO：20所示。此外，起始蛋白可以被改变或突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是在本文相对于本发明产生的随后修饰的蛋白仍称作起始未修饰的蛋白。因此，可以选择与未修饰的参考蛋白相比已经被修饰具有希望的特定活性或性质增加或降低的本领域已知的现有蛋白，并用作起始未修饰的蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的修饰的CYP52A12蛋白，其与未修饰的CYP52A12蛋白相比，在相应于SEQ ID NO：20的第76位的位置包括Asp和在相应于SEQID NO：20的第470位的位置包括Ile。

术语“参照……编号”或者“相应于”当用在给定氨基酸或多核苷酸序列编号上下文时，是指当该给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时参考序列的残基编号。当占据蛋白质或核酸内与给定残基或碱基相同的基本结构位置时，蛋白质中的氨基酸残基或核酸中的碱基“相应于”给定氨基酸残基或碱基。例如，在一些实施方案中，当选择的蛋白质与参考序列进行最大同源性对比时，在选择的蛋白中某个氨基酸残基与参考序列第67位的氨基酸残基占据相同的结构位置时，则选择的蛋白中该对比的氨基酸残基的位置被称为相应于参考序列第67位。例如当选择的蛋白的结构与参考序列进行最大相应性对比及整体结构进行对比时，三维结构对比也可以用于代替一级序列对比。

通常为了鉴别相应位置，排列氨基酸序列以便获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,NewYork,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。氨基酸序列的排列对比及某些程度的核苷酸序列排列对比，也可考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或取代频率。保守差异是保护涉及的残基的物理-化学性质的那些差异。排列对比可以是整体(在全长序列排列对比序列及包括所有残基)或局部(一部分序列的排列对比，仅包括最相似的一或多个区域)。

如本文所用，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指氨基酸或核苷酸序列无变化的程度，可通过比对多肽(或多核苷酸)与参考多肽(或多核苷酸)之间的相同氨基酸(或核苷酸碱基)的数目而检测，而且蛋白质同源性可包括保守氨基酸改变。序列同一性可以通过标准排列对比算法程序使用由每个供应商制定的默认缺口罚分确定。同源多肽是指预定数目的相同或同源氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代以及相同残基。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(沉默取代)以及相同的残基。基本同源的核酸分子典型在中等严格条件下或者在高度严格条件下杂交全长核酸或者至少或至少约70％、80％或90％全长的感兴趣的核酸分子。本发明还涵盖了含有简并密码子代替杂交核酸分子中密码子的核酸分子。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列(或者任两个多肽是否具有这样的氨基酸序列)可以使用已知的计算机算法确定，如FAST A、BLASTP、BLASTN、FASTA、DNAStar及Gap(University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG),Madison WI,USA)。例如，蛋白质和/或核酸分子的同源性或同一性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48:443(1970)，由Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981)修订)。简而言之，GAP程序根据相似的排列对比的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的符号总数而定义相似性。

本发明所述修饰的CYP52A12蛋白除了在相应于SEQ ID NO：20的第76和470位包含氨基酸置换外，可以在其它位置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个其他氨基酸修饰，例如插入、缺失或置换，只要所述其他修饰不实质降低修饰的CYP52A12蛋白在酸性培养条件下生产长链二元酸的活性。所述“不实质降低”是指在相同条件(例如酸性培养条件)下，与包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的修饰的CYP52A12蛋白的微生物相比，包含含有所述其他修饰的修饰的CYP52A12蛋白的微生物生产长链二元酸的产酸量(例如以单位mg二元酸/g发酵液)降低不超过50％，40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％，1％或更少。

在一个实施方案中，本发明所述修饰的CYP52A12蛋白包含与SEQ ID NO：20具有至少或至少约70％，例如至少或至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或更高的序列同一性的氨基酸序列，并且包括在相应于SEQ ID NO：20的第76位的位置用Asp置换Asn和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置用Ile置换Val。

在一个实施方案中，本发明所述修饰的CYP52A12蛋白具有细胞色素氧化酶P450家族CYP52亚族的活性，例如具有在发酵产酸过程中ω-氧化烷烃和脂类的活性。在一个实施方案中，本发明所述修饰的CYP52A12蛋白具有在酸性培养条件下生产长链二元酸的能力，例如在相同条件下，所述修饰的CYP52A12蛋白生产长链二元酸的能力(例如产酸量，例如以单位mg二元酸/g发酵液)是包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的修饰的CYP52A12蛋白的至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。

在一个实施方案中，本发明所述修饰的CYP52A12蛋白来自假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和耶氏酵母属，更优选来自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

同源基因是指序列相似性达80％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。本发明中所指的CYP52A12基因的同源基因既可以是CYP52A12基因的直向同源基因，也可以是其横向同源基因或异源同源基因。

序列同一性是指在序列比对和/或引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的碱基相同的百分比。在一些具体实施方式中，多核苷酸变体与本文所述的多核苷酸具有至少或至少约70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的多核苷酸同源性。

定向进化是指借助于技术手段模拟自然选择的过程。通过人为制造的突变和特定的筛选压力，使蛋白质或核酸向特定的方向突变，从而在短时间内在分子水平上实现自然界中需要成千上万年才能完成的进化过程。

在一些实施方案中，在本发明的易错PCR中，Mg²⁺浓度范围为1～10mM，优选地，2～8mM，更优选地，5～6mM，和/或dNTP的浓度为0.1～5mM，优选地，0.2-3mM，更优选地，0.5～2mM，更优选地，0.8-1.5mM，例如1mM，和/或添加新鲜配置的MnCl₂至终浓度为0.1～5mM，优选地，0.2～2mM，更优选地，0.3～1mM，更优选地，0.4～0.7mM，例如0.5mM。在一些实施方案中，通过降低模板量并适当增加至40个或更多个循环PCR以增加突变几率，例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60或更多个循环。

PCR重叠延伸又称SOE(gene splicing by overlap extension)PCR，是指通过设计具有互补末端的引物，通过PCR扩增将不同DNA片段拼接到一起的方法。

同源重组是指依赖于序列相似性的DNA分子之间的重组，最常见于细胞内用于修复有丝分裂期间产生的突变。同源重组技术已广泛应用于基因组编辑，包括基因敲除、基因修复以及向特定位点引入新的基因等。以酿酒酵母为代表的一类微生物，其细胞内发生同源重组的几率非常高，不依赖于序列特异性，在基因组编辑方面具有明显的优势。而位点特异性重组，依赖于特异性位点和位点特异性重组酶参与，重组仅发生于特异的位点之间，如Cre/loxP、FLP/FRT等。本发明使用的同源重组技术不属于位点特异性重组，重组依赖于细胞内的DNA修复系统。

抗性标记是指选择性标记的一种，其往往携带有赋予转化子在抗生素存在的条件下得以生存的能力。所述抗性标记基因包括NPT、HPT、BLA及CAT等，分别可以抗卡那霉素、潮霉素、氨苄/羧苄青霉素以及氯霉素等。优选的，所述抗性标记基因是潮霉素B抗性基因HPT。

碱性培养条件是指发酵底物产酸过程中，控制发酵体系的pH值维持在大于7.0的范围，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.2、9.4、9.6或更高。所述控制发酵体系的pH值优选为控制发酵体系转化期时的pH值，即当菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时。

酸性培养条件是指发酵底物产酸过程中，控制发酵体系的pH值维持在小于7.0的范围内，优选的，酸性培养条件是指控制发酵体系的pH值介于pH4.0至pH6.8，更优选的，酸性培养条件为pH5.0至pH6.5。优选的，所述控制发酵体系的pH值为控制发酵体系转化期时的pH值，即当菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时，控制所述发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。具体而言，控制所述发酵体系的pH值为：3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0。

本发明对pH值的调节或控制方式没有特别限制，可以是恒控某一pH值、不控制pH值、不低于某pH值、不高于某pH值、上调pH值、下调pH值、从范围外控制进入或自然进入所述pH值范围内的方式中的一种或多种的组合。本发明对于pH值的调控方法亦不做限定，可采用发酵领域的常用手段，如加入适当浓度的碱液。

发酵生产过程中，所述发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐。

在一些实施方案中，所述碳源包括选自葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)，例如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

在一些实施方案中，所述氮源包括选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或所述氮源的总添加量为0.1％～3％(w/v)，例如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％。

在一些实施方案中，所述无机盐包括选自磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或所述无机盐的总添加量为0.1％～1.5％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

在一些实施方案中，所述营养因子包括选自维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；和/或所述营养因子的总添加量为0～1％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％。按照发酵领域常识，本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL。

本领域技术人员可以容易地确定上述物质的添加量。

在本发明的一个实施方案中，发酵菌株的接种量为10％～30％，例如11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。所述菌株培养至菌体光密度(OD₆₂₀)为0.5以上(稀释30倍)时，加入底物进行发酵转化。

如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。

如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1培养基、培养发酵方法及二元酸检测方法

1、YPD培养基，配方(w/v)为：2％蛋白胨，2％葡萄糖和1％酵母提取物(OXOID,LP0021)。固体培养基中还需加入1.5～2％琼脂粉。

培养时，可取单菌落于含有1ml YPD液体培养基的2ml离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。

2、种子培养基，配方(w/v)为：蔗糖10～20g/L，酵母膏3～8g/L，工业发酵用玉米浆(简称玉米浆，总氮含量2.5wt％)2～4g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，尿素0.5～4g/L(115℃，20min单独灭菌)，发酵底物为正十二烷20mL/L。

培养时，将步骤1培养后的菌液接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶，接种量为3-5％，在250rpm、30℃摇床培养至OD₆₂₀达到0.8时(稀释30倍后)。

3、发酵培养基(w/v)：蔗糖10-40g/L，玉米浆(总氮含量2.5wt％)1～5g/L，酵母膏4～12g/L，NaCl 0～3g/L，KNO₃ 4～12g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，尿素0.5～3g/L(115℃，20min单独灭菌)，发酵底物为正十二烷300～400mL/L(如下文所示)，用1N HCl和1N NaOH调节pH值至4.5～7.5(如下文所示)。

发酵时，将步骤2培养的种子液接种到装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为10-30％，在30℃、250rpm摇床培养90-144h。培养过程中通过隔段时间补加酸/碱的方式调节pH值至设定范围。

4、酸碱滴定法测定长链二元酸产量的步骤

用1N盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的长链二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到长链二元酸粉末；将得到的长链二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量，并以此计算长链二元酸产量。

实施例2CYP52A12突变模板的制备

1、CYP52A12突变模板的制备。

使用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(Sangon，货号518257)提取假丝酵母CCTCC M 2011192的基因组DNA。为提高细胞壁破碎效率，辅以液氮研磨的方法破碎细胞壁。以用该方法获得的基因组DNA作为模板进行易错PCR。

2、易错PCR

调整Mg²⁺的浓度(2-8mM)，使用Taq DNA聚合酶(Takara，货号R001B)进行易错PCR扩增CYP52A12基因。(PCR条件为：步骤1:98℃30s,步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃2m 20s,共35个循环，步骤3:72℃5m)，引物如下：

CYP52A12-F：5'-CAAAACAGCACTCCGCTTGT-3'(SEQ ID NO：1)，

CYP52A12-R：5'-GGATGACGTGTGTGGCTTGA-3'(SEQ ID NO：2)，

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)进行回收纯化。

实施例3同源重组模板的制备

本实施例中所有DNA片段均使用HS高保真DNA聚合酶(Takara,R040A)扩增得到。经1％琼脂糖凝胶电泳后用Axygen凝胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。

(1)抗性筛选标记(HYG，即潮霉素抗性基因)的扩增，扩增模板为本公司所有的载体pCIB2(SEQ ID NO：3)，引物序列如下：

CYP52A12_HYG-F：

5'-TCAAGCCACACACGTCATCCGCATGCGAACCCGAAAATGG-3'(SEQ ID NO：4)，

CYP52A12_HYG-R：

5'-GATGTGGTGATGGGTGGGCTGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3'(SEQ ID NO：5)。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s，

步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃1m 50s,5个循环，

步骤3:98℃10s,72℃2m,25个循环，

步骤4:72℃5m。

获得的产物称为HPT，经测序证实无误，如SEQ ID NO：6所示。

(2)下游同源重组片段的扩增，模板为上述热带假丝酵母基因组DNA，引物序列如下：

CYP52A12_Down-F：5'-AGCCCACCCATCACCACATC-3'(SEQ ID NO：7)，

CYP52A12_Down-R：5'-CGAAGTCGTAATCCGCAACG-3'(SEQ ID NO：8)。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s，

步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃1m 40s共30个循环，

步骤3:72℃5m，

获得的产物称为CYP52A12_Down，经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO：9所示。

(3)PCR重叠延伸得到完整的重组模板。

将上述3条回收得到的PCR片段进行重叠延伸，得到同源重组模板，并回收纯化。具体方法如下：

加入等摩尔量的CYP52A12、HPT和CYP52A12_Down片段作为模板，引物为CYP52A12_F和CYP52A12_Down-R，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，凝胶电泳后进行回收纯化大小约为4.3Kb的重组片段。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s，

步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃4m 30s共30个循环，

步骤3:72℃5m，

凝胶电泳后进行回收纯化大小约为4.3Kb的重组片段，经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO：10所示。

图1示出了本发明通过同源重组的方式整合进带有突变位点的CYP52A12基因并去除潮霉素筛选标记的示意图。

实施例4构建热带假丝酵母CYP52A12基因突变体库

1、酵母电转化感受态细胞的制备

将30℃，250rpm摇床过夜培养的酵母细胞CCTCC M 2011192接种到100mL YPD培养基中，至OD₆₂₀为0.1。相同条件下培养至OD₆₂₀至1.3时，3000g、4℃离心收集细胞。用冰冷的无菌水洗涤细胞两次并收集后将细胞重悬于10ml冰上预冷的1M的山梨醇溶液，4℃、1500g离心收集细胞后重悬于1ml上述山梨醇溶液，分装100μL细胞悬液用于遗传转化。

2、酵母感受态电击转化

上述感受态细胞中加入1μg实施例3步骤(3)中回收的用于重组的DNA片段，冰上放置5min后迅速转移至0.2cm电击杯，电击转化(BioRad，Micropulser^TM Electroporator，转化程序SC2)后迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃，200rpm培养2小时后，收集菌液后涂布含有100mg/L潮霉素B的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

实施例5突变菌株的筛选

1、筛选方法：挑取实施例4获取的单菌落于含有1ml实施例1YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2ml离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30ml实施例1种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的500mL摇瓶中，接种量为3％，250rpm、30℃培养至OD₆₂₀达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接种到装有15ml实施例1发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，期间每隔1小时调节pH值至5.5，且发酵培养基中底物为正十二烷。继续250rpm、30℃培养至发酵结束，统计发酵时间。并以菌株CCTCC M 2011192作为对照例：培养基、培养和发酵方法与上述相同，区别在于：发酵时控制发酵体系的pH值为7.5。

并取0.5g发酵液样品采用实施例1中4所述的方法进行酸碱滴定，计算二元酸产量。

2、筛选结果：经筛选得到一株可在酸性培养条件下生产二元酸的菌株。与亲代菌株CCTCC M 2011192相比，其发酵时间缩短25小时。该菌株编号为540HYG。结果如表1所示。

表1

	CCTCC M 2011192于pH 7.5	540HYG于pH5.5
			发酵时间(h)	129	104
产酸量(mg/g)	150.9	141.8

实施例6突变菌株540HYG中CYP52A12基因序列分析

1、按实施例2的方法分别提取CCTCC M 2011192和540HYG酵母基因组DNA，并使用Takara公司HS高保真DNA聚合酶扩增CYP52A12基因区域，引物为CYP52A12-F和CYP52A12-R。PCR反应条件同上。

2、PCR完成后，将产物进行凝胶电泳并回收纯化。

3、纯化后的PCR片段加A处理：20μL PCR回收片段加入4μL 10X Takara Taq缓冲液、3.2μL dNTP(均为10mM)和0.2μL Takara Taq，补ddH₂O至40μL，混匀后于72℃保温20分钟后，使用Axygen PCR纯化试剂盒回收。

4、TA克隆。取加A后的步骤3的PCR回收片段4μL加入1μL pMD19-T载体骨架和5μLSolution I，混匀后16℃保温30min。并将连接产物转化至DH5α化学感受态，挑取阳性克隆送至Majorbio测序。

结果显示：与亲代菌株CCTCC M 2011192相比，筛选到的菌株540HYG在编码区发生了数处碱基突变，如图2序列比对结果中黑框位置所示。其序列如SEQ ID NO：11所示。

实施例7抗性筛选标记的去除

1、去除抗性筛选标记所用的同源重组模板的制备

以热带假丝酵母突变株540HYG基因组DNA为模板，使用HS高保真DNA聚合酶进行PCR扩增去除抗性筛选标记所需的重组模板片段，凝胶电泳后回收。获得的序列如SEQ ID NO：12所示。引物序列如下：

CYP52A12_Ter-F：5’-GTGCAGGACACAAACTCCCT-3’(SEQ ID NO：13)，

CYP52A12_Down-R：5’-CGAAGTCGTAATCCGCAACG-3’(SEQ ID NO：14)，

PCR反应条件为：

步骤1:98℃30s，

步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃30s共30个循环，

步骤3:72℃5m。

2、去除抗性筛选标记

制备菌株540HYG的新鲜电转化感受态细胞，加入步骤1所述重组片段0.3μg，冰上放置5min后迅速转移至冰上预冷的0.2cm电击杯，电击转化(如上，1.5kV,25uFD,200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃、200rpm培养2小时后，收集菌液后涂布含有不含抗生素的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

3、去除抗性标记的菌株的筛选

挑取单菌落一一对应分别接种于含有和不含潮霉素(100mg/L)的YPD平板，挑取在含有抗生素培养基上不生长但不含抗生素培养基上能够生长的单菌落接种于含有1mL的YPD培养基的2mL离心管中，于4℃、250rpm过夜培养，次日通过菌落PCR鉴定抗性筛选标记是否去除，所用引物为：

a)CYP52A12_Ter-F&CYP52A12_Down-R，PCR反应条件同上；

b)HYG-F:5’-CTCGGAGGGCGAAGAATCTC-3’(SEQ ID NO：15)，

HYG-R:5’-CAATGACCGCTGTTATGCGG-3’(SEQ ID NO：16)。

PCR反应条件为：

步骤1:98℃30s，

步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃35s共30个循环，

步骤3:72℃5m。

4、筛选结果

通过菌落PCR，筛选得到1株抗性筛选标记去除的菌株，并通过测序确认，方法同实施例6，该菌株CYP52A12基因编码区存在的突变与540HYG菌株相同，并已去除潮霉素筛选标记基因。最终该菌株命名为540。

实施例8菌株540发酵生产长链二元酸

接种菌株540至含有1ml实施例1YPD培养基的2ml离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30ml实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，摇床250rpm、30℃，36～48h培养至OD₆₂₀达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接种到装有15ml实施例1发酵培养基的摇瓶中，接种量为20％，期间每隔1小时调节pH值至4.5，且发酵培养基中底物为正十二烷。继续摇床250rpm、30℃培养至发酵结束，统计发酵时间，并使用实施例1中4所述的方法测定二元酸的产量。

对比例1菌株CCTCC(中国典型培养物保藏中心)M 2011192发酵生产长链二元酸

与实施例8的培养基、培养方法和发酵方法相同，区别在于，接种的菌株为菌株CCTCC M 2011192，且发酵时控制发酵体系的pH值为7.5。统计发酵时间，并使用实施例1中4所述的方法测定二元酸的产量。

对比例2菌株CCTCC M 2011192发酵生产长链二元酸

与实施例8的培养基、培养方法和发酵方法相同，区别在于，接种的菌株为菌株CCTCC M 2011192，且发酵时控制发酵体系转化期时的pH值为6.0。统计发酵时间，并使用实施例1中4所述的方法测定二元酸的产量。

实施例9培养基、培养方法和发酵方法同实施例8，区别在于，控制发酵体系转化期时的pH值为5.0。

实施例10培养基、培养方法和发酵方法同实施例8，区别在于，控制发酵体系转化期时的pH值为5.5。

实施例11培养基、培养方法和发酵方法同实施例8，区别在于，控制发酵体系转化期时的pH值为6.0。

实施例12培养基、培养方法和发酵方法同实施例8，区别在于，控制发酵体系转化期时的pH值为6.5。

实施例13培养基、培养方法和发酵方法同实施例8，区别在于，控制发酵体系转化期时的pH值为7.0。

实施例14培养基、培养方法和发酵方法同实施例8，区别在于，控制发酵体系转化期时的pH值为7.5。

统计对比例1-2、实施例8-14的结果数据如下表2所示，可见，菌株540在酸性条件下即发酵体系的pH小于7时，不仅可以发酵生产较多的二元酸，且发酵时间明显缩短。

表2

从表2可以看出，菌株540在pH X(X＝5.5、6.0、6.5)酸性条件下产酸量与菌株CCTCC M 2011192在碱性条件下产酸量相当，甚至更多，而且酸性发酵条件使得在产酸过程中无需添加大量的碱来维持碱性环境，简化了二元酸产品的提取工艺，并避免了发酵过程中大量高盐废水的产生，大大减轻了给环境带来的不利影响，而且发酵时间有效缩短。

实施例15为进一步验证上述突变提取酵母540HYG的基因组DNA，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR扩增包含突变后的CYP52A12和HYG抗性基因的DNA片段，凝胶电泳后所用引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.8，PCR反应条件同实施例3(3)，进行回收纯化，大小约为4Kb，经测序证实无误，其序列为SEQ ID NO：18。

CYP52A12-F:5'-ATGGCCACACAAGAAATCATCG-3'(SEQ ID NO：17)，

CYP52A12_Down-R:5'-CGAAGTCGTAATCCGCAACG-3'(SEQ ID NO：8)，

将上述DNA片段(SEQ ID NO：18)同源重组入菌株CCTCC M 2011192的过程同实施例4，筛选得到的单克隆的P450基因的测序步骤同实施例6。经测序确认，挑取的单克隆中整合入带有突变的P450基因，突变位点与SEQ ID NO：11一致。将其中一株菌命名为541HYG。

发酵时间的测定方法同实施例5。结果表明，与540HYG一致，541HYG在pH5.5时发酵时间与亲代菌株相比，有明显缩短，结果如表3所示。

表3

实施例16将实施例15所述DNA片段(SEQ ID NO：18)同源重组入热带假丝酵母(CCTCC M 203052)，方法同实施例4。筛选得到的单克隆与亲代菌株(CCTCC M203052)基因组中CYP52A12基因的序列分析方法同实施例6。经测序证实，亲代菌株(CCTCC M 203052)的CYP52A12的基因序列与GENBANK(登录号AY230498，SEQ ID NO：19)公布的序列一致，而筛选得到的克隆中该基因携带有突变，突变位点与SEQ ID NO：11一致。将其中一株菌命名为542HYG。

发酵时间的测定方法同实施例5。结果表明，542HYG在pH5.5时发酵时间与亲代菌株(CCTCC M 203052)相比，有明显缩短，结果如表4所示。

表4

菌株及pH条件	菌株CCTCC M 203052于pH 7.5	菌株542HYG于pH5.5
			发酵时间(h)	138	114
产酸量(mg/g)	140.7	131.9

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> CYP52A12基因的定向进化及其在二元酸生产中的应用

<130> PA18147CN1

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物CYP52A12-F

<400> 1

caaaacagca ctccgcttgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物 CYP52A12-R

<400> 2

ggatgacgtg tgtggcttga 20

<210> 3

<211> 5873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 载体pCIB2

<400> 3

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物CYP52A12_HYG-F

<400> 4

tcaagccaca cacgtcatcc gcatgcgaac ccgaaaatgg 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物CYP52A12_HYG-R

<400> 5

gatgtggtga tgggtgggct gctagcagct ggatttcact 40

<210> 6

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> HYG

<400> 6

tcaagccaca cacgtcatcc gcatgcgaac ccgaaaatgg agcaatcttc cccggggcct 60

ccaaatacca actcacccga gagagataaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata 120

tccaccaagg taagtaactc agagttaatg atacaggtgt acacagctcc ttccctagcc 180

attgagtggg tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc 240

aattccatgg ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct 300

ctgaaaatct tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc 360

caccctccct tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta 420

ctttccctcc ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga 480

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg 540

tctccgacct catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 600

gagggcgtgg atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 660

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 720

aattcagcga gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 780

acctccctga aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga 840

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 900

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 960

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca 1020

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 1080

acaatgtcct cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 1140

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 1200

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 1260

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1320

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 1380

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1440

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 1500

agtgtgctac ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata 1560

aataggatgc aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa 1620

tgaagtctat gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag 1680

tctgtaaaaa aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg 1740

aaatccagct gctagcagcc cacccatcac cacatc 1776

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物CYP52A12_Down-F

<400> 7

agcccaccca tcaccacatc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物 CYP52A12_Down-R

<400> 8

cgaagtcgta atccgcaacg 20

<210> 9

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CYP52A12_Down

<400> 9

agcccaccca tcaccacatc cctctactcg acaacgtcca aagacggcga gttctggtgt 60

gcccggaaat cagccatccc ggccacatac aagcagccgt tgattgcgtg catactcggc 120

gagcccacaa tgggagccac gcattcggac catgaagcaa agtacattca cgagatcacg 180

ggtgtttcag tgtcgcagat tgagaagttc gacgatggat ggaagtacga tctcgttgcg 240

gattacgact tcg 253

<210> 10

<211> 4255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 同源重组片段

<400> 10

caaaacagca ctccgcttgt cacaggttgt ctcctctcaa ccaacaaaaa aataagatta 60

aactttcttt gctcatgcat caatcggagt tatctctgaa agagttgcct ttgtgtaatg 120

tgtgccaaac tcaaactgca aaactaacca cagaatgatt tccctcacaa ttatataaac 180

tcacccacat ttccacagac cgtaatttca tgtctcactt tctcttttgc tcttctttta 240

cttagtcagg tttgataact tcctttttta ttaccctatc ttatttattt atttattcat 300

ttataccaac caaccaacca tggccacaca agaaatcatc gattctgtac ttccgtactt 360

gaccaaatgg tacactgtga ttactgcagc agtattagtc ttccttatct ccacaaacat 420

caagaactac gtcaaggcaa agaaattgaa atgtgtcgat ccaccatact tgaaggatgc 480

cggtctcact ggtattctgt ctttgatcgc cgccatcaag gccaagaacg acggtagatt 540

ggctaacttt gccgatgaag ttttcgacga gtacccaaac cacaccttct acttgtctgt 600

tgccggtgct ttgaagattg tcatgactgt tgacccagaa aacatcaagg ctgtcttggc 660

cacccaattc actgacttct ccttgggtac cagacacgcc cactttgctc ctttgttggg 720

tgacggtatc ttcaccttgg acggagaagg ttggaagcac tccagagcta tgttgagacc 780

acagtttgct agagaccaga ttggacacgt taaagccttg gaaccacaca tccaaatcat 840

ggctaagcag atcaagttga accagggaaa gactttcgat atccaagaat tgttctttag 900

atttaccgtc gacaccgcta ctgagttctt gtttggtgaa tccgttcact ccttgtacga 960

tgaaaaattg ggcatcccaa ctccaaacga aatcccagga agagaaaact ttgccgctgc 1020

tttcaacgtt tcccaacact acttggccac cagaagttac tcccagactt tttacttttt 1080

gaccaaccct aaggaattca gagactgtaa cgccaaggtc caccacttgg ccaagtactt 1140

tgtcaacaag gccttgaact ttactcctga agaactcgaa gagaaatcca agtccggtta 1200

cgttttcttg tacgaattgg ttaagcaaac cagagatcca aaggtcttgc aagatcaatt 1260

gttgaacatt atggttgccg gaagagacac cactgccggt ttgttgtcct ttgctttgtt 1320

tgaattggct agacacccag agatgtggtc caagttgaga gaagaaatcg aagttaactt 1380

tggtgttggt gaagactccc gcgttgaaga aattaccttc gaagccttga agagatgtga 1440

atacttgaag gctatcctta acgaaacctt gcgtatgtac ccatctgttc ctgtcaactt 1500

tagaaccgcc accagagaca ccactttgcc aagaggtggt ggtgctaacg gtaccgaccc 1560

aatctacatt cctaaaggct ccactgttgc ttacgttgtc tacaagaccc accgtttgga 1620

agaatactac ggtaaggacg ctaacgactt cagaccagaa agatggtttg aaccatctac 1680

taagaagttg ggctgggctt atgttccatt caacggtggt ccaagagtct gcttgggtca 1740

acaattcgcc ttgactgaag cttcttatgt gatcactaga ttggcccaga tgtttgaaac 1800

tgtctcatct gatccaggtc tcgaataccc tccaccaaag tgtattcact tgaccatgag 1860

tcacaacgat ggtgtctttg tcaagatgta aagtagtcga tgctgggtat tcgattacat 1920

gtgtatagga agattttggt tttttattcg ttcttttttt taatttttgt taaattagtt 1980

tagagatttc attaatacat agatgggtgc tatttccgaa actttacttc tatcccctgt 2040

atcccttatt atccctctca gtcacatgat tgctgtaatt gtcgtgcagg acacaaactc 2100

cctaacggac ttaaaccata aacaagctca gaaccataag ccgacatcac tccttcttct 2160

ctcttctcca accaatagca tggacagacc caccctccta tccgaatcga agacccttat 2220

tgactccata cccacctgga agcccctcaa gccacacacg tcatccgcat gcgaacccga 2280

aaatggagca atcttccccg gggcctccaa ataccaactc acccgagaga gataaagaga 2340

caccacccac cacgagacgg agtatatcca ccaaggtaag taactcagag ttaatgatac 2400

aggtgtacac agctccttcc ctagccattg agtgggtatc acatgacact ggtaggttac 2460

aaccacgttt agtagttatt ttgtgcaatt ccatggggat caggaagttt ggtttggtgg 2520

gtgcgtctac tgattcccct ttgtctctga aaatcttttc cctagtggaa cactttggct 2580

gaatgatata aattcacctt gattcccacc ctcccttctt tctctctctc tctgttacac 2640

ccaattgaat tttctttttt tttttacttt ccctccttct ttatcatcaa agataagtaa 2700

gtttatcaat tgcctattca gaatgaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa 2760

gtttctcatc gaaaagttcg acagcgtctc cgacctcatg cagctctcgg agggcgaaga 2820

atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctccggg taaatagctg 2880

cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc 2940

gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctcacctatt gcatctcccg 3000

ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct ccctgaaacc gaactccccg ctgttctcca 3060

gccggtcgcg gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt 3120

cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc 3180

gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc 3240

cgtcgcgcag gctctcgatg agctcatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca 3300

cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctcacg gacaatggcc gcataacagc 3360

ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt 3420

cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca 3480

tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca 3540

actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg 3600

cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag 3660

cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc 3720

cagcactcgt ccgagggcaa aggaatagtg tgctacccac gcttactcca ccagagctat 3780

taacatcaga aatatttatt ctaataaata ggatgcaaaa aaaaaacccc ccttaataaa 3840

aaaaaaagaa acgatttttt atctaatgaa gtctatgtat ctaacaaatg tatgtatcaa 3900

tgtttattcc gttaaacaaa aatcagtctg taaaaaaggt tctaaataaa tattctgtct 3960

agtgtacaca ttctcccaaa atagtgaaat ccagctgcta gcagcccacc catcaccaca 4020

tccctctact cgacaacgtc caaagacggc gagttctggt gtgcccggaa atcagccatc 4080

ccggccacat acaagcagcc gttgattgcg tgcatactcg gcgagcccac aatgggagcc 4140

acgcattcgg accatgaagc aaagtacatt cacgagatca cgggtgtttc agtgtcgcag 4200

attgagaagt tcgacgatgg atggaagtac gatctcgttg cggattacga cttcg 4255

<210> 11

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 突变的基因

<400> 11

atggccacac aagaaatcat cgattctgta cttccgtact tgaccaaatg gtacactgtg 60

attactgcag cagtattagt cttccttatc tccacaaaca tcaagaacta cgtcaaggca 120

aagaaattga aatgtgtcga tccaccatac ttgaaggatg ccggtctcac tggtattctg 180

tctttgatcg ccgccatcaa ggccaagaac gacggtagat tggctgactt tgccgatgaa 240

gttttcgacg agtacccaaa ccacaccttc tacttgtctg ttgccggtgc tttgaagatt 300

gtcatgactg ttgacccaga aaacatcaag gctgtcttgg ccacccaatt cactgacttc 360

tccttgggta ccagacacgc ccactttgct cctttgttgg gtgacggtat cttcaccttg 420

gacggagaag gttggaagca ctccagagct atgttgagac cacagtttgc tagagaccag 480

attggacacg ttaaagcctt ggaaccacac atccaaatca tggctaagca gatcaagttg 540

aaccagggaa agactttcga tatccaagaa ttgttcttta gatttaccgt cgacaccgct 600

actgagttct tgtttggtga atccgttcac tccttgtacg atgaaaaatt gggcatccca 660

actccaaacg aaatcccagg aagagaaaac tttgccgctg ctttcaacgt ttcccaacac 720

tacttggcca ccagaagtta ctcccagact ttttactttt tgaccaaccc taaggaattc 780

agagactgta acgccaaggt ccaccacttg gccaagtact ttgtcaacaa ggccttgaac 840

tttactcctg aagaactcga agagaaatcc aagtccggtt acgttttctt gtacgaattg 900

gttaagcaaa ccagagatcc aaaggtcttg caagatcaat tgttgaacat tatggttgca 960

ggaagagaca ccactgccgg tttgttgtcc tttgctttgt ttgaattggc tagacaccca 1020

gagatgtggt ccaagttgag agaagaaatc gaagttaact ttggtgttgg tgaagactcc 1080

cgcgttgaag aaattacctt cgaagccttg aagagatgtg aatacttgaa ggctatcctt 1140

aacgaaacct tgcgtatgta cccatctgtt cctgtcaact ttagaaccgc caccagagac 1200

accactttgc caagaggtgg tggtgctaac ggtaccgacc caatctacat tcctaaaggc 1260

tccactgttg cttacgttgt ctacaagacc caccgtttgg aagaatacta cggtaaggac 1320

gctaacgact tcagaccaga aagatggttt gaaccatcta ctaagaagtt gggctgggct 1380

tatgttccat tcaacggtgg tccaagaatc tgcttgggtc aacaattcgc cttgactgaa 1440

gcttcttatg tgatcactag attggcccag atgtttgaaa ctgtctcatc tgatccaggt 1500

ctcgaatacc ctccaccaaa gtgtattcac ttgaccatga gtcacaacga tggtgtcttt 1560

gtcaagatgt aa 1572

<210> 12

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 去除抗性基因的基因

<400> 12

gtgcaggaca caaactccct aacggactta aaccataaac aagctcagaa ccataagccg 60

acatcactcc ttcttctctc ttctccaacc aatagcatgg acagacccac cctcctatcc 120

gaatcgaaga cccttattga ctccataccc acctggaagc ccctcaagcc acacacgtca 180

tccagcccac ccatcaccac atccctctac tcgacaacgt ccaaagacgg cgagttctgg 240

tgtgcccgga aatcagccat cccggccaca tacaagcagc cgttgattgc gtgcatactc 300

ggcgagccca caatgggagc cacgcattcg gaccatgaag caaagtacat tcacgagatc 360

acgggtgttt cagtgtcgca gattgagaag ttcgacgatg gatggaagta cgatctcgtt 420

gcggattacg acttcg 436

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物 CYP52A12_Ter-F

<400> 13

gtgcaggaca caaactccct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物 CYP52A12_Down-R

<400> 14

cgaagtcgta atccgcaacg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物 HYG-F

<400> 15

ctcggagggc gaagaatctc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物HYG-R

<400> 16

caatgaccgc tgttatgcgg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物CYP52A12-F

<400> 17

caaaacagca ctccgcttgt 20

<210> 18

<211> 3936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 包含突变后的CYP52A12和HYG抗性基因的DNA片段

<400> 18

atggccacac aagaaatcat cgattctgta cttccgtact tgaccaaatg gtacactgtg 60

attactgcag cagtattagt cttccttatc tccacaaaca tcaagaacta cgtcaaggca 120

aagaaattga aatgtgtcga tccaccatac ttgaaggatg ccggtctcac tggtattctg 180

tctttgatcg ccgccatcaa ggccaagaac gacggtagat tggctaactt tgccgatgaa 240

gttttcgacg agtacccaaa ccacaccttc tacttgtctg ttgccggtgc tttgaagatt 300

gtcatgactg ttgacccaga aaacatcaag gctgtcttgg ccacccaatt cactgacttc 360

tccttgggta ccagacacgc ccactttgct cctttgttgg gtgacggtat cttcaccttg 420

gacggagaag gttggaagca ctccagagct atgttgagac cacagtttgc tagagaccag 480

attggacacg ttaaagcctt ggaaccacac atccaaatca tggctaagca gatcaagttg 540

aaccagggaa agactttcga tatccaagaa ttgttcttta gatttaccgt cgacaccgct 600

actgagttct tgtttggtga atccgttcac tccttgtacg atgaaaaatt gggcatccca 660

actccaaacg aaatcccagg aagagaaaac tttgccgctg ctttcaacgt ttcccaacac 720

tacttggcca ccagaagtta ctcccagact ttttactttt tgaccaaccc taaggaattc 780

agagactgta acgccaaggt ccaccacttg gccaagtact ttgtcaacaa ggccttgaac 840

tttactcctg aagaactcga agagaaatcc aagtccggtt acgttttctt gtacgaattg 900

gttaagcaaa ccagagatcc aaaggtcttg caagatcaat tgttgaacat tatggttgcc 960

ggaagagaca ccactgccgg tttgttgtcc tttgctttgt ttgaattggc tagacaccca 1020

gagatgtggt ccaagttgag agaagaaatc gaagttaact ttggtgttgg tgaagactcc 1080

cgcgttgaag aaattacctt cgaagccttg aagagatgtg aatacttgaa ggctatcctt 1140

aacgaaacct tgcgtatgta cccatctgtt cctgtcaact ttagaaccgc caccagagac 1200

accactttgc caagaggtgg tggtgctaac ggtaccgacc caatctacat tcctaaaggc 1260

tccactgttg cttacgttgt ctacaagacc caccgtttgg aagaatacta cggtaaggac 1320

gctaacgact tcagaccaga aagatggttt gaaccatcta ctaagaagtt gggctgggct 1380

tatgttccat tcaacggtgg tccaagagtc tgcttgggtc aacaattcgc cttgactgaa 1440

gcttcttatg tgatcactag attggcccag atgtttgaaa ctgtctcatc tgatccaggt 1500

ctcgaatacc ctccaccaaa gtgtattcac ttgaccatga gtcacaacga tggtgtcttt 1560

gtcaagatgt aaagtagtcg atgctgggta ttcgattaca tgtgtatagg aagattttgg 1620

ttttttattc gttctttttt ttaatttttg ttaaattagt ttagagattt cattaataca 1680

tagatgggtg ctatttccga aactttactt ctatcccctg tatcccttat tatccctctc 1740

agtcacatga ttgctgtaat tgtcgtgcag gacacaaact ccctaacgga cttaaaccat 1800

aaacaagctc agaaccataa gccgacatca ctccttcttc tctcttctcc aaccaatagc 1860

atggacagac ccaccctcct atccgaatcg aagaccctta ttgactccat acccacctgg 1920

aagcccctca agccacacac gtcatccgca tgcgaacccg aaaatggagc aatcttcccc 1980

ggggcctcca aataccaact cacccgagag agataaagag acaccaccca ccacgagacg 2040

gagtatatcc accaaggtaa gtaactcaga gttaatgata caggtgtaca cagctccttc 2100

cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta caaccacgtt tagtagttat 2160

tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg ggtgcgtcta ctgattcccc 2220

tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc tgaatgatat aaattcacct 2280

tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca cccaattgaa ttttcttttt 2340

ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta agtttatcaa ttgcctattc 2400

agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctcat cgaaaagttc 2460

gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc 2520

gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa 2580

gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac 2640

attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg 2700

ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc agccggtcgc ggaggccatg 2760

gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa 2820

ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga tccccatgtg 2880

tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat 2940

gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc 3000

ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag 3060

gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg 3120

gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg 3180

ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt 3240

gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc 3300

ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat 3360

ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca 3420

aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta ttaacatcag aaatatttat 3480

tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa aaaaaaaaga aacgattttt 3540

tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca atgtttattc cgttaaacaa 3600

aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc tagtgtacac attctcccaa 3660

aatagtgaaa tccagctgct agcagcccac ccatcaccac atccctctac tcgacaacgt 3720

ccaaagacgg cgagttctgg tgtgcccgga aatcagccat cccggccaca tacaagcagc 3780

cgttgattgc gtgcatactc ggcgagccca caatgggagc cacgcattcg gaccatgaag 3840

caaagtacat tcacgagatc acgggtgttt cagtgtcgca gattgagaag ttcgacgatg 3900

gatggaagta cgatctcgtt gcggattacg acttcg 3936

<210> 19

<211> 4115

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<400> 19

catatgcgct aatcttcttt ttctttttat cacaggagaa actatcccac ccccacttcg 60

aaacacaatg acaactcctg cgtaacttgc aaattcttgt ctgactaatt gaaaactccg 120

gacgagtcag acctccagtc aaacggacag acagacaaac acttggtgcg atgttcatac 180

ctacagacat gtcaacgggt gttagacgac ggtttcttgc aaagacaggt gttggcatct 240

cgtacgatgg caactgcagg aggtgtcgac ttctccttta ggcaatagaa aaagactaag 300

agaacagcgt ttttacaggt tgcattggtt aatgtagtat ttttttagtc ccagcattct 360

gtgggttgct ctgggtttct agaataggaa atcacaggag aatgcaaatt cagatggaag 420

aacaaagaga taaaaaacaa aaaaaaactg agttttgcac caatagaatg tttgatgata 480

tcatccactc gctaaacgaa tcatgtgggt gatcttctct ttagttttgg tctatcataa 540

aacacatgaa agtgaaatcc aaatacacta cactccgggt attgtccttc gttttacaga 600

tgtctcattg tcttactttt gaggtcatag gagttgcctg tgagagatca cagagattat 660

cacactcaca tttatcgtag tttcctatct catgctgtgt gtctctggtt ggttcatgag 720

tttggattgt tgtacattaa aggaatcgct ggaaagcaaa gctaactaaa ttttctttgt 780

cacaggtaca ctaacctgta aaacttcact gccacgccag tctttcctga ttgggcaagt 840

gcacaaacta caacctgcaa aacagcactc cgcttgtcac aggttgtctc ctctcaacca 900

acaaaaaaat aagattaaac tttctttgct catgcatcaa tcggagttat ctctgaaaga 960

gttgcctttg tgtaatgtgt gccaaactca aactgcaaaa ctaaccacag aatgatttcc 1020

ctcacaatta tataaactca cccacatttc cacagaccgt aatttcatgt ctcactttct 1080

cttttgctct tcttttactt agtcaggttt gataacttcc ttttttatta ccctatctta 1140

tttatttatt tattcattta taccaaccaa ccaaccatgg ccacacaaga aatcatcgat 1200

tctgtacttc cgtacttgac caaatggtac actgtgatta ctgcagcagt attagtcttc 1260

cttatctcca caaacatcaa gaactacgtc aaggcaaaga aattgaaatg tgtcgatcca 1320

ccatacttga aggatgccgg tctcactggt attctgtctt tgatcgccgc catcaaggcc 1380

aagaacgacg gtagattggc taactttgcc gatgaagttt tcgacgagta cccaaaccac 1440

accttctact tgtctgttgc cggtgctttg aagattgtca tgactgttga cccagaaaac 1500

atcaaggctg tcttggccac ccaattcact gacttctcct tgggtaccag acacgcccac 1560

tttgctcctt tgttgggtga cggtatcttc accttggacg gagaaggttg gaagcactcc 1620

agagctatgt tgagaccaca gtttgctaga gaccagattg gacacgttaa agccttggaa 1680

ccacacatcc aaatcatggc taagcagatc aagttgaacc agggaaagac tttcgatatc 1740

caagaattgt tctttagatt taccgtcgac accgctactg agttcttgtt tggtgaatcc 1800

gttcactcct tgtacgatga aaaattgggc atcccaactc caaacgaaat cccaggaaga 1860

gaaaactttg ccgctgcttt caacgtttcc caacactact tggccaccag aagttactcc 1920

cagacttttt actttttgac caaccctaag gaattcagag actgtaacgc caaggtccac 1980

cacttggcca agtactttgt caacaaggcc ttgaacttta ctcctgaaga actcgaagag 2040

aaatccaagt ccggttacgt tttcttgtac gaattggtta agcaaaccag agatccaaag 2100

gtcttgcaag atcaattgtt gaacattatg gttgccggaa gagacaccac tgccggtttg 2160

ttgtcctttg ctttgtttga attggctaga cacccagaga tgtggtccaa gttgagagaa 2220

gaaatcgaag ttaactttgg tgttggtgaa gactcccgcg ttgaagaaat taccttcgaa 2280

gccttgaaga gatgtgaata cttgaaggct atccttaacg aaaccttgcg tatgtaccca 2340

tctgttcctg tcaactttag aaccgccacc agagacacca ctttgccaag aggtggtggt 2400

gctaacggta ccgacccaat ctacattcct aaaggctcca ctgttgctta cgttgtctac 2460

aagacccacc gtttggaaga atactacggt aaggacgcta acgacttcag accagaaaga 2520

tggtttgaac catctactaa gaagttgggc tgggcttatg ttccattcaa cggtggtcca 2580

agagtctgct tgggtcaaca attcgccttg actgaagctt cttatgtgat cactagattg 2640

gcccagatgt ttgaaactgt ctcatctgat ccaggtctcg aataccctcc accaaagtgt 2700

attcacttga ccatgagtca caacgatggt gtctttgtca agatgtaaag tagtcgatgc 2760

tgggtattcg attacatgtg tataggaaga ttttggtttt ttattcgttc ttttttttaa 2820

tttttgttaa attagtttag agatttcatt aatacataga tgggtgctat ttccgaaact 2880

ttacttctat cccctgtatc ccttattatc cctctcagtc acatgattgc tgtaattgtc 2940

gtgcaggaca caaactccct aacggactta aaccataaac aagctcagaa ccataagccg 3000

acatcactcc ttcttctctc ttctccaacc aatagcatgg acagacccac cctcctatcc 3060

gaatcgaaga cccttattga ctccataccc acctggaagc ccctcaagcc acacacgtca 3120

tccagcccac ccatcaccac atccctctac tcgacaacgt ccaaagacgg cgagttctgg 3180

tgtgcccgga aatcagccat cccggccaca tacaagcagc cgttgattgc gtgcatactc 3240

ggcgagccca caatgggagc cacgcattcg gaccatgaag caaagtacat tcacgagatc 3300

acgggtgttt cagtgtcgca gattgagaag ttcgacgatg gatggaagta cgatctcgtt 3360

gcggattacg acttcggtgg gttgttatct aaacgaagat tctatgagac gcagcatgtg 3420

tttcggttcg aggattgtgc gtacgtcatg agtgtgcctt ttgatggacc caaggaggaa 3480

ggttacgtgg ttgggacgta cagatccatt gaaaggttga gctggggtaa agacggggac 3540

gtggagtgga ccatggcgac gacgtcggat cctggtgggt ttatcccgca atggataact 3600

cgattgagca tccctggagc aatcgcaaaa gatgtgccta gtgtattaaa ctacatacag 3660

aaataaaaac gtgtcttgat tcattggttt ggttcttgtt gggttccgag ccaatatttc 3720

acatcatctc ctaaattctc caagaatccc aacgtagcgt agtccagcac gccctctgag 3780

atcttattta atatcgactt ctcaaccacc ggtggaatcc cgttcagacc attgttacct 3840

gtagtgtgtt tgctcttgtt cttgatgaca atgatgtatt tgtcacgata cctgaaataa 3900

taaaacatcc agtcattgag cttattactc gtgaacttat gaaagaactc attcaagccg 3960

ttcccaaaaa acccagaatt gaagatcttg ctcaactggt catgcaagta gtagatcgcc 4020

atgatctgat actttaccaa gctatcctct ccaagttctc ccacgtacgg caagtacggc 4080

aacgagctct ggaagctttg ttgtttgggg tcata 4115

<210> 20

<211> 523

<212> PRT

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(523)

<400> 20

Met Ala Thr Gln Glu Ile Ile Asp Ser Val Leu Pro Tyr Leu Thr Lys

1 5 10 15

Trp Tyr Thr Val Ile Thr Ala Ala Val Leu Val Phe Leu Ile Ser Thr

20 25 30

Asn Ile Lys Asn Tyr Val Lys Ala Lys Lys Leu Lys Cys Val Asp Pro

35 40 45

Pro Tyr Leu Lys Asp Ala Gly Leu Thr Gly Ile Ser Ser Leu Ile Ala

50 55 60

Ala Ile Lys Ala Lys Asn Asp Gly Arg Leu Ala Asn Phe Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Phe Asp Glu Tyr Pro Asn His Thr Phe Tyr Leu Ser Val Ala Gly

85 90 95

Ala Leu Lys Ile Val Met Thr Val Asp Pro Glu Asn Ile Lys Ala Val

100 105 110

Leu Ala Thr Gln Phe Thr Asp Phe Ser Leu Gly Thr Arg His Ala His

115 120 125

Phe Ala Pro Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Thr Leu Asp Gly Glu Gly

130 135 140

Trp Lys His Ser Arg Ala Met Leu Arg Pro Gln Phe Ala Arg Asp Gln

145 150 155 160

Ile Gly His Val Lys Ala Leu Glu Pro His Ile Gln Ile Met Ala Lys

165 170 175

Gln Ile Lys Leu Asn Gln Gly Lys Thr Phe Asp Ile Gln Glu Leu Phe

180 185 190

Phe Arg Phe Thr Val Asp Thr Ala Thr Glu Phe Leu Phe Gly Glu Ser

195 200 205

Val His Ser Leu Tyr Asp Glu Lys Leu Gly Ile Pro Thr Pro Asn Glu

210 215 220

Ile Pro Gly Arg Glu Asn Phe Ala Ala Ala Phe Asn Val Ser Gln His

225 230 235 240

Tyr Leu Ala Thr Arg Ser Tyr Ser Gln Thr Phe Tyr Phe Leu Thr Asn

245 250 255

Pro Lys Glu Phe Arg Asp Cys Asn Ala Lys Val His His Leu Ala Lys

260 265 270

Tyr Phe Val Asn Lys Ala Leu Asn Phe Thr Pro Glu Glu Leu Glu Glu

275 280 285

Lys Ser Lys Ser Gly Tyr Val Phe Leu Tyr Glu Leu Val Lys Gln Thr

290 295 300

Arg Asp Pro Lys Val Leu Gln Asp Gln Leu Leu Asn Ile Met Val Ala

305 310 315 320

Gly Arg Asp Thr Thr Ala Gly Leu Leu Ser Phe Ala Leu Phe Glu Leu

325 330 335

Ala Arg His Pro Glu Met Trp Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Val

340 345 350

Asn Phe Gly Val Gly Glu Asp Ser Arg Val Glu Glu Ile Thr Phe Glu

355 360 365

Ala Leu Lys Arg Cys Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Leu Asn Glu Thr Leu

370 375 380

Arg Met Tyr Pro Ser Val Pro Val Asn Phe Arg Thr Ala Thr Arg Asp

385 390 395 400

Thr Thr Leu Pro Arg Gly Gly Gly Ala Asn Gly Thr Asp Pro Ile Tyr

405 410 415

Ile Pro Lys Gly Ser Thr Val Ala Tyr Val Val Tyr Lys Thr His Arg

420 425 430

Leu Glu Glu Tyr Tyr Gly Lys Asp Ala Asn Asp Phe Arg Pro Glu Arg

435 440 445

Trp Phe Glu Pro Ser Thr Lys Lys Leu Gly Trp Ala Tyr Val Pro Phe

450 455 460

Asn Gly Gly Pro Arg Val Cys Leu Gly Gln Gln Phe Ala Leu Thr Glu

465 470 475 480

Ala Ser Tyr Val Ile Thr Arg Leu Ala Gln Met Phe Glu Thr Val Ser

485 490 495

Ser Asp Pro Gly Leu Glu Tyr Pro Pro Pro Lys Cys Ile His Leu Thr

500 505 510

Met Ser His Asn Asp Gly Val Phe Val Lys Met

515 520

<210> 21

<211> 523

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 修饰的CYP52A12蛋白

<400> 21

Met Ala Thr Gln Glu Ile Ile Asp Ser Val Leu Pro Tyr Leu Thr Lys

1 5 10 15

Trp Tyr Thr Val Ile Thr Ala Ala Val Leu Val Phe Leu Ile Ser Thr

20 25 30

Asn Ile Lys Asn Tyr Val Lys Ala Lys Lys Leu Lys Cys Val Asp Pro

35 40 45

Pro Tyr Leu Lys Asp Ala Gly Leu Thr Gly Ile Ser Ser Leu Ile Ala

50 55 60

Ala Ile Lys Ala Lys Asn Asp Gly Arg Leu Ala Asp Phe Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Phe Asp Glu Tyr Pro Asn His Thr Phe Tyr Leu Ser Val Ala Gly

85 90 95

Ala Leu Lys Ile Val Met Thr Val Asp Pro Glu Asn Ile Lys Ala Val

100 105 110

Leu Ala Thr Gln Phe Thr Asp Phe Ser Leu Gly Thr Arg His Ala His

115 120 125

Phe Ala Pro Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Thr Leu Asp Gly Glu Gly

130 135 140

Trp Lys His Ser Arg Ala Met Leu Arg Pro Gln Phe Ala Arg Asp Gln

145 150 155 160

Ile Gly His Val Lys Ala Leu Glu Pro His Ile Gln Ile Met Ala Lys

165 170 175

Gln Ile Lys Leu Asn Gln Gly Lys Thr Phe Asp Ile Gln Glu Leu Phe

180 185 190

Phe Arg Phe Thr Val Asp Thr Ala Thr Glu Phe Leu Phe Gly Glu Ser

195 200 205

Val His Ser Leu Tyr Asp Glu Lys Leu Gly Ile Pro Thr Pro Asn Glu

210 215 220

Ile Pro Gly Arg Glu Asn Phe Ala Ala Ala Phe Asn Val Ser Gln His

225 230 235 240

Tyr Leu Ala Thr Arg Ser Tyr Ser Gln Thr Phe Tyr Phe Leu Thr Asn

245 250 255

Pro Lys Glu Phe Arg Asp Cys Asn Ala Lys Val His His Leu Ala Lys

260 265 270

Tyr Phe Val Asn Lys Ala Leu Asn Phe Thr Pro Glu Glu Leu Glu Glu

275 280 285

Lys Ser Lys Ser Gly Tyr Val Phe Leu Tyr Glu Leu Val Lys Gln Thr

290 295 300

Arg Asp Pro Lys Val Leu Gln Asp Gln Leu Leu Asn Ile Met Val Ala

305 310 315 320

Gly Arg Asp Thr Thr Ala Gly Leu Leu Ser Phe Ala Leu Phe Glu Leu

325 330 335

Ala Arg His Pro Glu Met Trp Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Val

340 345 350

Asn Phe Gly Val Gly Glu Asp Ser Arg Val Glu Glu Ile Thr Phe Glu

355 360 365

Ala Leu Lys Arg Cys Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Leu Asn Glu Thr Leu

370 375 380

Arg Met Tyr Pro Ser Val Pro Val Asn Phe Arg Thr Ala Thr Arg Asp

385 390 395 400

Thr Thr Leu Pro Arg Gly Gly Gly Ala Asn Gly Thr Asp Pro Ile Tyr

405 410 415

Ile Pro Lys Gly Ser Thr Val Ala Tyr Val Val Tyr Lys Thr His Arg

420 425 430

Leu Glu Glu Tyr Tyr Gly Lys Asp Ala Asn Asp Phe Arg Pro Glu Arg

435 440 445

Trp Phe Glu Pro Ser Thr Lys Lys Leu Gly Trp Ala Tyr Val Pro Phe

450 455 460

Asn Gly Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Gln Gln Phe Ala Leu Thr Glu

465 470 475 480

Ala Ser Tyr Val Ile Thr Arg Leu Ala Gln Met Phe Glu Thr Val Ser

485 490 495

Ser Asp Pro Gly Leu Glu Tyr Pro Pro Pro Lys Cys Ile His Leu Thr

500 505 510

Met Ser His Asn Asp Gly Val Phe Val Lys Met

515 520

Claims (15)

1.一种分离的修饰的CYP52A12蛋白，其中参照SEQ ID NO：20的氨基酸编号，所述修饰的CYP52A12蛋白与未修饰的CYP52A12蛋白相比，在相应于SEQ ID NO：20的第76位的位置包括Asp和在相应于SEQ ID NO：20的第470位的位置包括Ile。

2.权利要求1的修饰的CYP52A12蛋白，其中所述修饰的CYP52A12蛋白包含与SEQ IDNO：20具有至少或至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的修饰的CYP52A12蛋白，其中所述修饰的CYP52A12蛋白包含SEQ IDNO：21所示的氨基酸序列。

4.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-3任一项的修饰的CYP52A12蛋白，优选所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

5.一种载体，其包含权利要求4的核酸分子，所述载体优选是原核载体、病毒载体或者真核载体。

6.一种突变的CYP52A12基因、其同源基因或其变体，其相对于GenBank登录号AY230498所示的基因，以起始密码子ATG第一位碱基为1计，发生了以下碱基突变：c.226A>G、c.960C>A、c.1408G>A；并且其中所述变体与突变的CYP52A12基因、其同源基因具有至少或至少约70％的序列同一性。

7.根据权利要求6所述的突变的CYP52A12基因、其同源基因或其变体，其中所述的突变的CYP52A12基因的序列如SEQ ID NO：10或11所示或与其具有至少或至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的同一性的序列。

8.一种修饰的微生物，其包含权利要求1-3任一项的修饰的CYP52A12蛋白、权利要求4的核酸分子和/或权利要求5的载体，优选所述微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和耶氏酵母属，更优选选自酵母菌，更优选选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

9.一种含有权利要求6或7所述的突变的CYP52A12基因、其同源基因或其变体的微生物，其相对于含有未突变的CYP52A12基因、其同源基因或其变体的微生物可以在酸性培养条件下生产长链二元酸，优选地，其中所述微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、耶氏酵母属；更优选地，其中所述微生物是酵母菌；更优选地，其中所述微生物选自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选地，选自C9～C18的长链二元酸，更优选地，选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种，更优选地，所述长链二元酸选自十二碳至十六碳二元酸中的至少一种或者正十二碳至十六碳二元酸中的至少一种。

11.根据权利要求9或10所述的微生物，其中所述酸性培养条件是指控制发酵体系的pH值为7.0以下，优选地，4.0～6.8，更优选地，5.0～6.5；所述控制发酵体系的pH值优选为控制发酵体系转化期时的pH值。

12.一种利用权利要求8-11任一项所述的微生物产生长链二元酸的方法，其包括培养权利要求8-11任一项所述的微生物的步骤，优选在酸性培养条件下生产长链二元酸，任选地还包括从培养产物分离、纯化长链二元酸的步骤。

13.一种通过定向进化长链二元酸合成途径的关键基因改造长链二元酸生产菌株的方法，其中改造后的长链二元酸生产菌株相对于改造前的菌株可以在酸性培养条件下生产长链二元酸，优选地，所述长链二元酸合成途径的关键基因是CYP52A12基因，优选其中改造后的长链二元酸生产菌株与改造前的菌株相比，包含突变的CYP52A12基因，所述突变的CYP52A12基因编码权利要求1-3任一项的修饰的CYP52A12蛋白。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选地，选自C9～C18的长链二元酸，更优选地，选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种，更优选地，所述长链二元酸选自十二碳至十六碳二元酸中的至少一种或者正十二碳至十六碳二元酸中至少一种；

和/或其中改造后的长链二元酸生产菌株相对于改造前的菌株可以在pH为7.0以下，优选地，4.0～6.8，更优选地，5.0～6.5下生产长链二元酸。

15.根据权利要求13到14任一项所述的方法，其包括步骤：

1)通过易错PCR制备带有突变的目的基因片段；

2)制备同源重组所需的目的基因上下游片段作为同源重组的模板以及抗性标记基因，优选地，所述抗性标记基因是潮霉素B抗性基因；

3)通过PCR重叠延伸制备完整的重组片段；

4)利用同源重组将所述重组片段引入菌株；

5)利用抗性标记筛选阳性菌株；

6)筛选长链二元酸产率得以提高和/或可以在酸性pH下生产长链二元酸的菌株；

7)任选地，筛选到的菌株进一步经过同源重组去除抗性筛选标记。