JPH10310556A - 微生物由来の多価不飽和脂肪酸エステルの分離精製方法 - Google Patents

微生物由来の多価不飽和脂肪酸エステルの分離精製方法

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JPH10310556A
JPH10310556A JP9137707A JP13770797A JPH10310556A JP H10310556 A JPH10310556 A JP H10310556A JP 9137707 A JP9137707 A JP 9137707A JP 13770797 A JP13770797 A JP 13770797A JP H10310556 A JPH10310556 A JP H10310556A
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ester
fatty acid
dha
dpa
liquid chromatography
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JP9137707A
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English (en)
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Takaharu Yamamura
隆治 山村
Yasushi Shimomura
泰志 下村
Isao Sogo
功 十合
Satohiro Tanaka
悟広 田中
Toshiaki Yaguchi
敏昭 矢口
Takanori Higashihara
孝規 東原
Harurou Nakahara
東郎 中原
Toshihiro Yokochi
俊弘 横地
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Y M SHII KK
Nagase and Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Suntory Ltd
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Y M SHII KK
Agency of Industrial Science and Technology
Nagase and Co Ltd
Suntory Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ドコサヘキサエン酸(DHA)、ドコサペン
タエン酸(DPA)などの多価不飽和脂肪酸(PUF
A)のエステル体を、微生物の培養菌体から、高効率か
つ低コストで、高純度まで精製し得る方法を提供するこ
と。 【解決手段】 多価不飽和脂肪酸エステルを分離精製す
る方法であって、多価不飽和脂肪酸エステルの2種以上
を含有する脂質混合物を、高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)によって精製する工程を含む方法。ここ
で、脂質混合物は、シゾキトリウム(Schizochytrium)属
SR21株の培養菌体抽出物をエステル化することによ
って得られる。そして、高速液体クロマトグラフィー
は、アルキルシランで誘導化された多孔性粒状基材を充
填剤として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物由来の多価
不飽和脂肪酸エステルの分離精製方法に関する。特に、
本発明は、ドコサヘキサエン酸(DHA)およびドコサ
ペンタエン酸(DPA)を含む、医薬品および機能性食
品の素材として有用な多価不飽和脂肪酸(PUFA)の
エステルを、高純度にかつ効率的に分離精製する方法に
関する。
【0002】
【従来の技術】近年、多価不飽和脂肪酸(PUFA)
は、特異な生理活性を有する化合物として注目を浴びて
いる。代表的なPUFAとしてα−リノレン酸(AL
A)、γ−リノレン酸(GLA)、ジホモ−γ−リノレ
ン酸(DGLA)、アラキドン酸(AA)、エイコサペ
ンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸(DP
A)、ドコサヘキサエン酸(DHA)などがある。PU
FAはプロスタグランジン類などの生理活性物質の前駆
体であることより研究が進み、様々な生理作用が報告さ
れている。魚油由来のEPAエチルエステルは、約92
%の純度の精製品が、閉塞性動脈硬化症を適応症とした
医薬品として1990年に市販された。
【0003】一方、DHAは、その生理活性機能として
コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、制癌作用、
さらには脳代謝系に関連して記憶学習能力の向上作用、
老人性痴呆症の予防作用、アルツハイマー疾病の治療作
用、稚魚の成長必須因子としての作用などが示されてい
る。そのため、健康食品やベビーミルク等の素材として
使用されるとともに、医薬品としての研究が進められて
いる。また、DPAは、生体間でDHAの欠乏に対する
代償となることが報告され、何らかの生理活性機能があ
ると考えられている。従って、DPAも医薬品として利
用できる可能性がある。なお、DPAには不飽和結合の
位置によって(n−3)系と(n−6)系とがあるが、
本明細書中で単に「DPA」という場合、(n−6)系
のDPAを指す。
【0004】これらのPUFAは、一般に化学合成の困
難な化合物である。一方、天然において、これらはトリ
グリセリドやリン脂質中の脂肪酸残基として存在する。
従って従来から、天然の素材からの抽出、精製が行われ
てきた。例えば、EPAおよびDHAは海産魚の魚油中
に含有されており、従来はイワシ油、マグロの眼窩油な
ど、比較的複雑な脂肪酸組成を有する魚油から取り出さ
れていた。
【0005】今後、PUFAを医薬品としての使用に供
するためには、少なくとも95%以上の純度、望ましく
は98%以上の純度が要求されるといわれる。遊離の脂
肪酸の状態では、そのような、試薬や医薬品として適切
なレベルの純度にまで精製することは困難である。その
ため、エステル体、特にエチルエステルとして精製する
ことが一般的に行われる。
【0006】従来、遊離の脂肪酸またはそのエステル体
(以下、−Eで表す)の複数の種類を含む混合物から、
特定の脂肪酸を分離するための方法として、主として炭
素数の差を利用する蒸留法および超臨界流体抽出法、主
として二重結合数の差を利用する低温分別法、尿素添加
法、および溶剤分別法の他、イオン交換樹脂によるクロ
マトグラフィーなどが知られている。これらの方法の組
合せによって、90〜92%程度までの高純度化は達成
できるようになってきた。
【0007】特に、DHAエステル(DHA−E)につ
いては、工業的規模での高純度化を指向した方法とし
て、精密蒸留と分取液体クロマトグラフィーとを組み合
わせた方法(DHA高度精製抽出技術開発事業研究報告
書(平成4〜6年度)、p.213、DHA高度精製抽出技術
研究組合発行(平成7年11月))の他に、銀イオン交換
粘土鉱物を用いる吸着クロマトグラフィー(同報告書,
p.231;山口ら、油化学、第40巻、第10号、p.959(199
1))、硝酸銀水溶液中での錯体形成を利用した液相抽出
法(同報告書,p.247;三澤ら、日本化学会第61春期
年会予稿集、p.1245(1991))などが開発されている。し
かしこれらの方法によっても、一回の精製工程によって
得られるDHA−Eの純度は、95%程度までであっ
た。より高い純度、例えば医薬品としての使用に適切な
98%以上の純度で、DHA−Eや他のPUFAエステ
ルを得るためには、装置、試薬、原料素材などとして特
に高価なものを使用したり、複雑な精製操作を組み合わ
せることが要求された。
【0008】このように従来の精製方法は、工業的な規
模において、合理的なコストで、再現性良く、高純度の
PUFAエステルを得るためには、満足のいくものでは
なかった。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
の解決を意図するものである。その目的は、DHA、D
PAなどのPUFAのエステル体を、微生物の培養菌体
から、高効率かつ低コストで、高純度まで精製し得る方
法を提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、PUF
Aエステルを分離精製する方法であって、PUFAエス
テルの2種以上を含有する脂質混合物を、高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)によって精製する工程を含
む。ここで、脂質混合物は、シゾキトリウム(Schizochy
trium)属SR21株の培養菌体抽出物をエステル化する
ことによって得られ、そして、高速液体クロマトグラフ
ィーは、アルキルシランで誘導化された多孔性粒状基材
を充填剤として用いる。
【0011】上記多孔性粒状基材は、30から100μ
mまでの範囲の粒子径、および100から130オング
ストロームまでの範囲の細孔径を有し得る。また、上記
多孔性粒状基材は、14%から19%までの範囲の炭素
含有率を有するオクタデシルシラン(ODS)誘導化シ
リカゲルであり得る。
【0012】上記高速液体クロマトグラフィーには、溶
離液としてメタノール、エタノール、またはそのいずれ
かを80%以上含有する水溶液を用い得る。
【0013】上記高速液体クロマトグラフィーによっ
て、95%以上の純度のDHAエステルおよび/または
DPAエステルが得られ得る。
【0014】
【発明の実施の形態】
(HPLCによる精製)本発明の方法において、HPL
Cのカラムに用いる充填剤は、アルキルシランで誘導化
された多孔性粒状基材である。本発明者らは、アルキル
シランで誘導化された充填剤が、適切な条件下、PUF
Aエステルの炭素数および不飽和結合数の違いを、従来
予測された程度を著しく越えるレベルの精度をもって識
別し得ることを発見し、これに基づいて本発明を完成し
た。
【0015】多孔性粒状基材としては、クロマトグラフ
ィー用基材として適切な任意の基材を用い得る。好まし
い基材には、水和酸化金属または水和酸化メタロイドが
含まれる。その例としては、水和酸化アルミナ、水和酸
化チタニウム、水和酸化ジルコニウム、水和酸化ケイ
素、水和酸化スズなどが挙げられる。より具体的には、
シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、シリカ
・アルミナ、チタニア、ケイソウ土、ケイ酸ガラス、ア
ルミノケイ酸塩、クレーカオリン、タルク、ゼオライト
などが例示できる。ガラスビーズ表面にシリカゲル微粒
子などをまぶした基材も、ここに含まれる。また、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート、およびそれらの
誘導体を含むポリマー粒子も、好ましい基材として用い
得る。シリカゲルが特に好ましい。この基材は、粒子径
および細孔径が適切な範囲にあるものが選択される。こ
こで、粒子径および細孔径は、シランで誘導化される前
の状態で測定される値をいう。この測定値は、例えば、
基材を走査型電子顕微鏡などで観察したときの、粒子の
平均値である。
【0016】粒子径の上限は、代表的には100μm、
好ましくは80μm、より好ましくは60μmである。
粒子径の下限は、代表的には30μm、好ましくは40
μm、より好ましくは45μmである。粒子径が大きす
ぎる場合、カラムの分離能が低下する傾向があるため、
PUFAエステルを高純度化することが困難になること
がある。粒子径が小さすぎる場合、HPLCにおいて溶
離液を輸送する圧力が高くなりすぎるため、PUFAエ
ステルを大量に分取することが困難になることがあり、
実用上好ましくない。なお、適切な粒子径は、HPLC
に用いるカラムのサイズ(内径×長さ)にも依存して変
化することに留意すべきである。
【0017】細孔径の上限は、代表的には130オング
ストローム、好ましくは125オングストロームであ
る。細孔径の下限は、代表的には100オングストロー
ム、好ましくは110オングストロームである。細孔径
が大きすぎるか、小さすぎる場合、溶質であるPUFA
エステルの拡散、保持挙動を最適化しにくくなる。
【0018】多孔性粒状基材は、アルキルシランで誘導
化される。アルキルシランの鎖長の上限は、代表的には
炭素数40、好ましくは炭素数30、より好ましくは炭
素数20である。鎖長の下限は、代表的には炭素数1、
好ましくは炭素数8である。炭素数が多すぎると、カラ
ムの分離能が低下する傾向がある。入手の容易さの点か
ら、炭素数18のオクタデシル基を有するオクタデシル
シラン(ODS)が特に好ましい。
【0019】多孔性粒状基材のアルキルシランによる誘
導化は、当該シランに由来する炭素含有率が適切な範囲
になるように行われる。この炭素含有率は、得られた充
填剤の疎水性を示す目安となる値であり、一般に元素分
析法によって測定される。ポリマーを基材として用いる
場合には、誘導化反応の仕込み量に基づいて、化学量論
的に算出することができる。炭素含有率の上限は、代表
的には19%、好ましくは18%、より好ましくは1
7.5%である。炭素含有率の下限は、代表的には14
%、好ましくは15%、より好ましくは16%である。
炭素含有率が高すぎるか、低くすぎると、カラムの分離
能が低下する傾向がある。
【0020】上記の誘導化のための反応は、所望のアル
キル基(例えば、トリアコンチル基、エイコシル基、オ
クタデシル基、オクチル基、n−ブチル基など)を有す
る適切なシラン化合物(例えば、クロロシラン化合物、
アルコキシシラン化合物など)を用いて、公知の方法に
よって行うことができる。また、粒子径、細孔径、およ
び炭素含有率が上述した適切な範囲にある、オクタデシ
ルシラン(ODS)および他のアルキルシランで誘導化
された種々のシリカゲルが、例えば、(株)ワイエムシィ
社より「YMC*GEL」の商品名で市販されている。
【0021】HPLCの溶離液としては、逆相クロマト
グラフィーに適切な任意の極性溶媒を用い得る。例え
ば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセ
トニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、テトロヒド
ロフラン、これらの組み合わせ、および、これらと水と
の組み合わせが挙げられる。メタノール、エタノール、
またはそのいずれかを80%以上(好ましくは90%以
上、より好ましくは95%以上)含有する水溶液は、好
ましい溶離液の例である。溶媒の種類および混合比は、
高純度化されるべきPUFAエステルの種類に応じて、
適宜選択される。溶離液の最適化は、当業者には容易で
ある。
【0022】例えば、メタノール、またはメタノールを
80%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは9
5%以上)含有する水溶液は、DHA−EとDPA−E
とを、同時に高純度で分取する場合に、好ましい溶離液
である。一方、エタノール、またはエタノールの80%
以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以
上)の水溶液は、DHA−Eのみを高純度に分取する場
合に、好ましい溶離液である。
【0023】本発明の方法において、充填剤を充填した
カラムへの、脂質混合物の一回のチャージ(負荷)量
は、脂質混合物中の、高純度化されるべきPUFAエス
テルの含有量、ならびに、HPLC上で当該エステルと
近接した保持時間を示す不要な化合物の含有量などに依
存して決定される。チャージ量は特に限定されるもので
はないが、通常、カラム容積1リットル当たり、約1g
から約10g程度まで可能である。従って、本発明によ
れば、工業的規模での実施に適用する場合でも十分に実
用的な効率で、PUFAエステルを分離精製することが
できる。
【0024】溶離液の流速など、HPLCの他の操作条
件は、当業者により適宜設定される。HPLCの装置と
しては、市販の適切な装置を利用し得る。工業的規模で
の実施は、サンプル溶解タンク、サンプル供給タンク、
溶出タンク、溶離液回収システムなどを含む適切なプラ
ントを設置して行うことができる。
【0025】カラムからの溶出物の検出には、紫外(U
V)検出器、屈折率(RI)検出器など、任意の適切な
手段を利用し得る。
【0026】(PUFAエステルを含む脂質混合物の調
製)本発明の方法によって、エステル体として分離精製
されるPUFAは、特にDHAおよび/またはDPAで
ある。
【0027】従来から、ある種の微生物、特に海洋性の
菌類または藻類を培養することによって、DHAなどを
含む油脂が得られることが知られていた(例えば、特開
平7−87988および特開平7−8268、および特
開平7−75556を参照)。本発明者らは、Schizoch
ytrium属SR21株が、その菌体中にDHAおよびDP
Aを含む脂質を特に高含量で蓄積することを報告してい
る(J. Am. Oil Chem.Soc., Vol.73, No.11, p.1421 (1
996))。ここで得られる脂質は、DHAおよびDPA
の他に飽和脂肪酸類を多く含むが、他のFUPAの含量
は通常かなり低い。従って、この微生物の培養菌体は、
DHAおよび/またはDPAを高純度化するために特に
有利に使用し得る。
【0028】Schizochytrium属SR21株は、例えば、
50%の人工海水を含み、グルコース、コーンステープ
リカーを基本とした培地を用いた、室温付近の温度、弱
酸性のpHの下、好気的条件での液体培養により、多量
のDHAおよびDPAを含む脂質成分を蓄積する。これ
ら培地組成、温度、pHなどの培養条件は、必要に応じ
て適宜変更され得る。適切な培養条件の選択は、当業者
には容易である。
【0029】なお、 Schizochytrium属SR21株は、
工業技術院生命工学工業技術研究所に「海生菌SR21
株」の名称で平成7年3月6日付けで寄託され、受託番
号FERM BP−5034を取得している。さらに、
財団法人発酵研究所に平成7年3月17日付けで寄託さ
れ、受入番号IFO 32693を取得している。
【0030】本発明の方法に用いる脂質は、上記寄託株
の培養によって得られるものに限られず、SR21株と
同一の菌学的性質を有し、同一の種に属すると認められ
る菌株の培養によって得られるものも含まれる。
【0031】SR21株の培養菌体を、必要に応じて乾
燥し、常法に従い、菌体の粉砕などの操作をした後、脂
質を抽出する。抽出された脂質をエステル化することに
よって、PUFAエステル、特にDHA−Eおよび/ま
たはDPA−Eを含有する脂質混合物が得られる。PU
FAエステルのエステル基は、代表的にはアルキル基で
ある。もっとも、ビニルなどのアルケニル基、フェニル
などのアリール基、およびベンジルなどのアリールアル
キル基などでもよい。アルキル基としては、炭素数1か
ら6までのアルキル基が好ましく、炭素数1から4まで
のアルキル基がより好ましい。ヒトに直接投与する医薬
品または機能性食品としては、エチルエステルが特に好
ましい。
【0032】エステル化の適切な反応条件は、当業者に
は公知である。例えば、脂質をヘキサンなどの有機溶媒
に溶解した後、アルカリ(例えば1Nの水酸化カリウム
を含むエタノール)を添加し、10〜25℃程度の温度
でエステル化を行うことができる。有機相を分液した
後、常法に従って濃縮すれば、エステル体を含む脂質混
合物が得られる。
【0033】この脂質混合物を、上述のように、HPL
Cに供する。本発明の方法によれば、一回のHPLCの
操作によって、目的とするPUFAエステル、特にDH
A−Eおよび/またはDPA−Eが高純度で得られる。
従って、上記のエステル化反応の後、予備的な精製操作
を行う必要はなく、直ちにHPLCを行うことができ
る。
【0034】本明細書中でPUFAエステルの純度と
は、HPLCまたはGCの少なくとも一方によって測定
される純度をいうものとする。本発明によれば、代表的
には95%以上、好ましくは98%以上、より好ましく
は99%以上の純度が達成できる。従って、得られたP
UFAエステルは、医薬品および機能性食品などの製造
に直ちに使用できる。
【0035】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【0036】なお、以下の実施例において、他に記載の
ない限り、DHA−EおよびDPA−Eの純度は、高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)による場合、分析
用カラムとして(株)ワイエムシィ社製YMC−Pack
AM−303を用い、溶離液としてアセトニトリル/
水(97.5/2.5)を流速1ml/分で流通させ、
UV(220nm)で検出することによって測定した。
【0037】(実施例1) (シゾキトリウム属SR21株による油脂の生産)グル
コース60g、ポリペプトン20g、酵母エキス10g
および50%濃度の人工海水1リットルからなる培地
(A)、またはグルコース90g、ポリペプトン10
g、コーンスチープリカー10gおよび50%濃度の人
工海水1リットルからなる培地(B)を用いて、ジャー
ファーメンター(培養槽容量5リットル、培地量3リッ
トル)での培養を行った。培養は、培養温度25℃、通
気量0.5vvm、および撹拌速度200rpmで行っ
た。
【0038】培養後、遠近分離法により菌体を集めて凍
結乾燥し、重量法により培地1リットル当たりの菌体量
を求めた。次いで、この乾燥菌体にクロロホルム/メタ
ノール(2/1;容積比)混合液を加え、ガラスビーズの
存在下でホモジナイズすることにより、菌体の破砕と油
脂(脂質)の抽出を行った。抽出液をFolch法により洗
浄した後、溶媒を留去して精製油脂を得、その重量を求
めた。
【0039】得られた油脂の一部について、油脂を10
%HClを含むメタノール溶液とジクロロメタンの等量
混合液に溶解し、60℃で2時間熱処理することにより
脂肪酸メチルエステルを調製し、油脂の脂肪酸組成をガ
スクロマトグラフ法により分析した。
【0040】ここで、GCの分離条件は次のようであっ
た。
【0041】 1)カラム:タイプ;キャピラリーカラム、TC−70、 メーカー;GLサンエンス社、 形状;直径0.25mm×長さ30m 2)流速:0.8ml/分、100kPa(カラム頭部圧力) 3)キャリアーガス:窒素ガス 4)カラム温度:昇温モード、170〜220℃(4℃/分) 5)検出:FID 分析の結果を表1および表2に示す。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】以上の結果から、シゾキトリウム属SR2
1株は、実用的な培養法である通気撹拌培養でも良好な
増殖を示すとともに、油脂を効率よく蓄積することが示
された。また、高度不飽和脂肪酸としては、ドコサヘキ
サエン酸(DHA)が極めて高い濃度で含有され、さら
にドコサペンタエン酸(DPA)も含有されているが、
アラキドン酸(AA)およびエイコサペンタエン酸(E
PA)をほとんど含まないことが示された。この結果
は、それら脂肪酸を10重量%前後含んでいる魚油とは
大きく異なっている。
【0045】上記のようにして得られた脂質(実験No.3
01)を、ヘキサン中で、水酸化カリウムを含むエタノー
ルの添加によってエステル化した。常法に従って後処理
することにより、脂肪酸のエステル体を含む脂質混合物
を得た。
【0046】(HPLCによる精製)粒子径50μm、
細孔径120オングストローム、炭素含有率17%の、
オクタデシルシラン(ODS)充填剤(YMC*GEL
ODS−AM−120−S50)を用いた。この充填
剤を充填した、内径400mm、長さ2000mmのカ
ラムを用いてHPLCを行い、DHA−EおよびDPA
−Eを分取した。用いた分取用HPLC装置は、(株)ワ
イエムシィ社製である。溶離液としてメタノールを使用
して、4.4リットル/分の流速で通液させた。
【0047】上記の脂質混合物1.42kgを、メタノ
ールの10%溶液として、カラムにチャージした。予め
検討した結果に基づく各成分の保持時間を基に、各成分
のフラクションを分取した。各フラクションをエバポレ
ートして溶剤を留去し、DHA−EおよびDPA−Eを
得た。得られたDHA−Eは0.36、DPA−Eは
0.07kgであった。
【0048】これらの純度を、HPLCにより分析した
ところ、DHA−Eは98.9%、DPA−Eは97.
7%であった。
【0049】(実施例2)充填剤(YMC*GEL O
DS−AM−120−S50)を充填した内径400m
m、長さ2000mmのカラムを用いてHPLCを行
い、DHA−EおよびDPA−Eを分取した。用いた分
取用HPLC装置は(株)ワイエムシィ社製である。溶離
液としてメタノール/水(98/2;容積比)の混合溶
液を使用して、4.4リットル/分の流速で通液させ
た。
【0050】実施例1と同じ脂質混合物1.33kg
を、メタノールの10%溶液として、カラムにチャージ
した。各成分のフラクションを分取し、各フラクション
をエバポレートして溶剤を留去し、DHA−EおよびD
PA−Eを得た。得られたDHA−Eは0.30kg、
DPA−Eは0.07kgであった。これらの純度をH
PLCにより分析したところ、DHA−Eは99.0
%、DPA−Eは99.7%であった。
【0051】(実施例3)粒子径約20μm、細孔径1
20オングストローム、炭素含有率17%の、ODS充
填剤(YMC*GEL ODS−A−120−S15/
30)を充填した内径6mm、長さ2000mmのカラ
ムを用いてHPLCを行い、DHA−EおよびDPA−
Eを分取した。用いた分取用HPLC装置は(株)島津製
作所製LC−8Aである。溶離液としてメタノール/水
(90/10;容積比)を使用して、1ml/分の流速
で通液させた。
【0052】各種脂質のエステル体を含む脂質の実施例
1と同じ脂質混合物480mgを、メタノールの10%
溶液として、カラムにチャージした。各成分のフラクシ
ョンを分取し、各フラクションをエバポレートして溶剤
を留去し、DHA−EおよびDPA−Eを得た。得られ
たDHA−Eは114.2mg、DPA−Eは11.1
mgであった。これらの純度をHPLCにより分析した
ところ、DHA−Eは99.3%、DPA−Eは99.
7%であった。
【0053】(実施例4)粒子径50μm、細孔径12
0オングストローム、炭素含有率約13%の、ODS充
填剤(YMC*GEL ODS−AQ−120−S5
0)を充填した内径6mm、長さ2000mmのカラム
を用いてHPLCを行い、DHA−EおよびDPA−E
を分取した。用いた分取用HPLC装置は(株)島津製作
所製LC−8Aである。溶離液としてエタノール/水
(95/5;容積比)を使用して、1ml/分の流速で
通液させた。
【0054】実施例1と同じ脂質混合物80mgを、メ
タノールの10%溶液として、カラムにチャージした。
各成分のフラクションを分取し、各フラクションをエバ
ポレートして溶剤を留去し、DHA−EおよびDPA−
Eを得た。得られたDHA−Eは28mg、DPA−E
は5mgであった。これらの純度をHPLCにより分析
したところ、DHA−Eは96.5%、DPA−Eは8
8.9%であった。
【0055】
【発明の効果】本発明の方法によれば、DHA、DPA
などのPUFAのエステル体を、高効率、低コストで、
高純度まで精製することができる。
【0056】本発明では、特に、DHAおよび/または
DPAを選択的に産生する微生物であるSchizochytrium
属SR21株の培養菌体からの抽出物を利用する。得ら
れる脂肪酸エステルは、その脂肪酸組成が比較的に単純
であるため、カラムへの1回のチャージ量を増やすこと
ができる。従って、高純度のPUFAエステルを多量に
かつ高収率で得ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)上記4名の代理人 弁理士 山本 秀策 (71)出願人 000001144 工業技術院長 東京都千代田区霞が関1丁目3番1号 (74)上記1名の復代理人 弁理士 山本 秀策 (外1 名) (71)出願人 597074239 東原 孝規 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (71)出願人 597074240 中原 東郎 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (71)出願人 597074251 横地 俊弘 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (74)上記3名の代理人 弁理士 山本 秀策 (72)発明者 山村 隆治 京都府久世郡久御山町田井新荒見69−1 株式会社ワイエムシィ分離センター内 (72)発明者 下村 泰志 石川県小松市国府台5丁目28番 株式会社 ワイエムシィ技術開発センター内 (72)発明者 十合 功 兵庫県神戸市西区美賀多台7丁目2−9 (72)発明者 田中 悟広 京都府福知山市長田野町1丁目52番地 ナ ガセ生化学工業株式会社内 (72)発明者 矢口 敏昭 大阪府三島郡島本町若山台1丁目1番1号 サントリー株式会社研究センター内 (72)発明者 東原 孝規 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 中原 東郎 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 横地 俊弘 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技術 院生命工学工業技術研究所内

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 多価不飽和脂肪酸エステルを分離精製す
    る方法であって、 多価不飽和脂肪酸エステルの2種以上を含有する脂質混
    合物を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によ
    って精製する工程を包含し、ここで、該脂質混合物は、
    シゾキトリウム(Schizochytrium)属SR21株の培養菌
    体抽出物をエステル化することによって得られ、そし
    て、該高速液体クロマトグラフィーは、アルキルシラン
    で誘導化された多孔性粒状基材を充填剤として用いる、
    方法。
  2. 【請求項2】 前記多孔性粒状基材が、30から100
    μmまでの範囲の粒子径、および100から130オン
    グストロームまでの範囲の細孔径を有する、請求項1に
    記載の方法。
  3. 【請求項3】 前記多孔性粒状基材が、14%から19
    %までの範囲の炭素含有率を有するオクタデシルシラン
    (ODS)誘導化シリカゲルである、請求項1または2
    に記載の方法。
  4. 【請求項4】 前記高速液体クロマトグラフィーが、溶
    離液としてメタノール、エタノール、またはそのいずれ
    かを80%以上含有する水溶液を用いる、請求項1から
    3までのいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項5】 前記高速液体クロマトグラフィーによっ
    て、95%以上の純度のドコサヘキサエン酸(DHA)
    エステルおよび/またはドコサペンタエン酸(DPA)
    エステルが得られる、請求項1から4までのいずれかに
    記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記多価不飽和脂肪酸エステルがエチル
    エステルである、請求項1から5までのいずれかに記載
    の方法。
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