JP4236128B2 - 精油組成物 - Google Patents
精油組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4236128B2 JP4236128B2 JP52338495A JP52338495A JP4236128B2 JP 4236128 B2 JP4236128 B2 JP 4236128B2 JP 52338495 A JP52338495 A JP 52338495A JP 52338495 A JP52338495 A JP 52338495A JP 4236128 B2 JP4236128 B2 JP 4236128B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipase
- dha
- epa
- fatty acids
- alcohol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C67/60—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by treatment giving rise to chemical modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
- C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
- C11C1/02—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils
- C11C1/04—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis
- C11C1/045—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis using enzymes or microorganisms, living or dead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
- C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
- C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
- C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
- C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
- C11C3/10—Ester interchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6454—Glycerides by esterification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
Description
本発明は、より高い濃度の多不飽和脂肪酸を有する精製された生成物を得るために、グリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を処理する新規な方法に関する。本発明は、特に好ましい態様において、魚油組成物中のＥＰＡおよびＤＨＡの濃度を上昇させる方法を提供する。
本明細書において「多不飽和脂肪酸」はオメガ−またはｎ−数を末端のメチル基から数えて最初の二重結合の位置で命名する方式に従い同定される。例えば、オメガ−３またはｎ−３の脂肪酸においては、酸の末端メチル基から第３番目の炭素炭素結合に最初の二重結合が現れる。さらに例えばＣ１８：３として脂肪酸が同定されていれば、これは鎖中に１８炭素原子を有し、かつ３つの二重結合を有する脂肪酸を表している。
商業的に重要な多不飽和脂肪酸は、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）およびＡＡ（アラキドン酸、Ｃ２０：４）である。ＩＵＰＡＣ（国際純正および応用化学連合）方式に従ったこれらの酸の完全な名称は、次の通りである。
ＥＰＡ
シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸
ＤＨＡ
シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸
ＡＡ
シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸
広く知られているように、ＥＰＡおよびＤＨＡは特に医薬産業および食品添加物産業においてその価値が上昇している。これらの酸はある種の海産油（marineoil）中に比較的高濃度で見出されるが、種々の目的のためには、これらの海産油を精製することにより、適切なレベルまでＥＰＡおよび／またはＤＨＡの含有量を増加させるか、あるいは原料油中に生来的に現出するある種の他の物質の濃度を減少させるか、さらにはその物質を排除することが必要である。例えば医薬および食品に用いることを目的とする場合には、人口密集地域からかなり離れた海洋域において捕獲された魚から得られたものであってさえも海産油中に広く現出する殺虫剤残渣を、実質的に完全に排除する必要がある。
ＥＰＡおよびＤＨＡが毒性無しに生物学的活性を発揮するためには、これらはその生来的に現出する状態に相当する完全なシス（Ｚ−Ｚ）立体配置を示していなければならない。しかしながらこれらの酸は、熱せられたときに極端にもろく、そして非常に容易に、急速な低分子量化、異性体化および過酸化反応を受ける。従って、ＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物を、有用な形態をしたそれら所望の酸を損失する危険なしに、精製することは極端に困難である。
ＥＰＡおよびＤＨＡは、多くはそのトリグリセリドとして海産油中に現出する。現在までのところ、最も実際的な精製方法は、低分子量アルコール（通常はエタノール）を用いて油をエステル化すること、または油を加水分解して遊離酸またはその塩を形成させることのどちらかから出発し、その後、所望の生成物を回収するための油の分別が開始されている。
しかし、海産原材料の複雑さの故に、高度に精製された形態の多不飽和脂肪酸誘導体は、どのような単一分別技法によっても容易に調製されない。従って、通常は複数の技法の組合せが用いられるが、その際には、原材料の組成、濃度および生成物に求められるその他の品質基準に応じて、特定の組合せが選択される。尿素錯化反応は、高ＥＰＡおよび／またはＤＨＡ含有量組成物を回収する方法に広く採用されている分別技法の一つである。
尿素は直鎖有機化合物と固体錯体を形成するという有用な特性を有している。脂肪酸またはエステルを含有する海産油組成物が尿素溶液に添加されたときに、酸の、より飽和した画分において、結晶性錯体が形成される。この結晶は、より不飽和な脂肪酸または脂肪酸エステルのラフィネートから除去され得る。
尿素錯化反応は、両方の遊離脂肪酸、ならびに脂肪酸のメチルまたはエチルエステルに対して用いられている。この技法は、尿素吸蔵形成のためのリアクターとしてキサゲ面を備えた熱交換器を用いて連続的になされることができる。エステルを分別するときには、最初に油をアルコールおよび／またはアルコール／水と反応させ、次に尿素錯化反応前にエステル／遊離脂肪酸を単離することが普通の手順であると思われる。しかし、その場でのエステル化と尿素分別との組合せも、欧州特許出願第０２５５８２４号明細書に記載されているように、実施されることができる。
そのような方法が、例えば２またはそれ以上の工程の分子蒸留と組み合わせて用いられれば、原料海産油由来のＥＰＡおよびＤＨＡが多くを占めるｎ−３多不飽和脂肪酸を８５重量％またはそれ以上含有する精製された生成物を製造することが可能である。しかし、精製された生成物の総回収率はあいにく低い。そのような従来の分別方法を用いた典型的な工業的操業において期待し得るのは、１０００トンの原料海産油から約６０〜８０トンの８５％ｎ−３脂肪酸濃縮物だけが回収されること、即ちわずか６〜８％の回収率である。この僅かな収率は、そのような精製方法が非常に割高であることのみでなく、それらの方法が大規模で複雑な装置を必要とすることをも意味している。
多くの環境汚染物質（例：殺虫剤および多塩素化ビフェニル）の親油性特質は、これらの化合物の海産脂質中への集積という結果を生む。不運にも、尿素はそのような汚染物質の多くとは錯体を形成せず、その結果、尿素錯化反応により得られる濃縮物は、元の海産油に比べて上昇した、多くの目的には許容され得ないほど高いレベルの殺虫剤およびその他の環境汚染物を含有する。従って、人間が消費するための精製魚油を製造するための、尿素錯化反応に基づく現行の精製方法は、複雑で高価な精製手順を包含して汚染物質レベルを許容され得る値まで減少させる必要がある。
本発明は、油組成物の多不飽和脂肪酸含量を増加させるための改良された方法、特にＥＰＡおよび／またはＤＨＡを増加した収率で魚油から回収するための産業的方法に適合した方法を提供することを目的とする。
公知のように、リパーゼは、ＥＰＡおよびＤＨＡ等の、海産油中に現出する非常に不安定なｎ−３多不飽和脂肪酸を包含する方法における触媒としての使用に好適である。これは、低温で作用し得るリパーゼの能力、その中性ｐＨおよび作用の穏やかさのためであり、これらは、シス−トランス異性体化、二重結合移行、重合化および酸化等の望ましくない副反応を最小限に留めることを助ける。そして、海産油中の脂肪酸の加水分解のためのリパーゼの利用は既によく文献に記述されている。
例えば、リーとランバートソン（Lie and Lambertsen in Comp. Biochem. Physiol. 80B No. 3, pages 447-450, 1985）は、タラから得られた腸管リパーゼがカラフトシシャモ油中にトリグリセリドとして存在する１８：４、２０：５および２２：６の多不飽和脂肪酸を優先的に加水分解したことを報告している。彼らは、この特異性が２０：５の酸、即ちＥＰＡに対して特に顕著であったと報告している。
一方、リーとランバートソンは、カンジダ・シリンドラセア（candida cylindracea）のリパーゼによって、カラフトシシャモから得られたトリグリセリドとしてはＣ14〜Ｃ18の飽和および不飽和脂肪酸が優先的に加水分解されたのに対し、長鎖モノエン類であるＣ２０：１およびＣ２２：１ならびに特に不飽和脂肪酸であるＣ１８：４が、そしてそれより少ない程度でＥＰＡおよびＤＨＡが、加水分解に対して抵抗性であったことも報告している（Lie and Lambertsen, Fette, Seifen, Anstrichmittel, 88, 365, 1986）。
ノグチら（Noguchi et al.）による日本特許５９−１４７９３号明細書は、飽和酸と不飽和酸とのリパーゼによる上記と同様の識別に基づく、高度に多不飽和な脂肪酸の濃縮物を調製するための方法を述べている。イワシとサバの油等の寄せ集め海産油からのエチルエステルは、種々のリパーゼ（Candida cylindracea、Aspergillus rhizopusおよびMucor mieheiのリパーゼ）で加水分解される。選択的加水分解は、加水分解された脂肪酸の分離後に２５％までのＥＰＡおよび１７％までのＤＨＡのエチルエステル濃縮物をもたらした。
別の日本特許１７２６９１号明細書（日本油脂、１９９０年）が、カンジダ・エスピー（Candida sp.）のリパーゼを用いた海産油の加水分解に基づく方法を述べている。ＥＰＡまたはそのエステルが遊離脂肪酸成分から得られ、そしてＤＨＡまたはそのエステルが残物グリセリド成分から得られた。この方法の操作は、脂肪酸とグリセリド成分の分離、低級アルキルを用いたエステル化、尿素錯化反応を用いた多不飽和脂肪酸の濃縮、そしてさらに、分子蒸留、超臨界ＣＯ2流体抽出または液体クロマトグラフィーによる精製を包含していた。タカギ（Takagi,Am. Oil Chem. Soc. 66, 488, 1988）は、固定化したマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼを用いてＥＰＡとＤＨＡを分離するための、リバース法（reverse process）に基づく方法を述べている。
尿素付加物法により日本産イワシ油から得られた多不飽和脂肪酸濃縮物が、室温でｎ−ヘキサン媒質中にてメタノールでエステル化された。リパーゼがＥＰＡとＤＨＡとを識別し、そして選択的エステル化が、５１％のＥＰＡと６％のＤＨＡを含みＥＰＡに富むメチルエステル濃縮物、ならびに５２％のＤＨＡと１２％のＥＰＡを含みＤＨＡに富む遊離脂肪酸濃縮物とを、それぞれ５９対４１の割合でもたらした。
ヤマネ（Yamane）およびその共同研究者らは、つい最近、種々のリパーゼを用いてタラ肝臓油および精製イワシ油を選択的に加水分解している（Agric. Biol.Chem. 54, 1459, 1990）。最良の結果はカンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）の非位置特異性リパーゼ、およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の１，３−特異性リパーゼにおいて得られたが、グリセリド生成物のＥＰＡ含有量を有意に上昇させたリパーゼは無かった。
海産油脂肪酸のエステルを加水分解するためのリパーゼの使用に関するこの先行研究から、次のことが明らかである。即ち、異なるリパーゼが全く異なる挙動をすること、ならびに、ある脂肪酸と別の脂肪酸との間またはあるタイプの脂肪酸と別のタイプの脂肪酸との間での非常に顕著な選択性が、リパーゼによりしばしば発揮されることである。
ある種のリパーゼのこの基質選択性がズイとワードによって利用され、そして彼らは、ｎ−３多不飽和脂肪酸に富む画分を調製するための、タラ肝臓油の、リパーゼで触媒されたアルコーリシスについて述べている（Zuyi and Ward,”Lipase-catalyzed alchoholysis to concentrate the n-3 polyunsaturated fatty acid of cod liver oil”, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, July, 601-606）。この著者らは９種類のリパーゼについて研究を行い、そして彼らはシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（Amano International Enzyme CoからのCES）が他のリパーゼよりも高い割合で魚油をアルコーリシスし、ＥＰＡおよびＤＨＡに非常に富むモノグリセリドを製造したことを見出した。この先行技術の方法において、（エタノールおよびイソプロパノールが使用されたが、）アルコールは、反応体と反応のための溶媒とを兼ねて採用された。
ズイとワードは反応媒質中の水の濃度の効果を研究し、そして彼らはリパーゼＣＥＳによる（イソプロパノールを用いた）アルコーリシスが０〜７．５％（v/v）の範囲内の含水量に連れて増加したことを見出した。公表されたデータは、５％（v/v）の含水量が最適であること、および２．５％（v/v）の含水量では油中に存在する元のトリグリセリドの４０％を越えるものが１２時間後でも未反応のままであったことを示している（これらの含水量は反応系に添加した水を指しており、魚油および「乾燥」酵素中に不可分に存在する少量の水は除外されているものと理解される）。付随してトリグリセリドから遊離脂肪酸への加水分解が（典型的には３０％を越える）非常に高い割合で生じており、例えば、５％（v/v）の含水量において、（アルコーリシスは僅か１５．５％であるのに比べて、）１８．９％の加水分解が生じている。
上記のズイとワードの方法は科学的には興味深いものであるが、不運にも、この方法は精製ＥＰＡ／ＤＨＡ組成物を工業的に調製するための改良された方法を提供していない。特に、リパーゼにより触媒された生成物中に大量の遊離脂肪酸が不可分に存在することが、その後に所望のｎ−３多不飽和脂肪酸を精製することを困難にしている。例えば、低い揮発性のために、従来の分子蒸留技法では遊離脂肪酸をグリセリドと分離することができない。さらに、エステルおよび遊離脂肪酸は実質的に異なる極性を有し、そしてモノ−およびジ−グリセリドはその中間的な極性であるので、抽出法では、これらをグリセリドと分離することができない。下記に示すとおり、これとは対照的に有利に、本発明は分子蒸留を用いて、多不飽和脂肪酸グリセリドを飽和および単不飽和脂肪酸エステルと分離するのみならず、同時に、所望の多不飽和脂肪酸グリセリド画分から殺虫剤および多塩素化ビフェニル等の環境汚染物質の除去をも行うことができる。
本発明者らは、本発明により、ズイとワードによって使用されたシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼを含むある種の特定のリパーゼが、実質的に無水の反応条件下に海産油中のトリグリセリド内の飽和および不飽和脂肪酸のエステル成分を選択的にエステル交換することに用いられ得ることを思いがけず見出した。そのようなエステル交換が、実質的に付随する加水分解無しに、変換の程度に応じて、主としてモノ−およびジグリセリドであるがトリグリセリドであってもよい、エステルとしてグリセロール成分に結合したままの残余ｎ−３多不飽和長鎖脂肪酸と、より感受性な飽和脂肪酸のモノエステルの混合物をもたらすことが判明した。
より具体的には、本発明は、より高濃度の多不飽和脂肪酸を有する精製された生成物を得るために、トリグリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を処理する方法であって、次の工程：
（ａ） 該油組成物を、実質的に無水の条件下、かつ飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、反応中に存在するＣ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量を超えない量であるＣ1〜Ｃ6アルコールを用いて、エステル交換反応に供する工程；そしてその後で、
（ｂ） 多不飽和脂肪酸のグリセリドに富む残余画分を、前記リパーゼで触媒されるエステル交換反応により製造された飽和および単不飽和脂肪酸エステルを含有する画分から分離する工程；
を含む方法を提供する。
既述の通り、本発明の方法は、海産油中で飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼを利用する。本発明者らは、多くのリパーゼが、本発明のエステル交換反応において比較的貧弱な活性を有するかまたは全く活性を有していないか、あるいは飽和および単不飽和脂肪酸を一方としてもう一方を多不飽和脂肪酸とする双方の間で貧弱な選択性を示すかのどちらかであることを見出した。このことは、例えば種々の細菌類のリパーゼ［Geotrichum candidum（GCL; Amano GC）、Aspergillus niger（ANL; Amano A）、Candida rugosa（CRL; Amano AY）、Chromobacterium viscosum（CVL; Sigma）、Humicula lanuginosa（HLL; Amano CE）、Rhizopus delemar（RDL; Amano D）、Rhizopus oryzae（ROL; Amano F）、Penicillium camembertii（PCL; Amano G）、Candida lipolytica（CLL; Amano L）、Mucor javanicus（MJL; Amano M）、およびRhizopus niveus（RNL; Amona N）］に当てはまる。カンジダ・アンタラクチカのリパーゼ［Candida antarctica（CAL; Novo SP435）］はエステル交換反応において高活性であることが見出されたが、不運なことに脂肪酸の異なるクラスの間での低い選択性を示したかまたは全く選択性を示さなかったので、本発明に用いるには適していない。
本発明者らの見出した、本発明の方法において使用し得るリパーゼの例は、良好なエステル交換活性ならびに多不飽和脂肪酸と飽和および単不飽和脂肪酸との間での適度な選択性を示すマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼ（MML; Novo Lipozyme）；他のリパーゼよりも活性が低いが双方共に満足すべき選択性を発揮するカンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼ（CCL; Sigma）およびペニシリウム・ログエフォルティイ（Penicillium roguefortii）のリパーゼ（PRL; Amano R）；ならびに、双方共に良好な活性および選択性を発揮するのでしばしば本発明に用いるに好ましいシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼ（PFL; Amano PS）およびシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（PSL; Amano AK）を包含する。
リパーゼの支持体材料上への固定化は幾つかの利点を提供し得る。例えば、固定化はリパーゼに高い安定性を与えるので、リパーゼがより長く持ちこたえる。また、固定化はリパーゼの回収をかなり容易にし、そしてその再使用を可能とするが、これはコストを劇的に低減する。また、固定化酵素が用いられるとエステル交換反応が扱い易くなり、そしてリパーゼが、やはり酵素的工業化方法にとって極めて重要な、連続法に適するようになる。ときには、固定化は酵素の能力における改善をもたらす。最後に、支持体表面上でのリパーゼの分散はリパーゼの基質への暴露を確実にし、それにより単位重量当たりの酵素活性を劇的に増大させ、そして酵素の投与量および従って酵素に関する費用を大きく削減する。
ＥＰＡとＤＨＡ双方に富む精製魚油組成物の調製が所望であれば、これらのｎ−３多不飽和脂肪酸双方に対して実質的に不活性なリパーゼ、即ちＥＰＡとＤＨＡとを有意に識別しないリパーゼを使用することが好ましい。このような場合にはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）とシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼが使用されることが好ましいが、後者のリパーゼが特に好ましい。これらのリパーゼは、アマノ・インターナショナル・エンザイム社（Amano International Enzyme Co of Nagoya, Japan）から入手可能である。
本発明の方法の重要な特徴は、リパーゼで触媒されるエステル交換が実質的に無水の反応条件下に実施されなければならないことである。好ましくは、反応系内の総水量は、海産油とリパーゼを含む全ての供給源からのものを合わせて１％（w/w）未満でなければならず、好ましくは０．５（w/w）未満であり、そして最も望ましくは０．０１〜０．２５％（w/w）の間である。（典型的な場合において、海産油出発材料は０．１〜０．２％（w/w）の水を含有し、アルコール試薬として使用される無水エタノールは０．２〜０．５％（w/w）の水を含有し、そしてリパーゼ調製物は２〜２．５％（w/w）の水を含有している。）
しかし、少量の水、一般的にはリパーゼの重量に基づいて約１〜２重量％が、活性を成立させるためには酵素系内に常に必要とされるので、完全な無水反応条件を採用することは不可能である。必要とする水の量は使用する酵素に非常に大きく依存する（例えばカンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼは本発明の方法において最大の活性を発揮するために約１０重量％の水の添加を必要とする）。後記実施例に示すとおり、これらの極少量の水は有意な加水分解を全く引き起こさず、そしてエステル交換された生成物中の遊離脂肪酸の濃度を３重量％未満に維持すること、即ち既述のズイとワードの報告の約１０％だけの加水分解率を維持することが可能である。
本発明の別の重要な特徴は、存在するアルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量、好ましくは９モル当量を越えないように制限されなければならないことである（換言すれば、３モル当量のアルコールが化学量論量である）。従って、アルコールは本質的に溶媒としてよりもむしろ反応体として働く。海産油トリグリセリドの、リパーゼで触媒される選択的エステル交換がそのような無溶媒反応系内で成功裏に生じることは驚くべきことである。好ましくは、実質的に化学量論量のアルコール、即ち存在するトリグリセリドに基づいて２〜５モル当量のアルコールが採用されるが、それは化学量論量よりも大過剰の量のアルコールが所望の多不飽和脂肪酸の低い回収をもたらすからである。
全てのＣ1〜Ｃ6アルコールを利用可能であるが、（典型的には０．１〜０．５重量％の範囲の含水量を有する）無水エタノールの使用が好ましい。入手し易さおよび費用がその理由であり、また実質的に無水な反応条件に留意してのことでもある。
また、エステル交換反応が実施される温度も厳密に制限されるものではない。しかし、温度の増大に連れて反応速度は増大するが反応の選択性は減少する。採用されるリパーゼによるが、一般的に反応は４０〜６０℃を越えない温度で実施されることが好ましく、（約２０℃の）室温で実施されることがより好ましい。
エステル交換は、例えば超臨界ＣＯ2のような超臨界液体を反応媒質として用いて実施されることができる。例えば、魚油のエタノリシスは２５０バール（２５０×１０5パスカル）、４０℃にて超臨界ＣＯ2中で実施される。超臨界ＣＯ2液体は、反応媒質としてのみならず、エステルと遊離脂肪酸とを残余グリセリドから分離することにも用いられることができる。
本発明による、海産油中のトリグリセリドの、リパーゼで触媒されるエステル交換は、説明のためのＣ1〜Ｃ6アルコールとしてエタノールを用いた、下記の単純化した反応式により模式的に説明されることができる。
工程（ａ）
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は元の組成物中にトリグリセリドとして存在する、混合した（飽和、単不飽和および多不飽和）脂肪酸を表し、
Ｒ’はｎ−３多不飽和脂肪酸を表し、そして
Ｒ”は飽和および単不飽和脂肪酸を表す。］
（単純化のために、１，２−および２，３−ジグリセリドおよび２−モノグリセリドだけが生成物側に示されている。）
グリセリド画分からのエチルエステル画分の分離は分子蒸留技法により適切に実施されるが、該技法において、相対的に揮発性のエチルエステルが揮発性に劣る残余グリセリド混合物から容易に除去されることができる。エステル交換反応の生成物は実質的に無水である反応条件の使用の結果として、遊離脂肪酸を少量だけ含有しているので、分子蒸留後には、所望でない飽和および単飽和脂肪酸を実質的に有しない残余画分が得られる。分子蒸留工程は少量の最も揮発性なモノグリセリドを蒸留物申に出現させるという結果を生むことがあるが、これらのモノグリセリドは主として比較的短鎖の脂肪酸のモノグリセリドである（即ち、ＥＰＡまたはＤＨＡは蒸留物中に僅かしか失われないか、または全く失われない）。同様に、少量の低揮発性のエステル画分、即ち主としてＥＰＡおよびＤＨＡ等の長鎖脂肪酸のエステルが、残余グリセリド混合物と共に残り得る。従って、所望の多不飽和脂肪酸の比較的量の少ない一部がエステル交換にあずかるが、それにもかかわらず、蒸留後の残余画分中に残る。これらのことから、分子蒸留は難しい分離に適しているとは一般的に見なされていないにもかかわらず、本発明の方法においては驚くほど有利であることが証明された。
殺虫剤および多塩素化ビフェニル（ＰＣＢ類）等の環境汚染物質は長鎖脂肪酸のグリセリドよりも揮発性であるので、分子蒸留はこれらの化合物をグリセリド画分から除去し、そしてこれらの化合物は蒸留物（エステル画分）中に濃縮される。これが、本発明の方法における分子蒸留の使用のさらに別の利点である。
実際、ある特定の態様において、本発明は、トリグリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物からの環境汚染物質の除去のための方法であって、次の工程：
（ａ） 該油組成物を、実質的に無水の条件下、かつ飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、反応中に存在するＣ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量を超えない量であるＣ1〜Ｃ6アルコールを用いて、エステル交換反応に供する工程；そしてその後で、
（ｂ） 工程（ａ）において得られた生成物を１またはそれ以上の分子蒸留に供して多不飽和脂肪酸のグリセリドに富み、かつ環境汚染物質が優先的に除去された残余画分を回収する工程；
を含む方法を提供する。
本発明の方法は、ＥＰＡおよびＤＨＡを４０重量％を越え、好ましくは７０重量％を越える高濃度で含有する組成物の海産供給源からの調製に特に適合している。リパーゼで触媒されるエステル交換の生成物は所望でない飽和および単不飽和脂肪酸を遊離酸としてよりはむしろ主としてそれらのエチルエステル（エチルアルコールが使用された場合）の形態で含有する（多不飽和脂肪酸は実質的にグリセリドとして残る）ので、飽和脂肪酸画分は、所望の多不飽和脂肪酸成分の比較的少ない損失を伴う比較的穏やかな分子蒸留により除去され得る。同時に、殺虫剤およびＰＣＢ類等の比較的揮発性の環境汚染物質が、上記で論じたように、エチルエステル画分と共に除去される。ＥＰＡ/ＤＨＡ濃縮物を製造するための従来法と比較すると、本発明は、特にその好ましい態様において、下記のような重要な利点をもたらす。即ち、
（ｉ） 溶媒の不存在が嵩高性の非常な減少をもたらし、この効果は化学量論濃度のアルコールだけを使用し得ることにより強調され；
（ii） エステル交換反応が、例えば室温のような穏やかな条件下に実施され得るので、副反応を最小限にし、そして高エネルギーの入力を必要とせず；
（iii） ＥＰＡおよびＤＨＡの回収が非常に高く、そして回収された生成物は環境汚染物質による汚染を本質的に被っておらず；そして
（iv） 用いられる実質的に無水である反応条件は最小限の加水分解をもたらしそれにより、エステル交換反応からのグリセリド画分の分子蒸留が、所望でない飽和および単不飽和脂肪酸からの所望の多不飽和脂肪酸の良好な分離を与える。
従って、本発明のアルコーリシス法は、ＥＰＡ＋ＤＨＡ濃縮物の製造のための統合（integral）製造方法における最初の段階となり得る。そのような統合方法において、飽和脂肪酸エチルエステル画分の多不飽和脂肪酸グリセリド画分からの分離を実施するための分子蒸留またはその他の技法の後、所望の多不飽和脂肪酸を含有する後者の画分はさらに、存在する特定の酸の濃度を上昇させるために処理されることができる。例えば、高度に濃縮されたＥＰＡおよびＤＨＡを含有するエチルエステル組成物を得ることが所望であれば、分子蒸留後に得られるグリセリド画分は、例えば、触媒量のナトリウムエトキシドまたはカリウムエトキシド等の存在下に無水エタノールを用いた化学的エステル交換によりエステル化されることができる。この方法は、次の反応式により模式的に説明される。
（単純化のために、１，２−および２，３−ジグリセリドおよび２−モノグリセリドだけが上記式中に示されている。）
次いで、製造されたグリセロールが公知の技法を用いて除去され得る。典型的には、これは、従来法に比べて非常に良好な多不飽和脂肪酸の回収による、約４５〜５０重量％のＥＰＡ＋ＤＨＡ含量をもたらす。
より具体的には、本発明による高濃度ＥＰＡ＋ＤＨＡ組成物を得るための統合方法は、さらに次の工程：
（ｃ） ナトリウムエトキシドまたはカリウムエトキシド等の塩基をエステル交換を触媒するに充分な量だけ含有するアルカリ性環境のような化学的触媒作用か、または実質的に無水である条件下でカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼを用いるような酵素的触媒作用を用いて、グリセリド画分を低級アルコールによりエステル交換する工程；
（ｄ） 得られたアルキルエステル生成物をアルカノール中で過剰の尿素と共に５５〜９９℃の温度に加熱する工程；
（ｅ） 工程（ｄ）の生成物を、例えば０〜２５℃に冷却して尿素脂肪酸アルキルエステル付加物を沈殿し、その後、該付加物を分離除去してｎ−３脂肪酸エステルを主に含有する溶液を残す工程；
（ｆ） 工程（ｅ）で残した溶液からｎ−３脂肪酸アルキルエステルを分離する工程；および
（ｇ） 工程（ｆ）で得られた混合物から全ての溶媒を除去する工程；
を含む。
本発明の統合方法の特に好ましい態様において、工程（ｇ）で得られた濃縮物が、例えば９工程の分子蒸留のような１種類またはそれ以上の手段によりさらに濃縮されて、その中に含まれるＥＰＡ＋ＤＨＡ濃度が８５重量％またはそれ以上に上昇させられる。
添付の図１は、８５重量％ＥＰＡ＋ＤＨＡエチルエステル濃縮物の製造のための、本発明によるそのような統合製造方法を模式的に説明している。
例えば触媒量のナトリウムエトキシドまたはカリウムエトキシドの存在下にエタノールを用いて行うような、グリセリド画分の化学的エステル交換の代替として、エステル交換は、例えばカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼを用いる等、酵素的に突施されることができる。このリパーゼはｎ−３多不飽和脂肪酸に対して、他の脂肪酸に対すると同様に非常に活性であり、そして採用されたときに、穏やかな条件下かつ溶媒の不存在下に高度に効率的にグリセリド画分のエステル交換を実施することにより、嵩高性のさらなる減少に寄与し得る。
幾つかの例において、出発海産油組成物から実質的に純粋な１種類の不飽和脂肪酸を単離することを所望されることがある。それぞれ実質的に１００％のＥＰＡおよび１００％のＤＨＡである生成物の製造のためのそのような方法が、添付図２において模式的に説明されている。本発明のこの態様は、本発明の教示に従い飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との最初の分離を達成するためのシュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼ（ＰＳＬ）のみならず、その後の工程において、ＤＨＡよりもむしろＥＰＡのエステル交換を選択的に好み、それによりこれら２つの酸の良好な分離を可能とするマコール・メイヘイ（Mucor miehei）のリパーゼ（ＭＭＬ）、ならびにそのようにして製造されたＤＨＡに富むグリセリド混合物のエタノリシスを実施するカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）をも利用する。
さらに具体的には、実質的に純粋なＥＰＡならびに実質的に純粋なＤＨＡを得るための、本発明による好ましい統合方法は、次の工程：
（ｉ） 出発海産油を上記の通り実質的に無水である反応条件下にＰＳＬを用いてエタノールによりエステル交換する工程；
（ii） リパーゼにより触媒されたエステル交換生成物を分子蒸留に供して４０〜５０％のＥＰＡ＋ＤＨＡを含有するグリセリド画分を回収する工程；
（iii） 工程（ii）からのグリセリド画分を最初のエステル交換と類似のエステル交換条件（即ち実質的に溶媒および水の不存在、かつ実質的に化学量論量のエタノールの使用）下にマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼ（ＭＭＬ）を用いてエタノールによりエステル交換する工程；
（iv） 得られたＥＰＡに富む画分と残余のＤＨＡに富むグリセリド混合物とを工程（ii）と類似の方式にて分子蒸留により分離する工程；
（ｖ） ＥＰＡ−エチルエステル画分を、分子蒸留を尿素沈殿、クロマトグラフィー等と組み合わせて用いること等により処理して実質的に１００％純度までＥＰＡ画分を濃縮する工程；
（vi） 工程（iii）より回収したＭＭＬ介在エステル交換からのＤＨＡに富むグリセリド混合物をカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）を用いてエタノールによりエステル交換する工程；および
（vii） 得られたＤＨＡエチルエステル濃縮物を工程（ｖ）で用いたと同様の技法により処理して実質的に１００％純粋なＤＨＡを回収する工程；
を含む。
高濃度のＥＰＡおよび／またはＤＨＡを有する組成物の製造のための統合方法に用いるようにうまく適合され得ることは本発明の特別の利点であるが、同様の一般的技法が、例えば１８：４ ｎ−３、２０：４ ｎ−３、２１：５ ｎ−３および２２：５ ｎ−３等のその他の不飽和脂肪酸を海産油から単離することに利用し得ることも着目されるべきである。本発明の方法は、例えば発酵生成物ならびに蔬菜および植物油等の他の供給源からの、多不飽和脂肪酸含有油生成物に適用可能である。ｎ−６多不飽和脂肪酸は植物および蔬菜油の特質である。そのようなｎ−６脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ ｎ−６）、ビスホモ−γ−リノレン酸（ＢＨＧＬＡ、２０：３ ｎ−６）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ ｎ−６）を包含する。アラキドン酸を含有する油生成物も、クサレケカビ属（Mortierella）を用いた発酵により工業的に得られている。
本発明の方法により、少なくとも４０重量％のアラキドン酸を含有する組成物を植物または蔬菜油から容易に調製し得ることが見出された。その方法に用いるに好ましいリパーゼは、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼおよびシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼである。アラキドン酸画分は実質的に１００％の純度までさらに濃縮されることができる。
一般的に、本発明の方法において出発材料として用いられる海産油組成物は、魚またはその他の海産供給源からの、そしてトリグリセリドの形態で多不飽和脂肪酸を包含する脂肪酸を含有する、未処理のまたは部分的に処理された油であれば、どのようなものであっても良い。典型的には、そのような海産油中のそれぞれのトリグリセリド分子は、種々の程度に、飽和、単不飽和または多不飽和であるか、あるいは長鎖または短鎖の、異なる脂肪酸エステル成分を含有する。
下記実施例により本発明が説明される。
実施例 １
本研究の目的は、多不飽和脂肪酸、特にＥＰＡおよびＤＨＡを、魚油組成物中の飽和および単不飽和脂肪酸から分離するための方法における種々のリパーゼの使用を試験することであった。
下記のリパーゼを試験した：
１つの試験において、上記リパーゼのそれぞれを３７℃で試験し、その結果を表Ｉに示した。別の試験においては、２種類のシュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼであるＰＦＬとＰＳＬを２０℃で試験し、その結果を表IIおよびIIIに示した。
試験に使用した手順は次の通りである：
魚油のトリグリセリドをプロノバ・バイオケア社（Pronova Biocare a.s., Norway）から調達したが、それは１４．９％のＥＰＡと９．８％のＤＨＡを含有していた。これらは、さらなる処理をすることなく調達したままで直接使用した。全ての溶媒は分析品質のものをメルク社（Merck AG in Germany）から購入した。特に断らない限り、化学量論量、即ちトリグリセリドに基づいて３モル当量の（無水）エタノールを使用した。カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼを用いた場合以外は、反応系に水は全く添加しなかった。魚油出発材料およびリパーゼから生じる水の含量を約０．３〜０．４重量％と計算した。カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼを用いた場合には、リパーゼの重量に基づき１０重量％の量で水を添加し、結果として総量で約０．８重量％の水を含有する反応系とし、この場合でさえも実質的に無水である条件を維持した。
脂肪酸の分析は、既に記載のある手順
に従い、キャリアガスとして水素ガスを用いた３０ｍの細管カラムＤＢ−２２５ ３０Ｎ ０．２５ｍｍを使用するパーキン−エルマー８１４０ガスクロマトグラフを採用して、エチルエステルについて実施した。それぞれＰＳＬとＰＦＬに関する表IIとIIIに示した詳細な研究のために、分取薄膜クロマトグラフィーを採用し、適当な時間間隔で脂質画分を反応混合物から分離して反応の進行を監視した。メルク社からのシリカゲルプレート（Art 5721）を、クロロホルム−メタノールの５０：５０混合液で洗浄し、１１０℃に３０分間加熱した後に用いた。溶離は、石油エーテル−ジエチルエーテル−酢酸の８０：２０：１混合液を用いて実施した。ローダミン（Rhodamine）６Ｇ（Merck社）を用いてバンドを視覚化し、続いてこれをこそげ取って上記の通り脂肪をメチル化して分析した。注入前に、内部標準としてシグマ社（Sigma）から購入したＣ19:0またはＣ21:0のメチルエステルを試料に添加した。
表Ｉに示した研究において、エチルエステルとグリセリドの分離は、ウオータースプレップエル［Waters PrepL（商標）］システム５００Ａ装置を用いて実施した。ミリポア社（Millipore）からのプレップパック［PrepPak（商標）］５００/シリカカートリッジカラムを、石油エーテル中の１０％エチルエーテルを流速２５０ｍＬ/分で用いて溶離した。それぞれの試行が屈折検出器の指数により２つのピークを与えたが、第１のピークは、ほぼ１つのカラム容量後に出現し、純粋なエチルエステルからなっており、そして第２のピークは、大ざっぱに、ＴＬＣによる純粋なトリグリセリドを含有する２つのカラム容量後に溶離した。残ったモノ−およびジ−グリセリドはメタノールによりカラムから洗い流した。
典型的な手順において、リパーゼ（０．５ｇ）を、魚油［５．０ｇ、約５．６７ミリモル（分子量約８８２ｇ/モル）］と無水エタノール（０．８０ｇ、１７．４ミリモル）の混合物に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素雰囲気下に室温（表Ｉの研究においては３７℃）で穏やかに攪拌した。適当な時間をおいた後、クロロホルムの添加および濾過による酵素の分離により反応を止めた。有機溶媒を真空下（回転蒸留器および高真空ポンプ処理）に除去して定量的収量で粗生成物混合物を得た。生成物を等量のクロロホルムに溶解し、上記の通りＨＰＬＣ装置に注入した。それぞれの画分を収集して溶媒を真空下に蒸留し、計量し、そして最後にガスクロマトグラフィーにて分析した。
分取ＨＰＬＣの代わりに分取ＴＬＣを用いた場合には、適当なときにパスツールピペットを用いて少量（１００〜２００ｍｇ）の試料を反応系から取り出した。試料を第２のパスツールピペット内に設置した綿羊毛栓に通すことにより、酵素粒子を分離した。次いで、ＴＬＣプレートに導入する前に、それぞれの試料をクロロホルムに希釈した（２５０ｍｇ/ｍＬ）。
結果を、下記表Ｉ〜IIIに示す：
最初の表である表Ｉは、試験したリパーゼ全てを用いて３７℃で（３モル当量のエタノールを用いて）実施された研究の結果を要約している。
カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼ（ＣＣＬ）についての結果は、このリパーゼが水の添加無しには不活性であるので、リパーゼに基づき１０％の添加水を用いて得られたものである。カンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）のＥＰＡとＤＨＡに対する貧弱な選択性が記録されたので、このリパーゼは本発明において有用では無い。対称的に、試験したその他のリパーゼは全て満足すべき活性および選択性を示し、そして２種類のシュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼはそれらの点において抜きん出ていた。
上記表IIは、エステル交換における優れた結果がシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼを用いて得られたことを明示している。即ち、１３時間後に４８％の変換に達し、９１．９％のＥＰＡの回収と８２．８％のＤＨＡの回収を伴う、グリセリド中の４４．９％のＥＰＡ＋ＤＨＡ含量をもたらした。２４時間の反応後には、５２％の変換が得られ、ＥＰＡとＤＨＡそれぞれについて８９．５と７７．５％の回収を伴う、４５．８％のＥＰＡ＋ＤＨＡ含量をもたらしたが、このことは、実施に当たっては、反応をこれより早い段階で止めることが好ましいであろうことを示唆している。副反応である加水分解の程度は、反応を通じ、２．５〜２．９％の範囲内に、定常的に低く維持された。
上記表IIIは、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼにおいてもエステル交換における良好な結果が得られたが、その変換速度はＰＳＬを用いたよりもやや遅いことを示している。即ち、２５時間後に、４８％の変換が得られ、それは４９時間後に６０％まで上昇した。反対に、加水分解の程度はやや低かった。また、このリパーゼの能力は、２５時間後における、ＥＰＡとＤＨＡの回収（それぞれ８８．６％と８４．１％）およびＥＰＡ＋ＤＨＡ組成物（４０．５％）に関して、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼの能力よりも劣っている。
上記表Ｉ〜IIIにおいて、下記略号を使用している：
ＭＧ モノグリセリド
ＤＧ ジグリセリド
ＴＧ トリグリセリド
ＦＦＡ 遊離脂肪酸
ＥＥ エチルエステル
面積％ＥＰＡ、面積％ＤＨＡおよび面積％ＥＰＡ＋ＤＨＡ
面積％は対応するＧＣクロマトグラムの積分に基づいている。
これらの略号は、後記実施例を通じて使用する。
上記表から、シュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼは双方共にＥＰＡとＤＨＡに対する独特の低い親和性を示すが、初期のトリグリセリド類に対しては高い親和性を示すことが明らかである。
また、２つのシュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼは、ＥＰＡよりはむしろＤＨＡのエステル交換を幾らか好む傾向があることにも注意すべきであろう。本発明者らが試験した他のリパーゼは全て逆の傾向を示すので、これは全く普通でない振る舞いである。
さらに、表IIおよびIIIから、一定時間後にＭＧ/ＤＧ/ＴＧの割合が最高値から減少し始めることにも着目すべきであろう。このことから、一般的に、エステル交換はそれが完了する前に終了することが好ましい。
実施例 ２
本研究は、大規模な試行において２種類のシュードモナス属（Pseudomons）のリパーゼを試験するために計画した。
実施例 ２ａ−ＰＳＬ
シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（１００ｇ、２５２００活性単位/ｇ）を魚油（１０００ｇ、約１．１３モル）と無水エタノール（１７０ｇ、３．７０モル）の混合物に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素雰囲気下に室温で磁力攪拌器で穏やかに攪拌した。反応混合液の含水量を約０．３〜０．４重量％であると計算した。
２５時間後、実施例１に記載の手順に従い試料を取り出し、分析した。反応はさらに２４時間続行させた。反応混合液とリパーゼとを分離するため（５０００ｒｐｍで１０分間の）遠心を採用した。
５０時間後に反応を停止した時点で、生成物は下記の組成を有していた：
生成物の一部（９０２．４ｇ）を真空下に８０℃で脱気して揮発性成分を除去した。揮発性成分を液体窒素で冷却したコールドトラップ内に収集した。脱気後、８４４．１ｇのグリセリド/エチル/エステル混合物が残った。この混合物を７５６．３ｇ取り、１２５℃、０．００５ミリバール（０．０５パスカル）にて分子蒸留用蒸留器内で蒸留した。これにより３５８．６ｇ（４７．４％）の蒸留物と３８８．３ｇ（５１．３％）の重さの残物を得た。それぞれの画分は下記の組成を有していた。
上記表Ｖは、残物が４７．３％のＥＰＡ＋ＤＨＡを含有していること、即ち分子蒸留前よりも高濃度にこれら所望のｎ−３多不飽和脂肪酸を含有していることを示している（表IV参照）。これは、さらなる濃縮のためには、公知技法を用いること、即ち分子蒸留の後に尿素画分法を用いることが理想的であることを意味している。
蒸留物がかなりの量のモノグリセリド（１０．６％）を含有している一方、残物は２．３％のエチルエーテルを含有していることに着目すべきである。既に論じたように、これらはそれぞれ、比較的単鎖の脂肪酸由来のモノグリセリドと長鎖脂肪酸由来のエチルエステルがほとんどであろう。
実施例 ２ｂ
実施例２ａで用いたと同じ油を１ｋｇ用意し、これをＰＦＬ酵素を用いてエタノールによりエステル交換した。反応は４８時間後に停止させた。中間生成物の組成を下記表VIに示す。
中間生成物を脱気し、実施例２ａと同様の条件下に分子蒸留した。その結果を下記に表として示す。
実施例 ３
実施例２のそれと類似の３つのパイロットプラント試行から得られた生成物を分析して環境汚染物質のレベルを測定した。その結果を下記表VIIに示す：
上記の結果は、汚染物質がエチルエステル画分内に濃縮されることを示している。幾つかの殺虫剤については、出発材料中のレベルが明らかに適用した分析法の検出限界を僅かに下回っていた。これが、本発明者らがこれらの殺虫剤をエチルエステル画分内では検出したが、元の魚油内では検出しなかったことの原因である。奇妙なことに、ＤＤＴのレベルは、元の油と比較してエチルエステル画分中で上昇しているようには見えない。本発明者らはエチルエステルとグリセリドを（分子蒸留により）分離する前に、穏やかな分子蒸留工程を実施して反応混合物中の未反応エタノールを除去した。明らかにこのエタノール除去がＤＤＴの一部を除去するに充分であった。回収したエタノールの分析（ＰＳＬの実施例）は０．０３ｍｇ/ｋｇの総ＤＤＴ量を示したが、一方その他の殺虫剤は検出されなかった。
実施例 ４
本研究の目的は、固定化リパーゼのための異なる手法を比較すること、ならびに本発明の方法においてリパーゼを固定化した形態で使用する効果を調べることであった。
Ａ． 固定化手法
（ｉ） デュオライト上へのＰＳＬとＰＦＬの固定化
デュオライト（Duolite）Ａ ５６２（Duolite International; １０．０ｇ）を、ブフナー漏斗上で３〜４回、３０ｍＭのＮａＯＨ（各２５０ｍＬ）を用いて洗浄した後、水（４０ｍＬ）および磁石攪拌子と共に１５０ｍＬ容ビーカー内に置いた。この溶液のｐＨを、自動滴定器（１．００Ｍ ＮａＯＨ）を用いてｐＨ８に調整した。最初のｐＨがｐＨ５．０よりも低いときには、ｐＨ８．０で平衡に達するまでに多大な時間を要する可能性がある。一方、ｐＨがｐＨ８以上であるときには、リパーゼ溶液を添加するまで滴定しない。水（２０ｍＬ）に溶解したリパーゼ（２．０ｇ、ＰＳＬ/ＰＦＬ）をパスツールピペットを介してデュオライト溶液に添加した。自動滴定器を用いて、添加する間中、ｐＨをｐＨ８．０〜８．４の間に維持し、そして溶液を１時間磁力攪拌器を用いて攪拌した。その後では、９５〜９９％のリパーゼがデュオライト上に固定化されていた。攪拌後、リパーゼ調製物を緩衝溶液（トリス塩酸；ｐＨ８．０）で洗浄した。最後に、固定化リパーゼ調製物を、真空（０．１〜０．０１ｍｍＨｇ）下に０．５〜１時間かけて乾燥した。乾燥過程を速めるために蒸気浴（４０℃）を使用することができる。固定化リパーゼ調製物は冷蔵庫（４℃）内に保存した。
（ii） アンバーライト上へのＰＳＬの固定化
アンバーライト（Amberlite）ＸＡＤ−７樹脂（５０ｇ；Rohm and Haas；含水量７０％）をｐＨ７、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で完全に洗浄（各１２５ｍＬで２回）した。ＰＳＬ粉末（Amano AK；１．５ｇ；２０，０００リパーゼ単位（ＬＵ、トリブチリン加水分解に基づき１分間の間に生成される遊離脂肪酸のμモルとして規定）；１７ＬＵ/ｍｇ）を、ｐＨ７．０で０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＬ）に溶解した。ｐＨの低下が生じたときにはｐＨを７．０に調整した。次いで、リパーゼ溶液を樹脂に添加し、そして得られた懸濁液を、トリブチリン加水分解による上澄み液の活性計測により確かめて、少なくとも９５％の固定化が起こるまで（約１時間）攪拌した。
（iii） 固定化リパーゼ調製物の活性計測
固定化樹脂（約４０ｍｇ）を正確に計り取り、ｎ−ブチルパルミテート（３１０〜３１５ｍｇ）に添加した。この混合物に９５％エタノール（１２０μＬ）を添加し、そして混合物を９０分間良く攪拌した。試料を収集し、ＧＬＣにより分析した。リパーゼアルコール単位（ＬＡＵ）は、１分間の間に生成されるパルミテートの量（μモル）として規定されている。
Ｂ． 固定化ＰＳＬを用いた生産性研究
デュオライトおよびアンバーライトの双方の上に固定化したＰＳＬについて、魚油エタノリシス生産性研究を、次の方法に従い実施した。
（ｉ） 固定化ＰＳＬを用いた生産性研究
魚油（１００ｇ）、無水エタノール（２０ｍＬ）および水（１ｍＬ）を全て混合し、得られた混合物を、良好な分散系が形成されるまで強く攪拌した。湿分を含まない固定化リパーゼ（１０ｇ）をこの分散系に添加し、透明な溶液が形成されるまで強くかき混ぜた。次いで、混合物を、約５０％の変換が達成されるまで（２４時間）穏やかに攪拌した。リパーゼを濾過して分離してその後の試行に使用し、その一方で、前述のようにして脂肪を分析した。
デュオライト上に固定化したＰＳＬを用いた生産性研究の結果を下記表VIIIに示す。
表VIIIは、１０回の連続試行において常に高い割合の変換（４６〜５５％）が得られ、これにより固定化リパーゼの生産性が立証されたことを示している。ＥＰＡおよびＤＨＡの回収は、５０％の量のリパーゼだけが用いられてさえも常に、リパーゼ粉末に関して表IIに示された回収と少なくとも同じであるかまたはそれより優っていた。従って、グリセリド生成物混合物中のＥＰＡ＋ＤＨＡ含有量は実際に非常に高い割合である４４〜５５％の範囲で残った。加水分解副反応の程度は、表IIにおけるそれよりも僅かに高い。これは、反応内の含水量は依然として規定限界である１％よりも低いものの、固定化リパーゼには粉末リパーゼよりも高い含水量が必要とされることの結果であると思われる。
デュオライトを用いた場合と正確に同じ反応条件下における、アンバーライト上に固定化したＰＳＬを用いた生産性研究の結果を、下記表IXに示す。
表IXから、アンバーライト上での固定化はデュオライト上での固定化よりもさらに成功したことが明らかである。同等の結果を得るための固定化リパーゼの量は、デュオライトにおいて必要とされる量（不固定化リパーゼ粉末量の十分の一）の半分だけである。例えば、２４時間の反応期間の後で、８つの連続試行において一定程度の変換（４８〜５０％）が得られたが、このとき、グリセリド生成物混合物のＥＰＡ＋ＤＨＡ組成物は常に４５〜４７％残っていた。デュオライト調製物と比較したところ、ＥＰＡおよびＤＨＡの回収、ならびに加水分解の程度が類似していた（含水量は規定限界である１％より低いが、表中に加水分解の結果を示していない）。
実施例 ５
本研究の目的は、上述のようにしてＰＳＬの存在下に魚油をエステル交換して製造されるグリセリド混合物のエタノリシスにおける、カンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）およびマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼ（ＭＭＬ）の活性を評価することであった。
（ａ） グリセリドのＣＡＬエタノリシス
固定化ＣＡＬ（Novo-Nordisk、SP 435、含水量１〜２％；０．５ｇ）をグリセリド混合物（２．５ｇ；約８．５ミリモルのエステル当量；初期組成；２５．０％のＥＰＡと１５．１％のＤＨＡ、魚油のＰＳＬに触媒されたエステル交換により製造された）と無水エタノール（０．８０ｇ、１７．４ミリモル）に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素雰囲気下に室温で穏やかに攪拌した。適宜試料を収集し、既述のようにして分析した。反応は、２２時間後に、濾過により酵素を分離して停止させた。
その結果を下記表Ｘに示す。
表Ｘは、２０℃でＣＡＬを用いたグリセリド混合物のエタノリシスの進行を明示している。初期グリセリド混合物中に存在するエステル群のモル当量に基づいて約２倍過剰のエタノールを使用した。エチルエステル生成物の組成だけを表中に示している。反応が進行して２２時間の反応期間後に完了したことが判る。また、リパーゼはＥＰＡとＤＨＡの双方に対して高い活性を示したが、前者の脂肪酸、即ちＥＰＡに対して後者よりかなり高い活性を示すことが明白である。
（ｂ） グリセリドのＭＭＬエタノリシス
反応条件は、上記（ａ）で述べたＣＡＬエタノリシス反応の条件と同一であった。固定化ＭＭＬ（Novo-Nordisk, Lipozyme（商標）、含水量１０％；０．５ｇ）をグリセリド混合物（２．５ｇ；約８．５ミリモルのエステル当量；初期組成：２５％のＥＰＡと１５．１％のＤＨＡ、魚油のＰＳＬに触媒されたエステル交換により製造された）と無水エタノール（０．８０ｇ、１７．４ミリモル）に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素下に室温で穏やかに攪拌した。適宜試料を収集し、既述のようにして分析した。反応は、２７時間後に、濾過により酵素を分離して停止させた。
前記ＣＡＬ反応において使用したと同じグリセリド試料の、２０℃でＭＭＬを用いたエタノリシスの進行を下記表XIに示す。
表XIから、ＭＭＬが、ＥＰＡ/ＤＨＡに富むグリセリドのエタノリシス反応においてＥＰＡとＤＨＡとの区別をかなりな程度に示すことは明白である。２７時間の反応期間後、５０％変換時点で、約８０％の初期ＤＨＡ含量が残余グリセリド混合物中に残っている。ＥＰＡの分布は好都合というほどのものではなく、エチルエステル中に５５％、そして依然としてグリセリド残物中に４５％であった。これは、類似の条件にグリセリド残物に対して２回目のエタノリシスを試行することにより改善し得る。また、ＭＭＬの活性は、この方法論により、ＥＰＡに富む魚油を使用してＥＰＡを製造する可能性、ならびに（マグロ油のような）ＤＨＡに富む魚油を使用してＤＨＡを製造する可能性を提供することにも着目すべきである。
実施例 ６
本研究の目的は、本発明の方法が植物および蔬菜油に適用可能であることを例証することであった。
アラキドン酸抽出物（ＡＡ）のＰＳＬに触媒されるエタノリシス
プロノバ・バイオケア（Pronova Biocare）社から調達した、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ ｎ−６）を３１．１％含有するアラキドン酸抽出物を、魚油について実施例１にて述べた方法（即ち１０％ＰＳＬ粉末、２０℃、５０％変換、２４時間）に従い処理した。
その結果を下記表XIIに示す。
表XIIは、５０％変換における８７％というグリセリド混合物中のＡＡの非常に高い回収を示したが、これは、相応する魚油反応におけるＥＰＡよりは低いもののＤＨＡよりは高い値である。加水分解副反応の程度は、魚油研究におけると同等の２％であった。グリセリド生成物混合物のＡＡ含量は５４．２％であった。驚くべきことに、これはＴＧ画分において最高であり、そしてＭＧ画分において最低であった。
本明細書において「多不飽和脂肪酸」はオメガ−またはｎ−数を末端のメチル基から数えて最初の二重結合の位置で命名する方式に従い同定される。例えば、オメガ−３またはｎ−３の脂肪酸においては、酸の末端メチル基から第３番目の炭素炭素結合に最初の二重結合が現れる。さらに例えばＣ１８：３として脂肪酸が同定されていれば、これは鎖中に１８炭素原子を有し、かつ３つの二重結合を有する脂肪酸を表している。
商業的に重要な多不飽和脂肪酸は、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）およびＡＡ（アラキドン酸、Ｃ２０：４）である。ＩＵＰＡＣ（国際純正および応用化学連合）方式に従ったこれらの酸の完全な名称は、次の通りである。
ＥＰＡ
シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸
ＤＨＡ
シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸
ＡＡ
シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸
広く知られているように、ＥＰＡおよびＤＨＡは特に医薬産業および食品添加物産業においてその価値が上昇している。これらの酸はある種の海産油（marineoil）中に比較的高濃度で見出されるが、種々の目的のためには、これらの海産油を精製することにより、適切なレベルまでＥＰＡおよび／またはＤＨＡの含有量を増加させるか、あるいは原料油中に生来的に現出するある種の他の物質の濃度を減少させるか、さらにはその物質を排除することが必要である。例えば医薬および食品に用いることを目的とする場合には、人口密集地域からかなり離れた海洋域において捕獲された魚から得られたものであってさえも海産油中に広く現出する殺虫剤残渣を、実質的に完全に排除する必要がある。
ＥＰＡおよびＤＨＡが毒性無しに生物学的活性を発揮するためには、これらはその生来的に現出する状態に相当する完全なシス（Ｚ−Ｚ）立体配置を示していなければならない。しかしながらこれらの酸は、熱せられたときに極端にもろく、そして非常に容易に、急速な低分子量化、異性体化および過酸化反応を受ける。従って、ＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物を、有用な形態をしたそれら所望の酸を損失する危険なしに、精製することは極端に困難である。
ＥＰＡおよびＤＨＡは、多くはそのトリグリセリドとして海産油中に現出する。現在までのところ、最も実際的な精製方法は、低分子量アルコール（通常はエタノール）を用いて油をエステル化すること、または油を加水分解して遊離酸またはその塩を形成させることのどちらかから出発し、その後、所望の生成物を回収するための油の分別が開始されている。
しかし、海産原材料の複雑さの故に、高度に精製された形態の多不飽和脂肪酸誘導体は、どのような単一分別技法によっても容易に調製されない。従って、通常は複数の技法の組合せが用いられるが、その際には、原材料の組成、濃度および生成物に求められるその他の品質基準に応じて、特定の組合せが選択される。尿素錯化反応は、高ＥＰＡおよび／またはＤＨＡ含有量組成物を回収する方法に広く採用されている分別技法の一つである。
尿素は直鎖有機化合物と固体錯体を形成するという有用な特性を有している。脂肪酸またはエステルを含有する海産油組成物が尿素溶液に添加されたときに、酸の、より飽和した画分において、結晶性錯体が形成される。この結晶は、より不飽和な脂肪酸または脂肪酸エステルのラフィネートから除去され得る。
尿素錯化反応は、両方の遊離脂肪酸、ならびに脂肪酸のメチルまたはエチルエステルに対して用いられている。この技法は、尿素吸蔵形成のためのリアクターとしてキサゲ面を備えた熱交換器を用いて連続的になされることができる。エステルを分別するときには、最初に油をアルコールおよび／またはアルコール／水と反応させ、次に尿素錯化反応前にエステル／遊離脂肪酸を単離することが普通の手順であると思われる。しかし、その場でのエステル化と尿素分別との組合せも、欧州特許出願第０２５５８２４号明細書に記載されているように、実施されることができる。
そのような方法が、例えば２またはそれ以上の工程の分子蒸留と組み合わせて用いられれば、原料海産油由来のＥＰＡおよびＤＨＡが多くを占めるｎ−３多不飽和脂肪酸を８５重量％またはそれ以上含有する精製された生成物を製造することが可能である。しかし、精製された生成物の総回収率はあいにく低い。そのような従来の分別方法を用いた典型的な工業的操業において期待し得るのは、１０００トンの原料海産油から約６０〜８０トンの８５％ｎ−３脂肪酸濃縮物だけが回収されること、即ちわずか６〜８％の回収率である。この僅かな収率は、そのような精製方法が非常に割高であることのみでなく、それらの方法が大規模で複雑な装置を必要とすることをも意味している。
多くの環境汚染物質（例：殺虫剤および多塩素化ビフェニル）の親油性特質は、これらの化合物の海産脂質中への集積という結果を生む。不運にも、尿素はそのような汚染物質の多くとは錯体を形成せず、その結果、尿素錯化反応により得られる濃縮物は、元の海産油に比べて上昇した、多くの目的には許容され得ないほど高いレベルの殺虫剤およびその他の環境汚染物を含有する。従って、人間が消費するための精製魚油を製造するための、尿素錯化反応に基づく現行の精製方法は、複雑で高価な精製手順を包含して汚染物質レベルを許容され得る値まで減少させる必要がある。
本発明は、油組成物の多不飽和脂肪酸含量を増加させるための改良された方法、特にＥＰＡおよび／またはＤＨＡを増加した収率で魚油から回収するための産業的方法に適合した方法を提供することを目的とする。
公知のように、リパーゼは、ＥＰＡおよびＤＨＡ等の、海産油中に現出する非常に不安定なｎ−３多不飽和脂肪酸を包含する方法における触媒としての使用に好適である。これは、低温で作用し得るリパーゼの能力、その中性ｐＨおよび作用の穏やかさのためであり、これらは、シス−トランス異性体化、二重結合移行、重合化および酸化等の望ましくない副反応を最小限に留めることを助ける。そして、海産油中の脂肪酸の加水分解のためのリパーゼの利用は既によく文献に記述されている。
例えば、リーとランバートソン（Lie and Lambertsen in Comp. Biochem. Physiol. 80B No. 3, pages 447-450, 1985）は、タラから得られた腸管リパーゼがカラフトシシャモ油中にトリグリセリドとして存在する１８：４、２０：５および２２：６の多不飽和脂肪酸を優先的に加水分解したことを報告している。彼らは、この特異性が２０：５の酸、即ちＥＰＡに対して特に顕著であったと報告している。
一方、リーとランバートソンは、カンジダ・シリンドラセア（candida cylindracea）のリパーゼによって、カラフトシシャモから得られたトリグリセリドとしてはＣ14〜Ｃ18の飽和および不飽和脂肪酸が優先的に加水分解されたのに対し、長鎖モノエン類であるＣ２０：１およびＣ２２：１ならびに特に不飽和脂肪酸であるＣ１８：４が、そしてそれより少ない程度でＥＰＡおよびＤＨＡが、加水分解に対して抵抗性であったことも報告している（Lie and Lambertsen, Fette, Seifen, Anstrichmittel, 88, 365, 1986）。
ノグチら（Noguchi et al.）による日本特許５９−１４７９３号明細書は、飽和酸と不飽和酸とのリパーゼによる上記と同様の識別に基づく、高度に多不飽和な脂肪酸の濃縮物を調製するための方法を述べている。イワシとサバの油等の寄せ集め海産油からのエチルエステルは、種々のリパーゼ（Candida cylindracea、Aspergillus rhizopusおよびMucor mieheiのリパーゼ）で加水分解される。選択的加水分解は、加水分解された脂肪酸の分離後に２５％までのＥＰＡおよび１７％までのＤＨＡのエチルエステル濃縮物をもたらした。
別の日本特許１７２６９１号明細書（日本油脂、１９９０年）が、カンジダ・エスピー（Candida sp.）のリパーゼを用いた海産油の加水分解に基づく方法を述べている。ＥＰＡまたはそのエステルが遊離脂肪酸成分から得られ、そしてＤＨＡまたはそのエステルが残物グリセリド成分から得られた。この方法の操作は、脂肪酸とグリセリド成分の分離、低級アルキルを用いたエステル化、尿素錯化反応を用いた多不飽和脂肪酸の濃縮、そしてさらに、分子蒸留、超臨界ＣＯ2流体抽出または液体クロマトグラフィーによる精製を包含していた。タカギ（Takagi,Am. Oil Chem. Soc. 66, 488, 1988）は、固定化したマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼを用いてＥＰＡとＤＨＡを分離するための、リバース法（reverse process）に基づく方法を述べている。
尿素付加物法により日本産イワシ油から得られた多不飽和脂肪酸濃縮物が、室温でｎ−ヘキサン媒質中にてメタノールでエステル化された。リパーゼがＥＰＡとＤＨＡとを識別し、そして選択的エステル化が、５１％のＥＰＡと６％のＤＨＡを含みＥＰＡに富むメチルエステル濃縮物、ならびに５２％のＤＨＡと１２％のＥＰＡを含みＤＨＡに富む遊離脂肪酸濃縮物とを、それぞれ５９対４１の割合でもたらした。
ヤマネ（Yamane）およびその共同研究者らは、つい最近、種々のリパーゼを用いてタラ肝臓油および精製イワシ油を選択的に加水分解している（Agric. Biol.Chem. 54, 1459, 1990）。最良の結果はカンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）の非位置特異性リパーゼ、およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の１，３−特異性リパーゼにおいて得られたが、グリセリド生成物のＥＰＡ含有量を有意に上昇させたリパーゼは無かった。
海産油脂肪酸のエステルを加水分解するためのリパーゼの使用に関するこの先行研究から、次のことが明らかである。即ち、異なるリパーゼが全く異なる挙動をすること、ならびに、ある脂肪酸と別の脂肪酸との間またはあるタイプの脂肪酸と別のタイプの脂肪酸との間での非常に顕著な選択性が、リパーゼによりしばしば発揮されることである。
ある種のリパーゼのこの基質選択性がズイとワードによって利用され、そして彼らは、ｎ−３多不飽和脂肪酸に富む画分を調製するための、タラ肝臓油の、リパーゼで触媒されたアルコーリシスについて述べている（Zuyi and Ward,”Lipase-catalyzed alchoholysis to concentrate the n-3 polyunsaturated fatty acid of cod liver oil”, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, July, 601-606）。この著者らは９種類のリパーゼについて研究を行い、そして彼らはシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（Amano International Enzyme CoからのCES）が他のリパーゼよりも高い割合で魚油をアルコーリシスし、ＥＰＡおよびＤＨＡに非常に富むモノグリセリドを製造したことを見出した。この先行技術の方法において、（エタノールおよびイソプロパノールが使用されたが、）アルコールは、反応体と反応のための溶媒とを兼ねて採用された。
ズイとワードは反応媒質中の水の濃度の効果を研究し、そして彼らはリパーゼＣＥＳによる（イソプロパノールを用いた）アルコーリシスが０〜７．５％（v/v）の範囲内の含水量に連れて増加したことを見出した。公表されたデータは、５％（v/v）の含水量が最適であること、および２．５％（v/v）の含水量では油中に存在する元のトリグリセリドの４０％を越えるものが１２時間後でも未反応のままであったことを示している（これらの含水量は反応系に添加した水を指しており、魚油および「乾燥」酵素中に不可分に存在する少量の水は除外されているものと理解される）。付随してトリグリセリドから遊離脂肪酸への加水分解が（典型的には３０％を越える）非常に高い割合で生じており、例えば、５％（v/v）の含水量において、（アルコーリシスは僅か１５．５％であるのに比べて、）１８．９％の加水分解が生じている。
上記のズイとワードの方法は科学的には興味深いものであるが、不運にも、この方法は精製ＥＰＡ／ＤＨＡ組成物を工業的に調製するための改良された方法を提供していない。特に、リパーゼにより触媒された生成物中に大量の遊離脂肪酸が不可分に存在することが、その後に所望のｎ−３多不飽和脂肪酸を精製することを困難にしている。例えば、低い揮発性のために、従来の分子蒸留技法では遊離脂肪酸をグリセリドと分離することができない。さらに、エステルおよび遊離脂肪酸は実質的に異なる極性を有し、そしてモノ−およびジ−グリセリドはその中間的な極性であるので、抽出法では、これらをグリセリドと分離することができない。下記に示すとおり、これとは対照的に有利に、本発明は分子蒸留を用いて、多不飽和脂肪酸グリセリドを飽和および単不飽和脂肪酸エステルと分離するのみならず、同時に、所望の多不飽和脂肪酸グリセリド画分から殺虫剤および多塩素化ビフェニル等の環境汚染物質の除去をも行うことができる。
本発明者らは、本発明により、ズイとワードによって使用されたシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼを含むある種の特定のリパーゼが、実質的に無水の反応条件下に海産油中のトリグリセリド内の飽和および不飽和脂肪酸のエステル成分を選択的にエステル交換することに用いられ得ることを思いがけず見出した。そのようなエステル交換が、実質的に付随する加水分解無しに、変換の程度に応じて、主としてモノ−およびジグリセリドであるがトリグリセリドであってもよい、エステルとしてグリセロール成分に結合したままの残余ｎ−３多不飽和長鎖脂肪酸と、より感受性な飽和脂肪酸のモノエステルの混合物をもたらすことが判明した。
より具体的には、本発明は、より高濃度の多不飽和脂肪酸を有する精製された生成物を得るために、トリグリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を処理する方法であって、次の工程：
（ａ） 該油組成物を、実質的に無水の条件下、かつ飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、反応中に存在するＣ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量を超えない量であるＣ1〜Ｃ6アルコールを用いて、エステル交換反応に供する工程；そしてその後で、
（ｂ） 多不飽和脂肪酸のグリセリドに富む残余画分を、前記リパーゼで触媒されるエステル交換反応により製造された飽和および単不飽和脂肪酸エステルを含有する画分から分離する工程；
を含む方法を提供する。
既述の通り、本発明の方法は、海産油中で飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼを利用する。本発明者らは、多くのリパーゼが、本発明のエステル交換反応において比較的貧弱な活性を有するかまたは全く活性を有していないか、あるいは飽和および単不飽和脂肪酸を一方としてもう一方を多不飽和脂肪酸とする双方の間で貧弱な選択性を示すかのどちらかであることを見出した。このことは、例えば種々の細菌類のリパーゼ［Geotrichum candidum（GCL; Amano GC）、Aspergillus niger（ANL; Amano A）、Candida rugosa（CRL; Amano AY）、Chromobacterium viscosum（CVL; Sigma）、Humicula lanuginosa（HLL; Amano CE）、Rhizopus delemar（RDL; Amano D）、Rhizopus oryzae（ROL; Amano F）、Penicillium camembertii（PCL; Amano G）、Candida lipolytica（CLL; Amano L）、Mucor javanicus（MJL; Amano M）、およびRhizopus niveus（RNL; Amona N）］に当てはまる。カンジダ・アンタラクチカのリパーゼ［Candida antarctica（CAL; Novo SP435）］はエステル交換反応において高活性であることが見出されたが、不運なことに脂肪酸の異なるクラスの間での低い選択性を示したかまたは全く選択性を示さなかったので、本発明に用いるには適していない。
本発明者らの見出した、本発明の方法において使用し得るリパーゼの例は、良好なエステル交換活性ならびに多不飽和脂肪酸と飽和および単不飽和脂肪酸との間での適度な選択性を示すマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼ（MML; Novo Lipozyme）；他のリパーゼよりも活性が低いが双方共に満足すべき選択性を発揮するカンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼ（CCL; Sigma）およびペニシリウム・ログエフォルティイ（Penicillium roguefortii）のリパーゼ（PRL; Amano R）；ならびに、双方共に良好な活性および選択性を発揮するのでしばしば本発明に用いるに好ましいシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼ（PFL; Amano PS）およびシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（PSL; Amano AK）を包含する。
リパーゼの支持体材料上への固定化は幾つかの利点を提供し得る。例えば、固定化はリパーゼに高い安定性を与えるので、リパーゼがより長く持ちこたえる。また、固定化はリパーゼの回収をかなり容易にし、そしてその再使用を可能とするが、これはコストを劇的に低減する。また、固定化酵素が用いられるとエステル交換反応が扱い易くなり、そしてリパーゼが、やはり酵素的工業化方法にとって極めて重要な、連続法に適するようになる。ときには、固定化は酵素の能力における改善をもたらす。最後に、支持体表面上でのリパーゼの分散はリパーゼの基質への暴露を確実にし、それにより単位重量当たりの酵素活性を劇的に増大させ、そして酵素の投与量および従って酵素に関する費用を大きく削減する。
ＥＰＡとＤＨＡ双方に富む精製魚油組成物の調製が所望であれば、これらのｎ−３多不飽和脂肪酸双方に対して実質的に不活性なリパーゼ、即ちＥＰＡとＤＨＡとを有意に識別しないリパーゼを使用することが好ましい。このような場合にはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）とシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼが使用されることが好ましいが、後者のリパーゼが特に好ましい。これらのリパーゼは、アマノ・インターナショナル・エンザイム社（Amano International Enzyme Co of Nagoya, Japan）から入手可能である。
本発明の方法の重要な特徴は、リパーゼで触媒されるエステル交換が実質的に無水の反応条件下に実施されなければならないことである。好ましくは、反応系内の総水量は、海産油とリパーゼを含む全ての供給源からのものを合わせて１％（w/w）未満でなければならず、好ましくは０．５（w/w）未満であり、そして最も望ましくは０．０１〜０．２５％（w/w）の間である。（典型的な場合において、海産油出発材料は０．１〜０．２％（w/w）の水を含有し、アルコール試薬として使用される無水エタノールは０．２〜０．５％（w/w）の水を含有し、そしてリパーゼ調製物は２〜２．５％（w/w）の水を含有している。）
しかし、少量の水、一般的にはリパーゼの重量に基づいて約１〜２重量％が、活性を成立させるためには酵素系内に常に必要とされるので、完全な無水反応条件を採用することは不可能である。必要とする水の量は使用する酵素に非常に大きく依存する（例えばカンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼは本発明の方法において最大の活性を発揮するために約１０重量％の水の添加を必要とする）。後記実施例に示すとおり、これらの極少量の水は有意な加水分解を全く引き起こさず、そしてエステル交換された生成物中の遊離脂肪酸の濃度を３重量％未満に維持すること、即ち既述のズイとワードの報告の約１０％だけの加水分解率を維持することが可能である。
本発明の別の重要な特徴は、存在するアルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量、好ましくは９モル当量を越えないように制限されなければならないことである（換言すれば、３モル当量のアルコールが化学量論量である）。従って、アルコールは本質的に溶媒としてよりもむしろ反応体として働く。海産油トリグリセリドの、リパーゼで触媒される選択的エステル交換がそのような無溶媒反応系内で成功裏に生じることは驚くべきことである。好ましくは、実質的に化学量論量のアルコール、即ち存在するトリグリセリドに基づいて２〜５モル当量のアルコールが採用されるが、それは化学量論量よりも大過剰の量のアルコールが所望の多不飽和脂肪酸の低い回収をもたらすからである。
全てのＣ1〜Ｃ6アルコールを利用可能であるが、（典型的には０．１〜０．５重量％の範囲の含水量を有する）無水エタノールの使用が好ましい。入手し易さおよび費用がその理由であり、また実質的に無水な反応条件に留意してのことでもある。
また、エステル交換反応が実施される温度も厳密に制限されるものではない。しかし、温度の増大に連れて反応速度は増大するが反応の選択性は減少する。採用されるリパーゼによるが、一般的に反応は４０〜６０℃を越えない温度で実施されることが好ましく、（約２０℃の）室温で実施されることがより好ましい。
エステル交換は、例えば超臨界ＣＯ2のような超臨界液体を反応媒質として用いて実施されることができる。例えば、魚油のエタノリシスは２５０バール（２５０×１０5パスカル）、４０℃にて超臨界ＣＯ2中で実施される。超臨界ＣＯ2液体は、反応媒質としてのみならず、エステルと遊離脂肪酸とを残余グリセリドから分離することにも用いられることができる。
本発明による、海産油中のトリグリセリドの、リパーゼで触媒されるエステル交換は、説明のためのＣ1〜Ｃ6アルコールとしてエタノールを用いた、下記の単純化した反応式により模式的に説明されることができる。
工程（ａ）
Ｒ’はｎ−３多不飽和脂肪酸を表し、そして
Ｒ”は飽和および単不飽和脂肪酸を表す。］
（単純化のために、１，２−および２，３−ジグリセリドおよび２−モノグリセリドだけが生成物側に示されている。）
グリセリド画分からのエチルエステル画分の分離は分子蒸留技法により適切に実施されるが、該技法において、相対的に揮発性のエチルエステルが揮発性に劣る残余グリセリド混合物から容易に除去されることができる。エステル交換反応の生成物は実質的に無水である反応条件の使用の結果として、遊離脂肪酸を少量だけ含有しているので、分子蒸留後には、所望でない飽和および単飽和脂肪酸を実質的に有しない残余画分が得られる。分子蒸留工程は少量の最も揮発性なモノグリセリドを蒸留物申に出現させるという結果を生むことがあるが、これらのモノグリセリドは主として比較的短鎖の脂肪酸のモノグリセリドである（即ち、ＥＰＡまたはＤＨＡは蒸留物中に僅かしか失われないか、または全く失われない）。同様に、少量の低揮発性のエステル画分、即ち主としてＥＰＡおよびＤＨＡ等の長鎖脂肪酸のエステルが、残余グリセリド混合物と共に残り得る。従って、所望の多不飽和脂肪酸の比較的量の少ない一部がエステル交換にあずかるが、それにもかかわらず、蒸留後の残余画分中に残る。これらのことから、分子蒸留は難しい分離に適しているとは一般的に見なされていないにもかかわらず、本発明の方法においては驚くほど有利であることが証明された。
殺虫剤および多塩素化ビフェニル（ＰＣＢ類）等の環境汚染物質は長鎖脂肪酸のグリセリドよりも揮発性であるので、分子蒸留はこれらの化合物をグリセリド画分から除去し、そしてこれらの化合物は蒸留物（エステル画分）中に濃縮される。これが、本発明の方法における分子蒸留の使用のさらに別の利点である。
実際、ある特定の態様において、本発明は、トリグリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物からの環境汚染物質の除去のための方法であって、次の工程：
（ａ） 該油組成物を、実質的に無水の条件下、かつ飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、反応中に存在するＣ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量を超えない量であるＣ1〜Ｃ6アルコールを用いて、エステル交換反応に供する工程；そしてその後で、
（ｂ） 工程（ａ）において得られた生成物を１またはそれ以上の分子蒸留に供して多不飽和脂肪酸のグリセリドに富み、かつ環境汚染物質が優先的に除去された残余画分を回収する工程；
を含む方法を提供する。
本発明の方法は、ＥＰＡおよびＤＨＡを４０重量％を越え、好ましくは７０重量％を越える高濃度で含有する組成物の海産供給源からの調製に特に適合している。リパーゼで触媒されるエステル交換の生成物は所望でない飽和および単不飽和脂肪酸を遊離酸としてよりはむしろ主としてそれらのエチルエステル（エチルアルコールが使用された場合）の形態で含有する（多不飽和脂肪酸は実質的にグリセリドとして残る）ので、飽和脂肪酸画分は、所望の多不飽和脂肪酸成分の比較的少ない損失を伴う比較的穏やかな分子蒸留により除去され得る。同時に、殺虫剤およびＰＣＢ類等の比較的揮発性の環境汚染物質が、上記で論じたように、エチルエステル画分と共に除去される。ＥＰＡ/ＤＨＡ濃縮物を製造するための従来法と比較すると、本発明は、特にその好ましい態様において、下記のような重要な利点をもたらす。即ち、
（ｉ） 溶媒の不存在が嵩高性の非常な減少をもたらし、この効果は化学量論濃度のアルコールだけを使用し得ることにより強調され；
（ii） エステル交換反応が、例えば室温のような穏やかな条件下に実施され得るので、副反応を最小限にし、そして高エネルギーの入力を必要とせず；
（iii） ＥＰＡおよびＤＨＡの回収が非常に高く、そして回収された生成物は環境汚染物質による汚染を本質的に被っておらず；そして
（iv） 用いられる実質的に無水である反応条件は最小限の加水分解をもたらしそれにより、エステル交換反応からのグリセリド画分の分子蒸留が、所望でない飽和および単不飽和脂肪酸からの所望の多不飽和脂肪酸の良好な分離を与える。
従って、本発明のアルコーリシス法は、ＥＰＡ＋ＤＨＡ濃縮物の製造のための統合（integral）製造方法における最初の段階となり得る。そのような統合方法において、飽和脂肪酸エチルエステル画分の多不飽和脂肪酸グリセリド画分からの分離を実施するための分子蒸留またはその他の技法の後、所望の多不飽和脂肪酸を含有する後者の画分はさらに、存在する特定の酸の濃度を上昇させるために処理されることができる。例えば、高度に濃縮されたＥＰＡおよびＤＨＡを含有するエチルエステル組成物を得ることが所望であれば、分子蒸留後に得られるグリセリド画分は、例えば、触媒量のナトリウムエトキシドまたはカリウムエトキシド等の存在下に無水エタノールを用いた化学的エステル交換によりエステル化されることができる。この方法は、次の反応式により模式的に説明される。
次いで、製造されたグリセロールが公知の技法を用いて除去され得る。典型的には、これは、従来法に比べて非常に良好な多不飽和脂肪酸の回収による、約４５〜５０重量％のＥＰＡ＋ＤＨＡ含量をもたらす。
より具体的には、本発明による高濃度ＥＰＡ＋ＤＨＡ組成物を得るための統合方法は、さらに次の工程：
（ｃ） ナトリウムエトキシドまたはカリウムエトキシド等の塩基をエステル交換を触媒するに充分な量だけ含有するアルカリ性環境のような化学的触媒作用か、または実質的に無水である条件下でカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼを用いるような酵素的触媒作用を用いて、グリセリド画分を低級アルコールによりエステル交換する工程；
（ｄ） 得られたアルキルエステル生成物をアルカノール中で過剰の尿素と共に５５〜９９℃の温度に加熱する工程；
（ｅ） 工程（ｄ）の生成物を、例えば０〜２５℃に冷却して尿素脂肪酸アルキルエステル付加物を沈殿し、その後、該付加物を分離除去してｎ−３脂肪酸エステルを主に含有する溶液を残す工程；
（ｆ） 工程（ｅ）で残した溶液からｎ−３脂肪酸アルキルエステルを分離する工程；および
（ｇ） 工程（ｆ）で得られた混合物から全ての溶媒を除去する工程；
を含む。
本発明の統合方法の特に好ましい態様において、工程（ｇ）で得られた濃縮物が、例えば９工程の分子蒸留のような１種類またはそれ以上の手段によりさらに濃縮されて、その中に含まれるＥＰＡ＋ＤＨＡ濃度が８５重量％またはそれ以上に上昇させられる。
添付の図１は、８５重量％ＥＰＡ＋ＤＨＡエチルエステル濃縮物の製造のための、本発明によるそのような統合製造方法を模式的に説明している。
例えば触媒量のナトリウムエトキシドまたはカリウムエトキシドの存在下にエタノールを用いて行うような、グリセリド画分の化学的エステル交換の代替として、エステル交換は、例えばカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼを用いる等、酵素的に突施されることができる。このリパーゼはｎ−３多不飽和脂肪酸に対して、他の脂肪酸に対すると同様に非常に活性であり、そして採用されたときに、穏やかな条件下かつ溶媒の不存在下に高度に効率的にグリセリド画分のエステル交換を実施することにより、嵩高性のさらなる減少に寄与し得る。
幾つかの例において、出発海産油組成物から実質的に純粋な１種類の不飽和脂肪酸を単離することを所望されることがある。それぞれ実質的に１００％のＥＰＡおよび１００％のＤＨＡである生成物の製造のためのそのような方法が、添付図２において模式的に説明されている。本発明のこの態様は、本発明の教示に従い飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との最初の分離を達成するためのシュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼ（ＰＳＬ）のみならず、その後の工程において、ＤＨＡよりもむしろＥＰＡのエステル交換を選択的に好み、それによりこれら２つの酸の良好な分離を可能とするマコール・メイヘイ（Mucor miehei）のリパーゼ（ＭＭＬ）、ならびにそのようにして製造されたＤＨＡに富むグリセリド混合物のエタノリシスを実施するカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）をも利用する。
さらに具体的には、実質的に純粋なＥＰＡならびに実質的に純粋なＤＨＡを得るための、本発明による好ましい統合方法は、次の工程：
（ｉ） 出発海産油を上記の通り実質的に無水である反応条件下にＰＳＬを用いてエタノールによりエステル交換する工程；
（ii） リパーゼにより触媒されたエステル交換生成物を分子蒸留に供して４０〜５０％のＥＰＡ＋ＤＨＡを含有するグリセリド画分を回収する工程；
（iii） 工程（ii）からのグリセリド画分を最初のエステル交換と類似のエステル交換条件（即ち実質的に溶媒および水の不存在、かつ実質的に化学量論量のエタノールの使用）下にマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼ（ＭＭＬ）を用いてエタノールによりエステル交換する工程；
（iv） 得られたＥＰＡに富む画分と残余のＤＨＡに富むグリセリド混合物とを工程（ii）と類似の方式にて分子蒸留により分離する工程；
（ｖ） ＥＰＡ−エチルエステル画分を、分子蒸留を尿素沈殿、クロマトグラフィー等と組み合わせて用いること等により処理して実質的に１００％純度までＥＰＡ画分を濃縮する工程；
（vi） 工程（iii）より回収したＭＭＬ介在エステル交換からのＤＨＡに富むグリセリド混合物をカンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）を用いてエタノールによりエステル交換する工程；および
（vii） 得られたＤＨＡエチルエステル濃縮物を工程（ｖ）で用いたと同様の技法により処理して実質的に１００％純粋なＤＨＡを回収する工程；
を含む。
高濃度のＥＰＡおよび／またはＤＨＡを有する組成物の製造のための統合方法に用いるようにうまく適合され得ることは本発明の特別の利点であるが、同様の一般的技法が、例えば１８：４ ｎ−３、２０：４ ｎ−３、２１：５ ｎ−３および２２：５ ｎ−３等のその他の不飽和脂肪酸を海産油から単離することに利用し得ることも着目されるべきである。本発明の方法は、例えば発酵生成物ならびに蔬菜および植物油等の他の供給源からの、多不飽和脂肪酸含有油生成物に適用可能である。ｎ−６多不飽和脂肪酸は植物および蔬菜油の特質である。そのようなｎ−６脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ ｎ−６）、ビスホモ−γ−リノレン酸（ＢＨＧＬＡ、２０：３ ｎ−６）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ ｎ−６）を包含する。アラキドン酸を含有する油生成物も、クサレケカビ属（Mortierella）を用いた発酵により工業的に得られている。
本発明の方法により、少なくとも４０重量％のアラキドン酸を含有する組成物を植物または蔬菜油から容易に調製し得ることが見出された。その方法に用いるに好ましいリパーゼは、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼおよびシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼである。アラキドン酸画分は実質的に１００％の純度までさらに濃縮されることができる。
一般的に、本発明の方法において出発材料として用いられる海産油組成物は、魚またはその他の海産供給源からの、そしてトリグリセリドの形態で多不飽和脂肪酸を包含する脂肪酸を含有する、未処理のまたは部分的に処理された油であれば、どのようなものであっても良い。典型的には、そのような海産油中のそれぞれのトリグリセリド分子は、種々の程度に、飽和、単不飽和または多不飽和であるか、あるいは長鎖または短鎖の、異なる脂肪酸エステル成分を含有する。
下記実施例により本発明が説明される。
実施例 １
本研究の目的は、多不飽和脂肪酸、特にＥＰＡおよびＤＨＡを、魚油組成物中の飽和および単不飽和脂肪酸から分離するための方法における種々のリパーゼの使用を試験することであった。
下記のリパーゼを試験した：
試験に使用した手順は次の通りである：
魚油のトリグリセリドをプロノバ・バイオケア社（Pronova Biocare a.s., Norway）から調達したが、それは１４．９％のＥＰＡと９．８％のＤＨＡを含有していた。これらは、さらなる処理をすることなく調達したままで直接使用した。全ての溶媒は分析品質のものをメルク社（Merck AG in Germany）から購入した。特に断らない限り、化学量論量、即ちトリグリセリドに基づいて３モル当量の（無水）エタノールを使用した。カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼを用いた場合以外は、反応系に水は全く添加しなかった。魚油出発材料およびリパーゼから生じる水の含量を約０．３〜０．４重量％と計算した。カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパーゼを用いた場合には、リパーゼの重量に基づき１０重量％の量で水を添加し、結果として総量で約０．８重量％の水を含有する反応系とし、この場合でさえも実質的に無水である条件を維持した。
脂肪酸の分析は、既に記載のある手順
表Ｉに示した研究において、エチルエステルとグリセリドの分離は、ウオータースプレップエル［Waters PrepL（商標）］システム５００Ａ装置を用いて実施した。ミリポア社（Millipore）からのプレップパック［PrepPak（商標）］５００/シリカカートリッジカラムを、石油エーテル中の１０％エチルエーテルを流速２５０ｍＬ/分で用いて溶離した。それぞれの試行が屈折検出器の指数により２つのピークを与えたが、第１のピークは、ほぼ１つのカラム容量後に出現し、純粋なエチルエステルからなっており、そして第２のピークは、大ざっぱに、ＴＬＣによる純粋なトリグリセリドを含有する２つのカラム容量後に溶離した。残ったモノ−およびジ−グリセリドはメタノールによりカラムから洗い流した。
典型的な手順において、リパーゼ（０．５ｇ）を、魚油［５．０ｇ、約５．６７ミリモル（分子量約８８２ｇ/モル）］と無水エタノール（０．８０ｇ、１７．４ミリモル）の混合物に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素雰囲気下に室温（表Ｉの研究においては３７℃）で穏やかに攪拌した。適当な時間をおいた後、クロロホルムの添加および濾過による酵素の分離により反応を止めた。有機溶媒を真空下（回転蒸留器および高真空ポンプ処理）に除去して定量的収量で粗生成物混合物を得た。生成物を等量のクロロホルムに溶解し、上記の通りＨＰＬＣ装置に注入した。それぞれの画分を収集して溶媒を真空下に蒸留し、計量し、そして最後にガスクロマトグラフィーにて分析した。
分取ＨＰＬＣの代わりに分取ＴＬＣを用いた場合には、適当なときにパスツールピペットを用いて少量（１００〜２００ｍｇ）の試料を反応系から取り出した。試料を第２のパスツールピペット内に設置した綿羊毛栓に通すことにより、酵素粒子を分離した。次いで、ＴＬＣプレートに導入する前に、それぞれの試料をクロロホルムに希釈した（２５０ｍｇ/ｍＬ）。
結果を、下記表Ｉ〜IIIに示す：
最初の表である表Ｉは、試験したリパーゼ全てを用いて３７℃で（３モル当量のエタノールを用いて）実施された研究の結果を要約している。
上記表Ｉ〜IIIにおいて、下記略号を使用している：
ＭＧ モノグリセリド
ＤＧ ジグリセリド
ＴＧ トリグリセリド
ＦＦＡ 遊離脂肪酸
ＥＥ エチルエステル
面積％ＥＰＡ、面積％ＤＨＡおよび面積％ＥＰＡ＋ＤＨＡ
面積％は対応するＧＣクロマトグラムの積分に基づいている。
これらの略号は、後記実施例を通じて使用する。
上記表から、シュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼは双方共にＥＰＡとＤＨＡに対する独特の低い親和性を示すが、初期のトリグリセリド類に対しては高い親和性を示すことが明らかである。
また、２つのシュードモナス属（Pseudomonas）のリパーゼは、ＥＰＡよりはむしろＤＨＡのエステル交換を幾らか好む傾向があることにも注意すべきであろう。本発明者らが試験した他のリパーゼは全て逆の傾向を示すので、これは全く普通でない振る舞いである。
さらに、表IIおよびIIIから、一定時間後にＭＧ/ＤＧ/ＴＧの割合が最高値から減少し始めることにも着目すべきであろう。このことから、一般的に、エステル交換はそれが完了する前に終了することが好ましい。
実施例 ２
本研究は、大規模な試行において２種類のシュードモナス属（Pseudomons）のリパーゼを試験するために計画した。
実施例 ２ａ−ＰＳＬ
シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（１００ｇ、２５２００活性単位/ｇ）を魚油（１０００ｇ、約１．１３モル）と無水エタノール（１７０ｇ、３．７０モル）の混合物に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素雰囲気下に室温で磁力攪拌器で穏やかに攪拌した。反応混合液の含水量を約０．３〜０．４重量％であると計算した。
２５時間後、実施例１に記載の手順に従い試料を取り出し、分析した。反応はさらに２４時間続行させた。反応混合液とリパーゼとを分離するため（５０００ｒｐｍで１０分間の）遠心を採用した。
５０時間後に反応を停止した時点で、生成物は下記の組成を有していた：
蒸留物がかなりの量のモノグリセリド（１０．６％）を含有している一方、残物は２．３％のエチルエーテルを含有していることに着目すべきである。既に論じたように、これらはそれぞれ、比較的単鎖の脂肪酸由来のモノグリセリドと長鎖脂肪酸由来のエチルエステルがほとんどであろう。
実施例 ２ｂ
実施例２ａで用いたと同じ油を１ｋｇ用意し、これをＰＦＬ酵素を用いてエタノールによりエステル交換した。反応は４８時間後に停止させた。中間生成物の組成を下記表VIに示す。
実施例２のそれと類似の３つのパイロットプラント試行から得られた生成物を分析して環境汚染物質のレベルを測定した。その結果を下記表VIIに示す：
実施例 ４
本研究の目的は、固定化リパーゼのための異なる手法を比較すること、ならびに本発明の方法においてリパーゼを固定化した形態で使用する効果を調べることであった。
Ａ． 固定化手法
（ｉ） デュオライト上へのＰＳＬとＰＦＬの固定化
デュオライト（Duolite）Ａ ５６２（Duolite International; １０．０ｇ）を、ブフナー漏斗上で３〜４回、３０ｍＭのＮａＯＨ（各２５０ｍＬ）を用いて洗浄した後、水（４０ｍＬ）および磁石攪拌子と共に１５０ｍＬ容ビーカー内に置いた。この溶液のｐＨを、自動滴定器（１．００Ｍ ＮａＯＨ）を用いてｐＨ８に調整した。最初のｐＨがｐＨ５．０よりも低いときには、ｐＨ８．０で平衡に達するまでに多大な時間を要する可能性がある。一方、ｐＨがｐＨ８以上であるときには、リパーゼ溶液を添加するまで滴定しない。水（２０ｍＬ）に溶解したリパーゼ（２．０ｇ、ＰＳＬ/ＰＦＬ）をパスツールピペットを介してデュオライト溶液に添加した。自動滴定器を用いて、添加する間中、ｐＨをｐＨ８．０〜８．４の間に維持し、そして溶液を１時間磁力攪拌器を用いて攪拌した。その後では、９５〜９９％のリパーゼがデュオライト上に固定化されていた。攪拌後、リパーゼ調製物を緩衝溶液（トリス塩酸；ｐＨ８．０）で洗浄した。最後に、固定化リパーゼ調製物を、真空（０．１〜０．０１ｍｍＨｇ）下に０．５〜１時間かけて乾燥した。乾燥過程を速めるために蒸気浴（４０℃）を使用することができる。固定化リパーゼ調製物は冷蔵庫（４℃）内に保存した。
（ii） アンバーライト上へのＰＳＬの固定化
アンバーライト（Amberlite）ＸＡＤ−７樹脂（５０ｇ；Rohm and Haas；含水量７０％）をｐＨ７、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で完全に洗浄（各１２５ｍＬで２回）した。ＰＳＬ粉末（Amano AK；１．５ｇ；２０，０００リパーゼ単位（ＬＵ、トリブチリン加水分解に基づき１分間の間に生成される遊離脂肪酸のμモルとして規定）；１７ＬＵ/ｍｇ）を、ｐＨ７．０で０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＬ）に溶解した。ｐＨの低下が生じたときにはｐＨを７．０に調整した。次いで、リパーゼ溶液を樹脂に添加し、そして得られた懸濁液を、トリブチリン加水分解による上澄み液の活性計測により確かめて、少なくとも９５％の固定化が起こるまで（約１時間）攪拌した。
（iii） 固定化リパーゼ調製物の活性計測
固定化樹脂（約４０ｍｇ）を正確に計り取り、ｎ−ブチルパルミテート（３１０〜３１５ｍｇ）に添加した。この混合物に９５％エタノール（１２０μＬ）を添加し、そして混合物を９０分間良く攪拌した。試料を収集し、ＧＬＣにより分析した。リパーゼアルコール単位（ＬＡＵ）は、１分間の間に生成されるパルミテートの量（μモル）として規定されている。
Ｂ． 固定化ＰＳＬを用いた生産性研究
デュオライトおよびアンバーライトの双方の上に固定化したＰＳＬについて、魚油エタノリシス生産性研究を、次の方法に従い実施した。
（ｉ） 固定化ＰＳＬを用いた生産性研究
魚油（１００ｇ）、無水エタノール（２０ｍＬ）および水（１ｍＬ）を全て混合し、得られた混合物を、良好な分散系が形成されるまで強く攪拌した。湿分を含まない固定化リパーゼ（１０ｇ）をこの分散系に添加し、透明な溶液が形成されるまで強くかき混ぜた。次いで、混合物を、約５０％の変換が達成されるまで（２４時間）穏やかに攪拌した。リパーゼを濾過して分離してその後の試行に使用し、その一方で、前述のようにして脂肪を分析した。
デュオライト上に固定化したＰＳＬを用いた生産性研究の結果を下記表VIIIに示す。
デュオライトを用いた場合と正確に同じ反応条件下における、アンバーライト上に固定化したＰＳＬを用いた生産性研究の結果を、下記表IXに示す。
実施例 ５
本研究の目的は、上述のようにしてＰＳＬの存在下に魚油をエステル交換して製造されるグリセリド混合物のエタノリシスにおける、カンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼ（ＣＡＬ）およびマコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼ（ＭＭＬ）の活性を評価することであった。
（ａ） グリセリドのＣＡＬエタノリシス
固定化ＣＡＬ（Novo-Nordisk、SP 435、含水量１〜２％；０．５ｇ）をグリセリド混合物（２．５ｇ；約８．５ミリモルのエステル当量；初期組成；２５．０％のＥＰＡと１５．１％のＤＨＡ、魚油のＰＳＬに触媒されたエステル交換により製造された）と無水エタノール（０．８０ｇ、１７．４ミリモル）に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素雰囲気下に室温で穏やかに攪拌した。適宜試料を収集し、既述のようにして分析した。反応は、２２時間後に、濾過により酵素を分離して停止させた。
その結果を下記表Ｘに示す。
（ｂ） グリセリドのＭＭＬエタノリシス
反応条件は、上記（ａ）で述べたＣＡＬエタノリシス反応の条件と同一であった。固定化ＭＭＬ（Novo-Nordisk, Lipozyme（商標）、含水量１０％；０．５ｇ）をグリセリド混合物（２．５ｇ；約８．５ミリモルのエステル当量；初期組成：２５％のＥＰＡと１５．１％のＤＨＡ、魚油のＰＳＬに触媒されたエステル交換により製造された）と無水エタノール（０．８０ｇ、１７．４ミリモル）に添加した。得られた酵素懸濁液を窒素下に室温で穏やかに攪拌した。適宜試料を収集し、既述のようにして分析した。反応は、２７時間後に、濾過により酵素を分離して停止させた。
前記ＣＡＬ反応において使用したと同じグリセリド試料の、２０℃でＭＭＬを用いたエタノリシスの進行を下記表XIに示す。
実施例 ６
本研究の目的は、本発明の方法が植物および蔬菜油に適用可能であることを例証することであった。
アラキドン酸抽出物（ＡＡ）のＰＳＬに触媒されるエタノリシス
プロノバ・バイオケア（Pronova Biocare）社から調達した、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ ｎ−６）を３１．１％含有するアラキドン酸抽出物を、魚油について実施例１にて述べた方法（即ち１０％ＰＳＬ粉末、２０℃、５０％変換、２４時間）に従い処理した。
その結果を下記表XIIに示す。
Claims (23)
- 多不飽和脂肪酸を有する精製された生成物を得るために、トリグリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を処理する方法であって、次の工程：
（ａ） 該油組成物を、１％未満の水含量の条件下、かつ飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、反応中に存在するＣ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量を超えない量であるＣ1〜Ｃ6アルコールを用いて、エステル交換反応に供する工程；そしてその後で、
（ｂ） 多不飽和脂肪酸のグリセリドに富む残余画分を、前記リパーゼで触媒されるエステル交換反応により製造された飽和および単不飽和脂肪酸エステルを含有する画分から分離する工程；
を含むことを特徴とする、方法。 - 前記リパーゼが固定化された形態である、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃ1〜Ｃ6アルコールが無水エタノールである、請求項１または２に記載の方法。
- 前記Ｃ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて２〜５モル当量である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
- 前記エステル交換反応が室温で実施される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
- 前記分離工程（ｂ）が１またはそれ以上の分子蒸留を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
- 前記油組成物がｎ−３多不飽和脂肪酸を含有する海産油組成物または発酵生成物である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
- 前記リパーゼが、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の双方に対して実質的に不活性である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
- 前記リパーゼが、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼまたはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼである、請求項８に記載の方法。
- 少なくとも４０重量％のＥＰＡ＋ＤＨＡを含有する組成物の調製のための、請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法であって、さらに次の工程：
（ｃ） アルカリ性環境中で化学的触媒作用によるか、またはリパーゼを用いる酵素的触媒作用によって、前記グリセリド画分を低級アルコールによりエステル交換する工程；
（ｄ） 得られたアルキルエステル生成物をアルカノール中で過剰の尿素と共に５５〜９９℃の温度に加熱する工程；
（ｅ） 工程（ｄ）の生成物を冷却して尿素脂肪酸アルキルエステル付加物を沈殿させ、その後、該付加物を分離除去してｎ−３脂肪酸エステルを主に含有する溶液を残す工程；
（ｆ） 工程（ｅ）で残した溶液からｎ−３脂肪酸アルキルエステルを分離する工程；および
（ｇ） 工程（ｆ）で得られた混合物から全ての溶媒を除去する工程；
を含む、方法。 - 前記工程（ｇ）で得られた濃縮物を、１またはそれ以上の工程の分子蒸留の手段によりさらに濃縮させ、その中に含まれるＥＰＡ＋ＤＨＡの濃度を８５重量％またはそれ以上にまで上昇させる、請求項１０に記載の方法。
- 実質的に純粋なＥＰＡならびに実質的に純粋なＤＨＡを得るための、請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法であって、さらに次の工程：
（ｉ） １％未満の水含量の条件下、かつＥＰＡのエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、Ｃ1〜Ｃ6アルコールにより前記グリセリド画分をエステル交換する工程；
（ｉｉ） 得られたＥＰＡに富むＣ1〜Ｃ6アルコールエステル画分と残余のＤＨＡに富むグリセリド混合物とを分離する工程；
（ｉｉｉ） 上記ＥＰＡ−Ｃ1〜Ｃ6アルコールエステル画分を処理し、そして該ＥＰＡ画分を実質的に１００％の純度にまで濃縮する工程；
（ｉｖ） ＤＨＡのエステル交換を触媒するに活性なリパーゼの存在下に、Ｃ1〜Ｃ6アルコールにより上記ＤＨＡに富むグリセリド混合物をエステル交換する工程；および
（ｖ） 得られたＤＨＡ−Ｃ1〜Ｃ6アルコールエステル画分を処理し、そして該ＤＨＡ画分を実質的に１００％純正なＤＨＡにまで濃縮する工程；
を含む、方法。 - 前記工程（ｉ）におけるリパーゼが、マコール・メイヘイ（Mucor meihei）のリパーゼである、請求項１２に記載の方法。
- 前記工程（ｉｖ）におけるリパーゼが、カンジダ・アンタラクチカ（Candida antarctica）のリパーゼである、請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記工程（ｉ）および／または（ｉｖ）におけるＣ1〜Ｃ6アルコールが、エタノールである、請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
- 前記油組成物が、ｎ−６多不飽和脂肪酸を含有する植物油または蔬菜油あるいは発酵生成物である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
- 前記リパーゼが、アラキドン酸（ＡＡ）に対して実質的に不活性なリパーゼである、請求項１６に記載の方法。
- 前記リパーゼが、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）のリパーゼまたはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）のリパーゼである、請求項１７に記載の方法。
- 少なくとも４０重量％のアラキドン酸を含有する組成物の調製のための、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の方法であって、さらに次の工程：
（ｃ） アルカリ性環境中で化学的触媒作用によるか、またはリパーゼを用いる酵素的触媒作用によって、前記グリセリド画分を低級アルコールによりエステル交換する工程；
（ｄ） 得られたアルキルエステル生成物をアルカノール中で過剰の尿素と共に５５〜９９℃の温度に加熱する工程；
（ｅ） 工程（ｄ）の生成物を冷却して尿素脂肪酸アルキルエステル付加物を沈殿させ、その後、該付加物を分離除去してｎ−６脂肪酸エステルを主に含有する溶液を残す工程；
（ｆ） 工程（ｅ）で残した溶液からｎ−６脂肪酸アルキルエステルを分離する工程；および
（ｇ） 工程（ｆ）で得られた混合物から全ての溶媒を除去する工程；
を含む、方法。 - 前記工程（ｇ）で得られた濃縮物を、１またはそれ以上の工程の分子蒸留の手段によりさらに濃縮させ、その中に含まれるアラキドン酸の濃度を８５重量％またはそれ以上にまで上昇させる、請求項１９に記載の方法。
- 前記アラキドン酸画分が、実質的に１００％の純度にまで濃縮される、請求項２０に記載の方法。
- トリグリセリドの形態で飽和および不飽和脂肪酸を含有する油組成物からの環境汚染物質の除去のための方法であって、次の工程：
（ａ） 該油組成物を、１％未満の水含量の条件下、かつ飽和および単不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するに活性なリパーゼの存在下に、反応中に存在するＣ1〜Ｃ6アルコールの量が、存在するトリグリセリドに基づいて１５モル当量を超えない量であるＣ1〜Ｃ6アルコールを用いて、エステル交換反応に供する工程；そしてその後で、
（ｂ） 工程（ａ）において得られた生成物を１またはそれ以上の分子蒸留に供して多不飽和脂肪酸のグリセリドに富み、かつ環境汚染物質が優先的に除去された残余画分を回収する工程；
を含むことを特徴とする、方法。 - 前記工程（ａ）が、請求項２〜５のいずれか１つに規定のようにして実施される、請求項２１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9404483.1 | 1994-03-08 | ||
| GB9404483A GB9404483D0 (en) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | Refining marine oil compositions |
| PCT/NO1995/000050 WO1995024459A1 (en) | 1994-03-08 | 1995-03-07 | Refining oil compositions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09510091A JPH09510091A (ja) | 1997-10-14 |
| JP4236128B2 true JP4236128B2 (ja) | 2009-03-11 |
Family
ID=10751490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52338495A Expired - Lifetime JP4236128B2 (ja) | 1994-03-08 | 1995-03-07 | 精油組成物 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5945318A (ja) |
| EP (1) | EP0749468B1 (ja) |
| JP (1) | JP4236128B2 (ja) |
| KR (1) | KR970701773A (ja) |
| CN (1) | CN1143384A (ja) |
| AU (1) | AU686348B2 (ja) |
| CA (1) | CA2185018C (ja) |
| DE (1) | DE69509756T2 (ja) |
| ES (1) | ES2133752T3 (ja) |
| GB (1) | GB9404483D0 (ja) |
| HU (1) | HUT76707A (ja) |
| IS (1) | IS4270A (ja) |
| NZ (1) | NZ282508A (ja) |
| RU (1) | RU2151788C1 (ja) |
| WO (1) | WO1995024459A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA951867B (ja) |
Families Citing this family (101)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2731015B1 (fr) * | 1995-02-24 | 1997-05-30 | Sci Sartone | Procede d'enrichissement enzymatique d'huiles d'origine marine et les triglycerides d'acides gras polyinsatures ainsi obtenus |
| NO312973B1 (no) * | 1999-02-17 | 2002-07-22 | Norsk Hydro As | Lipase-katalysert forestring av marine oljer |
| US6395778B1 (en) | 2000-01-11 | 2002-05-28 | Omegatech, Inc. | Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters |
| CN1109549C (zh) * | 2000-07-12 | 2003-05-28 | 刘玉 | 高浓鱼油软胶丸及其超临界co2萃取精馏的制法 |
| KR20030034617A (ko) * | 2001-10-26 | 2003-05-09 | 아츠시 와타나베 | 엔진오일 열화방지제 및 그 제조방법 |
| AU2013203201A1 (en) * | 2002-07-11 | 2013-05-02 | Pronova Biopharma Norge As | A process for decreasing environmental pollutants in an oil or a fat, a volatile environmental pollutants de-creasing working fluid, a health supplement, and an animal feed product |
| SE0202188D0 (sv) * | 2002-07-11 | 2002-07-11 | Pronova Biocare As | A process for decreasing environmental pollutants in an oil or a fat, a volatile fat or oil environmental pollutants decreasing working fluid, a health supplement, and an animal feed product |
| EP2295529B2 (en) † | 2002-07-11 | 2022-05-18 | Basf As | Use of a volatile environmental pollutants-decreasing working fluid for decreasing the amount of pollutants in a fat for alimentary or cosmetic use |
| US6706903B1 (en) | 2002-10-07 | 2004-03-16 | Crompton Corporation | Process for separating saturated fatty acids from fatty acid mixtures |
| NO319194B1 (no) | 2002-11-14 | 2005-06-27 | Pronova Biocare As | Lipase-katalysert forestringsfremgangsmate av marine oljer |
| US20040242831A1 (en) * | 2003-05-30 | 2004-12-02 | Dong Tian | Enzyme catalyzed polyesters and polyol polymers |
| DE102004019472A1 (de) * | 2004-04-22 | 2005-11-17 | Bayer Healthcare Ag | Phenylacetamide |
| WO2006050589A1 (en) * | 2004-11-09 | 2006-05-18 | Cognis Ip Management Gmbh | “biodiesel production from soapstock” |
| US20060135610A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-22 | Bortz Jonathan D | Cardiovascular compositions |
| DK2439268T3 (en) | 2005-06-16 | 2016-02-01 | Dsm Nutritional Products Ag | Immobilized enzymes and methods of use thereof |
| PE20070482A1 (es) | 2005-08-26 | 2007-06-08 | Ocean Nutrition Canada Ltd | Metodo para remover y/o reducir esteroles a partir de aceites |
| US7977498B2 (en) | 2005-08-26 | 2011-07-12 | Ocean Nutrition Canada Limited | Reduction of sterols and other compounds from oils |
| US9150817B2 (en) | 2006-04-13 | 2015-10-06 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Process for preparing concentrated polyunsaturated fatty acid oil |
| EP2044208A4 (en) * | 2006-07-05 | 2012-02-22 | Photonz Corp Ltd | PRODUCTION OF EPA AND ULTRA PURE POLAR LIPIDS FROM A BROADLY HETERATROPHE CULTURE |
| EP2099908B1 (en) * | 2006-11-28 | 2014-05-14 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
| UA97127C2 (uk) * | 2006-12-06 | 2012-01-10 | Бандж Ойлз, Инк. | Спосіб безперервної ферментативної обробки композиції, що містить ліпід, та система для його здійснення |
| DE502008000886D1 (de) * | 2007-04-02 | 2010-08-19 | Cognis Ip Man Gmbh | Ein Gemisch enthaltend Fettsäureglyceride |
| EP1978101A1 (de) | 2007-04-02 | 2008-10-08 | Cognis IP Management GmbH | Verfahren zur Anreicherung mehrfach ungesättigter Fettsäuren |
| EP2147088A4 (en) * | 2007-04-26 | 2010-05-05 | Patrick Adlercreutz | FERTILIZED MILK OILS COMPRISING MULTIPLE-UNSATURATED FATTY ACIDS, COMPRISING EICOSAPENTAIC ACID (EPA) AND DOCOSAHEXAIC ACID (DHA), AND MANUFACTURING METHOD THEREFOR |
| CL2008002020A1 (es) | 2007-07-12 | 2008-11-14 | Ocean Nutrition Canada Ltd | Metodo de modificacion de un aceite, que comprende hidrolizar gliceridos con una solucion de lipasa thermomyces lanuginosus, separar la fraccion de acido graso saturado de la fraccion de glicerido hidrolizado y esterificar los gliceridos hidrolizados en la presencia de candida antarctica lipasa b; y composicion de aceite. |
| CN101765662B (zh) * | 2007-07-30 | 2014-04-02 | 日本水产株式会社 | Epa浓缩油和dha浓缩油的制造方法 |
| WO2009020406A1 (en) * | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Granate Seed Limited | Methods of making lipid substances, lipid substances made thereby and uses thereof |
| KR101650680B1 (ko) * | 2007-08-31 | 2016-08-23 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 다중불포화된 지방산 함유 고체 지방 조성물 및 그의 용도 및 생산 |
| US7790429B2 (en) * | 2007-11-28 | 2010-09-07 | Transbiodiesel Ltd. | Robust multi-enzyme preparation for the synthesis of fatty acid alkyl esters |
| EP2334295B1 (en) | 2008-09-02 | 2017-06-28 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Pharmaceutical composition comprising eicosapentaenoic acid and nicotinic acid and methods of using same |
| WO2010036334A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-04-01 | LiveFuels, Inc. | Systems and methods for producing biofuels from algae |
| ES2633726T3 (es) | 2008-10-31 | 2017-09-25 | Lipid Pharmaceuticals Ehf. | Ácidos grasos para utilizar como medicamento |
| KR101070791B1 (ko) * | 2008-11-07 | 2011-10-07 | 씨제이제일제당 (주) | 효소적 에스테르 교환 반응으로 제조된 코코아 버터 대용 유지 및 그 제조방법 |
| EP2358217A4 (en) * | 2008-11-28 | 2014-04-30 | Pronova Biopharma Norge As | COMPOSITION WITH / WITHOUT AT LEAST ONE EASILY OXIDIZABLE COMPONENT WITH A PROCESSED EDIBLE OIL OR FAT MIXTURE FOR GROWTH PROMOTION IN ONE ANIMAL, OXIDATIVE STRESS INHIBITION, PREVENTION OF LIVER ENLARGEMENT IN FISHING AND FEED COMPOSITION |
| US8362080B2 (en) * | 2008-12-18 | 2013-01-29 | Baylor College Of Medicine | Increasing glutathione levels for therapy |
| CN103025880A (zh) | 2009-04-06 | 2013-04-03 | 诺维信公司 | 具有高不饱和脂肪酸含量的甘油三酯 |
| WO2010121094A1 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Livefuels. Inc. | Systems and methods for culturing algae with bivalves |
| MX2011011538A (es) | 2009-04-29 | 2012-06-13 | Amarin Pharma Inc | Composicion farmaceutica estable y metodos de uso de la misma. |
| NZ771180A (en) | 2009-04-29 | 2022-07-29 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same |
| ES2856959T3 (es) | 2009-06-15 | 2021-09-28 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Composiciones y métodos para el tratamiento del ictus en un sujeto en terapia simultánea con estatina |
| EP2480248B1 (en) | 2009-09-23 | 2015-09-02 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Pharmaceutical composition comprising omega-3 fatty acid and hydroxy-derivative of a statin and methods of using same |
| EP2519332B1 (en) | 2009-12-30 | 2014-03-05 | BASF Pharma (Callanish) Limited | Simulated moving bed chromatographic separation process for the purification of polyunsaturated fatty acids |
| FR2955459B1 (fr) * | 2010-01-28 | 2013-11-22 | Polaris | Composition huileuse riche en monoglycerides de dha |
| US20130123525A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-05-16 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Method for producing oil containing polyunsaturated fatty acid using lipase |
| US9476008B2 (en) | 2010-06-25 | 2016-10-25 | Epax As | Process for separating polyunsaturated fatty acids from long chain unsaturated or less saturated fatty acids |
| EP2638903A4 (en) | 2010-11-09 | 2013-12-04 | Mochida Pharm Co Ltd | GLYCEMIA ELEVATION SUPPRESSOR |
| US11712429B2 (en) | 2010-11-29 | 2023-08-01 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Low eructation composition and methods for treating and/or preventing cardiovascular disease in a subject with fish allergy/hypersensitivity |
| NZ727980A (en) | 2010-11-29 | 2018-08-31 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Low eructation composition and methods for treating and/or preventing cardiovascular disease in a subject with fish allergy/hypersensitivity |
| CL2010001587A1 (es) | 2010-12-27 | 2013-01-11 | Golden Omega S A | Proceso de preparacion de un concentrado de etil esteres de acidos grasos omega-3 que comprende sobre el 80% en peso de dichos esteres en configuracion cis y sus dobles enlaces separados por una unidad metilenica. |
| US9029584B2 (en) | 2011-03-03 | 2015-05-12 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Method for producing oil containing highly unsaturated fatty acid using lipase |
| US9487716B2 (en) | 2011-05-06 | 2016-11-08 | LiveFuels, Inc. | Sourcing phosphorus and other nutrients from the ocean via ocean thermal energy conversion systems |
| GB201111591D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | Further new process |
| GB201111594D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | New improved process |
| GB201111589D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | New modified process |
| GB201111595D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | Improved process |
| GB201111601D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | New process |
| ES2395320B1 (es) | 2011-07-14 | 2013-12-18 | Soluciones Extractivas Alimentarias, S.L. | Nuevo método para la reducción de contaminantes en grasas y aceites a partir de aceites y sus derivados. |
| CA2842032C (en) * | 2011-08-31 | 2016-09-27 | Trans Bio-Diesel Ltd. | Enzymatic transesterification with lipases immobilized on hydrophobic resins in water solutions |
| US20140205650A1 (en) | 2011-09-06 | 2014-07-24 | Lipid Pharmaceuticals Ehf. | Coated suppositories |
| US20130131170A1 (en) | 2011-11-07 | 2013-05-23 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating hypertriglyceridemia |
| US11291643B2 (en) | 2011-11-07 | 2022-04-05 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating hypertriglyceridemia |
| UA114615C2 (uk) | 2012-01-06 | 2017-07-10 | Омтера Фармасьютікалз, Інк. | Збагачена дпк композиція омега-3 поліненасичених жирних кислот у формі вільної кислоти |
| EP2800469B1 (en) | 2012-01-06 | 2021-08-25 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering levels of high-sensitivity (hs-crp) in a subject |
| WO2013169797A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | Omthera Pharmaceuticals, Inc. | Compositions of statins and omega-3 fatty acids |
| CN104302615B (zh) * | 2012-05-14 | 2017-09-08 | 日本水产株式会社 | 减低了环境污染物质的高度不饱和脂肪酸或高度不饱和脂肪酸乙酯及其制造方法 |
| RS61557B1 (sr) | 2012-06-29 | 2021-04-29 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Postupci za smanjenje rizika od kardiovaskularnog događaja kod pacijenta na terapiji statinom primenom etil estra eikozapentaenske kiseline |
| CN111508638B (zh) * | 2012-10-18 | 2021-12-21 | 陶氏环球技术有限公司 | 基于非油酸甘油三酯、低粘度、高闪点的介电流体 |
| US20150265566A1 (en) | 2012-11-06 | 2015-09-24 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and Methods for Lowering Triglycerides without Raising LDL-C Levels in a Subject on Concomitant Statin Therapy |
| US8540881B1 (en) * | 2012-11-27 | 2013-09-24 | Menlo Energy Management, LLC | Pretreatment, esterification, and transesterification of biodiesel feedstock |
| US8545703B1 (en) * | 2012-11-27 | 2013-10-01 | Menlo Energy Management, LLC | Production of glycerin from feedstock |
| US8545702B1 (en) * | 2012-11-27 | 2013-10-01 | Menlo Energy Management, LLC | Production of biodiesel from feedstock |
| US8580119B1 (en) * | 2012-11-27 | 2013-11-12 | Menlo Energy Management, LLC | Transesterification of biodiesel feedstock with solid heterogeneous catalyst |
| US20140187633A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating or preventing nonalcoholic steatohepatitis and/or primary biliary cirrhosis |
| US9814733B2 (en) | 2012-12-31 | 2017-11-14 | A,arin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions comprising EPA and obeticholic acid and methods of use thereof |
| GB201300354D0 (en) | 2013-01-09 | 2013-02-20 | Basf Pharma Callanish Ltd | Multi-step separation process |
| US9452151B2 (en) | 2013-02-06 | 2016-09-27 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing apolipoprotein C-III |
| US9624492B2 (en) | 2013-02-13 | 2017-04-18 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions comprising eicosapentaenoic acid and mipomersen and methods of use thereof |
| US9662307B2 (en) | 2013-02-19 | 2017-05-30 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions comprising eicosapentaenoic acid and a hydroxyl compound and methods of use thereof |
| US9283201B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-03-15 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for treating or preventing obesity in a subject in need thereof |
| US20140271841A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Pharmaceutical composition comprising eicosapentaenoic acid and derivatives thereof and a statin |
| CN104130860B (zh) * | 2013-05-03 | 2020-03-31 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸的方法 |
| US8802880B1 (en) | 2013-05-07 | 2014-08-12 | Group Novasep | Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids |
| US9428711B2 (en) | 2013-05-07 | 2016-08-30 | Groupe Novasep | Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids |
| US10966968B2 (en) | 2013-06-06 | 2021-04-06 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Co-administration of rosiglitazone and eicosapentaenoic acid or a derivative thereof |
| JP6302310B2 (ja) * | 2013-08-30 | 2018-03-28 | 備前化成株式会社 | 高純度オメガ３系脂肪酸エチルエステルの生産方法 |
| US20150065572A1 (en) | 2013-09-04 | 2015-03-05 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating or preventing prostate cancer |
| RU2533419C1 (ru) * | 2013-09-05 | 2014-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Способ производства биодизеля |
| US9585859B2 (en) | 2013-10-10 | 2017-03-07 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering triglycerides without raising LDL-C levels in a subject on concomitant statin therapy |
| EP3733857A3 (en) | 2013-12-04 | 2020-12-09 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Dihomo-gamma-linolenic acid-containing microbial oil and dihomo-gamma-linolenic acid-containing microbial biomass |
| EP3118186B1 (fr) * | 2013-12-11 | 2022-02-09 | Novasep Process | Installation chromatographique de production d acides gras polyinsatures |
| EP3092218B1 (fr) | 2014-01-07 | 2022-03-09 | Novasep Process Solutions | Procédé de purification d'acides aminés aromatiques |
| JP6357018B2 (ja) * | 2014-05-30 | 2018-07-11 | 花王株式会社 | 足用消臭剤組成物 |
| US10561631B2 (en) | 2014-06-11 | 2020-02-18 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing RLP-C |
| US10172818B2 (en) | 2014-06-16 | 2019-01-08 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing or preventing oxidation of small dense LDL or membrane polyunsaturated fatty acids |
| US10406130B2 (en) | 2016-03-15 | 2019-09-10 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing or preventing oxidation of small dense LDL or membrane polyunsaturated fatty acids |
| WO2018116297A1 (en) * | 2016-12-19 | 2018-06-28 | Trans Bio-Diesel Ltd. | ENZYMATIC ENRICHMENT OF n-3 FATTY ACIDS IN THE FORM OF GLYCERIDES |
| WO2018213663A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering triglycerides in a subject having reduced kidney function |
| WO2019030147A1 (en) * | 2017-08-07 | 2019-02-14 | Dsm Ip Assets B.V. | PROCESS FOR PRODUCTION OF CONCENTRATED OILS OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS |
| US11058661B2 (en) | 2018-03-02 | 2021-07-13 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering triglycerides in a subject on concomitant statin therapy and having hsCRP levels of at least about 2 mg/L |
| CN108795999B (zh) * | 2018-07-04 | 2021-01-05 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种三饱和脂肪酸甘油酯的制备方法 |
| MA51766A (fr) | 2018-09-24 | 2020-12-16 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Procédés de réduction du risque d'événements cardiovasculaires chez un sujet |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4377525A (en) * | 1980-10-22 | 1983-03-22 | Plastics Engineering Company | Addition products of diacetylene-terminated polyimide derivatives and a dienophile having a terminal vinyl group |
| US4377526A (en) * | 1981-05-15 | 1983-03-22 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Method of purifying eicosapentaenoic acid and its esters |
| JPS5914793A (ja) * | 1982-07-16 | 1984-01-25 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | 高度不飽和脂肪酸低級アルコ−ルエステルの濃縮分離方法 |
| JPS6078587A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Lion Corp | 脂肪酸エステルの製造方法 |
| JPS60234588A (ja) * | 1984-05-07 | 1985-11-21 | Asahi Denka Kogyo Kk | 長鎖高度不飽和脂肪酸アルコ−ルエステルの製造法 |
| US4792418A (en) * | 1985-08-14 | 1988-12-20 | Century Laboratories, Inc. | Method of extraction and purification of polyunsaturated fatty acids from natural sources |
| JPS6291188A (ja) * | 1985-10-17 | 1987-04-25 | Nisshin Oil Mills Ltd:The | 高度不飽和脂肪酸グリセリドの製造法 |
| NO157302C (no) * | 1985-12-19 | 1988-02-24 | Norsk Hydro As | Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeoljekonsentrat. |
| JPS63192324A (ja) * | 1986-12-19 | 1988-08-09 | ニチアスセラテック株式会社 | ロツクウ−ル細粒綿 |
| JPH0789944B2 (ja) * | 1986-12-23 | 1995-10-04 | 旭電化工業株式会社 | 製菓用油脂組成物の製法 |
| JPH0716425B2 (ja) * | 1987-05-20 | 1995-03-01 | 花王株式会社 | 油脂類のエステル交換反応方法 |
| JPH01252294A (ja) * | 1988-03-31 | 1989-10-06 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | 不飽和脂肪酸エステルの濃縮方法 |
| JPH0225447A (ja) * | 1988-07-13 | 1990-01-26 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | 高度不飽和脂肪酸類の製造方法 |
| GB8819110D0 (en) * | 1988-08-11 | 1988-09-14 | Norsk Hydro As | Antihypertensive drug & method for production |
| US5316927A (en) * | 1988-10-04 | 1994-05-31 | Opta Food Ingredients, Inc. | Production of monoglycerides by enzymatic transesterification |
| US5935828A (en) * | 1989-05-01 | 1999-08-10 | Opta Food Ingredients, Inc. | Enzymatic production of monoglycerides containing omega-3 unsaturated fatty acids |
| DK95490D0 (da) * | 1990-04-18 | 1990-04-18 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af triglycerid og triglyceridsammensaetning |
| JPH06116585A (ja) * | 1992-10-09 | 1994-04-26 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 油脂の精製方法 |
| JP2668187B2 (ja) * | 1993-09-17 | 1997-10-27 | 日清製油株式会社 | リパーゼ粉末を用いたエステル交換法 |
-
1994
- 1994-03-08 GB GB9404483A patent/GB9404483D0/en active Pending
-
1995
- 1995-03-07 WO PCT/NO1995/000050 patent/WO1995024459A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-07 CA CA002185018A patent/CA2185018C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 RU RU96118495/04A patent/RU2151788C1/ru active
- 1995-03-07 CN CN95192022A patent/CN1143384A/zh active Pending
- 1995-03-07 ES ES95912522T patent/ES2133752T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 US US08/714,042 patent/US5945318A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 JP JP52338495A patent/JP4236128B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 HU HU9602440A patent/HUT76707A/hu unknown
- 1995-03-07 AU AU19639/95A patent/AU686348B2/en not_active Expired
- 1995-03-07 ZA ZA951867A patent/ZA951867B/xx unknown
- 1995-03-07 DE DE69509756T patent/DE69509756T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 EP EP95912522A patent/EP0749468B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 IS IS4270A patent/IS4270A/is unknown
- 1995-03-07 NZ NZ282508A patent/NZ282508A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-09-04 KR KR19967004872A patent/KR970701773A/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT76707A (en) | 1997-10-28 |
| DE69509756T2 (de) | 1999-12-02 |
| AU1963995A (en) | 1995-09-25 |
| ES2133752T3 (es) | 1999-09-16 |
| ZA951867B (en) | 1995-12-11 |
| HU9602440D0 (en) | 1996-11-28 |
| EP0749468A1 (en) | 1996-12-27 |
| CN1143384A (zh) | 1997-02-19 |
| RU2151788C1 (ru) | 2000-06-27 |
| WO1995024459A1 (en) | 1995-09-14 |
| CA2185018C (en) | 2000-12-19 |
| JPH09510091A (ja) | 1997-10-14 |
| NZ282508A (en) | 1997-09-22 |
| KR970701773A (en) | 1997-04-12 |
| AU686348B2 (en) | 1998-02-05 |
| DE69509756D1 (de) | 1999-06-24 |
| EP0749468B1 (en) | 1999-05-19 |
| IS4270A (is) | 1995-09-09 |
| US5945318A (en) | 1999-08-31 |
| GB9404483D0 (en) | 1994-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4236128B2 (ja) | 精油組成物 | |
| Soumanou et al. | Two-step enzymatic reaction for the synthesis of pure structured triacylglycerides | |
| Tanaka et al. | Concentration of docosahexaenoic acid in glyceride by hydrolysis of fish oil with Candida cylindracea lipase | |
| JP5111363B2 (ja) | 高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法 | |
| JP5204776B2 (ja) | Ｅｐａ濃縮油およびｄｈａ濃縮油の製造方法 | |
| Haraldsson et al. | The preparation of concentrates of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid by lipase‐catalyzed transesterification of fish oil with ethanol | |
| Hills et al. | Enzymatic fractionation of fatty acids: Enrichment of γ‐linolenic acid and docosahexaenoic acid by selective esterification catalyzed by lipases | |
| US7491522B2 (en) | Lipase-catalysed esterification of marine oil | |
| Shimada et al. | Purification of docosahexaenoic acid by selective esterification of fatty acids from tuna oil with Rhizopus delemar lipase | |
| CA2803477C (en) | Process for separating polyunsaturated fatty acids from long chain unsaturated or less saturated fatty acids | |
| Shimada et al. | Purification of docosahexaenoic acid from tuna oil by a two‐step enzymatic method: Hydrolysis and selective esterification | |
| EP0882797B1 (en) | Preparation of symmetrical triglycerides aba | |
| RU96118495A (ru) | Рафинирование масляных композиций | |
| NO312973B1 (no) | Lipase-katalysert forestring av marine oljer | |
| EP2147088A1 (en) | A polyunsaturated fatty acid (pufa) enriched marine oil comprising eicosapentaenoic acid (epa) and docosahexaenoic acid (dha), and a process of production thereof | |
| Yamane et al. | Production of n‐3 polyunsaturated fatty acid‐enriched fish oil by lipase‐catalyzed acidolysis without solvent | |
| EP1891189A2 (en) | Concentration of fatty acid alkyl esters by enzymatic reactions with glycerol | |
| JP4079516B2 (ja) | トリグリセリドの製造方法 | |
| Wongsakul et al. | Lipase‐catalyzed synthesis of structured triacylglycerides from 1, 3‐diacylglycerides | |
| JP6645804B2 (ja) | 構造油脂の製造方法 | |
| Lie Ken Jie et al. | Enzymatic enrichment of C20cis‐5 polyunsaturated fatty acids fromBiota orientalis seed oil | |
| US7737289B2 (en) | Process for enriching polyunsaturated fatty acids | |
| JP3734905B2 (ja) | ω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法 | |
| JP2020174570A (ja) | 高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法 | |
| JPH0588111B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040212 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040329 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040511 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040622 |
|
| A72 | Notification of change in name of applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A721 Effective date: 20040921 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061012 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061012 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080707 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080718 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080904 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080916 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081212 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
| S633 | Written request for registration of reclamation of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313633 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121226 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121226 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131226 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |