HUT76707A - Refining oil compositions - Google Patents

Refining oil compositions Download PDF

Info

Publication number
HUT76707A
HUT76707A HU9602440A HU9602440A HUT76707A HU T76707 A HUT76707 A HU T76707A HU 9602440 A HU9602440 A HU 9602440A HU 9602440 A HU9602440 A HU 9602440A HU T76707 A HUT76707 A HU T76707A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lipase
dha
epa
acid
fatty acids
Prior art date
Application number
HU9602440A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9602440D0 (en
Inventor
Harald Breivik
Gudmundur G Haraldsson
Original Assignee
Norsk Hydro As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Norsk Hydro As filed Critical Norsk Hydro As
Publication of HU9602440D0 publication Critical patent/HU9602440D0/hu
Publication of HUT76707A publication Critical patent/HUT76707A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/60—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by treatment giving rise to chemical modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/02—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils
    • C11C1/04—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis
    • C11C1/045—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis using enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/10—Ester interchange
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

KIVONAT
A találmány szerinti eljárás telített és telítetlen zsírsavakat trigliceridek alakjában tartalmazó olajkompozíció kezelése útján többszörösen telítetlen zsírsavakat nagyobb koncentrációban tartalmazó finomított termék előállítására szolgál. Az eljárás során
a) az olajkompozíciót lényegileg vízmentes körülmények között 1-6 szénatomos alkohollal, elsődlegesen telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak átészterezését katalizáló lipáz jelenlétében átészterezik, ahol a jelen lévő trigliceridre vonatkoztatva legfeljebb 15 mólekvivalens mennyiségű 1-6 szénatomos alkoholt használnak, és
b) a lipázzal katalizált átészterezési reakcióban kapott telített és telítetlen zsírsav-észtereket tartalmazó frakciótól többszörösen telítetlen zsírsavak gliceridjeiben dúsított frakciót választanak el.
A találmány szerinti eljárás egyes változatai alkalmasak olajkompozícióból környezetszennyező anyagok eltávolítására. (1. ábra)
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440
Képviselő:
Danubia Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft. Budapest
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
Eljárás olajok finomítására NORSK HYDRO A.S, Oslo, NO
Feltalálók:
BREIVIK Harald
HARALDSSON Gudmundur
A bejelentés napja: Elsőbbsége:
A nemzetközi bejelentés száma:
A nemzetközi közrebocsátás száma:
Skjelsvik, NO Reykjavik, IS
1995. 03. 07.
1994. 03. 08. (9404483.1, GB)
PCT/N095/00050
WO 95/24459
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·· ·· ···· » · · · »·· · · ··.
• · · •» ····· ·
A találmány telített és telítetlen zsírsavakat trigliceridek alakjában tartalmazó olajkompozíció kezelése útján többszörösen telítetlen zsírsavakat nagyobb koncentrációban tartalmazó finomított termék új előállítási eljárására vonatkozik. A találmány előnyös változatai különösen halolaj-kompozícióban ejkozapentánsav és dokozahexánsav koncentrációjának növelésére vonatkoznak.
A leírásban a többszörösen telített zsírsavakat olyan rendszerben azonosítjuk, amelyben az Ω- vagy n-számok az első kettős kötés helyét a láncvégi metilcsoporttól számítva adják meg, azaz egy Ω-3 vagy n-3 típusú zsírsavban az első kettős kötés a sav láncvégi metilcsoportjátói számított harmadik szénatomnál fordul elő. Egy C18:3 jelzéssel azonosított zsírsav továbbá a szénláncban 18 szénatomot és három kettős kötést tartalmazó zsírsavat jelent.
Ipari szempontból fontos többszörösen telítetlen zsírsavak az EPA (ejkozapentánsav, C20:5), a DHA (dokozahexánsav, C22:6) és az AA (arachidonsav, C20:4). E savak IUPAC rendszer szerinti teljes elnevezése a következő
EPA - cisz-5,8,11,14,17-ejkozapentánsav,
DHA - cisz-4,7,10,13,16,19-dokozahexánsav és
AA - cisz-5,8,11,14-ejkozatetraénsav.
Ismeretes, hogy az EPA és DHA fontossága különösen a gyógyszeripar és az élelmiszerkiegészítőket gyártó ipar számára fokozatosan növekszik. Ezek a savak viszonylag nagy koncentrációkban találhatók bizonyos tengeri állatokból előállított olajokban, azonban számos célra szükséges ezeknek az olajoknak a finomítása az EPA és/vagy DHA koncentrációjának
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · • · · · • · · • · · · · megfelelő növelésére vagy a nyers olajban természetesen előforduló bizonyos más anyagok eltávolítására vagy koncentrációjuk csökkentésére. így gyógyszerek és élelmiszerek esetén szükség van a tengeri állatokból előállított olajokban szokásosan előforduló peszticidmaradványok lényegileg teljes eltávolítására még azoknak a halaknak az esetén is, amelyeket intenziven művelt területektől egészen távol eső tengerekben fognak ki.
Természetes előfordulási állapotuknak megfelelően az EPA és DHA szerkezetében teljes cisz(Z-Z) konfigurációra van szükség ahhoz, hogy biológiai aktivitásuk toxikusság nélkül érvényesüljön. Ezek a savak azonban hevítés során rendkívül „törékenyek”, és nagyon könnyen gyors oligomerizálási, izomerizálási és peroxidációs reakciókban vesznek részt. Ennek megfelelően tengeri állatokból előállított, EPA- és DHA-tartalmú olajkompozíciók tisztítása rendkívül bonyolult annak veszélye nélkül, hogy ezeket a kívánt savakat hasznos formájukban elveszítsük.
A tengeri állatokból előállított olajokban az EPA és DHA főleg trigliceridjeik alakjában fordul elő. Az eddig alkalmazott legtöbb finomítási eljárás kezdetén vagy kis molekulatömegű alkohollal (szokásosan etanollal) észterezik az olajat, vagy az olajat szabad savakká vagy sóikká hidrolizálják, majd ezt követően a kívánt termék kinyerésére szakaszos lepárlást folytatnak le.
A tengeri állatokból előállított nyersanyagok bonyolult öszszetétele következtében azonban egyetlen szakaszos lepárlási eljárással nem könnyű többszörösen telítetlen zsírsavszárma84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • ·
- 4 zékokat nagy tisztaságú alakban előállítani. Ezért szokásosan eljárások kombinációját alkalmazzák, ahol az egyes esetekben megválasztott kombináció a nyersanyag összetételétől és koncentrációjától, valamint a termék szempontjából kívánatos minőségi kritériumoktól függ. Nagy EPA- és/vagy DHA-koncentrációjú készítmények előállítására szokásosan alkalmazott eljárásokban az egyik elválasztási módszer komplexek képzése karbamiddal.
A karbamid egyik hasznos tulajdonsága, hogy egyenes láncú szerves vegyületekkel szilárd komplexeket alkot. Ha tengeri állatokból előállított, zsírsavakat vagy -észtereket tartalmazó olajkompozíciót karbamidoldathoz adunk, a legkevésbé telítetlen savakkal kristályos komplex képződik. A kristályokat elválasztva telítetlenebb zsírsavak vagy zsírsav-észterek finomított terméke marad vissza.
A karbamiddal lefolytatott komplexképzést alkalmazzák mind szabad zsírsavak, mind zsírsavak metil- vagy etil-észterei esetén. Az eljárás lefolytatható folyamatos üzemmódban a karbamidkiválás reaktoraként kapart felületű hőcserélők használatával. Észterek szakaszos elválasztása esetén a szokásos eljárás szerint először az olajat alkohollal és/vagy alkohol/víz eleggyel reagáltatják, majd a karbamiddal lefolytatott komplexképzés előtt az észtereket és szabad zsírsavakat elválasztják. In situ észterezés és karbamiddal való elválasztás együttesen is lefolytatható (EP A 0 255 824).
Ha egy ilyen, a fentiekben vázolt eljárást többek között két vagy több lépésben lefolytatott molekuláris desztillációval kombinálnak, tengeri állatokból előállított nyers olajból előállít84158-3523/VO/LZs
P 96 02440
- 5 ható olyan finomított termék, amely legalább 85 tömeg% n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakat, főleg EPA és DHA komponenseket tartalmaz. A finomított termékre vonatkozó bruttó kinyerés azonban nemkívánt módon csekély. Ilyen hagyományos elválasztási műveleteket alkalmazó jellegzetes ipari eljárásban 1000 t tengeri állatokból előállított nyers olajból csak 60-80 t 85 tömeg%-os n-3 típusú zsírsavkoncentrátum várható, azaz a kinyerés csak 6-8%-os. Az ilyen csekély kitermelés nemcsak azt jelenti, hogy az ilyen finomítási eljárások nagyon költségesek, hanem azt is, hogy ezek az eljárások nagy méretű, bonyolult berendezéseket igényelnek.
Számos környezetszennyező anyag (így peszticidek és klóratommal többszörösen helyettesített bifenilek) lipofil jellege következtében ezek a vegyületek tengeri eredetű lipidekben felhalmozódnak. A karbamid számos ilyen szennyező anyaggal kedvezőtlen módon nem képez komplexeket, ennek eredményeként a karbamiddal lefolytatott komplexképzés útján kapott koncentrátum a tengeri állatokból előállított eredeti olajhoz viszonyítva peszticideket és egyéb környezetszennyező anyagokat megnövekedett - számos célra elfogadhatatlanul nagy mértékben tartalmaz. Ennek következtében a karbamiddal lefolytatott komplexképzésen alapuló jelenlegi finomítási eljárások bonyolult és költséges tisztítási műveleteket igényelnek a szennyező anyagok elfogadható koncentrációra csökkentése céljából olyan esetekben, ha emberi fogyasztásra szánt finomított halolaj előállítására szolgálnak.
A találmány célja javított eljárás kidolgozása olajkompozíciók többszörösen telítetlen zsírsavtartalmának növelésére,
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · közelebbről olyan eljárás kidolgozása, amely ipari eljárásként alkalmas halolajból megnövelt kitermeléssel EPA és/vagy DHA kinyerésére.
Ismeretes, hogy lipázok katalizátorként alkalmasak olyan eljárásokhoz, amelyekkel tengeri állatokból előállított olajban előforduló, nagy mértékben labilis n-3 típusú, többszörösen telítetlen zsírsavakat, így EPA és DHA komponenseket kezelnek. Ez a lipázok alacsony hőmérsékleteken is érvényesülő hatásosságának, semleges pH-jának és kíméletes hatásának következménye, ami lehetővé teszi a nemkívánatos mellékreakciók, így a cisz-transz izomerizálódás, kettős kötések migrációja, polimerizálódás, oxidálódás és hasonlók minimális sebességen tartását. A lipázok alkalmazása tengeri állatokból előállított olajban lévő zsírsavak hidrolízisére ezért a szakirodalomban kellő részletességgel tárgyalva van.
Beszámoltak arról, hogy tőkehal beiéiből kinyert lipáz a kapelinolajban trigliceridekként jelen lévő 18:4, 20:5 és 22:6 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakat hidrolizálta elsődlegesen [Lie és Lambertsen: Comp. Biochem Physiol. 80B, (3), 447-450, (1985)]. Az ismertetés szerint ez a specifikus jelleg különösen a 20:5 típusú sav, azaz EPA esetében érvényesült.
Azt is megállapították, hogy a kapelinolajban trigliceridekként jelen lévő 14-18 szénatomos telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak kitüntetett hidrolizálásához vezetett a Candida cylindracea lipáz, míg a hosszú szénláncú egyszeresen telítetlen C20:1 és C22:1 típusú zsírsavak, és különösen a többszörösen telítetlen zsírsavak, így a C18:4 és kisebb mértékben az
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • ·
- 7 EPA és DHA a hidrolízis szempontjából rezisztens volt [Lie és Lambertsen: Fette, Seifen, Anstrichmittel, 88, 365 (1986)].
Többszörösen telítetlen zsírsavak koncentrátumainak előállítására ismertettek olyan eljárást, amely lipázok telített és telítetlen savakra vonatkozóan hasonló eltérő hatásán alapszik (JP 59-14 793). Különböző (Candida cylindracea, Aspergillus rhizopus és Mucor miehei) lipázokkal tengeri állatokból származó vegyes olajokban, így szardíniaolajban és makrélaolajban lévő etil-észtereket hidrolizáltattak. A hidrolizált zsírsavak elválasztását követően lefolytatott szelektív hidrolízis során kapott etil-észter-koncentrátumokban az EPA- és DHA-tartalom 25 tömeg%-ig, illetve 17 tömeg%-ig terjedt.
Tengeri állatokból előállított olaj hidrolízisére ismertettek Candida sp. lipázon alapuló eljárást is (JP 172 691). Az EPA-t vagy észterét szabad zsírsavkomponensből, a DHA-t vagy észterét a visszamaradó gliceridkomponensből nyerték ki. Az eljárás során lefolytatott műveletek a következők: a zsírsav- és gliceridkomponensek elválasztása, észtere2és rövid szénláncú alkilcsoporttal, többszörösen telítetlen zsírsavak betöményítése karbamiddal lefolytatott komplexképzés útján és további finomítás molekuláris desztilláció, szuperkritikus CO2 közeggel lefolytatott folyadékfázisú extrakció vagy folyadékkromatográfla alkalmazásával. EPA és DHA elválasztására fordított eljáráson alapuló módszert is ismertettek Mucor miehei lipáz alkalmazásával [Takagi: Am. Oil Chem. Soc. 66, 488 (1988)].
Japán szardíniaolajból a karbamidadalékot alkalmazó eljárással kapott többszörösen telítetlen zsírsav-koncentrátumokat szobahőmérsékleten n-hexán közegben metanollal észterezték.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • ·
- 8 A lipáz EPA és DHA tekintetében eltérő viselkedése folytán lejátszódó szelektív észterezés 51 tömeg% EPA- és 6 tömeg% DHA-tartalmú, EPA komponensben dúsított metil-észter koncentrátumot, valamint 52 tömeg% DHA- és 12 tőmeg% EPA-tartalmú, DHA komponensben dús szabad zsírsav-koncentrátumot eredményezett 59:41 tömegarányban.
Újabban különböző lipázokat alkalmaztak csukamájolaj és finomított szardíniaolaj szelektív hidrolízisére [Agric. Bioi. Chem. 54, 1459, (1990)]. A legjobb eredményeket a nem régióspecifikus Candida cylindracea és az 1,3-specifikus Aspergillus niger lipázok esetén kapták, azonban a gliceridtermékek EPA-tartalmát egyik lipáz sem növelte szignifikáns módon.
A technika állásából a lipázok tengeri állatokból előállított olajok zsírsav-észtereinek hidrolízisére történő alkalmazásából kitűnik, hogy a különböző lipázok eltérően viselkednek, valamint az egyik és másik zsírsav vagy az egyik típusú és a másik típusú zsírsav egészen eltérő szelektivitása gyakran a lipázok tulajdonságainak következménye.
Bizonyos lipázoknak ezt a szubsztrátumra vonatkozó szelektivitását használták ki n-3 típusú többszörösen telített zsírsavakban dús frakció előállítására csukamájolaj lipázzal katalizált alkoholízise útján [Zuyi és Ward: Enzyme Microb. Technok, 15, 601-606 (1993)]. Kilenc vizsgált lipáz közül a Pseudomonas sp. lipáz (CES, gyártó cég: Amano International Enzyme Co.) hatására a halolaj alkoholízise nagyobb sebességgel játszódott le, mint a többi lipáz jelenlétében, ennek következtében az EPA és DHA komponensekben jelentősen dúsított monoglicerideket állítottak elő. Ebben az ismert eljárásban az alkohol rea84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·· · · • · » gens és egyúttal a reakcióközeg oldószere is volt (az eljárásban etanolt és izopropanolt alkalmaztak).
A fenti közlemény szerzői tanulmányozták a reakcióelegyben lévő vlzkoncentráció hatását. Megállapították, hogy a 0-7,5 térfogat% víztartalom-tartományban a CES lipáz jelenlétében (izopropanollai) lefolytatott alkoholízis sebessége nő. A közölt adatok azt mutatják, hogy 5 térfogat% víztartalom optimális, és akár 2,5 térfogat% víztartalom esetén az olajban eredetileg jelen lévő trigliceridek több mint 40%-a 12 óra múlva is reagálatlan marad. (A víztartalomra vonatkozó fenti adatok a reakcióelegyhez hozzáadott vízre vonatkoznék, figyelmen kívül hagyva a halolajban és a „száraz” enzimben jelen lévő kis mennyiségű vizet.) Következésképpen a triglicerid szabad zsírsavvá hidrolízise nagyon jelentős volt (jellemzően meghaladta a 30%-ot), így 5 térfogat% víztartalom esetén a hidrolízis foka 18,9% volt (az alkoholízis csupán 15,5%-os mértékéhez hasonlítva).
A fenti eljárás tudományos értéke kétségtelen, azonban nem eredményezett javított eljárást tisztított EPA/DHA kompozíciók ipari előállítására. Közelebbről a lipázzal katalizált termékben jelentős mennyiségű szabad zsírsav elkerülhetetlen jelenléte megnehezíti a kívánt n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavak későbbi tisztítását. így a szabad zsírsavak kis illékonyságuk következtében nem választhatók el a gliceridektől szokásos molekuláris desztillációs eljárásokkal. Ezenkívül minthogy az észterek és a szabad zsírsavak polaritása lényegesen különböző, míg a mono- és digliceridek közbülső polaritásúak - az észterek és a szabad zsírsavak nem választhatók
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·©*·
- 10 el a gliceridektől extrakcióval. Az alábbiakban ismertetettek szerint a találmány ezzel szemben előnyösen használhatja a molekuláris desztillációs eljárást nem csak többszörösen telítetlen zsírsav-gliceridek telített és egyszeresen telítetlen zsírsav-észterektől való elválasztására, hanem egyidejűleg arra is, hogy környezetszennyező anyagokat, így peszticideket és klórral többszörösen helyettesített bifenileket eltávolítsunk a kívánt többszörösen telítetlen zsírsav-glicerid frakcióból.
Váratlan módon azt állapítottuk meg, hogy - a találmánynak megfelelően - bizonyos lipázok, közöttük a Pseudomonas sp. lényegileg vízmentes reakciókörülmények között alkalmazhatók tengeri állatokból előállított olajban lévő trigliceridekben a telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak észtercsoportjainak szelektív átészterezésére. Megállapítottuk, hogy az ilyen átészterezés lényeges mértékű hidrolízis nélkül az érzékenyebb telített zsírsavak monoésztereinek elegyéhez vezet, és a visszamaradó n-3 típusú többszörösen telítetlen hosszú szénláncú zsírsavak a glicerinhez között állapotban maradnak észter alakjában, a konverzió mértékétől függően főleg mono- és digliceridekként, azonban még trigliceridek is előfordulnak.
A fentiek alapján a találmány eljárás telített és telítetlen zsírsavakat trigliceridek alakjában tartalmazó olajkompozíció kezelése útján többszörösen telítetlen zsírsavakat nagyobb koncentrációban tartalmazó finomított termék előállítására. Az eljárás során
a) az olajkompozíciót lényegileg vízmentes körülmények között 1-6 szénatomos alkohollal, elsődlegesen telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak átészterezését katalizáló lipáz
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • *w
- 11 jelenlétében átészterezzük, ahol a jelen lévő trigliceridre vonatkoztatva legfeljebb 15 mólekvívalens mennyiségű 1-6 szénatomos alkoholt használunk, és
b) a lipázzal katalizált átészterezési reakcióban kapott telített és telítetlen zsírsav-észtereket tartalmazó frakciótól többszörösen telítetlen zsírsavak gliceridjeiben dúsított frakciót választunk el.
A fentiek szerint a találmány szerinti eljárás lipázt alkalmaz, amely a tengeri állatokból előállított olajban lévő telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak átészterezését katalizálja elsődlegesen. Megállapítottuk, hogy számos lipáz a találmány szerinti átészterezési reakcióban viszonylag csekély aktivitást fejt ki vagy ténylegesen nem aktív, vagy pedig csekély szelektivitást mutat egyrészt telített és egyszeresen telített zsírsavak, másrészt többszörösen telítetlen zsírsavak vonatkozásában. Ez érvényes többek között a következő lipázokra: Geotrichum candidum (GCL; Amano GC), Aspergillus niger (ANL; Amano A), Candida rugósa (CRL; Amano AY), Chromobactaeirum viscosum (CVL; Sigma), Humicula lanuginosa (HLL; Amano CE), Rhizopus delemar (RDL; Amano D), Rhizopus oryzae (ROL; Amano F), Penicillium camembertii (PCL; Amano G), Candida lipolytica (CLL; Amano L), Mucor javanicus (MJL; Amano M) és Rhizopus niveus (RNL; Amano N). A Candida antarctica (CAL; Novo SP435) az átészterezési reakcióban nagyon aktív, a zsírsavak különböző osztályai között azonban csekély szelektivitást mutat vagy egyáltalán nem szelektív, ezért a találmány szempontjából alkalmatlan.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · • · ···
A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatónak talált lipázok többek között a Mucor miehei lipáz (MML, Novo Lipozyme), amely jó átészterezési aktivitást, valamint elfogadható szelektivitást mutat a többszörösen telítetlen zsírsavak és a telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak vonatkozásában; Candida cylindracea (CCL, Sigma) és Penicillium roguefortii (PRL, Amano R) lipázok, amelyek kielégítő szelektivitást mutatnak, bár aktivitásuk csekélyebb, mint néhány más lipázé; továbbá a Pseudomonas fluorescens (PFL, Amano PS) és Pseudomonas sp. (PSL, Amano AK) lipázok, amelyeknek aktivitása és szelektivitása egyaránt jó, ezért gyakran előnyösen használhatók a találmány megvalósításához.
A lipáz hordozóanyagon történő immobilizálása számos előnnyel járhat. így az immobilizálás a lipázoknak nagyobb stabilitást kölcsönöz, ezért tovább használhatók. Az immobilizálás megkönnyíti visszanyerésüket és lehetővé teszi ismételt felhasználásukat, ami jelentősen csökkenti a lipázok költségét. Az észterezési reakciók is könyebben befolyásolhatók, ha immobilizált enzimet használunk, és a lipáz folyamatos eljárások iránt érzékenyné válhat, ami alapvető fontosságú lehet enzimatikus ipari eljárások szempontjából. Az immobilizálás olykor javítja az enzimek alkalmasságát. Végül a lipáz diszperziója a hordozó felületén biztosítja a lipáz szubsztrátumokkal való érintkezését, ami lényegesen megnöveli az enzim tömegegységre vonatkoztatott aktivitását, jelentősen csökkentve ezáltal az adagolt enzim mennyiségét és az ezzel járó költségeket.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 * ··· · ··· · · • · · · · · · ··» · · ····«· · ·
Ha az EPA és DHA komponensekben egyaránt dúsított finomított halolaj-kompozíció előállítása kívánatos, akkor előnyös olyan lipáz alkalmazása, amely e két n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakra nézve lényegileg inaktív, azaz amely lényegében nem tesz különbséget az EPA és DHA között. Ilyen esetben előnyösen a Pseudomonas fluorescens és Pseudomonas sp. lipázokat alkalmazzuk,, amelyek közül az utóbbi különösen előnyös. E lipázok beszerzési forrása: Amano International Enzyme Co., Nagoya, Japan.
A találmány kritikus jellemzője, hogy a lipázzal katalizált átészterezést lényegében vízmentes reakciókörülmények között kell lefolytatni. A reakcióelegy teljes víztartalma - az összes forrásból, beleértve a tengeri állatokból előállított olajat és a lipázt - előnyösen legfeljebb 1 tömeg%, előnyösebben legfeljebb 0,5 tömeg%, legelőnyösebben 0,01-0,25 tömeg%. (Jellemző esetben a tengeri állatokból előállított olaj kiindulási anyag víztartalma 0,1-0,2 tömeg%, a reagensként használt abszolút etanol 0,2-0,5 tömeg% vizet tartalmaz, éö a lipázkészítmény víztartalma 2-2,5 tömeg%.)
Teljesen vízmentes reakciókörülmények megvalósítása azonban nem lehetséges, minthogy kis mennyiségű, a lipáz tömegére számítva általában 1-2 tömeg% víz mindig szükséges enzimrendszerekben az aktivitás fenntartására, bár ennek mennyisége nagyon függ a kérdéses enzimtől (a Candida cylindracea lipáz így 10 tömeg% víz hozzáadását igényeli ahhoz, hogy a találmány szerinti eljárásban optimális aktivitást fejtsen ki). Amint az alábbi példákban bemutatjuk, ilyen kis mennyiségű víz nem vezet jelentős mértékű hidrolízishez, és
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · • · · » az átészterezett termékben a szabad zsírsavak koncentrációja tömeg%-nál kisebb értéken tartható, azaz a Zuyi és Ward fenti közleményében ismertetett hidrolízis mértékének csak
10%-át teszi ki.
A találmány másik kritikus jellemzője, hogy a jelen lévő alkohol mennyiségét a jelen lévő trigliceridekre vonatkoztatva legfeljebb 15 mólekvivalens, előnyösen legfeljebb 9 mólekvivalens mennyiségben kell korlátozni (a sztöchiometrikus mennyiség 3 mólekvivalens alkohol). Az alkohol így elsődlegesen inkább reagensként szolgál, mint oldószerként. Meglepő, hogy a tengeri állatokból előállított olaj trigliceridjeinek lipázzal katalizált szelektív átészterzése ilyen eredményesen lefolytatható lényegében oldószermentes reakcióelegyben. Előnyösen lényegében sztöchiometrikus mennyiségű, azaz a jelen lévő trigliceridekre vonatkoztatva 2-5 mólekvivalens mennyiségű alkoholt használunk, minthogy a sztöchiometrikus mennyiséghez képest nagy alkoholfelesleg a kívánt többszörösen telítetlen zsírsavak kisebb mértékű kinyerését eredményezi.
Jóllehet bármilyen 1-6 szénatomos alkoholt használhatunk, előnyösen abszolút (jellemzően 0,1-0,5 tomeg% víztartalmú) etanolt használunk a hozzáférhetőség és költségek okán, a lényegében vízmentes reakciókörülmények követelményét is szem előtt tartva.
Az átészterezési reakció lefolytatásának hőmérséklete nem kritikus. Megállapítottuk azonban, hogy a reakció szelektivitása növekvő hőmérséklettel csökken, bár a reakciósebesség nő. A reakciót előnyösen általában 40-60 °C-ig terjedő hőmérsékle84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·· ···· ·· • · ·
ten folytatjuk le az alkalmazott lipáztól függően, a reakciót még előnyösebben szobahőmérsékleten (20 °C körül) folytatjuk le.
Az átészterezést lefolytathatjuk oly módon, hogy reakcióközegként szuperkritikus folyadékokat, így szuperkritikus CO2-ot használunk. Halolaj etanolizisét lefolytattuk szuperkritikus CO2-ban 250 bar nyomáson 40 °C hőmérsékleten. A szuperkritikus CO2 folyadék nem csak reakcíóközegként használható, hanem az észterek és szabad zsírsavak maradék gliceridektől való elválasztására is.
Tengeri állatokból előállított olaj trigliceridjeinek találmány szerinti, lipázzal katalizált átészterezését sematikusan a következő, egyszerűsített reakcióegyenlettel szemléltethetjük, ahol 1-6 szénatomos alkoholként etanolt alkalmazunk.
a) reakciólépés
(— OOCR-i pOH p-OOCR'
Lipáz
-oocr9-► -OOCR* + -OOCR’ +
EtOH
t-OOCR- oocr' L-oh
i—OH
A fenti reakciólépésben
R1f R2 és R3 jelöli az eredeti kompozícióban trigliceridek alakjában jelen lévő vegyes (telített, egyszeresen telítetlen és többszörösen telítetlen) zsírsavakat,
R’ jelöli a n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakat, és R” jelöli a telített és egyszeresen telítetlen zsírsavakat.
(Az egyszerűség kedvéért a reakciótermékek között csak 1,2és 2,3-diglicerideket, valamint 2-monogticerideket tüntettünk fel.)
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · I • · · • · · · · · · • · · «· ····· » · ·
Az etil-észter-frakciót alkalmasan molekuláris desztilláció útján választjuk el a gliceridfrakciótól, ahol a viszonylag illékony etil-észtereket könnyen eltávolíthatjuk a kevésbé illékony maradék gliceridelegytől. Minthogy az átészterezési reakció terméke - a lényegében vízmentes reakciókörülmények következtében - csak kis mennyiségű szabad zsírsavakat tartalmaz, a molekuláris desztillációt követően visszamaradó frakció a nemkívánatos telített és egyszeresen telítetlen zsírsavaktól lényegében mentes. Azonban még a molekuláris desztilláció művelete után is megjelenhet a desztillátumban a leginkább illékony monogliceridek kis része, amelyek főleg viszonylag rövid láncú zsírsav-észterek monogliceridjei (azaz a desztillátumba EPA vagy DHA nem jut be veszteségként vagy csak nagyon csekély mértékben). Ennek megfelelően a kívánt, az átészterezésben részt vett többszörösen telítetlen zsírsavak viszonylag kis mennyisége marad a desztillációt követően a visszamaradó frakcióban. Ezért - bár a molekuláris desztillációt általában nem tekintik alkalmasnak bonyolult elválasztásokhoz - a találmány szerinti eljárásban meglepően előnyösnek bizonyult.
Minthogy a környezetszennyező anyagok így peszticidek és többszörösen klórozott bifenilek (PCB) ilfékonyabbak, mint hosszú szénláncú zsírsavak gliceridjei, a molekuláris desztilláció során ezek a vegyületek eltávoznak a gliceridfrakcióból, miközben a desztillátumban (észterfrakcióban) feldúsulnak. Ez további előnye a molekuláris desztilláció találmány szerinti eljárásban való használatának.
A fentiek alapján a találmány továbbá eljárás környezetszennyező anyagok eltávolítására telített és többszörösen telf84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • * *
tetlen zsírsavakat trigliceridek alakjában tartalmazó olajkompozícióból. Az eljárás során
a) az olajkompozíciót lényegileg vízmentes körülmények között 1-6 szénatomos alkohollal, elsődlegesen a telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak átészterezését katalizáló lipáz jelenlétében átészterezzük, ahol a jelen lévő trigliceridekre vonatkoztatva legfeljebb 15 mólekvivalens mennyiségű 1-6 szénatomos alkoholt használunk, és
b) az a) lépésben kapott terméket egy vagy több lépésben lefolytatott molekuláris desztillációval kezeljük, és környezetszennyező anyagoktól lényegileg megtisztított, többszörösen telítetlen zsírsavak gliceridjeiben dúsított frakciót nyerünk ki.
A találmány szerinti eljárás különösen alkalmas tengeri eredetű nyersanyagoktól 40 tömeg%-ot, előnyösen 70 tömeg%-ot meghaladó EPA- és DHA-koncentrációjú kompozíciók előállítására. Minthogy a lipázzal katalizált átészterezés terméke tartalmazza a nemkívánatos telített és egyszeresen telítetlen zsírsavakat - (etil-alkohol használata esetén) inkább etil-észtereik alakjában mint szabad savakként (a többszörösen telítetlen zsírsavak lényegében gliceridek alakjában maradnak) - a telített zsírsav-frakciót viszonylag kíméletes molekuláris desztilláció útján eltávolíthatjuk, ami a kívánt többszörösen telítetlen zsírsavkomponens viszonylag csekély veszteségével jár. Ugyanakkor a viszonylag illékony környezetszennyező anyagok, így a peszticidek és klóratommal többszörösen helyettesített bifenilek a fentiek szerint az etil-észter-frakcióval távoznak. EPA/DHA-koncentrátumok előállítására szokásos hagyo84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · • · · · · * • · · » » • · ··«·· · ·· mányos eljárásokkal összehasonlítva a találmány szerinti eljárás - különösen az előnyös változatokban - ezáltal lényeges előnyökkel jár, amelyek közül a következőket említjük:
i) az oldószermentesség jelentősen csökkenti a reakcióelegy volumenét, amit fokoz az a körülmény, hogy elegendő csak sztöchiometrikus mennyiségű alkoholt használni, ii) az átészterezési reakciót lefolytathatjuk kíméletes körülmények között, így szobahőmérsékleten, ami minimális mértékűre csökkenti a mellékreakciókat, továbbá nem igényel nagy energiaráfordítást, iii) az EPA és DHA komponensek kinyerése nagyon nagy mértékű, továbbá a kinyert termék lényegében mentes környezetszennyező anyagok okozta szennyeződésektől, és iv) a használt, lényegében vízmentes reakciókörülmények következtében a hidrolízis minimális mértékű, ezáltal az átészterezés reakcióelegyéből a gliceridfrakció molekuláris desztillációja által jól elválaszthatók a kívánt többszörösen telítetlen zsírsavak a nemkívánatos telített és egyszeresen telítetlen zsírsavaktól.
A találmány szerinti eljárásban ismertetett alkoholízis ezért lehet EPA+DHA koncentrátum előállítására irányuló integrált termelési eljárás kezdeti szakasza. Egy ilyen integrált eljárásban a molekuláris desztillációt vagy egyéb műveletet követően a telített zsírsav-etil-észter-frakciónak a többszörösen telítetlen zsírsav-glicerid-frakciótól történő elválasztására a kívánt többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó utóbbi frakciót a jelen lévő meghatározott savak koncentrációjának növelésére tovább kezelhetjük. Ha nagy koncentrációjú
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • ·
EPA+DHA komponenseket tartalmazó etil-észter kompozíció előállítása a cél, akkor a molekuláris desztillációt követően kapott gliceridfrakciót észterezhetjük többek között katalitikus mennyiségű nátrium-etoxid vagy kálium-etoxid jelenlétében abszolút etanollal lefolytatott kémiai átészterezés útján. Ezt az eljárást sematikusan a következő reakcióegyenlet szemlélteti:
rOH |—OOCR OH NaOEt/EtOH'
-OOCR + —OOCR + -OOCR -►
Δ
Lqocr *—OH L-oh
OH —OH + RCOOEt —OH (az egyszerűsítés érdekében a fenti reakcióegyenletben csak 1,2- és 2,3-diglicerideket, valamint 2-monoglicerideket tüntettünk fel).
A termelt glicerint ezután ismert eljárásokat használva eltávolíthatjuk. Ez az eljárás jellemző módon 45-50 tömeg% EPA+DHA-tartalomhoz vezet, ahol - hagyományos eljáráshoz hasonlítva - a többszörösen telítetlen zsírsavak kitermelése nagyon jó.
A fentiek alapján a találmány még előnyösebben integrált eljárás összesen legalább 40 tömeg% ejkozapentánsavat és dokozahexánsavat tartalmazó kompozíció előállítására. Az eljárás során továbbá
c) a b) lépésben kapott frakciót csak az átészterezés katalizálásához elegendő mennyiségű bázist, így nátrium- vagy kálium-etoxidot tartalmazó lúgos közegben kémiai katalízis vagy lipázt, így Candida antarctica lipázt alkalmazó, lényegileg vízmentes körülmények között lefolytatott enzimatikus katalízis útján rövid szénláncú alkohollal, így etanollal átészterezzük,
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · · « *
d) a kapott alkil-észtert alkanolban karbamid feleslegével 55-99 °C hőmérsékletre hevítjük,
e) a d) lépésben kapott terméket (többek között 0-25 °C hőmérsékletre) hűtve karbamid/zsirsav-alkil-észter adduktumot csapatunk ki, majd az adduktumot elválasztjuk a főleg n-3 típusú zsírsav-észtereket tartalmazó oldattól,
f) az e) lépésben visszamaradó oldatból az n-3 típusú zsírsav-észtereket elválasztjuk, és
g) az f) lépésben kapott elegyet oldószermentesítjük.
Ezen integrált eljárás különösen előnyös változatában a kapott koncentrátumot a g) lépésben tovább töményítjük egy vagy több, így kilenc lépésben lefolytatott molekuláris desztillációval az (EPA+DHA) komponensek koncentrációjának legalább 85 tömeg%-ig történő növelésére.
A csatolt rajzok közül az 1. ábra ilyen, találmány szerinti integrált termelési eljárást szemléltet sematikusan 85 tömeg% EPA+DHA-etil-észter koncentrátum előállítására.
A gliceridfrakció kémiai átészterezésének, így etanollal katalitikus mennyiségű nátrium- vagy kálium-etoxid jelenlétében lefolytatott művelet helyett ezt az átészterezést lefolytathatjuk enzimatikus úton, így Candida antarctica lipázt használva. Ez a lipáz n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakkal, valamint egyéb zsírsavakkal szemben nagy aktivitást mutat, és a gliceridfrakció átészterezésére enyhe reakciókörülmények között és oldószer nélkül nagyon hatásosan alkalmazható, ezáltal a reakcióelegy volumene tovább csökkenthető.
Bizonyos esetekben kívánatos lehet lényegében tisztán egyetlen telítetlen zsírsav izolálása a tengeri állatokból előállí84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 tott kiindulási olajkompozícióból. Ilyen eljárást szemléltet sematikusan a 2. ábra külön-külön lényegében 100%-os EPA és 100%-os DHA előállítására. A találmány szerinti eljárásnak ez a változata nem csak Pseudomonas lipázt (PSL) alkalmaz telített és telítetlen zsírsavaknak a találmány kitanitása szerinti kezdeti elválasztására, hanem ezt követő lépésekben Mucor miehei lipázt (MML) is - amely szelektív módon inkább az EPA észterezésének kedvez, mint a DHA észterezésének, lehetővé téve ezáltal e két sav jó elválasztását valamint Candida antarctica lipázt (CAL) az utóbbi lépés során előállított DHA-komponensben dús gliceridelegy etanolízisének lefolytatására.
Közelebbről a találmány szerinti előnyös integrált eljárás lényegileg tiszta EPA és lényegileg tiszta DHA előállítására a következő lépéseket tartalmazza:
i) a tengeri állatokból előállított kiindulási olajat etanollal átészterezzük PSL alkalmazása mellett a fentiek szerinti, lényegében vízmentes reakciókörülmények között;
ii) a lipázzal katalizált átészterezés termékét molekuláris desztilláció útján kezelve 40-50 tömeg% EPA és DHA komponenseket tartalmazó gliceridfrakciót nyerünk ki;
iii) a ii) lépés során kapott gliceridfrakciót etanollal átészterezzük MML használata mellett a kezdeti átészterezés során alkalmazotthoz hasonló átészterezési reakciókörülmények között (azaz lényegében oldószer és víz nélkül sztöchiometrikus mennyiségű etanolt használva);
iv) a kapott, EPA komponensben dús etil-észter-frakciót és a visszamaradt, DHA komponensben dús gliceridelegyet a
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ii) lépéshez hasonló módon molekuláris desztilláció útján kezeljük;
v) az EPA-etil-észter frakciót többek között karbamiddal lefolytatott kicsapás, kromatográfiás és hasonló eljárásokkal kombinált molekuláris desztilláció útján kezelve lényegileg 100%-os tisztaságú EPA-frakcióvá betöményítjük;
vi) az MML alkalmazásával lefolytatott átészterezés iii) lépésben kinyert, DHA komponensben dús glicerinelegyét etanollal CAL használata mellett átészterezzük; és vii) a kapott DHA-etil-észter koncentrátumot az v) lépésben használt eljáráshoz hasonló módon feldolgozva lényegileg 100%-os tisztaságú DHA-t kapunk.
Bár a találmány sajátos előnye az, hogy jól alkalmazható nagy EPA- és/vagy DHA-koncentrációjú kompozíciók előállítására szolgáló integrált eljárásokban, megjegyzendő, hogy ugyanezen általános eljárások használhatók tengeri eredetű olajtermékekből egyéb telítetlen zsírsavak, így 18:4 n-3, 20:4 n-3, 21:5 n-3 és 22:5 n-3 típusú zsírsavak izolálására is. A találmány szerinti eljárás alkalmazható egyéb forrásból, így fermentációs termékekből és növényi olajokból származó, többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó olajokhoz is. A növényi olajokra jellemzőek az n-6 típusú többszörösen telítetlen zsírsavak. A fontos n-6 típusú zsírsavakhoz tartoznak többek között az arachidonsav (AA, 20:4 n-6), a biszhomo-y-linolénsav (BHGLA, 20:3 n-6) és a γ-linolénsav (GLA, 18:3 n-6). Arachidonsavat tartalmazó olajtermékeket iparilag is előállítottak Mortierella alkalmazásával lefolytatott fermentálás útján.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440
Megállapítottuk, hogy a találmány szerinti eljárással könynyen előállíthatók növényi olajokból legalább 40 tömeg% arachidonsavat tartalmazó kompozíciók. Az eljárásban előnyösen alkalmazható lipázok a Pseudomonas sp. lipáz és a Pseudomonas fluorescens lipáz. Az arachidonsav-tartalmú frakciót tovább töményíthetjük lényegileg 100%-os tisztaságúvá.
A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként alkalmazott tengeri eredetű olajkompozíció lehet bármilyen halból vagy egyéb tengeri forrásból származó nyers vagy részlegesen kezelt olaj, amely trigliceridek alakjában zsírsavakat, közöttük többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmaz. Az ilyen tengeri eredetű olajban lévő trigliceridmoleulák jellemzően - többé vagy kevésbé véletlenszerű eloszlásban - tartalmaznak különböző zsírsav-észter-származékokat, legyenek azok telítettek, egyszeresen vagy többszörösen telítetlenek, rövid vagy hosszú szénláncúak.
A következőkben a találmányt példákkal szemléltetjük.
1. példa
E kísérlet célja különböző lipázok alkalmazásának vizsgálata olyan eljárásban, amelyben többszörösen telítetlen zsírsavakat, különösen EPA és DHA komponenseket választunk el halolaj-kompozícióban lévő telített és egyszeresen telített zsírsavaktól.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · • · ···· ·· • · · · · • · · · · ·
A következő lipázokat tanulmányozzuk:
név rövidítés állapot gyártó cég
Mucor míehei MML immobilizált Novo
Candida antartica CAL immobilizált Novo
Candida cylindracea CCL por Sigma
Pseudomonas fluorescens PFL por Amano
Penicillium roqueforti PRL por Amano
Pseudomonas sp. PSL por Amano
Az egyik vizsgálatban a fenti lipázokat 37 °C hőmérsékleten tanulmányozzuk, az erre vonatkozó eredményeket az I. táblázat foglalja össze. Egy további vizsgálatban a két Pseudomonas lipázt (PFL és PSL) vizsgáljuk 20 °C hőmérsékleten, az erre vonatkozó eredményeket a II. és III. táblázat mutatja.
Ezekben a vizsgálatokban a következő eljárás szerint járunk el. A vizsgálatokhoz 14,9 tömeg% EPA- és 9,8 tömeg% DHA-tartalmú halolaj-triglicerideket használunk (gyártó cég: Pronove Biocare a.s., Norvégia). Ezt a kiindulási anyagot szállítási állapotban további kezelés nélkül használjuk. Valamennyi alkalmazott oldószer analitikai tisztaságú (gyártó cég: Merck AG, NSZK). Egyéb utalás hiányában sztöchiometrikus mennyiségű, azaz a trigliceridre vonatkoztatva 3 mólekvivalens (abszolút) etanolt használunk. A reakcióelegyhez - a Candida cylindracea lipáz esetétől eltekintve - nem adunk vizet. A halolaj triglicerid kiindulási anyagból és a lipázból származó víz számított mennyisége 0,3-0,4 tömeg%. A Candida cylindracea lipáz esetén a lipáz tömegére számítva 10 tömeg% mennyiségű vizet adunk a reakcióelegyhez, ami a reakcióelegy tömegére
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · • · • ··· · ··· » · • · « · · · ·
- 25 - .............
vonatkoztatva 0,8 tömeg% koncentrációnak felel meg, azaz még ebben az esetben is lényegileg vízmentes körülményeket alkalmazunk.
A zsírsavakat metil-észterek alakjában elemezzük, ehhez 30 m hosszúságú, DB-225 30N típusú 0,25 mm-es kapilláris oszloppal felszerelt Perkin-Elmer 8140 típusú gázkromatográfot használunk hidrogén vivőgázzal a szakirodalomban ismertetett módon [G. G. Haraldsson és ö. Almarsson: Acta Chemica Scandinavica, 45, 723-730 (1991)]. A PSL és PFL esetén lefolytatott, a II., illetve III. táblázatban feltüntetett részletes vizsgálatokhoz preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárást alkalmazunk, ennek során alkalmas időközökben a reakciók előrehaladásának követésére a lipidfrakciókat elválasztjuk a reakcióelegytől. Merck gyártmányú (5721 azonosítási számú) szilikagél lemezeket használunk kloroform és metanol 50:50 térfogatarányú elegyével végzett mosás és 30 percen át 110 °C hőmérsékletre való hevítés után. Eluálószerként petroléter/dietil-éter/ecetsav 80:20:1 térfogatarányú elegyét használjuk. Az egymást követően lekapart sávok megjelenítésére Merck gyártmányú Rhodamine 6G-t használunk, majd a zsírt metilezés után a fentiek szerint elemezzük. Belső standardként a mintákhoz injektálás előtt Sigma gyártmányú C19;0 vagy C21;0 metil-észtert adunk.
Az I. táblázatban bemutatott kísérletekben az etil-észtereket és glicerideket Waters PrepL 500A típusú berendezésen választjuk el. A Millipore gyártmányú PrepPak 500 típusú szilikabetétes oszlopon eluálószerként petroléterben lévő 10 térfogat% etil-étert használunk 250 ml/min áramlási sebesség
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · · • ··· · ··· · · • · « · · · · ··· ·· ···«· · * *
- 26 mellett. Mindegyik kísérlet két csúcsot szolgáltat a refrakciós detektor indexének megfelelően, ahol az első csúcs 1 névleges oszloptérfogatot követően jelenik meg, és tiszta etil-észterekből áll, míg a második csúcs 2 névleges oszloptérfogat után hagyja el az oszlopot, és TLC vizsgálat alapján tiszta triglicerideket tartalmaz. A visszamaradó mono- és diglicerideket metanollal mossuk ki az oszlopból.
Az általánosan alkalmazott eljárásban 0,5 g lipázt adunk 5,0 g (5,67 mmol, közelítő molekulatömeg 882) halolaj és 0,80 g (17,4 mmol) abszolút etanol elegyéhez. A kapott enzimszuszpenziót szobahőmérsékleten (az I. táblázatban bemutatott kísérletekben 37 °C hőmérsékleten) nitrogénatmoszféra alatt kíméletesen keverjük. Megfelelő időtartam után a reakciót kloroform hozzáadásával megszakítjuk, és az enzimet szűréssel eltávolítjuk. A szerves oldószert vákuumban (forgó rendszerű bepárlóban és nagy vákuumot létesítő szivattyúval kezelve) távolítjuk el, ennek során a nyers termékelegyet kvantitatív kitermeléssel kapjuk. A terméket azonos térfogatú kloroformban oldjuk, és a fentiekben leírtak szerint a HPLC berendezésbe injektáljuk. Az egyes frakciókat összegyűjtjük, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a visszamaradó termék tömegét meghatározzuk, majd végül gázkromatográffal elemezzük.
Amikor preparatív HPLC helyett preparatív TLC eljárást használunk, alkalmas időpontokban Pasteur-pipettával kis (100-200 mg) tömegű mintákat veszünk a reakcióelegyből. Az enzimrészecskéket úgy választjuk el, hogy a mintát egy második Pasteur-pipetta belsejében elhelyezett gyapotbetéten ke84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · · • ·
- 27 resztül szűrjük. A TLC lemezre adás előtt mindegyik mintát kloroformmal (250 mg/ml koncentrációra) hígítjuk.
Az eredményeket az l-lll. táblázatok foglalják össze.
Az I. táblázat (3 mólekvivalens mennyiségű etanollal) 37 °C hőmérsékleten lefolytatott kísérletek eredményeit mutatja valamennyi vizsgált lipáz esetében.
I. táblázat
MML (10%*, 23 h) EPA DHA
frakció tömeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 32,0 8,73 18,66 0,96 3,13
TG 35,0 20,12 47,04 11,49 41,14
MG/DG 32,0 16,07 34,35 17,01 55,70
MG/DG/TG 67,0 18,19 81,39 14,12 96,84
| CAL (2%*, 10 h) EPA DHA
I frakció tömeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 47,3 18,51 54,51 4,33 20,36
TG 33,8 15,56 32,74 12,45 41,84
MG/DG 18,9 10,83 12,74 20,11 37,79
MG/DG/TG 52,7 13,68 45,49 15,20 79,64
CAL (2%*, 23 h) EPA DHA
frakció tömeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 69,5 17,28 76,45 6,77 44,11
TG 16,6 13,16 13,91 14,73 22,92
MG/DG 13,9 10,90 9,64 25,30 32,97
MG/DG/TG 30,5 12,13 23,55 19,55 55,89
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·♦· ·
CCL (10%*, 71 h) EPA DHA
frakció tömeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 5 6,52 2,17 2,73 1,45
TG 69 16,19 74,53 10,81 79,00
MG/DG 26 13,43 23,30 . 7,1 19,55
MG/DG/TG 95 15,43 97,83 9,79 98,55
PRL (10%*, 102 h) EPA DHA
frakció tömeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 8,4 7,70 4,12 2,48 2.14
TG 61 17,08 66,37 10,53 65,90
MG/DG 30,6 15,14 29,51 10,18 31,96
MG/DG/TG 91,6 16,43 95,88 10,41 97,86
PSL (10%*, 5 h) EPA DHA
frakció tömeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 40,3 2,42 6,00 2,92 11,70
TG 11,5 30,87 21,84 13,53 15,47
MG/DG 48,2 24,34 72,16 15,20 72,83
MG/DG/TG 59,7 25,60 94,00 14,88 88,30
PFL (10%*, 10 h) EPA DHA
frakció tómeg% tömeg% kinyerés (%) tömeg% kinyerés (%)
EE 36 2,87 6,44 2,39 8,48
TG 17,7 28,23 31,13 11,41 19,90
MG/DG 46 21,78 62,43 15,8 71,62
MG/DG/TG 63,7 23,57 93,56 14,58 91,52
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • ·« ·· ·«·« *· «·· ··· » · • ·«« · ··· · · • · · · · · ·
- 29 * A %-ban megadott adatok a hozzáadott lipáz mennyiségét jelentik a trigliceridek tömegére vonatkoztatva.
A Candida cylindracea lipázra (CCL) megadott eredmények a lipáz tömegére vonatkoztatva 10 tömeg% vízadalékkal értendők, minthogy ez a lipáz víz hozzáadása nélkül inaktív. Megjegyezzük, hogy a Candida antarctica lipáz (CAL) EPA és DHA esetén csekély szelektivitást mutat, ezért ez a lipáz a találmány szempontjából nem használható. Ezzel szemben az öszszes többi lipáz megfelelő aktivitást és szelektivitást mutat, e tekintetben a két Pseudomonas típusú lipáz kiemelkedő.
II. táblázat
PSL 3 mólekvivalens etanollal 20 °C hőmérsékleten lipidosztályok (tömeg%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 13 h 24 h
MG 5,0 9,4 13,0 17,9 16,8 15,9
DG 29,1 35,6 31,6 23,3 24,9 25,9
FFA 2.6 2.9 2.5 2,7 2,7 2,7
TG 42,9 17,9 14,2 9,1 7,5 3,7
EE 20,4 34,2 38,7 47,0 48,1 51,8
EPA terület (%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 13 h 24 h
MG 12,0 12,8 16,4 19,2 22,5 26,1
DG 19,3 21,6 26,0 28,1 32,3 32,3
FFA 3.0 2,7 5.0 6,2 5,7 9,0
TG 19,2 23,2 30,3 31,8 32,7 32,0
EE 1,1 1,2 1.6 2,0 2,2 2,8
MG/DG/TG 18,8 20,7 24,9 25,6 29,0 30,1
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440
DHA terület (%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 13 h 24 h
MG 15,5 16,2 16,4 17,3 18,4 17,7
DG 12,7 13,2 13,7 14,1 15,1 14,9
FFA 2,5 2,7 4,9 6,4 6,7 9.9
TG 9,8 10,3 11,6 12,2 12,9 12,3
EE 1,5 1.4 1,9 2,4 2,8 3,6
MG/DG/TG 11,3 12,8 13,8 14,9 15,9 15,7
EPA + DHA terület (%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 13 h 24 h
MG 27,5 29,0 32,8 36,5 40,9 43,8
DG 32,0 34,8 39,7 42,2 47,4 47,2
FFA 5,5 5,4 9,9 12,6 12,4 18,9
TG 29,0 33,5 41,9 44,0 45,6 44,3
EE 2,6 2,6 3,5 4,4 5,0 6,4
MG/DG/TG 30,0 33,6 38,7 40,5 44,9 45,8
EPA (tömeg%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 13 h 24 h
MG 3,5 7,8 12,1 21,4 21,8 22,4
DG 37,2 56,5 53,5 51,3 53,1 51,7
FFA 0,6 0,7 0,9 1,2 1,2 1.6
TG 57,3 32,2 29,4 20,3 17,0 15,4
EE 1,5 2,9 4,1 5,7 6,9 9,0
MG/DG/TG 98,0 96,5 95,0 93,0 91,9 89,5
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·, · ·
DHA (tömeg%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 13 h 24 h
MG 7.5 15,6 22,8 33,0 29,9 26,2
DG 40,4 55,0 48,3 38,6 41,5 41,0
FFA 0,8 1,1 1,5 2,2 2,3 3,0
TG 48,1 22,6 19,4 13,8 11,4 10,3
EE 3,3 5,7 8,0 12,4 14,8 19,6
MG/DG/TG 96,0 93,2 90,5 85,4 82,8 77,5
A II. táblázat adatai szemléltetik, hogy a Pseudomonas sp. lipázzal kitűnő eredményeket érünk el az átészterezési reakcióban. így 13 óra reakcióidő után a konverzió 48%-os, a gliceridek együttes EPA- és DHA-koncentrációja 44,9 tömeg%. Az EPA kinyerése 91,9%-os, míg a DHA kinyerése 82,8%-os. 24 óra reakcióidő után a konverzió 52%-os, a gliceridekben az együttes EPA- és DHA-koncentráció 45,8 tömeg%. Az EPA és DHA kinyerése 89,5%-os, illetve 77,5%-os, ez azt mutatja, hogy a gyakorlatban célszerű a reakciót egy korábbi stádiumban megszakítani. A hidrolízis melléktermékeinek mennyisége a reakció során alacsony állandó értéken marad a 2,5-2,9% tartományban.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ·*·» *» « « « <· · • * ·<· · · • · · · ·«·«« w * *
III. táblázat
RFL 3 mólekvivalens etanoilai 20 °C hőmérsékleten lipidosztályok (tömeg%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 14 h 25 h 49 h
MG 2,2 2,9 4,8 10,2 15,1 18,1 16,7
DG 10,8 15,6 23,4 34,8 29,2 22,5 16,0
FFA 0,9 0,9 1,3 1,2 1,2 1,0 1,4
TG 81,9 71,0 49,1 27,3 15,8 9,9 6,3
EE 4,2 9,6 21,3 26,5 38,7 48,4 59,7
EPA terület (%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 14 h 25 h 49 h
MG 11,6 12,7 13,7 12,7 14,5 16,9 21,5
DG 17,9 19,6 16,9 17,8 25,5 28,9 27,1
FFA 3,5 4,5 6,3 5,1 5,5 8,8 14,2
I TG 15,9 16,4 18,0 22,0 29,2 31,8 26,7
EE 0,0 1,5 1,3 1,9 2,2 3,1 4,7
MG/DG/TG 16,0 16,8 17,4 18,7 23,7 25,2 24,6
DHA terület (%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 14 h 25 h 49 h
I mg 10,5 14,7 18,1 18,1 18,6 18,7 13,2
DG 12,2 12,9 13,5 10,9 13,8 14,4 11,8
FFA 3,4 3,5 4,3 4,4 3,2 9,4 8,4
TG 9,6 9,6 9,3 9,8 10,8 11,4 10,1
EE 0,0 1,3 1,1 1,5 2,0 2,7 3,7
MG/DG/TG 9,9 10,3 11,1 11,5 14,2 15,4 12,1
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 >· ·*· « * » ··
EPA + DHA terület (%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 14 h 25 h 49 h
MG 22,1 27,4 31,8 30,8 33,1 35,6 34,7
DG 30,1 32,5 30,4 28,7 39,3 43,3 38,9
FFA 6,9 8,0 10,6 9,5 8,7 18,2 22,6
TG 25,5 26,0 27,3 31,8 40,0 43,2 36,8
EE 0,0 2,8 2.4 3,4 4,2 5,8 8,4
MG/DG/TG 25,9 27,2 28,5 30,2 37,9 40,5 36,8
EPA (tömeg %)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 14 h 25 h 49 h
MG 1.4 2,0 4,1 8,0 12,7 18,8 25,5
DG 12,1 19,4 28,0 43,6 49,2 46,1 35,3
FFA 0,2 0,3 0.6 0,5 0,5 0,7 1.7
TG 86,3 77,5 65,4 44,4 32,2 23,7 14,4
EE 0,0 0,9 1.9 3,5 5,5 10,6 23,0
MG/DG/TG 99,8 98,9 97,5 96,0 94,1 88,6 75,2
DHA (tömeg%)
osztály 1 h 2 h 4 h 8 h 14 h 25 h 49 h
MG 2,0 3,8 8,5 18,5 27,1 33,7 28,1
DG 13,3 20,7 35,1 44,0 44,3 36,9 27,6
FFA 0,4 0,4 0,7 0,7 0.4 1.2 1.8
TG 84,3 73,9 53,2 32,5 19,9 13,5 9,8
EE 0,0 1.3 2,5 4,4 8,2 14,7 32,6
MG/DG/TG 99,6 98,4 96,8 95,0 91,3 84,1 65,5
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 » ·*·· • ·
V ···
A III. táblázat azt mutatja, hogy a Pseudomonas fluorescens lipázzal is jó eredményeket érünk el az átészterzésben, bár a konverzió sebessége valamivel kisebb, mint PSL esetén. Így 25 óra után 48%-os a konverzió mértéke, ami 49 óra után 60%-ra nő. Másrészt a hidrolízis mértéke valamelyest csekélyebb. A Pseudomonas sp. lipázhoz hasonlítva az EPA és DHA kinyerés (88,6%, illetve 84,1%) és az együttes EPA- és DHA-koncentráció (40,5 tömeg%) tekintetében ezen lipáz alkalmassága is alárendelt 25 óra reakcióidő után.
A fenti l-lll. táblázatokban a következő jelöléseket alkalmazzuk:
- MG monoglicerid
- DG diglicerid
- TG triglicerid
- FFA szabad zsírsav
- EE etil-észter
- EPA terület (%)
- DHA terület (%)
- EPA + DHA terület (%) a %-ban megadott terület a megfelelő GC-kromatogram integrálásán alapszik.
Ezeket a rövidítéseket a további példákban is alkalmazzuk.
Az előző táblázatokból kitűnik, hogy mindkét Pseudomonas lipáz egyedülállóan csekély aktivitást mutat az EPA és DHA komponensekkel szemben, viszont a kezdeti trigliceridekkel szembeni aktivitásuk nagy.
Az is megjegyezendő, hogy a két Pseudomonas lipáz bizonyos mértékben inkább a DHA átészterezésének kedvez, mint az EPA átészterezésének. Ez rendkívül szokatlan viselkedés,
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · . 35 - .............
minthogy az összes többi vizsgált lipáz ellentétes tendenciát mutat.
A II. és III. táblázat adataiból látható továbbá, hogy bizonyos idő után az MG/DG/TG arány az optimumhoz képest csökkenni kezd. Ennek megfelelően általában kívánatos az átészterezési reakció megszakítása annak befejeződése előtt.
2. példa
Ebben a kísérletben a két Pseudomonas lipázt (PSL és PFL) nagyobb anyagmennyiséggel lefolytatott vizsgálatban tanulmányozzuk.
2a példa - PSL vizsgálata
100 g (25 200 aktivitásegység/g) Pseudomonas sp. lipázt adunk 1000 g (1,13 mól) halolaj és 170 g (3,70 mól) abszolút etanol elegyéhez. A kapott enzimszuszpenziót mágneses keverővei szobahőmérsékleten nitrogénatmoszféra alatt kíméletesen keverjük. A reakcióelegy számított víztartalma 0,3-0,4 tömeg %.
óra múlva az 1. példában ismertetett módon mintát veszünk és megelemezzük. A reakciót további 24 órán át folytatjuk. A reakcióelegyből a lipáz elválasztására centrifugálást alkalmazunk (percenként 5000 fordulat mellett 10 perc időtartamig).
A reakciót 50 óra után megszakítjuk, az ekkor kapott termék összetételét a IV. táblázat tünteti fel.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · ·
IV. táblázat
50 h EPA DHA EPA + DHA
lipidosz- tályok tömeg% terület (%) tömeg% terület (%) tömeg% terület (%)
MG 17,1 17,0 18,0 17,8 28,9 34,8
DG 26,0 28,9 53,1 14,5 42,1 43,4
FFA 2,8 5,7 1,2 6,0 1,9 11,7
TG 8,9 28,8 19,3 11,8 12,2 40,6
EE 46,2 2,6 8.4 2,9 14,8 5,5
MG/DG/TG 52,0 25,0 90,4 15,1 83,2 40,1
A termék egy (902,4 g tömegű) részét az illékony komponensek eltávolítására 80 °C hőmérsékleten vákuum alatt gáztalanítjuk. Az illékony komponenseket cseppfolyós nitrogénnel hűtött kifagyasztóedényben gyűjtjük össze. Gáztalanítás után 844,1 g glicerid/etil-észter elegy marad vissza. Ennek 756,3 g tömegű részét 125 °C hőmérsékleten és 0,005 mbar nyomáson lefolytatott molekuláris desztillációval kezeljük. Ennek során 358,6 g (47,4%) desztillátumot kapunk, míg a maradék tömege 388,3 g (51,3%). A frakciók összetételét az V. táblázat mutatja be.
V. táblázat
TG DG MG EE EPA DHA EPA+DHA
terület (%)
gáztalanítás után 11,2 35,5 19,7 33,6 16,4 11,0 27,4
desztillátum - 0,9 10,6 88,5 3,6 3,4 7,0
maradék 18,5 54,0 25,2 2,3 29,1 18,2 47,3
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · ·· ·· ···· ··
A táblázat adatai szerint a maradék együttes EPA- és DHA-koncentrációja 47,3 tömeg%, azaz ezen kívánatos n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavak koncentrációja meghaladja a molekuláris desztilláció előtti értéket (lásd a IV. táblázatot). Ez azt jelenti, hogy ismert eljárásokat, így a karbamiddal lefolytatott frakcionálást követően további betöményítés szempontjából ideális a molekuláris desztilláció alkalmazása.
Megjegyezzük, hogy a desztillátum figyelemreméltó menynyiségű (10,6 tömeg%) monoglicerideket tartalmaz, míg a maradékban 2,3 tömeg% mennyiségű etil-észterek vannak jelen. Az előzőekben tárgyaltak szerint ezek főleg viszonylag rövid szénláncú zsírsavak monogliceridjei, illetve hosszú szénláncú zsírsavak etil-észterei.
2b példa
A 2a példában használttal azonos minőségű 1 kg tömegű olajat a PFL enzim alkalmazásával etanollal átészterezünk. A reakciót 48 óra múlva megszakítjuk. A közbülső termék összetételét a VI. táblázat foglalja össze.
VI. táblázat
lipidosz- tályok EPA DHA EPA + DHA
tömeg% terület (%) tömeg% terület (%) tömeg% terület (%)
MG 16,2 14,3 14,0 16,4 27,3 30,7
DG 26,8 26,5 48,6 13,7 43,1 40,2
TG 14,9 26,3 28,3 9,0 17,9 36,2
EE 42,2 2,9 9,9 2,4 11,6 5,3
MG/DG/TG 57,9 23,0 90,9 13,5 88,3 36,5
84158-3523/VO/LZs
P 96 0244Γ ·«
A 2a példában ismertetett körülmények között a közbülső terméket gáztalanítjuk és molekuláris desztillációval kezeljük. A kapott eredményeket a VIA táblázat foglalja össze.
VIA táblázat
TG DG MG EE EPA DHA EPA+DHA
terület (%)
gáztalanítás után 15,8 31,4 20,1 32,8 15,9 10,0 25,9
desztillátum - - 13,7 86,3 4,2 2,9 7,1
maradék 25,7 48,8 23,5 2,0 27,8 18,1 45,9
3. példa
A 2. példában ismertetetthez hasonló körülmények között lefolytatott három félüzemi kísérlet termékeit elemezzük a környezetszennyező anyagok mennyiségének meghatározására. Az eredményeket a VII. táblázat szemlélteti.
VII. táblázat
Három minta alapján meghatározott értékek (mg/kg)
Ivizsgált anyag ct-BCH HCB összes DDT toxafén
kiindulási anyag nk nk 0,03 nk I
PSL gliceridtermék nk nk • nk nk
PSL etil-észter melléktermék nk 0,01 0,03 nk
84158-3523/VO/LZs
P 96 0244 '
VII. táblázat (folytatás)
Három minta alapján meghatározott értékek (mg/kg)
vizsgált anyag a-BCH HCB összes DDT toxafén
PFL #1 glicerldter- mék nk nk nk nk
PFL #1 etil-észter melléktermék 0,005 0,02 0,03 0.4
PFL #2 gliceridter- mék nk nk nk nk
PFL #3 etil-észter melléktermék nk 0,03 0,03 0,4
nk = nem kimutatható
HCH = hexaklór-ciklohexán
HCB = hexaklór-benzol
DDT = diklór-difenil-triklór-etán
Az előzőekben közölt eredmények azt mutatják, hogy a szennyező anyagok az etil-észter-frakciókban dúsulnak fel. A peszticidek némelyikére a kiindulási anyagban lévő koncentráció láthatóan az analitikai módszer kimutatási határa alatt van. Ez az oka annak, hogy ezeket a peszticideket az etil-észter-frakciókban vizsgáljuk és nem az eredeti halolajban. Furcsa módon a DDT koncentráció az eredeti olajhoz viszonyítva az etil-észter-frakcióban nem növekszik. Az etil-észterek és gliceridek (molekuláris desztillációval lefolytatott) elválasztása előtt kíméletes molekuláris desztillációt folytatunk le a reagálatlan etanolnak a reakcióelegyből való kihajtására. Ez az etanolki84158-3523/VO/LZs
P 96 0244C hajtás nyilvánvalóan elegendő a DDT részleges eltávolítására. A visszanyert etanol (PSL minta) elemzése 0,03 mg/kg DDT-összkoncentrációt mutat, míg a többi peszticid nem mutatható ki.
4. példa
E vizsgálat célja a lipáz immobiHzálására szolgáló különböző eljárások összehasonlítása, továbbá a találmány szerinti eljárásban immobilizált alakban lévő lipázok használatának tanulmányozása.
A) Immobilizási eljárások
i) PSL és PFL immoblilízálása Duolíte hordozón
Büchner-tölcséren 10,0 g Duolite A 562 kereskedelmi nevű terméket (gyártó cég: Duolite International) egyenként 250 ml 30 mmol/l koncentrációjú NaOH-oldattal 3-4 alkalommal mosunk, majd 40 ml vízzel és mágneses keverő forgórészével együtt 150 ml térfogatú főzőpohárba visszük át. Az oldat pH-ját (1,00 mol/l koncentrációjú NaOH-oldattal) 8-ra állítjuk be automatikus titrálóberendezést használva. Ha az oldat kezdeti pH-ja <5,0, az egyensúlyi 8-as pH-érték elérése jelentős időt vehet igénybe. Ha viszont a pH-értéke >8,0, a lipázoldat hozzáadásáig nem csökken. A (20 ml) vízben oldott 2,0 g (PSL/PFL) lipázt Pasteur-plpettával adjuk a Duolite-oldathoz. Az oldat adagolása közben az automatikus titrálóberendezéssel a pH értékét 8,0 és 8,4 között tartjuk, és az oldatot 1 órán át mágneses keverővei keverjük. Ezen időtartam után a lipáz 95-99%-a a Duolite hordozón immobilizálódott. A keverést követően a lipázkészítményt (8,0 pH-jú Tris-HCI) pufferoldattal mossuk. Az immobilizált lipázkészítményt végül 0,5-1 órán át
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 (133,3-13,3 Pa nyomáson) vákuumban szárítjuk. A szárítási eljárás gyorsítására használhatunk (40 °C hőmérsékletet biztosító) gőzfürdőt. Az immobilizált lipázkészftményt hűtőszekrényben (4 °C hőmérsékleten) tároljuk.
ii) PSL immoblilizálása Amberlie hordozón g 70 tömeg% víztartalmú Amberlite XAD-7 gyantát (gyártó cég: Rohm and Haas) alaposan mosunk (két alkalommal, egyenként 125 ml) 0,1 mol/l koncentrációjú 7-es pH-jú nátrium-foszfát-pufferral. 200 ml 7,0 pH-jú 0,1 mol/l koncentrációjú nátrium-foszfát pufferoldatban 1,5 g [20 000 lipázegység (LU, amely definíció szerint tributirin hidrolízissel 1 perc alatt előállított szabad zsírsav mennyisége pmol egységben; 17 LU/mg por), gyártó cég: Amano AK] oldunk. A pH értékében beállt esetleges csökkenést követően a pH értékét 7,0-ra állítjuk be. A lipázoldatot ezután a gyantához adjuk, és a kapott szuszpenziót addig keverjük, amíg legalább 95%-os immobilizálás végbement (1 óra), amit a felülúszó folyadék tributirin hidrolízis során mutatott aktivitásának mérésével állapítunk meg.
iii) Immobilizált lipázkészítmények aktivitásának mérése mg névleges tömegű immobilizált gyantát pontosan lemérünk és 310-315 mg n-butil-palmitáthoz adjuk. Az elegyhez 120 μΙ 95 tömeg%-os etanolt adunk, és a kapott elegyet 90 percen át intenzíven keverjük. A mintát összegyűjtjük és GLC útján elemezzük. A lipáz-alkohol-egységek (LAU) mennyiségét az 1 perc alatt keletkezett (pmol egységben kifejezett) etil-palmitát mennyiségeként definiáljuk.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · ·
B) A termelékenység vizsgálata immobilizált PSL alkalmazásával
Halolaj etanolízisének termelékenységi vizsgálatát Duolite, illetve Amberlite hordozón immobilizált PSL alkalmazása esetén az alábbi eljárás szerint folytatjuk le.
100 g halolajat, 20 ml abszolút etanolt és 1 ml vizet összekeverünk, és a kapott elegyet intenzíven addig keverjük, amíg finom eloszlású diszperzió képződik. A diszperzióhoz 10 g nedvességmentes immobilizált lipázt adunk, és a kapott elegyet átlátszó oldat keletkezéséig intenzíven keverjük. Ezután az elegyet 50%-os konverzió eléréséig (24 óra időtartamig) kíméletesen keverjük. A lipázt szűréssel elválasztjuk és a következő kisérletsorozatban használjuk, mig a zsírt a fentiek szerint elemezzük.
A Duolite hordozón immobilizált PSL alkalmazásával lefolytatott termelékenységi vizsgálatok eredményeit a Vili. táblázat foglalja össze.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440
Vili. táblázat
Termelékenységi vizsgálatok Duolite hordozón lévő PSL alkalmazásával
osztály kísérlet
1 2 3 4 5
lipidosztál] /ok (töméi 9%)
EE 46,1 51,0 51,7 49,2 46,9
FFA 4,5 4,4 5,0 4,1 5,6
MG 15,9 16,8 17,3 16,5 17,0
DG 26,3 22,8 21,3 25,2 25,1
TG 7,3 5,1 4,7 5,0 5,5
MG/DG/TG 49,5 44,7 43,3 46,7 47,6
EPA terület (%)
EE 1,6 1,9 1,9 1,8 1,8
FFA 7,6 8,9 9,8 6,8 6,9
MG 26,5 26,5 25,1 23,7 22,9
DG 42,0 37,6 37,1 35,3 35,7
TG 41,0 35,8 35,2 35,6 42,7
MG/DG/TG 36,9 33,2 32,1 32,1 31,9
DHA terület (%)
EE 1.9 2,3 2,3 2,2 2,1
FFA 9,3 10,8 9,8 8,1 18,4
MG 20,2 20,0 19,8 18,0 18,5
DG 17,5 15,6 15,0 14,6 14,5
TG 15,5 12,5 13,2 12,7 13,9
MG/DG/TG 18,1 16,9 16,7 15,6 15,9
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · ·
I
EPA + DHA terület (%)
EE 3,5 4,2 4,2 4,0 3,9
FFA 16,9 19,7 19,6 14,9 25,3
MG 46,7 46,5 44,8 41,7 41,4
DG 59,6 53,2 52,1 49,8 50,2
TG 56,5 48,4 48,3 48,3 56,5
MG/DG/TG 55,0 50,1 48,8 46,8 47,8
EPA (tömeg%)
EE 3,8 6,1 6,4 5,7 5,1
FFA 2,0 2,7 3,6 2,0 2,6
MG 19,1 24,3 25,0 21,9 20,8
DG 57,9 54,3 52,8 57,7 55,5
TG 17,1 12,6 12,2 12,7 16,0
MG/DG/TG 94,2 91,2 90,0 92,3 92,3
DHA (tömej 3%)
EE 8,7 13,2 14,1 12,7 10,6
FFA 4,7 5,9 6,3 4,4 12,1
MG 27,9 32,7 34,2 30,7 29,1
DG 46,4 40,3 37,5 43,8 39,2
TG 12,4 7,9 8,0 8,4 9,0
MG/DG/TG 86,7 80,8 79,6 82,9 77,3
84158-3523/VO/LZs
Ρ 96 02440 • · ·
- 45 Vili. táblázat (folytatás)
Termelékenységi vizsgálatok Duolite hordozón lévő PSL alkalmazásával
osztály kísérlet
6 7 8 9 10
lipidosztál] <ok (törne
EE 55,4 53,7 54,9 48,3 48,9
FFA 2,5 2,3 3,0 3,6 4,4
MG 16,5 14,7 13,5 16,7 14,6
DG 23,7 27,4 26,1 25,5 25,9
TG 1,8 1.9 2,5 5,9 6,2
MG/DG/TG 42,0 44,0 42,1 48,1 46,7
EPA terület (%)
EE 1,7 1,9 1,6 1,4 1,4
FFA 11,2 11,8 11,1 8,2 7,7
MG 22,4 19,5 17,4 20,9 21,6
DG 35,1 36,7 34,2 36,3 38,7
TG 29,1 31,7 34,8 44,4 42,6
MG/DG/TG 29,9 30,7 30,0 32,0 33,9
DHA terület (%)
EE 1,9 2,2 1,8 1,5 1,6
FFA 18,8 20,6 21,5 9,0 7,7
MG 15,4 16,3 14,9 17,6 18,9
DG 13,2 15,0 14,1 15,1 16,1
TG 9,8 10,7 11,7 14,2 14,0
MG/DG/TG 13,9 15,3 14,2 15,9 16,7
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · 4 · * • ·
EPA + DHA terület (%)
EE 3,6 4,1 3,4 2,9 3,0
FFA 30,0 32,4 32,6 17,2 15,4
MG 37,8 35,7 32,1 38,5 40,5
DG 48,3 51,7 48,3 51,4 54,7
TG 38,9 42,4 46,6 58,7 56,6
MG/DG/TG 43,8 45,8 44,2 47,9 50,6
EPA (tömeg%)
EE 7,1 7,0 6,8 4,1 4,1
FFA 2,3 2,1 2,8 2,0 2,2
MG 23,9 17,0 15,3 18,7 16,4
DG 62,4 69,3 67,9 57,4 60,0
TG 4,4 4,6 7,3 17,7 17,4
MG/DG/TG 90,6 90,9 90,5 93,8 93,7
DHA (töméi 3%)
EE 15,0 14,4 13,1 8,8 8,9
FFA 7,3 6,5 9,6 4,2 4,2
MG 30,7 25,4 23,4 30,3 27,7
DG 44,2 50,9 49,7 45,7 48,1
TG 2,8 2,8 4,4 10,9 11,1
MG/DG/TG 77,7 79,2 77,4 87,0 86,8
A Vili. táblázat adatai szemléltetik, hogy egymást követő 10 kísérletben egyöntetűen magas fokú (46-55%-os) konverziót érünk el, ami az immobilizált lipáz termelékenységét igazolja. Az EPA és DHA kinyerése rendszerint legalább olyan jó vagy
84158-3523/VO/l_Zs
P 96 02440 meghaladja a II. táblázatban a por alakú lipázra bemutatott értéket, bár a lipáz mennyiségének csak 1/5 részét használjuk. Ennek megfelelően a glicerid termékelegyben az együttes EPAés DHA-tartalom ténylegesen nagyon magás, a 44-55 tömeg% tartományban marad. A hidrolízis mellékreakció mértéke valamelyest meghaladja a II. táblázatban közölt értéket, ez vélhetően az immobilizált lipáz esetében szükséges nagyobb víztartalom eredménye, bár a reakcióelegy víztartalma a kitűzött 1%-os határ alatt van.
A Duolite hordozó esetében alkalmazottal azonos reakciókörülmények között Amberlite hordozón lévő PSL alkalmazásával lefolytatott termelékenységi vizsgálatok eredményeit a IX. táblázat mutatja.
IX. táblázat
Termelékenységi vizsgálatok Amberlite hordozón lévő PSL alkalmazásával
kísér- let konver- zió (%) EPA DHA
EE terület (%) EEtö- meg% GL terület (%) EE terület (%) EEtö- meg% GL terület (%)
1 48,2 2.3 6,6 30,1 3,1 15,0 16,3
2 48,6 2,5 7,5 29,6 3,1 16,2 15,2
3 49,2 2,4 7,4 29,4 3,2 16,6 16,4
4 47,6 2,6 7,1 30,8 3,2 15,6 15,7
5 45,7 2,6 6,5 31,6 3,4 14,2 17,3
6 48,8 2,7 7,8 30,7 3,5 16,8 16,8
7 48,5 2,6 7,4 30,4 3,4 16,8 15,7
8 50,1 2,8 8,6 30,1 3.0 16,7 15,3
GL: glicerid termék (MG/DF/TG)
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · · • ·
A IX. táblázat adataiból nyilvánvaló, hogy az immobilizálás még kedvezőbb az Amberlite hordozón, mint a Duolite hordozó esetén. Az immobilizált lipáz hasonló eredmények eléréséhez szükséges mennyisége csak 50%-a a Duolite hordozó esetén használtnak (10%-a a por alakú lipáz eredeti mennyiségének), így nyolc egymást követő kísérletben 24 óra reakcióidő után (48-50%-os) állandó konverziót érünk el, ahol a glicerid termékelegy együttes EPA- és DHA-koncentrációja állandó jelleggel a 45-47%-os tartományban marad. Az EPA és DHA kinyerése, valamint a hidrolízis mellékreakció mértéke a Duolite készítményhez hasonlítva hasonló marad (a víztartalom a kitűzött 1%-os határ alatt van, a hidrolízis eredménye a táblázatban nincs feltüntetve).
5. példa
E vizsgálatok célja a Candida antarctica lipáz (CAL) és Mucor miehei lipáz (MML) aktivitásának meghatározása halolaj PSL jelenlétében a fentiek szerint lefolytatott átészterezésével kapott gliceridelegy etanolízisében.
a) Glicerinek etanolízise CAL jelenlétében
2,5 g (8,5 mmol) észterekvivalens, haloiaj PSL által katalizált átészterezése útján kapott, 25,0 tömeg% EPA és 15,1 tömeg% DHA kezdeti koncentrációjú gliceridelegyhez 0,5 g 1-2 tömeg% víztartalmú, SP 435 kereskedelmi nevű immobilizált CAL terméket (gyártó cég: Novo-Nordisk) és 0,80 g (17,4 mmol) abszolút etanolt adunk. A kapott enzimszuszpenziót szobahőmérsékleten nitrogénatmoszféra alatt kíméletesen keverjük. A megfelelő időpontokban vett mintákat a fentiek szerint elemezzük. 22 óra reakcióidő után a reakciót az enzim szű84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · · · • · · β · · · · • ··· · *·· · · • · · · · · · . ··* ·· ···· « · ·*
- 49 réssel történő elválasztásával megszüntetjük. Az eredményeket a X. táblázat foglalja össze.
X. táblázat
Gliceridelegy etanolízisének folyamata 20 °C hőmérsékleten CAL jelenlétében (EE termék)
idő 10 min 20 min 30 min ' 40 min 50 min
EE (tömeg%) 12,7 20,3 29,1 29,0 35,8
EE terület (%) 29,0 29,3 31,2 34,5 29,4
EPA (tömeg%) 15,4 24,6 36,8 42,6 34,2
DHA terület (%) 5,7 6,3 6,9 6,9 7,2
DHA (tömeg%) 5,4 9,5 14,7 14,7 14,7
I ™ 1 h 3h 6h 10 h 22 h
EE (tömeg%) 40,2 68,1 76,6 80,4 100,0
EE terület (%) 28,1 . 25,5 27,0 26,0 25,3
EPA (tömeg%) 47,1 72,6 83,4 83,9 98,0
DHA terület (%) 7,1 8,2 10,3 10,4 14,8
DHA (tömeg%) 20,8 40,4 55,4 54,9 100,0
A X. táblázat adatai gliceridelegy etanolízisének folyamatát szemléltetik 20 °C hőmérsékleten CAL jelenlétében. A kezdeti gliceridelegyben lévő mólekvivalensben megadott észtercsoportokra vonatkozóan az etanolt közelítőleg kétszeres feleslegben alkalmazzuk. A táblázatban csak az etil-észter termék összetétele van feltüntetve. Látható, hogy 22 óra reakcióidő után a reakció teljesen lejátszódik. Az is látható, hogy bár a
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · lipáz nagy aktivitást fejt ki mind az EPA, mind a DHA komponenssel szemben, az előbbi zsírsav, azaz EPA esetén aktivitása jelentősen nagyobb.
b) Gliceridek etanolízise MML jelenlétében
CAL jelenlétében lefolytatott etanolízis reakciókörülményeivel azonos, a fenti a) pont alatt ismertetett reakciókörülményeket alkalmazunk. 0,5 g 10 tömeg% víztartalmú Lipozyme kereskedelmi nevű immobilizált MML terméket (gyártó cég: Novo-Nordisk) adunk 2,5 g (8,5 mmol észterekvivalens, halolaj PSL által katalizált átészterezésével kapott, 25 tömeg% EPA és 15,1 tömeg% DHA kezdeti koncentrációjú) gliceridelegyhez és 0,80 g (17,4 mmol) abszolút etanolhoz. A kapott enzimszuszpenziót szobahőmérsékleten nitrogénatmoszféra alatt kíméletesen keverjük. A megfelelő időközökben vett mintákat a fentiekben ismertetett módon elemezzük. A reakciót 27 óra reakcióidő után az enzim szűréssel történő elválasztásával megszakítjuk.
A CAL jelenlétében lefolytatott reakcióban használttal azonos gliceridminta MML által 20 °C hőmérsékleten lefolytatott etanolízis folyamatát szemléltetik a XI. táblázat adatai.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • · • ··· · ··· · · • * · · ♦ · · ··< ·· ······ ··
- 51 XI. táblázat
Gliceridelegy etanolízisének folyamata 20 °C hőmérsék létén MML jelenlétében
idő 1 h 2 h 3 h 6 h 9 h 12 h 27 h
konverzió (%) 15,8 21,7 25,4 33,7 39,5 43,0 50,1
etil-észterek
EPA terület (%) 25,4 28,7 30,4 32,1 31,5 32,3 28,4
EPA (tömeg%) 14,4 24,1 27,5 39,3 47,1 50,2 55,0
DHA terület (%) 3,7 2,9 3,7 5.0 5,5 6,6 6,3
DHA (tömeg%) 4,0 4,7 6,4 11,2 15,2 16,7 21,7
maradék MG/DG/TG
EPA terület (%) 26,4 26,5 30,1 23,1 21,8 20,8 20,9
EPA (tömeg%) 85,6 75,9 72,5 60,7 52,9 49,8 45,0
DHA terület (%) 18,3 20,9 23,2 23,2 23,0 22,9 24,9
DHA (tömeg%) 96,0 95,7 93,6 88,8 86,8 83,3 78,3
A XI. táblázat adataiból kitűnik, hogy az EPA/DHA komponensekben dús gliceridek etanolízisének folyamatában MML jó hatásfokkal tesz különbséget EPA és DHA között. 27 óra reakcióidő után 50%-os konverziónál a kezdeti DHA-tartalom közel 80%-a van a visszamaradó gliceridelegyben. Az EPA eloszlása nem ilyen előnyös, 55%-a van az etil-észterekben és még mindig 45%-a a visszamaradó gliceridben. Javíthatunk ezen a helyzeten oly módon, hogy a visszamaradó gliceriddel azonos körülmények között egy második etanolizist folytatunk le. Megjegyezzük, hogy az MML aktivitása lehetővé teszi, hogy EPA komponensben dús halolajat használjunk EPA és DHA
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 komponensekben dús halolaj (így tonhalolaj), illetve DHA előállítására az ismertetett eljárással.
6. példa
Ezzel a kísérlettel azt szemléltetjük, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazható növényi olajokhoz.
Arachidonsavat (AA) tartalmazó extraktum PSL által katalizált etanolízise
31,1 tömeg% arachidonsavat (AA, 20:4 n-6) tartalmazó extraktumot (gyártó cég: Pronova Biocare) kezelünk az 1. példában halolajra megadott ejárás szerint, azaz por alakjában lévő 10 tömeg% PSL jelenlétében 20 °C hőmérsékleten 50%-os konverzióig 24 órán át.
Az eredményeket a XII. táblázat tünteti fel.
XII. táblázat
| osztály osztály (tömeg%) AA terület (%) AA (tömeg%)
EE 50 7,6 12
FFA 2 23,3 1
MG 17 49,0 24
DG 24 57,4 47
TG 8 58,9 16
MG/DG/TG 49 54,2 87
A XII. táblázat adatai szerint a gliceridelegyben AA kinyerése nagyon magas, 50%-os konverziónál 87% értéket ér el, ami a halolajjal lefolytatott megfelelő reakciókkal összehasonlítva magasabb, mint DHA esetén, azonban alacsonyabb, mint EPA esetében. A hidrolízis mellékreakciója összehasonlítható
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 ♦ * ♦ · · · • · ······ ·« mértékű (2%) a halolajjal lefolytatott kísérletekben megállapítottal. A glicerid termékelegy AA-tartalma 54,2%. Meglepő módon ez a TG-frakcióban volt a legnagyobb és az MG-frakcióban a legkisebb.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440
Szabadalmi igénypontok

Claims (14)

1. Eljárás telített és telítetlen zsírsavakat trigliceridek alakjában tartalmazó olajkompozlció kezelése útján többszörösen telítetlen zsírsavakat nagyobb koncentrációban tartalmazó finomított termék előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) az olajkompozíciót lényegileg vízmentes körülmények között 1-6 szénatomos alkohollal, elsődlegesen telített és egyszeresen telítetlen zsírsavak átészterezését katalizáló lipáz jelenlétében átészterezzük, ahol a jelen lévő trigliceridre vonatkoztatva legfeljebb 15 mólekvivalens mennyiségű 1-6 szénatomos alkoholt használunk, és
b) a lipázzal katalizált átészterezési reakcióban kapott telített és telítetlen zsírsav-észtereket tartalmazó frakciótól többszörösen telítetlen zsírsavak gliceridjeiben dúsított frakciót választunk el.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immobilizált alakban lévő lipázt használunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-6 szénatomos alkoholként abszolút etanolt használunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jelen lévő trigliceridre vonatkoztatva 2-5 mólekvivalens mennyiségű 1-6 szénatomos alkoholt használunk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átészterezési reakciót szobahőmérsékleten folytatjuk le.
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 • ·· «· «·· ·· ··· ··» · · • ·· · · *·· · ♦ • · · · · · «
- 55 - .............
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) elválasztási lépésben egy vagy több molekuláris desztillációs műveletet folytatunk le.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olajkompozícióként tengeri állatokból előállított olajat vagy n-3 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó fermentációs terméket kezelünk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ejkozapentánsavra és dokozahexánsavra nézve lényegileg inaktív lipázt használunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Pseudomonas sp. lipázt vagy Pseudomonas fluorascens lipázt használunk.
10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás összesen legalább 40 tömeg% ejkozapentánsavat és dokozahexánsavat tartalmazó kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy továbbá
c) a b) lépésben kapott frakciót lúgos közegben kémiai katalízis vagy lipázt alkalmazó enzimatikus katalízis útján rövid szénláncú alkohollal átészterezzük,
d) a kapott alkil-észtert alkanolban karbamid feleslegével 55-99 °C hőmérsékletre hevítjük,
e) a d) lépésben kapott terméket hűtve karbamid/zsírsav-alkil-észter adduktumot csapatunk ki, majd az adduktumot elválasztjuk a főleg n-3 típusú zsírsav-észtereket tartalmazó oldattól,
f) az e) lépésben visszamaradó oldatból az n-3 típusú zsírsav-észtereket elválasztjuk, és
84158-3523/VO/LZs
P 96 02440 * ·· ·· ··»· ·· · » · · · · • ··· · ··· · · • · · · · » e ·*· ·· ·····« ·«
- 56 g) az f) lépésben kapott elegyet oldószermentesítjük.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a g) lépésben kapott koncentrátum betöményítését egy vagy több lépésben lefolytatott molekuláris desztilláció útján legalább 85 tömeg% együttes ejkozapentánsav- és dokozahexánsav-koncentráció eléréséig tovább folytatjuk.
12. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás lényegileg tiszta ejkozapentánsav és lényegileg tiszta dokozahexánsav előállítására, azzal jellemezve, hogy továbbá
i) a gliceridfrakciót 1-6 szénatomos alkohollal lényegileg vízmentes körülmények között elsődlegesen ejkozapentánsav észterezését katalizáló lipáz jelenlétében átészterezzük, ii) a kapott, ejkozapentánsavban dúsult 1-6 szénatomos alkohol-észter frakciót és a maradék, dokozahexánsavban dúsult glicerinelegyet elválasztjuk, iii) az ejkozapentánsav-(1-6 szénatomos)alkohol-észter frakciót feldolgozzuk, és az ejkozapentánsav frakciót lényegileg 100%-os tisztaságúra betöményítjük, ív) a dokozahexánsavban dúsult glicerinelegyet 1-6 szénatomos alkohollal elsődlegesen dokozahexánsav észterezését katalizáló lipáz jelenlétében átészterezzük, és
v) a kapott dokozahexánsav-(1-6 szénatomos)alkohol-észter frakciót feldolgozzuk, és a dokozahexánsav frakciót lényegileg 100%-os tisztaságú dokozahexánsavvá betöményítjük.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben Mucor miehei lipázt használunk.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iv) lépésben Candida antarctica lipázt használunk.
HU9602440A 1994-03-08 1995-03-07 Refining oil compositions HUT76707A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9404483A GB9404483D0 (en) 1994-03-08 1994-03-08 Refining marine oil compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9602440D0 HU9602440D0 (en) 1996-11-28
HUT76707A true HUT76707A (en) 1997-10-28

Family

ID=10751490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9602440A HUT76707A (en) 1994-03-08 1995-03-07 Refining oil compositions

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5945318A (hu)
EP (1) EP0749468B1 (hu)
JP (1) JP4236128B2 (hu)
KR (1) KR970701773A (hu)
CN (1) CN1143384A (hu)
AU (1) AU686348B2 (hu)
CA (1) CA2185018C (hu)
DE (1) DE69509756T2 (hu)
ES (1) ES2133752T3 (hu)
GB (1) GB9404483D0 (hu)
HU (1) HUT76707A (hu)
IS (1) IS4270A (hu)
NZ (1) NZ282508A (hu)
RU (1) RU2151788C1 (hu)
WO (1) WO1995024459A1 (hu)
ZA (1) ZA951867B (hu)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2731015B1 (fr) * 1995-02-24 1997-05-30 Sci Sartone Procede d'enrichissement enzymatique d'huiles d'origine marine et les triglycerides d'acides gras polyinsatures ainsi obtenus
NO312973B1 (no) 1999-02-17 2002-07-22 Norsk Hydro As Lipase-katalysert forestring av marine oljer
WO2001051598A1 (en) 2000-01-11 2001-07-19 Monsanto Technology Llc Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters
CN1109549C (zh) * 2000-07-12 2003-05-28 刘玉 高浓鱼油软胶丸及其超临界co2萃取精馏的制法
KR20030034617A (ko) * 2001-10-26 2003-05-09 아츠시 와타나베 엔진오일 열화방지제 및 그 제조방법
AU2013203201A1 (en) * 2002-07-11 2013-05-02 Pronova Biopharma Norge As A process for decreasing environmental pollutants in an oil or a fat, a volatile environmental pollutants de-creasing working fluid, a health supplement, and an animal feed product
EP2295529B2 (en) † 2002-07-11 2022-05-18 Basf As Use of a volatile environmental pollutants-decreasing working fluid for decreasing the amount of pollutants in a fat for alimentary or cosmetic use
SE0202188D0 (sv) * 2002-07-11 2002-07-11 Pronova Biocare As A process for decreasing environmental pollutants in an oil or a fat, a volatile fat or oil environmental pollutants decreasing working fluid, a health supplement, and an animal feed product
US6706903B1 (en) 2002-10-07 2004-03-16 Crompton Corporation Process for separating saturated fatty acids from fatty acid mixtures
NO319194B1 (no) * 2002-11-14 2005-06-27 Pronova Biocare As Lipase-katalysert forestringsfremgangsmate av marine oljer
US20040242831A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Dong Tian Enzyme catalyzed polyesters and polyol polymers
DE102004019472A1 (de) * 2004-04-22 2005-11-17 Bayer Healthcare Ag Phenylacetamide
US20080118961A1 (en) * 2004-11-09 2008-05-22 Setsuo Sato Biodiesel Production From Soapstock
US20060135610A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-22 Bortz Jonathan D Cardiovascular compositions
US8951761B2 (en) * 2005-06-16 2015-02-10 Dsm Nutritional Products Ag Immobilized enzymes and methods of using thereof
US7977498B2 (en) 2005-08-26 2011-07-12 Ocean Nutrition Canada Limited Reduction of sterols and other compounds from oils
PE20070482A1 (es) 2005-08-26 2007-06-08 Ocean Nutrition Canada Ltd Metodo para remover y/o reducir esteroles a partir de aceites
DK2006389T3 (en) * 2006-04-13 2017-08-28 Nippon Suisan Kaisha Ltd Process for preparing concentrated polyunsaturated fatty acid oil
AU2007270135B9 (en) 2006-07-05 2013-06-27 Fermentalg Production of ultrapure EPA and polar lipids from largely heterotrophic culture
MY152163A (en) * 2006-11-28 2014-08-15 Novozymes As Lipolytic enzyme variants
UA97127C2 (uk) * 2006-12-06 2012-01-10 Бандж Ойлз, Инк. Спосіб безперервної ферментативної обробки композиції, що містить ліпід, та система для його здійснення
EP1978101A1 (de) 2007-04-02 2008-10-08 Cognis IP Management GmbH Verfahren zur Anreicherung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
DE502008000886D1 (de) 2007-04-02 2010-08-19 Cognis Ip Man Gmbh Ein Gemisch enthaltend Fettsäureglyceride
WO2008133573A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Patrick Adlercreutz A polyunsaturated fatty acid (pufa) enriched marine oil comprising eicosapentaenoic acid (epa) and docosahexaenoic acid (dha), and a process of production thereof
CL2008002020A1 (es) 2007-07-12 2008-11-14 Ocean Nutrition Canada Ltd Metodo de modificacion de un aceite, que comprende hidrolizar gliceridos con una solucion de lipasa thermomyces lanuginosus, separar la fraccion de acido graso saturado de la fraccion de glicerido hidrolizado y esterificar los gliceridos hidrolizados en la presencia de candida antarctica lipasa b; y composicion de aceite.
DK2172558T3 (en) 2007-07-30 2017-09-25 Nippon Suisan Kaisha Ltd Process for producing an EPA-enriched oil and DHA-enriched oil
WO2009020406A1 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Granate Seed Limited Methods of making lipid substances, lipid substances made thereby and uses thereof
KR101650584B1 (ko) * 2007-08-31 2016-08-23 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 다중불포화된 지방산 함유 고체 지방 조성물 및 그의 용도 및 생산
US7790429B2 (en) * 2007-11-28 2010-09-07 Transbiodiesel Ltd. Robust multi-enzyme preparation for the synthesis of fatty acid alkyl esters
EP3578177A1 (en) 2008-09-02 2019-12-11 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Pharmaceutical composition comprising eicosapentaenoic acid and nicotinic acid and methods of using same
US20100077654A1 (en) * 2008-09-23 2010-04-01 LiveFuels, Inc. Systems and methods for producing biofuels from algae
US8372425B2 (en) 2008-10-31 2013-02-12 Lipid Pharmaceuticals Ehf. Fatty acids for use as a medicament
KR101070791B1 (ko) * 2008-11-07 2011-10-07 씨제이제일제당 (주) 효소적 에스테르 교환 반응으로 제조된 코코아 버터 대용 유지 및 그 제조방법
WO2010062189A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Pronova Biopharma Norge As A composition, with/without at least one easily oxidised component, comprising an edible processed oil or fat mixture, for promoting growth in an animal, preventing oxidative stress, avoiding that fish develop enlarged live and feed composition
US8362080B2 (en) 2008-12-18 2013-01-29 Baylor College Of Medicine Increasing glutathione levels for therapy
AU2010233864A1 (en) 2009-04-06 2011-10-27 Novozymes A/S Triglycerides with high content of unsaturated fatty acids
US8753851B2 (en) 2009-04-17 2014-06-17 LiveFuels, Inc. Systems and methods for culturing algae with bivalves
NZ624963A (en) 2009-04-29 2016-07-29 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same
BRPI1011876B1 (pt) 2009-04-29 2020-03-31 Amarin Pharma, Inc. Composições farmacêuticas estáveis compreendendo etilácido eicosapentaenoico (etil-epa) e uso das mesmas para tratar ou prevenir uma doença relacionada ao cardiovascular
CN102625847A (zh) 2009-06-15 2012-08-01 阿马里纳制药公司 在相伴他汀类疗法的对象中降低甘油三酯、没有增加ldl-c水平的组合物和方法
AU2010298222B2 (en) 2009-09-23 2017-01-05 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Pharmaceutical composition comprising omega-3 fatty acid and hydroxy-derivative of a statin and methods of using same
PE20130491A1 (es) 2009-12-30 2013-05-02 Basf Pharma Callanish Ltd Proceso simulado de separacion cromatografica de lecho movil para la purificacion de acidos grasos poliinsaturados
FR2955459B1 (fr) * 2010-01-28 2013-11-22 Polaris Composition huileuse riche en monoglycerides de dha
WO2013030816A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Trans Bio-Diesel Ltd. Enzymatic transesterification with lipases immobilized on hydrophobic resins in water solutions
CN102959083B (zh) * 2010-05-28 2016-01-20 日本水产株式会社 利用脂肪酶的含高度不饱和脂肪酸的油脂的制造方法
WO2011161702A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Epax As Process for separating polyunsaturated fatty acids from long chain unsaturated or less saturated fatty acids
CN104814950A (zh) 2010-11-09 2015-08-05 持田制药株式会社 血糖值上升抑制剂在制造经口摄取用食品中的应用
AU2011336856A1 (en) 2010-11-29 2013-07-04 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Low eructation composition and methods for treating and/or preventing cardiovascular disease in a subject with fish allergy/hypersensitivity
US11712429B2 (en) 2010-11-29 2023-08-01 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Low eructation composition and methods for treating and/or preventing cardiovascular disease in a subject with fish allergy/hypersensitivity
CL2010001587A1 (es) 2010-12-27 2013-01-11 Golden Omega S A Proceso de preparacion de un concentrado de etil esteres de acidos grasos omega-3 que comprende sobre el 80% en peso de dichos esteres en configuracion cis y sus dobles enlaces separados por una unidad metilenica.
US9029584B2 (en) 2011-03-03 2015-05-12 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Method for producing oil containing highly unsaturated fatty acid using lipase
US9487716B2 (en) 2011-05-06 2016-11-08 LiveFuels, Inc. Sourcing phosphorus and other nutrients from the ocean via ocean thermal energy conversion systems
GB201111594D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd New improved process
GB201111595D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd Improved process
GB201111589D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd New modified process
GB201111601D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd New process
GB201111591D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd Further new process
ES2395320B1 (es) 2011-07-14 2013-12-18 Soluciones Extractivas Alimentarias, S.L. Nuevo método para la reducción de contaminantes en grasas y aceites a partir de aceites y sus derivados.
US20140205650A1 (en) 2011-09-06 2014-07-24 Lipid Pharmaceuticals Ehf. Coated suppositories
US20130131170A1 (en) 2011-11-07 2013-05-23 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of treating hypertriglyceridemia
US11291643B2 (en) 2011-11-07 2022-04-05 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of treating hypertriglyceridemia
ES2891473T3 (es) 2012-01-06 2022-01-28 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd Composiciones y métodos para reducir los niveles de alta sensibilidad (hs-CRP) en un sujeto
KR102153143B1 (ko) 2012-01-06 2020-09-08 옴테라 파마슈티칼스, 인크. 유리 산 형태의 오메가-3 다중불포화 지방산의 ｄｐａ-농축 조성물
EP2846779A4 (en) 2012-05-07 2015-12-16 Omthera Pharmaceuticals Inc STATIN AND OMEGA-3 FATTY ACID COMPOSITIONS
DK2851361T3 (da) * 2012-05-14 2022-01-03 Nippon Suisan Kaisha Ltd Højumættet fedtsyre eller højumættet fedtsyreethylester med reduceret indhold af miljøforurenende stoffer, og fremgangsmåde til fremstilling deraf
SG10201913645RA (en) 2012-06-29 2020-03-30 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd Methods of reducing the risk of a cardiovascular event in a subject on statin therapy
KR102133739B1 (ko) * 2012-10-18 2020-07-15 다우 글로벌 테크놀로지스 엘엘씨 비-올레산 트리글리세리드 기재의 저점도 고인화점 유전 유체
WO2014074552A2 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions and methods for lowering triglycerides without raising ldl-c levels in a subject on concomitant statin therapy
US8545703B1 (en) * 2012-11-27 2013-10-01 Menlo Energy Management, LLC Production of glycerin from feedstock
US8540881B1 (en) * 2012-11-27 2013-09-24 Menlo Energy Management, LLC Pretreatment, esterification, and transesterification of biodiesel feedstock
US8545702B1 (en) * 2012-11-27 2013-10-01 Menlo Energy Management, LLC Production of biodiesel from feedstock
US8580119B1 (en) * 2012-11-27 2013-11-12 Menlo Energy Management, LLC Transesterification of biodiesel feedstock with solid heterogeneous catalyst
US20140187633A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of treating or preventing nonalcoholic steatohepatitis and/or primary biliary cirrhosis
US9814733B2 (en) 2012-12-31 2017-11-14 A,arin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions comprising EPA and obeticholic acid and methods of use thereof
GB201300354D0 (en) 2013-01-09 2013-02-20 Basf Pharma Callanish Ltd Multi-step separation process
US9452151B2 (en) 2013-02-06 2016-09-27 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of reducing apolipoprotein C-III
US9624492B2 (en) 2013-02-13 2017-04-18 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions comprising eicosapentaenoic acid and mipomersen and methods of use thereof
US9662307B2 (en) 2013-02-19 2017-05-30 The Regents Of The University Of Colorado Compositions comprising eicosapentaenoic acid and a hydroxyl compound and methods of use thereof
US9283201B2 (en) 2013-03-14 2016-03-15 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions and methods for treating or preventing obesity in a subject in need thereof
US20140271841A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Pharmaceutical composition comprising eicosapentaenoic acid and derivatives thereof and a statin
CN104130860B (zh) * 2013-05-03 2020-03-31 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 利用固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶富集长链多不饱和脂肪酸的方法
US9428711B2 (en) 2013-05-07 2016-08-30 Groupe Novasep Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids
US8802880B1 (en) 2013-05-07 2014-08-12 Group Novasep Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids
US10966968B2 (en) 2013-06-06 2021-04-06 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Co-administration of rosiglitazone and eicosapentaenoic acid or a derivative thereof
JP6302310B2 (ja) * 2013-08-30 2018-03-28 備前化成株式会社 高純度オメガ３系脂肪酸エチルエステルの生産方法
US20150065572A1 (en) 2013-09-04 2015-03-05 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of treating or preventing prostate cancer
RU2533419C1 (ru) * 2013-09-05 2014-11-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" Способ производства биодизеля
US9585859B2 (en) 2013-10-10 2017-03-07 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions and methods for lowering triglycerides without raising LDL-C levels in a subject on concomitant statin therapy
JP6824038B2 (ja) 2013-12-04 2021-02-03 日本水産株式会社 ジホモ−γ−リノレン酸含有微生物油及びジホモ−γ−リノレン酸含有微生物菌体
EP2883860B1 (fr) * 2013-12-11 2016-08-24 Novasep Process Procédé chromatographique de production d'acides gras polyinsaturés
US10975031B2 (en) 2014-01-07 2021-04-13 Novasep Process Method for purifying aromatic amino acids
JP6357018B2 (ja) * 2014-05-30 2018-07-11 花王株式会社 足用消臭剤組成物
US10561631B2 (en) 2014-06-11 2020-02-18 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of reducing RLP-C
WO2015195662A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of reducing or preventing oxidation of small dense ldl or membrane polyunsaturated fatty acids
US10406130B2 (en) 2016-03-15 2019-09-10 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of reducing or preventing oxidation of small dense LDL or membrane polyunsaturated fatty acids
US10927391B2 (en) * 2016-12-19 2021-02-23 Enzymocore Ltd. Enzymatic enrichment of n-3 fatty acids in the form of glycerides
US10966951B2 (en) 2017-05-19 2021-04-06 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions and methods for lowering triglycerides in a subject having reduced kidney function
JP2020529397A (ja) * 2017-08-07 2020-10-08 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．Ｄｓｍ Ｉｐ Ａｓｓｅｔｓ Ｂ．Ｖ． 濃縮多価不飽和脂肪酸オイルの製造プロセス
US11058661B2 (en) 2018-03-02 2021-07-13 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Compositions and methods for lowering triglycerides in a subject on concomitant statin therapy and having hsCRP levels of at least about 2 mg/L
CN108795999B (zh) * 2018-07-04 2021-01-05 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种三饱和脂肪酸甘油酯的制备方法
MA51765A (fr) 2018-09-24 2020-12-16 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd Procédés de réduction du risque d'événements cardiovasculaires chez un sujet
US11986452B2 (en) 2021-04-21 2024-05-21 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Methods of reducing the risk of heart failure
NO20220910A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-26 Epax Norway As Cetoleic acid composition

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4377525A (en) * 1980-10-22 1983-03-22 Plastics Engineering Company Addition products of diacetylene-terminated polyimide derivatives and a dienophile having a terminal vinyl group
US4377526A (en) * 1981-05-15 1983-03-22 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Method of purifying eicosapentaenoic acid and its esters
JPS5914793A (ja) * 1982-07-16 1984-01-25 Nippon Oil & Fats Co Ltd 高度不飽和脂肪酸低級アルコ−ルエステルの濃縮分離方法
JPS6078587A (ja) * 1983-10-05 1985-05-04 Lion Corp 脂肪酸エステルの製造方法
JPS60234588A (ja) * 1984-05-07 1985-11-21 Asahi Denka Kogyo Kk 長鎖高度不飽和脂肪酸アルコ−ルエステルの製造法
US4792418A (en) * 1985-08-14 1988-12-20 Century Laboratories, Inc. Method of extraction and purification of polyunsaturated fatty acids from natural sources
JPS6291188A (ja) * 1985-10-17 1987-04-25 Nisshin Oil Mills Ltd:The 高度不飽和脂肪酸グリセリドの製造法
NO157302C (no) * 1985-12-19 1988-02-24 Norsk Hydro As Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeoljekonsentrat.
JPS63192324A (ja) * 1986-12-19 1988-08-09 ニチアスセラテック株式会社 ロツクウ−ル細粒綿
JPH0789944B2 (ja) * 1986-12-23 1995-10-04 旭電化工業株式会社 製菓用油脂組成物の製法
JPH0716425B2 (ja) * 1987-05-20 1995-03-01 花王株式会社 油脂類のエステル交換反応方法
JPH01252294A (ja) * 1988-03-31 1989-10-06 Nippon Oil & Fats Co Ltd 不飽和脂肪酸エステルの濃縮方法
JPH0225447A (ja) * 1988-07-13 1990-01-26 Nippon Oil & Fats Co Ltd 高度不飽和脂肪酸類の製造方法
GB8819110D0 (en) * 1988-08-11 1988-09-14 Norsk Hydro As Antihypertensive drug & method for production
US5316927A (en) * 1988-10-04 1994-05-31 Opta Food Ingredients, Inc. Production of monoglycerides by enzymatic transesterification
US5935828A (en) * 1989-05-01 1999-08-10 Opta Food Ingredients, Inc. Enzymatic production of monoglycerides containing omega-3 unsaturated fatty acids
DK95490D0 (da) * 1990-04-18 1990-04-18 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af triglycerid og triglyceridsammensaetning
JPH06116585A (ja) * 1992-10-09 1994-04-26 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 油脂の精製方法
JP2668187B2 (ja) * 1993-09-17 1997-10-27 日清製油株式会社 リパーゼ粉末を用いたエステル交換法

Also Published As

Publication number Publication date
ZA951867B (en) 1995-12-11
CA2185018C (en) 2000-12-19
NZ282508A (en) 1997-09-22
US5945318A (en) 1999-08-31
IS4270A (is) 1995-09-09
GB9404483D0 (en) 1994-04-20
CN1143384A (zh) 1997-02-19
AU686348B2 (en) 1998-02-05
JP4236128B2 (ja) 2009-03-11
WO1995024459A1 (en) 1995-09-14
KR970701773A (en) 1997-04-12
HU9602440D0 (en) 1996-11-28
DE69509756D1 (de) 1999-06-24
DE69509756T2 (de) 1999-12-02
ES2133752T3 (es) 1999-09-16
AU1963995A (en) 1995-09-25
JPH09510091A (ja) 1997-10-14
RU2151788C1 (ru) 2000-06-27
EP0749468B1 (en) 1999-05-19
EP0749468A1 (en) 1996-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT76707A (en) Refining oil compositions
CA2362212C (en) Lipase-catalysed esterification of marine oil
US7491522B2 (en) Lipase-catalysed esterification of marine oil
US9556401B2 (en) Method for producing EPA-enriched oil and DHA-enriched oil
JP5111363B2 (ja) 高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法
EP1005517B1 (en) Process for producing diglycerides
US9476008B2 (en) Process for separating polyunsaturated fatty acids from long chain unsaturated or less saturated fatty acids
EP0307154B1 (en) Preparation of diglycerides
EP1891189B1 (en) Concentration of fatty acid alkyl esters by enzymatic reactions with glycerol
JPWO2006022356A1 (ja) ジアシルグリセロールの含量を任意に含んだ微生物油脂の製造法並びに該油脂
US20030130533A1 (en) Conjugated fatty acid containing monoglycerides and process for producing them
EP3848466A1 (en) Production method for highly unsaturated fatty acid-containing glyceride using lipase hydrolysis reaction
JP2000004894A (ja) トリグリセリドの製造方法
JPH08214891A (ja) 高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリドを含む油脂の製造方法
JP6645804B2 (ja) 構造油脂の製造方法
JP7092460B2 (ja) 構造油脂の製造方法
JP2004222594A (ja) ジグリセリドの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal