JP2000004894A

JP2000004894A - トリグリセリドの製造方法

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Publication number: JP2000004894A
Application number: JP10172942A
Authority: JP
Inventors: Kengo Akimoto; 健吾秋元; Shigeaki Fujikawa; 茂昭藤川; Yuji Shimada; 裕司島田; Akio Sugihara; 耿雄杉原; Yoshio Tominaga; 嘉男富永
Original assignee: Suntory Ltd; Osaka City
Current assignee: Suntory Ltd; Osaka City
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2000-01-11
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: JP4079516B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト母乳型のトリグリセリド構造と考えられ
ている構造脂質、即ち、トリグリセリドの２位が炭素数
が１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位に結合し
た不飽和脂肪酸の少なくともひとつがω３、ω６又はω
９系不飽和脂肪酸である新規なトリグリセリドの製造方
法の提供。【解決手段】２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸
が結合しているグリセリドに、１, ３位のエステル結合
に特異的に作用するリパーゼを作用させ、エステル交換
反応によって１及び３位の脂肪酸がω３、ω６及び／又
はω９系の不飽和脂肪酸となったトリグリセリドを製造
するに際し、一旦トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素
数が１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪
酸が中鎖脂肪酸となった融点が４５℃以下のトリグリセ
リドを原料として用いるかまたはそれを中間体として経
由させることよって、目的とするトリグリセリドを製造
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新しいトリグリセリ
ドの製造方法に関するもので、特にトリグリセリドの２
位に炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸を有し、１及び３位
の少なくとも一方にω３、ω６及び／又はω９系の不飽
和脂肪酸を有するトリグリセリドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】我々の摂取している脂質の大部分は中性
脂肪であり、トリグリセリドの１, ２及び３位に種々の
脂肪酸がエステル結合したトリグリセリドの混合物であ
る。そして、脂肪酸の結合位置の違いにより、その生理
活性が異なることが指摘されており、トリグリセリドの
決まった位置に特定の脂肪酸を結合させた脂質（構造脂
質）が、最近、特に注目されている。

【０００３】例えば、特公平4-12920 には、トリグリセ
リドの２位に炭素数８〜１４の脂肪酸が結合し、１及び
３位に炭素数が１８以上の脂肪酸が結合した消化吸収性
の良いトリグリセリドが開示されている。また、２- モ
ノグリセリドが人の生体に最も吸収され易い形態である
と考えられていることから、特公平5-87497 には、２位
に生理機能を有するω３又はω６系高度不飽和脂肪酸を
結合させ、１及び３位に消化管の酵素により容易に加水
分解される飽和脂肪酸を結合させたトリグリセリドが開
示されている。

【０００４】一方、脂肪酸の生理機能に目を向けると、
近年、アラキドン酸及びドコサヘキサエン酸が注目され
ている。これら脂肪酸は、母乳中に含まれており、乳児
の発育に役立つとの報告（「Advances in Polyunsatura
ted Fatty Acid Research 」, Elsevier Science Publi
shers, 1993, pp.261-264 ）や、胎児の身長や脳の発育
に重要であるとの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 1073-1077 (1993), Lancet, 344, 1319-1322 (199
4) ）がある。

【０００５】そして、いくつかの公的機関から推奨摂取
量が公表され（未熟児：アラキドン酸60、ドコサヘキサ
エン酸40；正常児：アラキドン酸20、ドコサヘキサエン
酸20mg/kg体重/ 日 (WHO-FAO (1994)）、ヨーロッパの
数カ国では既にドコサヘキサエン酸と併せて醗酵生産し
たアラキドン酸をトリグリセリドとして配合した未熟児
用調製乳が市販されている。しかし、調製乳に加えたト
リグリセリドのアラキドン酸及び／又はドコサヘキサエ
ン酸の結合位置に関しては考慮されていない。

【０００６】人の母乳中のトリグリセリド構造は、トリ
グリセリドの２位にパルミチン酸（16:0）が結合する割
合が高く、１及び３位に高度不飽和脂肪酸あるいは中鎖
脂肪酸が結合する割合が高いと考えられている（Christ
ie, W.W. (1986) The Positional Distribution of Fat
ty Acids in Triglycerids. Analysis of Oils and Fat
s in (Hamilton, R.J., and Russell, J.B., eds.) pp.
313-339, Elsevier Applied Science, London) 。

【０００７】これに対し、前述の脂肪酸組成を母乳の組
成に近付けるために調製乳に加えられる、醗酵法で生産
されたアラキドン酸含有トリグリセリドの構造は、パル
ミチン酸を始めとする飽和脂肪酸が１及び３位に結合
し、不飽和脂肪酸は２位に結合する割合が高く（J.J. M
yher, A. Kuksis, K. Geher, P.W. Park, and D.A Dier
sen-Schade, Lipids 31, 207-215 (1996)）、人の母乳
型と考えられているものとは明らかに異なっていた。し
たがって、人の母乳型のトリグリセリド構造と考えられ
ている構造脂質、つまり、トリグリセリドの２位に炭素
数が１６〜１８の飽和脂肪酸、１及び３位に高度不飽和
脂肪酸又は中鎖脂肪酸が結合した、構造が明確に確認さ
れている構造脂質の開発が強く望まれている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ヒト
母乳型のトリグリセリド構造と考えられている構造脂
質、つまり、トリグリセリドの２位が炭素数が１６〜１
８の飽和脂肪酸であり、１及び３位に結合した不飽和脂
肪酸の少なくともひとつがω３、ω６又はω９系不飽和
脂肪酸である新規なトリグリセリド、もしくはトリグリ
セリドの２位が炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸であ
り、１及び３位の一方が炭素数が４〜１８の飽和脂肪酸
であり、もう一方がω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸
である新規なトリグリセリドの製造方法を提供しようと
するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】１, ３位特異的リパーゼ
を用いたエステル交換反応によってトリグリセリドの２
位に炭素数８〜１４の脂肪酸が結合し、１及び３位に炭
素数が１８以上の脂肪酸が結合したトリグリセリドを製
造する方法は、前述の特公平4-12920 に開示されてい
る。しかし２位の脂肪酸が炭素数がさらに増加した炭素
数１６〜１８の飽和脂肪酸からなるトリグリセリドを原
料とし、１, ３位特異的リパーゼを用い、ω３、ω６又
はω９系の不飽和脂肪酸とのエステル交換反応を行なう
には、反応温度を５０℃以上にしなければならない。該
反応は、固定化酵素を用いた反応であり、２位に炭素数
が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１, ３位にω３、
ω６及び／又はω９系の不飽和脂肪酸が結合したトリグ
リセリドを製造するには、反応温度が高くなると酵素の
寿命が短くなることに加え、高度不飽和脂肪酸が変性す
る危険性を含んでいる。

【００１０】そこで、本発明者等は上記の課題を解決す
るために鋭意研究した結果、２位に炭素数が１６〜１８
の飽和脂肪酸が結合しているグリセリドに、１, ３位の
エステル結合に特異的に作用するリパーゼを作用させ、
エステル交換反応によって１及び３位の少なくとも一方
の脂肪酸がω３、ω６及び／又はω９系の不飽和脂肪酸
となったトリグリセリドを製造するに際し、一旦、トリ
グリセリドの２位の脂肪酸が炭素数が１６〜１８の飽和
脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸が中鎖脂肪酸である
融点が４５℃以下のトリグリセリドを原料として用いる
かまたはそれを中間体として経由させることよって、目
的とするトリグリセリドを製造することが出来ることを
見出し、本発明を完成した。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明によれば、トリグリセリド
の２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１
及び３位の少なくとも一方にω３、ω６及び／又はω９
系不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを、２位に炭
素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリ
ドを基質として用い、ω３、ω６及び／又はω９系不飽
和脂肪酸又はそのエステルの存在下で、１, ３位に特異
的に作用するリパーゼによるエステル交換反応によって
製造することができる。

【００１２】２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が
結合したトリグリセリドとしては、例えば、トリパルミ
チン（１, ２及び３位の全てがパルミチン酸（16:
0））、トリステアリン（１, ２及び３位の全てがステ
アリン酸（18:0））を挙げることができるが、トリグリ
セリドの構成飽和脂肪酸の炭素数が１６以上の場合は、
これに１, ３位特異的リパーゼとω３、ω６又はω９系
不飽和脂肪酸とを、有機溶媒を含まない反応系中で、５
０℃以下で反応させたとき、１, ３位でのエステル交換
反応はほとんど進まず、目的とする構造を持ったトリグ
リセリドは得られない。

【００１３】これは、リパーゼが液体状の油脂には作用
するが、固体状の油脂にはほとんど作用しないという性
質に起因している。したがって、トリグリセリドの構成
飽和脂肪酸の炭素数が多くなると融点が高くなる分、こ
れに応じて反応温度を高くする必要がある。例えば、ト
リパルミチンを使用する場合には、反応液組成によって
異なるが反応は５０〜７０℃で行わなければならない。
このため、酵素の失活とエステル交換のために添加した
不飽和脂肪酸の変性が問題となる。

【００１４】そこで、これら融点の高いトリグリセリド
を基質原料として用いるときには、エステル交換で１及
び３位の脂肪酸を目的とする不飽和脂肪酸に交換する前
に、例えば、原料トリグリセリドの１及び／又は３位に
結合している脂肪酸をカプリル酸のような炭素数８〜１
２程度の中鎖脂肪酸又はオレイン酸、リノール酸などの
融点の低い脂肪酸にエステル交換し、融点を４５℃以下
に低下させたトリグリセリドを原料として使用すると良
いことを明らかにした。

【００１５】また、この方法では、一旦１位または３位
に結合した高度不飽和脂肪酸は、その後にさらに１, ３
位特異的リパーゼを作用させてもエステル交換を起こし
にくく、中鎖脂肪酸が優先的にエステル交換されるた
め、反応を繰り返すことによって、目的の２位に炭素数
が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１及び／又は３位
にω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸が結合した
トリグリセリドの収量を増加させることができることも
明らかにした。

【００１６】本発明の特徴を明確にするために、トリグ
リセリドに結合した脂肪酸がすべて同じで炭素数１６〜
１８の飽和脂肪酸である場合を例に説明したが、トリグ
リセリドにエステル結合する脂肪酸はすべて同じである
必要はなく、トリグリセリドの２位に炭素数１６〜１８
の飽和脂肪酸が結合していれば、１及び３位には炭素数
４〜１８のいかなる脂肪酸が結合していてもまたいかな
る組み合わせでも良く、４５℃以下で反応を行うことの
できるトリグリセリドを基質として用いることは本発明
の技術的範囲に含まれる。

【００１７】また、２位に飽和脂肪酸が結合したトリグ
リセリドとは、本発明の目的からして２位に炭素数１６
〜１８の飽和脂肪酸が結合していれば、１及び３位のい
ずれかに、ω３, ω６又はω９系不飽和脂肪酸が結合し
ていても構わず、これらの基質を用いた場合は不飽和脂
肪酸の結合していない位置にω３, ω６又はω９系不飽
和脂肪酸をエステル交換にて導入することができ、１及
び３位に結合しているω３、ω６及び／又はω９系の不
飽和脂肪酸の含量を高めることができる。

【００１８】たとえば、２位が飽和脂肪酸で１及び３位
のいずれかに不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドと
して、クリプテコデニウム（Crypthecodenium ）属、ス
ラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、シゾキト
リウム（Schizochytrium）属、ウルケニア（Ulkenia ）
属、ジャポノキトリウム（Japonochytorium ）属又はハ
リフォトリス（Haliphthoros）属の微生物を培養して得
られた油脂が利用できる。

【００１９】これらからは、例えば１, ２−ジパルミト
イル−３−ドコサヘキサノイルトリグリセリドを単離す
ることができ、このトリグリセリドを基質に１, ３位特
異的リパーゼを作用させ、ω３、ω６又はω９系不飽和
脂肪酸もしくはその脂肪酸エステルとエステル交換させ
ると、前述のようにドコサヘキサエン酸はほとんどエス
テル交換されないため、１位のパルミチン酸のみがエス
テル交換される。不飽和脂肪酸としてアラキドン酸を用
いた場合には、１及び３位の一方にドコサヘキサエン酸
が結合し、他方にアラキドン酸が結合し、２位にパルミ
チン酸が結合したトリグリセリドが製造できる。

【００２０】本発明には、トリグリセリドの１, ３位特
異的リパーゼを触媒として用いることができ、特に限定
されるものではないが、例えば、リゾプス（Rhizopus）
属、リゾムコール（Rhizomucor）属、ムコール（Mucor
）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、アスペルギ
ルス（Aspergillus ）属、フミコーラ（Humicola）属、
フザリウム（Fusarium）属などの微生物が生産するリパ
ーゼ、ブタ膵臓リパーゼなどが挙げられる。かかるリパ
ーゼについては、市販のものを用いることができる。

【００２１】例えば、リゾプス・デレマー（Rhizopus d
elemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製；タリパー
ゼ）、リゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）
のリパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リボザイム
IM）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）
のリパーゼ（天野製薬（株）製；リパーゼA ）、フミコ
ーラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa ）のリパー
ゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リポラーゼ）、ムコ
ール・ジャバニカス（Mucor javanicus ）のリパーゼ
（天野製薬（株）製；リパーゼM ）、フザリウム・ヘテ
ロスポラム（Fusarium heterosporum ）のリパーゼ等が
挙げられる。これらのリパーゼの使用形態はそのままで
用いても良く、また、セライトやイオン交換樹脂、セラ
ミックス担体などに固定化したリパーゼを用いてもよ
い。

【００２２】本反応系に加える水分量は極めて重要で、
水をまったく含まない場合はエステル交換が進行せず、
また、水分量が多い場合は加水分解が起こり、トリグリ
セリドの回収率が低下したり、生成した部分グリセリド
では自発的なアシル基転移が起こり、２位の飽和脂肪酸
が１位あるいは３位に転移する。従って、結合水を持た
ない固定化酵素を用いたとき、主反応を行う前に、ま
ず、水を添加した基質を用いて酵素を活性化し、主反応
では水を添加していない基質を用いると効果的である。
バッチ反応で活性化するには、加えた酵素量の０〜１,
０００% （重量%）の水を含む基質を用いて酵素を前処
理し、またカラム法で活性化するには、水飽和の基質を
連続的に流すとよい。

【００２３】例えば、セライト又はセラミックス担体に
固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）の
リパーゼ（田辺製薬（株）製；タリパーゼ）を用いてバ
ッチ反応で活性化する時の水分量は、加えた酵素量の１
０〜２００% （重量% ）である。しかし、エステル交換
反応の活性化に必要な水分量は用いる酵素の種類により
大きく左右され、例えば、リゾムコール・ミイハイ（Rh
izomucor miehei ）のリパーゼ（ノボ・ノルディスク
（株）製；リボザイムIM）であれば、ほとんど水分を必
要とせず、むしろ過剰の水を除去しなければならない。
過剰水の除去は主反応を妨害しないトリグリセリドを基
質として選択し、これを固定化酵素で加水分解するとよ
い。

【００２４】バッチ反応におけるリパーゼの使用量は反
応条件によって適宜決定すれば良く、特に制限されるも
のではないが、例えばセライトやセラミックス担体に固
定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリ
パーゼ、あるいはリゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor
miehei ）のリパーゼを用いたときには、反応混液の１
〜３０% （重量% ）が適量である。

【００２５】バッチ反応におけるエステル交換反応は、
以下の方法により行う。すなわち、２位に炭素数が１６
〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドに、ω
３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸あるいはその脂肪酸エ
ステルを加える。脂肪酸エステルとしては、例えばメチ
ルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチ
ルエステルなどを用いることができる。原料として用い
るトリグリセリド／脂肪酸またはトリグリセリド／脂肪
酸エステル比は１：０. ５〜２０が適量である。この基
質に適当な量（通常５, ０００〜５０, ０００U/g ；こ
こでリパーゼ１Ｕとは、オリーブ油を基質として用い、
１分間に１μmol の脂肪酸を遊離させる酵素量である）
の活性化または脱水した１, ３位特異的リパーゼを加
え、攪拌または振盪しながら４５℃以下、好ましくは３
０℃付近で２〜１００時間エステル交換反応を行えばよ
い。

【００２６】上記固定化酵素は繰り返し使用することが
できる。すなわち、反応後固定化酵素だけを反応器内に
残し、反応液を新たに調製した基質と交換することによ
り反応を継続することができる。また、カラム法による
エステル交換反応は、酵素１g 当り、０. ０５〜２０ml
/hr で基質を連続的に流すとよい。また、エステル交換
反応を繰り返して行うことにより、目的のトリグリセリ
ド含量を高めることができる。すなわち、ω３、ω６又
はω９系不飽和脂肪酸もしくはその脂肪酸エステルの存
在下に、トリグリセリドの１, ３位特異的リパーゼを作
用させて、１及び３位の脂肪酸がω３、ω６及び／又は
ω９系不飽和脂肪酸にエステル交換された反応液を得
る。

【００２７】次に、該反応溶液から後述する方法により
トリグリセリドを精製し、該精製トリグリセリドを原料
として再度ω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸またはそ
の脂肪酸エステルでエステル交換反応を行う。この繰り
返しエステル化反応により目的のトリグリセリド含有量
を飛躍的に高めることができ、繰り返し回数は２〜５回
が好ましい。

【００２８】従来の固定化リパーゼを用いたエステル交
換反応では、副反応として起こる加水分解反応により生
成した部分グリセリドの２位に結合していた脂肪酸のア
シル基転移が誘発された。しかし、本発明では、加水分
解反応をほぼ完全に抑えることができ、部分グリセリド
の生成量は１% 程度であり、従来の問題点を解決するこ
とができた。また、基質に含まれている水分含量が数千
ppm 以下であれば、副反応として起こる加水分解を無視
することができ、基質中に含まれる水分量を精密制御す
る必要がないという特徴を有している。

【００２９】さらに、従来の固定化酵素を用いた有機溶
媒中での反応あるいは５０℃以上の反応では数回の使用
で酵素活性が低下したのに対して、本発明では有機溶媒
を用いない反応系で４５℃以下で反応を行うため酵素の
失活が起こらず、バッチ反応で数十回以上、カラム反応
で１００日以上連続して酵素を使用することも可能であ
る。

【００３０】本発明では、基質が単純であるために、反
応により得られたトリグリセリドは数種の分子種から構
成される。そこで、液体クロマトグラフィー、分子蒸
留、流下膜蒸留、精密蒸留などの常法あるいはその組み
合わせにより、目的のトリグリセリドを容易に単離する
ことができる。本発明で製造する反応後のトリグリセリ
ドは、１位及び／又は３位に不飽和脂肪酸が結合したト
リグリセリドであり、該トリグリセリド、未反応原料、
未反応の不飽和脂肪酸または脂肪酸エステル及びエステ
ル交換されて生じた原料のトリグリセリドの１及び／又
は３位に結合していた脂肪酸または該脂肪酸エステルと
の混合物として存在している。

【００３１】そこで、目的の１位及び／又は３位に不飽
和脂肪酸が結合し、２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂
肪酸が結合したトリグリセリドの精製は、アルカリ脱
酸、水蒸気蒸留、分子蒸留、流下膜蒸留、真空精密蒸
留、カラムクロマトグラフィー、溶剤抽出、膜分離のい
ずれか又はこれらを組み合わせることにより、上記のエ
ステル交換された脂肪酸及び未反応の不飽和脂肪酸を除
去することによって行うことができる。

【００３２】本発明で得られるトリグリセリドの１及び
３位を構成する脂肪酸はω３、ω６及び／又はω９系不
飽和脂肪酸からなる。具体的には、ω３系不飽和脂肪酸
としては、9, 12, 15-オクタデカトリエン酸 (α- リノ
レン酸) ［18：3,ω3 ］、6,9, 12, 15- オクタデカテ
トラエン酸 (ステアリドン酸) ［18：4,ω3 ］、11,14,
17- エイコサトリエン酸 (ジホモ- α- リノレン酸)
［20：3,ω3 ］、8, 11, 14, 17-エイコサテトラエン酸
［20：4,ω3 ］、5, 8, 11, 14, 17- エイコサペンタエ
ン酸［20：5,ω3 ］、7, 10, 13, 16, 19-ドコサペンタ
エン酸［22：5,ω3 ］、4, 7, 10, 13, 16, 19- ドコサ
ヘキサエン酸［22：6,ω3 ］を挙げることができる。

【００３３】また、ω６系不飽和脂肪酸としては、9, 1
2-オクタデカジエン酸 (リノール酸) ［18：2,ω6 ］、
6, 9, 12- オクタデカトリエン酸 (γ- リノレン酸)
［18：3,ω6 ］、8, 11, 14-エイコサトリエン酸 (ジホ
モ- γ- リノレン酸) ［20：3,ω6 ］、5, 8, 11, 14-
エイコサテトラエン酸 (アラキドン酸) ［20：4,ω6
］、7, 10, 13, 16-ドコサテトラエン酸［22：4,ω6
］、4, 7, 10, 13, 16, - ドコサペンタエン酸［22：
3,ω6 ］を挙げることができる。さらに、ω９系不飽和
脂肪酸としては、6, 9- オクタデカジエン酸［18：2,ω
9 ］、8, 11-エイコサジエン酸［20：2,ω9 ］、5, 8,
11- エイコサトリエン酸 (ミード酸) ［20：3,ω9 ］挙
げることができる。さらに、アシル基はヒドロキシル
化、エポキシ化、又はヒドロキシエポキシ化されたアシ
ル基であっても構わない。本発明の新規なトリグリセリ
ドの２位を構成する脂肪酸は、炭素数１６〜１８の脂肪
酸からなる。例えば、パルミチン酸 (16：0 ）、ステア
リン酸 (18：0 ）を挙げることができる。

【００３４】

【実施例】次に、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。なお、本実施例では、便宜的に脂肪酸およ
びトリグリセリドを次のような略号で示す。まず、脂肪
酸を表わす一文字略号には次のものを用いる。８：カプ
リル酸、Ｐ：パルミチン酸、Ａ：アラキドン酸、Ｍ：ミ
ード酸、Ｄ：ドコサヘキサエン酸。次に、トリグリセリ
ドを、１位に結合している脂肪酸を表わす一文字略号、
２位に結合している脂肪酸を表わす一文字略号、３位に
結合している脂肪酸を表わす一文字略号により三文字で
表記する。従って、トリグリセリドの構造は例えば次の
例のように表記される。例：８Ｐ８（１位にカプリル
酸、２位にパルミチン酸、３位にカプリル酸が結合した
トリグリセリド）

【００３５】実施例１．トリパルミチン（ＰＰＰ）とカ
プリル酸の１：２（wt/wt ）混液を基質原料として使用
し、基質混液１０．５g と固定化リゾムコール・ミイハ
イ（Rhizomucor miehei ）リパーゼ（ノボ・ノルディス
ク（株）製；リボザイムIM60）１．２gからなる反応液
をねじ蓋付きバイアル瓶に入れ、５０℃で４８時間振盪
（１４０回／分）しながらインキュベートした。反応
後、固定化酵素だけを残して反応液を新しい基質混液と
交換し、同じ条件下で反応を行った。固定化酵素を繰り
返し使用しながら４回反応を行い、それぞれの反応液を
回収した。

【００３６】各反応液（１０．５g ）に７０mlの０．５
N KOH 溶液（２０% エタノール溶液）を加え、１００ml
のヘキサンでグリセリド画分を抽出後、エバポレーター
により溶剤を除去してグリセリドを回収した。イヤトロ
スキャン（ヤトロン（株）社製）でグリセリド組成を調
べた結果、１回目のグリセリド中には８% のジグリセリ
ドが含まれていたが、２回目以降のグリセリド中の部分
グリセリド含量は１%以下であった。２〜４回目のグリ
セリド画分の脂肪酸組成（モル% ）はカプリル酸４５．
１% 、パルミチン酸５４．９% であった。

【００３７】カプリル酸の交換率を高めるため、２〜４
回目のグリセリド画分を原料として再度エステル交換し
た。上記の反応に使用したリボザイム IM60 （１．２g
）に、調製したグリセリド３．５g とカプリル酸７g
を加え、３０℃で４８時間振盪しながら反応を行った
（５回目）。反応後、反応液を新しい基質と交換して同
じ条件下で反応を行った（６回目）。５、６回目の反応
液からグリセリド画分をヘキサン抽出により回収した
（合計４. ８g ）。得られたグリセリドの脂肪酸組成
（モル% ）はカプリル酸６４．２% 、パルミチン酸３
５．８% であった。このグリセリド中に含まれる部分グ
リセリドは１% 以下であり、アセトン／アセトニトリル
（１：１, vol/vol ）を溶出溶媒としてＯＤＳカラム
（Wakosil-II 3C18, 4.6 x 150mm, ２本）で分析した結
果、８Ｐ８の純度は９３% であった。

【００３８】得られた８Ｐ８（３．５g ）とアラキドン
酸（純度９０% ）７g を原料とし、上記の反応に用いた
リボザイム IM60 で３０℃で４８時間エステル交換反応
を行い（７回目）、反応後の反応液をアルカリ条件下で
ヘキサン抽出し、グリセリド画分（４．８g ）を得た。
グリセリドの脂肪酸組成を分析したところ、カプリル
酸、パルミチン酸、γ- リノレン酸、アラキドン酸はそ
れぞれ３８．５、２３．１、２．４及び３４．０モル%
であった。このグリセリドをアセトン／アセトニトリル
（１：１, vol/vol ）を溶出溶媒としてＯＤＳカラム
（SH-345-5, 20 x 500mm YMC（社）製）を用いた高速液
体クロマトグラフィーにより分画した結果、８ＰＡとＡ
ＰＡがそれぞれ０．７２、０．４４g 得られた。

【００３９】実施例２．実施例１に記載した方法の１０
０倍の規模で反応を行って８Ｐ８を調製し、原料として
使用した。リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）の
リパーゼ（田辺製薬（株）製；タリパーゼ）をJ. Ferme
nt. Bioeng., 81, 299-303 (1996) に従ってセラミック
ス担体 SM-10（日本ガイシ（株）製）に固定化した。固
定化酵素１０g （３１, ０００U/g ）をカラムに充填し
た後、水飽和の大豆油：カプリル酸１：２（wt/wt）混
合液を３０℃、流速３ml/hr で１００ml流し固定化酵素
を活性化した。

【００４０】次いで水を加えていない大豆油５０mlを流
して過剰水を除去した後、８Ｐ８とアラキドン酸エチル
エステル（純度９０% ）の１：４（wt/wt ）混液を同じ
条件で流しながらエステル交換反応を行った。反応液１
００g を高真空下で蒸留してグリセリド画分を残査とし
て回収した後、実施例１に従ってアルカリ条件下でヘキ
サン抽出した。エバポレーターにより溶媒を除去し、ヘ
キサン抽出物３５. ７g を得た。このヘキサン抽出物に
含まれているトリグリセリドと脂肪酸エステルの組成比
をイヤトロスキャンで分析したところ９１：９であっ
た。また、脂肪酸組成を分析した結果、カプリル酸、パ
ルミチン酸、γ- リノレン酸、ジホモ- γ- リノレン酸
及びアラキドン酸は、それぞれ２４．４、３４．５、
１．５、２．６及び３７．０モル% であった。

【００４１】実施例３．実施例１で用いた固定化リゾム
コール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）リパーゼ（ノ
ボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM60）に含まれ
ている過剰の水を除去するために、該固定化酵素１２g
、ＳＵＮＴＧＡ- ２５（サントリー（株）製）６０g
からなる反応混液を１００mlのねじ蓋付きバイアル瓶に
入れ、３０℃で４８時間振盪しながら反応させた（１回
目）。固定化酵素だけを反応器に残し、実施例２で作成
した８Ｐ８（１２g ）とミード酸エチルエステル（純度
９０% ）４８g を加えて十分窒素置換した後、３０℃で
７２時間振盪しながらエステル交換反応を行った（２、
３回目）。

【００４２】反応後、２回目と３回目の反応混液を合わ
せ、そのうち１００g を実施例２と同様に、高真空下で
蒸留してグリセリド画分を残査として回収した。次い
で、実施例１に従ってアルカリ条件下でヘキサン抽出し
た後、エバポレーターによりヘキサンを除去し、２４．
１g のグリセリド画分を得た。この中に含まれているト
リグリセリドと脂肪酸エステルの組成比をイヤトロスキ
ャンで分析したところ９２：８であった。実施例１に従
って高速液体クロマトグラフィーを行い示差屈折計のピ
ーク面積から脂肪酸エステルと各トリグリセリド成分を
定量したところ、ＭＰＭは１２．０％であった。またこ
の画分の脂肪酸組成は、カプリル酸、パルミチン酸及び
ミード酸がそれぞれ３１．２、３５．７及び３３．１モ
ル％であった。

【００４３】エステル交換率を高めるために、得られた
エステル交換トリグリセリドを再度ミード酸エチルエス
テルでエステル交換した。上記の固定化酵素にエステル
交換トリグリセリド１２g とミード酸エチルエステル４
８g を加えて３０℃で７２時間振盪しながら反応を行っ
た（４回目）。反応後、反応液５５g を上述した方法で
蒸留し、１２. ３g のグリセリド画分を得た。この画分
の脂肪酸組成は、カプリル酸、パルミチン酸及びミード
酸がそれぞれ５．２、３８．６及び５６．１モル％であ
った。

【００４４】実施例４．実施例１で用いた固定化リゾム
コール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）リパーゼ（ノ
ボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM60）に含まれ
ている過剰の水を除去するために、該固定化酵素２g 、
ＳＵＮＴＧＡ- ２５（サントリー（株）製）１０g から
なる反応混液を２０mlのねじ蓋付きバイアル瓶に入れ、
３０℃で４８時間振盪しながら反応させた（１回目）。
固定化酵素だけを反応器に残し、実施例２で作成した８
Ｐ８（１２g ）とＳＵＮＴＧＡ- ２５を加水分解して得
られた脂肪酸混液８g を加えて十分窒素置換した後、３
０℃で４８時間振盪しながらエステル交換反応を行った
（２〜５回目）。反応後、２〜５回目の反応混液からヘ
キサン抽出したグリセリドを合わせ、再度のエステル交
換反応の基質とした。

【００４５】上記の固定化酵素の入った反応器にエステ
ル交換トリグリセリド２g とＳＵＮＴＧＡ- ２５由来の
脂肪酸混液１０g を加え、３０℃で４８時間振盪しなが
ら反応させた（６、７回目）。６、７回目の反応混液か
らグリセリド画分を抽出し、再々度のエステル交換反応
の基質とし、同様に反応を行った（８回目）。エステル
交換反応を３回繰り返すことにより得られたトリグリセ
リドを構成する脂肪酸組成、トリグリセリドの１，３位
および２位の各脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーに
より分析した。この結果を表１に示す。

【００４６】

【表１】

【００４７】比較例１．実施例２で作成した８Ｐ８と固
定化酵素をそれぞれ原料および触媒として使用した。固
定化酵素２ｇ、大豆油４ｇ、カプリル酸８ｇおよび水
０．５ｇを２０ｍｌのバイアル瓶に入れ、３０℃で２４
時間振盪しながらインキュベートすることにより固定化
酵素を活性化した。活性化した酵素を反応器内に残し、
これに水を含まない基質、アラキドン酸／８Ｐ８（４：
１，wt/wt ）あるいは、アラキドン酸／ＰＰＰ（４：
１，wt/wt ）を加え、前者の反応は３０℃で後者の反応
は５０℃で振盪しながら行った。また反応は２４時間毎
に反応液を新らしい基質と交換しながら繰り返し固定化
酵素の安定性を比較した。

【００４８】基質にＰＰＰを用いて５０℃で反応を繰り
返したとき固定化酵素を７回使用した後ではアラキドン
酸の取り込み量は最初の取り込み量の１０％以下に低下
した（１回目と７回目のアラキドン酸の取り込み量はそ
れぞれ４７％と３％）。一方、基質に８Ｐ８を用いて３
０℃で反応を繰り返したとき固定化酵素を５０回使用し
てもアラキドン酸の取り込み量はほとんど変わらなかっ
た（１回目と５０回目のアラキドン酸の取り込み量はそ
れぞれ４１％と３８％）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者藤川茂昭大阪府三島郡島本町山崎５−２−５サントリー株式会社技術開発センター内 (72)発明者島田裕司大阪府堺市櫛屋町東４−２−31 (72)発明者杉原耿雄兵庫県伊丹市千僧６−87 (72)発明者富永嘉男大阪府大阪市西淀川区歌島２−７−２Ｆターム(参考） 4B064 AD85 CA21 CB30 CD07 CD22 4H006 AA02 BT12 KA02 4H059 BA33 BB05 CA35 EA17 EA40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数
１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸の
少なくともひとつがω３、ω６又はω９系の不飽和脂肪
酸であるトリグリセリドを製造する方法であって、トリ
グリセリドの２位の脂肪酸が炭素数１６〜１８の飽和脂
肪酸であり、１及び３位の脂肪酸が中鎖脂肪酸である融
点が４５℃以下のトリグリセリドに、ω３、ω６又はω
９系不飽和脂肪酸又はそのエステルの存在下で、１，３
位特異的リパーゼを作用させてエステル交換反応によっ
て目的のトリグリセリドを得ることを特徴とする当該ト
リグリセリドの製造方法。
【請求項２】製造するトリグリセリドが、トリグリセ
リドの２位の脂肪酸が炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸で
あり、１及び３位の脂肪酸の一方がω３、ω６又はω９
系の不飽和脂肪酸であり、他方も当該不飽和脂肪酸と同
じω３、ω６又はω９系の不飽和脂肪酸である請求項１
記載のトリグリセリドの製造方法。
【請求項３】製造するトリグリセリドが、トリグリセ
リドの２位の脂肪酸が炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸で
あり、１及び３位の脂肪酸の一方がω３、ω６又はω９
系の不飽和脂肪酸であり、他方が当該不飽和脂肪酸と異
なるω３、ω６又はω９系の不飽和脂肪酸である請求項
１記載のトリグリセリドの製造方法。
【請求項４】製造するトリグリセリドが、トリグリセ
リドの２位の脂肪酸が炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸で
あり、１及び３位の脂肪酸の一方がω３、ω６又はω９
系の不飽和脂肪酸であり、他方が炭素数４〜１８の飽和
脂肪酸である請求項１記載のトリグリセリドの製造方
法。
【請求項５】 ω３、ω６及び／又はω９系の不飽和脂
肪酸が、 9, 12, 15-オクタデカトリエン酸 (α- リノレン酸) 18：3,ω3 6, 9, 12, 15- オクタデカテトラエン酸 (ステアリドン酸) 18：4,ω3 11, 14, 17- エイコサトリエン酸 (ジホモ- α- リノレン酸) 20：3,ω3 8, 11, 14, 17-エイコサテトラエン酸 20：4,ω3 5, 8, 11, 14, 17- エイコサペンタエン酸 20：5,ω3 7, 10, 13, 16, 19-ドコサペンタエン酸 22：5,ω3 4, 7, 10, 13, 16, 19- ドコサヘキサエン酸22：6,ω3 9, 12-オクタデカジエン酸（リノール酸） 18：2,ω6 6, 9, 12- オクタデカトリエン酸 (γ- リノレン酸) 18：3,ω6 8, 11, 14-エイコサトリエン酸 (ジホモ- γ- リノレン酸) 20：3,ω6 5, 8, 11, 14- エイコサテトラエン酸 (アラキドン酸) 20：4,ω6 7, 10, 13, 16-ドコサテトラエン酸 22：4,ω6 4, 7, 10, 13, 16- ドコサペンタエン酸 22：5,ω6 6, 9- オクタデカジエン酸 18：2,ω9 8, 11-エイコサジエン酸 20：2,ω9 5, 8, 11- エイコサトリエン酸 (ミード酸) 20：3,ω9 からなる群から選ばれる不飽和脂肪酸である、請求項１
乃至４のいずれか１項に記載のトリグリセリドの製造方
法。
【請求項６】エステル交換反応のために用いる２位に
炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリ
ドが、ω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸をトリ
グリセリドの構成脂肪酸として生産する能力を有する微
生物由来であり、当該トリグリセリドの２位に炭素数１
６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１及び３位にω３、ω
６又はω９系の不飽和脂肪酸が結合しているトリグリセ
リドであることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれ
か１項に記載のトリグリセリドの製造方法。
【請求項７】エステル交換反応のために添加するω
３、ω６又はω９系の不飽和脂肪酸が、ω３、ω６又は
ω９系の不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするトリグリセリ
ドの加水分解混合物であることを特徴とする、請求項１
乃至５のいずれか１項に記載のトリグリセリドの製造方
法。
【請求項８】トリグリセリドの２位の脂肪酸がパルミ
チン酸またはステアリン酸である請求項１乃至５のいず
れか１項に記載のトリグリセリドの製造方法。
【請求項９】有機溶媒を使用しない反応系でエステル
交換反応を行うことを特徴とする、請求項１乃至８のい
ずれか１項に記載のトリグリセリドの製造方法。
【請求項１０】反応温度を４５℃以下でエステル交換
反応を行うことを特徴とする、請求項１乃至９のいずれ
か１項に記載のトリグリセリドの製造方法。