CN115478083A - 一种无溶剂体系制备磷脂型多不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多不饱和脂肪酸制备技术领域，具体涉及一种无溶剂体系制备磷脂型多不饱和脂肪酸的方法。本发明所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，包括：在无溶剂体系中及酶催化作用下，原料多不饱和脂肪酸酯与磷脂进行酯交换反应；其中：所述酯交换反应是在碱物质的作用下进行；所述多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围为1‑60mg KOH/g。本发明通过向体系中加入碱物质，并控制多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围，经两者协同作用，可显著提高产物中多不饱和脂肪酸含量。该方法所得产物中多不饱和脂肪酸的含量相对更高，同时操作相对更简便、安全性更高，生产成本相对较低，更适合工业化生产的优点。
Description
技术领域
本发明涉及多不饱和脂肪酸制备技术领域，具体涉及一种无溶剂体系制备磷脂型多不饱和脂肪酸的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸(PUFA)产品通常分为乙酯型、甘油三酯型和磷脂型，PUFA的生理功能因其在脂肪中的分子形式不同而有差异。
以磷脂形式存在的PUFA，不仅同时具有磷脂和PUFA的生理功能，而且结构更稳定、不易于氧化，更有利于人体的吸收。有研究表明，乙酯型DHA在人体内的吸收率仅为20％左右，甘油型DHA在人体吸收率则可以提高到70％，而磷脂型DHA在人体内的吸收率最高，超过99％。
天然的富含EPA/DHA的磷脂主要存在于海产动物中，其产量远远无法满足人们的需求，通过人工的方式合成磷脂型PUFA就成为另一种获取途径。
改变磷脂的脂肪酸构成，一般可以选择酯交换反应或者酸解反应。酯交换反应是选用目的脂肪酸的酯类化合物和磷脂上的脂肪酸进行交换；酸解反应是采用游离脂肪酸和磷脂上的脂肪酸进行交换。
中国发明专利CN104962590A公开了在溶剂体系中，含二十二碳六烯酸油脂与粉末磷脂脂肪酶促酯交换制备微生物来源的磷脂型多不饱和脂肪酸油脂的方法。但该方法使用溶剂，安全性较低，且采用两步酶法，存在反应繁琐、生产成本高的缺陷。
中国发明专利CN106893747A公开了一种酶法催化n-3多不饱和脂肪酸或其酯类衍生物与大豆磷脂酯交换制备n-3多不饱和脂肪酸磷脂的方法，但其只有在具有挥发性的可燃有机溶剂中酶促反应才能达到最佳结果，对生产条件及环境均不友好，且需附加溶剂回收工艺消耗大量资源，导致生产成本大幅提高。
文献(孙兆敏等，酶法制备n-3多不饱和脂肪酸型磷脂的工艺，中国油脂)提供了一种无溶剂体系中固定化磷脂酶A1催化大豆磷脂与乙酯型鱼油进行酯交换反应，制备n-3多不饱和脂肪酸型磷脂的工艺。但该工艺中使用的磷脂酶A1为液态，目前尚无固定化产品，不利于工业化生产。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种无溶剂体系制备磷脂型多不饱和脂肪酸的方法。该方法所得产物中多不饱和脂肪酸的含量相对更高，同时操作相对更简便、安全性更高，生产成本相对较低，更适合工业化生产的优点。
本发明所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，包括：在无溶剂体系中及酶催化作用下，原料多不饱和脂肪酸酯与磷脂进行酯交换反应；其中：
所述酯交换反应是在碱物质的作用下进行；
所述多不饱和脂肪酸类酯的酸价AV范围为1-60mg KOH/g。
现有无溶剂体系制备磷脂型多不饱和脂肪酸的方法普通存在产物中多不饱和脂肪酸含量偏低的问题。为此，本发明研究发现，通过向体系中加入碱物质，并控制多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围，经两者协同作用，可显著提高产物中多不饱和脂肪酸含量，使其满足工业化生产需求。
本发明进一步研究发现，所述碱物质的添加量对产物中多不饱和脂肪酸含量产生实质性影响。为此，本发明控制所述碱物质与所述多不饱和脂肪酸酯的质量比为(0.0007-0.02)：1；优选地，所述碱物质与所述多不饱和脂肪酸酯的质量比为(0.0035-0.02):1。
所述的碱物质可为NaOH、KOH、NaOC2H5、KOC2H5、NaOCH3、KOCH3中的一种或多种。
本发明中，所述碱物质与原料的混合方式为：先将碱物质配制为水溶液，再与所述多不饱和脂肪酯混合，最后向所得混合物中加入磷脂。通过调整加入方式，更有利于反应充分进行。
本发明研究发现，在碱物质存在下，所述多不饱和脂肪酯的酸价越高，越有助于酶促酯交换反应的进行，但酸价过高又难以保证目标产物品质。为此，本发明控制所述多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围为1-20mg KOH/g；优选为5-20mg KOH/g。
所述多不饱和脂肪酸酯为烷基酯和/或甘油酯；优选地，所述烷基酯为乙酯油。进一步优选地，所述多不饱和脂肪酸酯中多不饱和脂肪酸的含量不小于60％。
作为本发明的具体实施方式之一，所述多不饱和脂肪酸为ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、花生四烯酸、十八碳三烯酸、十八碳二烯酸或十八碳四烯酸中的一种或多种。
本发明中多不饱和脂肪酸酯可以含有多种多不饱和脂肪酸残基，实际实施中往往会以原料中某一种含量较高的脂肪酸作为目标接入，则以上所述的多不饱和脂肪酸的含量为目标多不饱和脂肪酸的含量。在一个容易理解的实施例中：目的是得到磷脂型EPA，则所述原料中EPA残基的含量需要大于60％。
本发明中，所述酶为1,3特异性脂肪酶；所述酶的添加量占底物质量的10％-30％。在碱物质存在条件下，相比随机化酶，1,3特异性脂肪酶具有更好效果。
本发明中，所述磷脂与所述多不饱和脂肪酸酯的质量比1:(3-10)。所述磷脂优选为甘油磷脂，甘油磷脂的主要来源可选大豆磷脂。
本发明中，所述酯交换反应的温度为45-65℃，反应时间为4-24h。
本发明所述酯交换反应中，控制水酶比为10-20％。
作为本发明具体实施方式之一，所述磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，步骤如下：
(1)向多不饱和脂肪酸乙酯油中加入氢氧化钠的水溶液，混合均匀；继续加入磷脂，混合均匀；
其中氢氧化钠与多不饱和脂肪酸乙酯油的质量比为(0.0035-0.02)：1；
所述多不饱和脂肪酸乙酯油的酸价AV范围为5-20mg KOH/g，其多不饱和脂肪酸的含量不小于60％；
所述磷脂与多不饱和脂肪酸乙酯油的质量比1:(3-10)；
(2)向体系中加入底物质量10-30％的1,3特异性脂肪酶，进行酯交换反应；
所述酯交换反应的温度为45-65℃，反应时间为4-24h；所述酯交换反应中，控制水酶比为10-20％；
(3)反应结束后离心，除去下层固定化酶，收集上层油脂混合物，分离油脂混合物，得到产物。
本发明的有益效果如下：
本发明通过向体系中加入碱物质，并控制多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围，经两者协同作用，可显著提高产物中多不饱和脂肪酸含量。该方法所得产物中多不饱和脂肪酸的含量相对更高，同时操作相对更简便、安全性更高，生产成本相对较低，更适合工业化生产的优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中各组分均可通过市售购买得到。
以下实施例中：
LipozymeRM IM、Novozym435、LipozymeTLIM均为诺维信产品；
粉末磷脂：新百维(丙酮不溶物95％)；
EPA乙酯油
实施例1
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(EPA含量为70％，AV 18.42mg KOH/g)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集上层油脂混合物，分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为27.2％。
实施例2
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：降低NaOH添加量；
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(同实施例1)，加入0.45mL 1mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入3.6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为14.8％。
实施例3
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于替换固定化脂肪酶RM IM酶为固定化脂肪酶TL IM。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(同实施例1)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶TL IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为25.8％。
实施例4
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：加入碱量的不同。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(同实施例1)，加入0.72mL12.5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集上层油脂混合物，分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为21.2％。
实施例5
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：降低EPA含量至50％。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入25.2gEPA乙酯油(EPA含量为50％，AV 12.25mg KOH/g)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集上层油脂混合物，分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为15.2％。
DHA乙酯油
实施例6
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换多不饱和脂肪酸为DHA乙酯油。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gDHA乙酯油(DHA含量为75％，AV 6.2mg KOH/g)，加入0.72mL 2.2mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入4.5g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中DHA面积含量为22.5％。
实施例7
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换DHA乙酯油(DHA含量为70％，AV 1.56mg KOH/g)
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gDHA乙酯油(DHA含量为70％，AV1.56mg KOH/g)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入4.5g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应完混合物于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中DHA面积含量为13.5％。
甘油酯
实施例8：(甘油酯)
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换多不饱和脂肪酸为EPA甘油酯。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入21g的EPA甘油酯(EPA含量为60％，AV 5.0mg KOH/g)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为10.8％。
对比例1
本对比例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：体系未加碱。结果显示所得产物的EPA面积含量较低。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(同实施例1)，加入0.72mL水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为10.4％。
对比例2
本对比例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换EPA乙酯油为EPA脂肪酸。结果显示所得产物中EPA面积含量较低。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18g的EPA脂肪酸(EPA含量为70％)，加入0.72mL5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为4.3％。
对比例3
本对比例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换固定化脂肪酶为非定向脂肪酶，即随机化脂肪酶435。结果显示所得产物中EPA面积含量较低。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(EPA含量为70％，AV 18.42mg KOH/g)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀。加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g随机化脂肪酶435，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应完混合物于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为7.2％。
对比例4
本对比例更换工艺路线制备磷脂型多不饱和脂肪酸，同时向体系中加入碱，但所得产物中DHA面积含量较低。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gDHA乙酯油(DHA含量为75％，AV 6.2mg KOH/g)、粉末磷脂原料5g，并加入40ml正己烷，获得油脂混合物A；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取0.15mL10.5mol/L氢氧化钠碱液，加入到油脂混合物A中并充分混匀，得到油脂混合物B；
(3)，精密称取固定化的RM IM脂肪酶3g，加入至步骤(2)获得的油脂混合物B中，在55℃的温度下反应8小时，获得油脂混合物C；分离油脂混合物C。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中DHA面积含量为6.4％。
对比例5
本对比例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换为DHA乙酯油，且酸价较低，AV 0.8mg KOH/g。结果显示所得产物中DHA面积含量较低。
(1)于圆底烧瓶中，加入18gDHA乙酯油(DHA含量为70％，AV 0.8mg KOH/g)，加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀。加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应完混合物于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。
分离油脂混合物，所得产物甲酯化后经气相色谱检测，得到磷脂中DHA面积含量为6.5％。
对比例6
本对比例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，与实施例1的区别在于：替换为DHA乙酯油，且酸价较低，AV 0.8mg KOH/g；同时加入柠檬酸。结果显示所得产物中DHA面积含量较低，说明原料的酸价并非仅起到调节pH值的作用。
具体步骤如下：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gDHA乙酯油(DHA含量为70％，AV 0.8mg KOH/g)，加入柠檬酸水溶液(12％)0.375mL，混合均匀，再加入0.72mL 5mol/L的NaOH水溶液，混合均匀，加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应完混合物于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集油脂混合物。
分离油脂混合物，所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中DHA面积含量为5.3％。
对比例7
本实施例提供一种无溶剂体系中磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)于圆底烧瓶中，加入18gEPA乙酯油(EPA含量为70％，AV 18.42mg KOH/g)，加入0.72mL 18.75mol/L的NaOH水溶液，混合均匀；继续加入6g粉末磷脂，超声5min溶解。
(2)加入3.6g固定化脂肪酶RM IM，置于65℃水浴，300rpm搅拌18h。
(3)反应结束后于6000rpm离心5min，除去下层固定化酶，收集上层油脂混合物，分离油脂混合物。
所得产物甲酯化后经气相色谱检测，结果显示产物中EPA面积含量为4.2％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，包括：在无溶剂体系中及酶催化作用下，原料多不饱和脂肪酸酯与磷脂进行酯交换反应；其中：
所述酯交换反应是在碱物质的作用下进行；
所述多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围为1-60mg KOH/g。
2.根据权利要求1所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述碱物质与所述多不饱和脂肪酸酯的质量比为(0.0007-0.02)：1。
3.根据权利要求2所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述碱物质与所述多不饱和脂肪酸酯的质量比为(0.0035-0.02):1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述碱物质与原料的混合方式为：先将碱物质配制为水溶液，再与所述多不饱和脂肪酯混合，最后向所得混合物中加入磷脂。
5.根据权利要求1-3任一项所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述多不饱和脂肪酸酯的酸价AV范围为1-20mg KOH/g；优选为5-20mg KOH/g。
6.根据权利要求5所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述多不饱和脂肪酸酯为烷基酯和/或甘油酯；
所述多不饱和脂肪酸酯中多不饱和脂肪酸的含量不小于60％。
7.根据权利要求6所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述酶为1,3特异性脂肪酶；所述酶的添加量占底物质量的10％-30％。
8.根据权利要求5所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述磷脂与所述多不饱和脂肪酸酯的质量比1:(3-10)；
优选地，所述磷脂为甘油磷脂。
9.根据权利要求5所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述酯交换反应中，控制水酶比为10-20％。
10.根据权利要求1所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)向多不饱和脂肪酸乙酯油中加入氢氧化钠的水溶液，混合均匀；继续加入磷脂，混合均匀；
其中氢氧化钠与多不饱和脂肪酸乙酯油的质量比为(0.0035-0.02)：1；
所述多不饱和脂肪酸乙酯油的酸价AV范围为5-20mg KOH/g，其多不饱和脂肪酸的含量不小于60％；
所述磷脂与多不饱和脂肪酸乙酯油的质量比1:(3-10)；
(2)向体系中加入底物质量10-30％的1,3特异性脂肪酶，进行酯交换反应；
所述酯交换反应的温度为45-65℃，反应时间为4-24h；所述酯交换反应中，控制水酶比为10-20％；
(3)反应结束后离心，除去下层固定化酶，收集上层油脂混合物，分离油脂混合物，得到产物。
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