JP3995409B2

JP3995409B2 - ５，８，１１−エイコサトリエン酸及び／又は６，９−オクタデカジエン酸を高濃度に含有するグリセリドの製造方法

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Publication number: JP3995409B2
Application number: JP2000321707A
Authority: JP
Inventors: 茂昭藤川; 健吾秋元; 裕司島田; 耿雄杉原; 嘉男富永
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2020-10-20
Also published as: JP2002125691A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂から、高濃度の５，８，１１−エイコサトリエン酸（以下「ミード酸」と記す場合がある）及び／又は６，９−オクタデカジエン酸（以下「１８：２ｎ−９」と記す場合がある）を含有するグリセリド、あるいは遊離脂肪酸混合物を得る方法に関するものである。
さらに本発明は、高濃度のミード酸及び／又は６，９−オクタデカジエン酸を含有するグリセリド並びに遊離脂肪酸混合物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ｎ−９系不飽和脂肪酸はその天然界での存在（Mead, J. F. and W.H.Sheraton Jr., J. Biol. Chem. 219: 715, (1956) ）や微生物生産（特願平3-251966）についてすでに知られている。また、ｎ−９系不飽和脂肪酸であるミード酸にロイコトリエンＢ４による医学的症状（リウマチや炎症）の予防の効果（特開平7-41421）があることが知られている。
【０００３】
微生物を培養して蓄積するミード酸含有トリグリセリドのミード酸含有率は２４〜２８％程度が最高であった（特願平3-251966、H. Kawashima, Appl. Environ. Microbiol. p.1820, (1997)）。しかも、これらの方法は、１０Ｌジャーファーメンターでの培養生産を開示しているにすぎず、すなわち、得られる油脂は１回の培養でわずか29g程度と非常に少量しか得ることができず、商業的に利用するには、スケールアップを行わなければならないが、糸状菌の培養におけるスケールアップは非常に困難であり、まだ検討すべき課題は多く残されている。
【０００４】
ミード酸を食品に加えその機能を発揮させる場合、トリグリセリドとして供するのが一般的であり、従来のミード酸含有油脂では、ミード酸の効果量だけ食品に供するには、該油脂をその３〜４倍量添加する必要があり、食品へ混合して利用することを考えた場合、本来持つ食品の風味を損ない、さらに油脂の多い食品になり、その用途は限られてしまう。そこで、ミード酸などのｎ−９系不飽和脂肪酸含有率の高いトリグリセリドの開発が望まれている。
【０００５】
さらに、ミード酸などのｎ−９系不飽和脂肪酸を医薬品として利用する場合には、純度の非常に高い遊離のｎ−９系不飽和脂肪酸又はｎ−９系不飽和脂肪酸エステルが必要であり、これらを製造するための原料となるｎ−９系不飽和脂肪酸含有油脂中のｎ−９系不飽和脂肪酸含量、又はｎ−９系不飽和脂肪酸含有遊離脂肪酸混合物中のｎ−９系不飽和脂肪酸含量が高いほどカラムクロマト等による精製が容易になる。
【０００６】
しかしながら微生物を培養して蓄積するｎ−９系不飽和脂肪酸含有トリグリセリドにはミード酸と６，９−オクタデカジエン酸の両方が存在し、しかも含有率もせいぜい１０％台であるため、従来のカラムクロマト等による精製では、一回の処理では精製できず、何度も繰り返して行わなければならず、時間がかかり収率も悪かった。そこで、カラムクロマト等による精製工程を行うための前工程として、工業的にも容易で安価にミード酸と６，９−オクタデカジエン酸を分別して高濃度化する方法の開発が求められている。
【０００７】
特定の脂肪酸含有率の高いトリグリセリドを得るには、油脂を脂肪酸又は脂肪酸の低級アルコールエステルに変換した後、（イ）クロマトグラフ分離による方法、（ロ）尿素付加分別による方法、（ハ）分別蒸留による方法、（ニ）液々分別による方法、などの従来から知られた技術を利用して濃縮を行い、続いてグリセリンによりエステル化して再びグリセリドとすることもできるが、工程が複雑なだけでなく、不飽和脂肪酸の異性体が生じるので実用的でない。
【０００８】
そこで、グリセリド中の特定の脂肪酸の含有率を酵素を用いて向上させる研究がなされ、ｎ−３系不飽和脂肪酸としては、特開昭58-165796号では魚油をキャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea）のリパーゼにより加水分解して濃縮することが記載されている。又、特開平7-203979号には、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂にゲオトリカム（Geotrichum）属のリパーゼを使用させてトリグリセリド中のDHAやEPAを濃縮することが記載されている。
【０００９】
ｎ−６系不飽和脂肪酸については、γ−リノレン酸の濃縮（特開平63-12289）、ｎ−６系高度不飽和脂肪酸の高濃度化方法（特開平10-245585、日本合成化学工業（株）、大阪市）などがあり、さらにアラキドン酸の濃縮（JAOCS、Vol.72、No11,1323 (1995）などについての報告がある。また、高純度遊離脂肪酸の製造方法として、アラキドン酸（JAOCS、Vol.75、No.9, 1213 (1998)の報告がある。
しかるに、ｎ−９系不飽和脂肪酸の高濃度化に関する研究は全く開示されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂から、高濃度の５，８，１１−エイコサトリエン酸及び／又は６，９−オクタデカジエン酸を含有するグリセリド、並びに高濃度の５，８，１１−エイコサトリエン酸又は６，９−オクタデカジエン酸を含有する遊離脂肪酸混合物を得る方法を提供しようとするものである。さらに本発明は、高濃度のミード酸及び／又は６，９−オクタデカジエン酸を含有するグリセリド、並びに高濃度の５，８，１１−エイコサトリエン酸又は６，９−オクタデカジエン酸を含有する遊離脂肪酸混合物を提供しようとするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決するために、６，９−オクタデカジエン酸又はミード酸の高濃度化について鋭意研究した結果、驚くべきことに、
少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及びミード酸を含有する油脂を、ミード酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼで加水分解することにより６，９−オクタデカジエン酸を遊離せしめ、６，９−オクタデカジエン酸とミード酸とを、それぞれ遊離脂肪酸画分とグリセリド画分に分別できること；
【００１２】
該ミード酸を多く含有するグリセリド画分は、これをさらに、ミード酸に作用しにくいリパ−ゼで加水分解することにより、ミード酸含量が高く６，９−オクタデカジエン酸含量が低いグリセリドが得られること；
６，９−オクタデカジエン酸又はミード酸を多く含有する遊離脂肪酸画分を、脂肪族アルコールと、６，９−オクタデカジエン酸及びミード酸に作用しにくいリパ−ゼとを作用させることによりエステル化して、それぞれ６，９−オクタデカジエン酸又はミード酸が高濃度化されること；
【００１３】
６，９−オクタデカジエン酸及びミード酸に作用しにくいリパーゼによる加水分解によりオレイン酸を除去して６，９−オクタデカジエン酸及びミード酸を高濃度に含有するグリセリドが得られること；
ミード酸に作用しにくいリパーゼによる加水分解によりオレイン酸及び６，９−オクタデカジエン酸を除去してミード酸を高濃度に含有するグリセリドが得られること；
【００１４】
並びに、６，９−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパーゼによる加水分解によってオレイン酸及びミード酸を除去して６，９−オクタデカジエン酸を高濃度に含有するグリセリドが得られること；
を見出し本発明を完成した。またこれらの方法は実験室での結果を容易にスケールアップすることが可能であり、上記油脂、脂肪酸の商業的生産に適した方法を提供するものである。
【００１５】
従って本発明は、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、５，８，１１−エイコサトリエン酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼにより加水分解して６，９−オクタデカジエン酸を除去し、反応後グリセリドを回収し、このグリセリド画分を、５，８，１１−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパーゼで加水分解し、反応後グリセリドを回収する、ことを特徴とする５，８，１１−エイコサトリエン酸含量が高く６，９−オクタデカジエン酸含量が低いグリセリドの製造方法を提供する。
【００１６】
好ましくは、前記５，８，１１−エイコサトリエン酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼは、シュードモナス・アエルギノサ (Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.)のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ (Pseudomonas stutzeri)のリパ−ゼである。
【００１７】
好ましくは、前記５，８，１１−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパーゼはキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼである。
好ましくは、前記キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼを、加水分解率５０％以上で用いる。
好ましくは、前記５，８，１１−エイコサトリエン酸含量が高く６，９−オクタデカジエン酸含量が低いグリセリドは、５，８，１１−エイコサトリエン酸含量が３０％以上で、６，９−オクタデカジエン酸含量が２０％以下である。
【００１８】
本発明はまた、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパ−ゼにより加水分解し、反応後グリセリド画分を回収する、ことを特徴とする６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を高濃度に含有するグリセリドの製造方法を提供する。
好ましくは、前記６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を高濃度に含有するグリセリドは、５，８，１１−エイコサトリエン酸を３０％以上、及び６，９−オクタデカジエン酸を１５％以上含有する。
【００１９】
本発明はまた、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、５，８，１１−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパーゼにより加水分解してオレイン酸及び６，９−オクタデカジエン酸を除去し、反応後グリセリドを回収する、ことを特徴とする５，８，１１−エイコサトリエン酸を高濃度に含有するグリセリドの製造方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、６，９−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパーゼにより加水分解してオレイン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を除去し、反応後グリセリド画分を回収する、ことを特徴とする６，９−オクタデカジエンを高濃度に含有するグリセリドの製造方法を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、５，８，１１−エイコサトリエン酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼにより加水分解して６，９−オクタデカジエン酸を遊離せしめ、遊離脂肪酸を回収し、この遊離脂肪酸画分を脂肪族アルコールと、６，９−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパーゼとによりエステル化し、反応後遊離脂肪酸を回収する、ことを特徴とする６，９−オクタデカジエン酸を高濃度に含有する遊離脂肪酸混合物の製造方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、前記５，８，１１−エイコサトリエン酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.)のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri)のリパ−ゼである。
【００２３】
好ましくは、前記６，９−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパ−ゼは、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼ、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri)のリパーゼである。
好ましくは、前記エステル化反応後、遊離脂肪酸を回収し、さらにエステル化反応と遊離脂肪酸の回収とを繰り返す。
【００２４】
本発明はさらに、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及び５，８，１１−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、５，８，１１−エイコサトリエン酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼにより加水分解して６，９−オクタデカジエン酸を除去し、反応後グリセリドを回収し、このグリセリド画分を加水分解し、これにより生成した遊離脂肪酸を脂肪族アルコールと、５，８，１１−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパ−ゼとによりエステル化し、反応後遊離脂肪酸を回収する、ことを特徴とする５，８，１１−エイコサトリエン酸を高濃度に含有する遊離脂肪酸混合物の製造方法を提供する。
【００２５】
好ましくは、前記５，８，１１−エイコサトリエン酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパーゼは、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.)のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri)のリパ−ゼである。
【００２６】
好ましくは、前記５，８，１１−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパ−ゼは、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼ、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパーゼ、又はシュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri)のリパーゼである。
好ましくは、前記のエステル化反応後、遊離脂肪酸を回収し、さらにエステル化反応と遊離脂肪酸の回収とを繰り返す。
【００２７】
本発明はさらに、５，８，１１−エイコサトリエン酸を２０％以上好ましくは３０％以上含有するグリセリド、５，８，１１−エイコサトリエン酸を３０％以上、及び６，９−オクタデカジエン酸を１５％以上含有することを特徴とするグリセリド、５，８，１１−エイコサトリエン酸含量を３０％以上、好ましくは３５％以上含有し、６，９−オクタデカジエン酸含量が２０％以下であることを特徴とするグリセリド、６，９−オクタデカジエン酸を２０％以上、好ましくは３０％以上含有するグリセリド、５，８，１１−エイコサトリエン酸を２０％以上含有する遊離脂肪酸混合物、及び６，９−オクタデカジエン酸を２０％以上含有する遊離脂肪酸混合物を提供する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
本発明において原料として油脂は、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及びミード酸を含有する９０％以上トリグリセリドの油脂である。該油脂としては、動物の軟骨から抽出する油脂や、Mortiellela（モルティエラ)属等の微生物より得られる油脂等が挙げられ、好ましくはモルティエレラ亜属の微生物より得られる油脂が用いられる。
【００２９】
なお微生物は野生株であっても変異株であっても遺伝子組み換え株であっても構わない。またモルティエレラ属等の微生物の脂肪酸合成に関与する酵素の遺伝子を組み込んだ微生物や植物から得られる油脂であってもよい。より具体的には特開平 5-91888号公報に記載の方法によって製造されたミード酸17％、６，９−オクタデカジエン酸14％及びオレイン酸35％を含有する９０％以上トリグリセリドの油脂(以下「SUN−TGM17」という)を用いることができる。
【００３０】
６，９−オクタデカジエン酸とミード酸とを分別して高濃度化する方法を以下に示すスキームを使って説明する。まず、少なくともオレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸及びミード酸を含有する油脂を、ミード酸よりも６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパ−ゼで加水分解することにより６，９−オクタデカジエン酸を遊離せしめる（加水分解１）。その結果、遊離脂肪酸画分では６，９−オクタデカジエン酸含量が高くなりミード酸含量が低くなる。得られた遊離脂肪酸画分を、６，９−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパ−ゼによりエステル化することにより、６，９−オクタデカジエン酸含量がさらに高い遊離脂肪酸混合物を製造することができる。
【００３１】
一方、加水分解１によって得られるグリセリド画分では、６，９−オクタデカジエン酸含量が低くなりミード酸含量が高くなる。このグリセリド画分を、ミード酸に作用しにくいリパーゼにより加水分解する（加水分解２）。その結果、グリセリド画分ではさらにミード酸含量が高くなる。また加水分解１によって得られたグリセリド画分を加水分解（酵素を用いた加水分解またはケン化分解）するか、あるいは６，９−オクタデカジエン酸よりもミード酸によく作用するリパ−ゼにより加水分解する（加水分解３）。得られた遊離脂肪酸画分中のミード酸含量は高く、６，９−オクタデカジエン酸含量は低い。得られた遊離脂肪酸画分をミード酸に作用しにくいリパ−ゼによりエステル化することにより、ミード酸含量がさらに高い遊離脂肪酸画分を製造することができる。
【００３２】
【表１】

【００３３】
上記加水分解１において、使用する油脂はオレイン酸、ミード酸及び６，９−オクタデカジエン酸を多く含んでいる。したがって、ミード酸にはあまり作用せず、６，９−オクタデカジエン酸によく作用する酵素を触媒として用いるとミード酸を未分解グリセリド中に濃縮することができる。
【００３４】
この脂肪酸特異性を持ったリパ−ゼであれば、微生物、動植物などいずれの起源の酵素であってもよく、例えばシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa) のリパーゼ（例えば、東洋紡績社製「LPL」）、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパーゼ（例えば、名糖産業（株）社製「Lipase PL」）、シュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri) のリパーゼ（例えば、名糖産業（株）社製「Lipase TL」）が利用できる。特にシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa) のリパーゼ（例えば、東洋紡（株）社製「LPL」）はミード酸に対する作用性と６，９−オクタデカジエン酸に対する作用性の差がはっきりしているため好ましい。
【００３５】
該加水分解については、反応系中の油脂の量として１〜90重量％、好ましくは10〜80重量％であり、水分量は１〜99重量％、好ましくは20〜90重量％である。該油脂／水（重量比）としては0.01〜9.0で、好ましくは0.1〜4.0である。
加水分解用リパーゼの使用形態は特に限定されず、セライト、イオン交換樹脂、多孔性の担体、セラミックス、膜などに固定化して使用してもよいが、そのまま用いるのが好ましい。
【００３６】
リパーゼの添加量は反応液１ｇに対して１〜10000ユニットが好ましく、さらには10〜5000である。ここでの１ユニットとは、オリーブ油を基質とし、１分間に１μモルの脂肪酸が生成するに必要なリパーゼ量を示す。
加水分解反応は、通常行われている油脂の加水分解反応の条件で行ってよい。10〜70℃の温度条件で１〜72時間静置、振盪又は攪拌することにより加水分解を行う。反応効率を高めるために攪拌などにより油滴を細かく分散させる手段を採用すればより効果的である。
【００３７】
該加水分解の反応後、常法により、遊離脂肪酸画分とグリセリド画分を回収する。例えば加水分解反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出してグリセリド画分を回収し、水層画分にｐＨを酸性に戻した後、ヘキサン抽出により遊離脂肪酸を回収する。このヘキサン抽出法以外に、蒸留、膜分離、クロマトグラフィー等も有効である。
【００３８】
なおモルティエレラ亜属の微生物より得られる油脂には、オレイン酸、６，９−オクタデカジエン酸、ミード酸の他に、ステアリン酸やパルミチン酸、１１−エイコサエン酸（20:1n-9）、８，１１−エイコサジエン酸（20：2, n-9）や炭素数２２又は２４の飽和脂肪酸が含まれているため、加水分解反応後回収した遊離脂肪酸画分には、炭素数１６〜２４の飽和脂肪（以下「長鎖飽和脂肪酸」という）が含まれている。そこでエステル化を行う前に、該遊離脂肪酸画分から例えば尿素包括法により長鎖飽和脂肪酸を除去することにより反応温度を下げることができるので好ましい。
【００３９】
本発明において、エステル化で用いるリパーゼは、６，９−オクタデカジエン酸及び又はミード酸に作用しにくいリパーゼであればいずれの起源の酵素であってもよく、例えばキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名シリンドラシエ（cylindracea））のリパ−ゼ（例えば、名糖産業（株）社製「Lipase OF」）、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパーゼ（例えば、東洋紡績社製「LPL」）、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパーゼ（例えば、名糖産業（株）社製「Lipase PL」）、シュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri) のリパーゼ（名糖産業（株）社製「Lipase TL」）などが効果的であるが、特にキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa) のリパ−ゼ（名糖産業（株）社製「Lipase OF」）が好ましい。
【００４０】
該リパーゼによりエステル化するとき、基質として使用するアルコールはいずれの種類であってもよいが、脂肪族アルコール、特に中〜長鎖の脂肪族アルコールが有効である。加えるアルコールの量は脂肪酸に対して0.1〜20モル等量、好ましくは0.2〜３モル等量、水分量は０〜90重量％、好ましくは５〜80重量％、リパーゼの添加量は反応液１ｇ当たり１〜10000ユニット、好ましくは20〜1000ユニットである。反応温度は10〜60℃、そして反応時間は１〜72時間に適宜設定するとよい。
【００４１】
また、反応形態は静置、攪拌、振盪などどの方式を採用してもかまわないが、反応液の分散状態を高めた方が反応は効率よく進行する。エステル化反応の産物であるワックスエステル、未反応の脂肪酸、および未反応のアルコールの分離にはヘキサン抽出、蒸留法、クロマトグラフィー、尿素包括法などいずれの方法を採用してもよいが、未反応アルコールの分離には蒸留法が、そしてワックスエステルの分離には蒸留法と尿素包括法の組み合わせが有効である。
【００４２】
エステル化反応後、例えばヘキサン抽出により未反応の遊離脂肪酸を回収することができる。
さらにエステル化反応後、未反応の遊離脂肪酸を回収し、エステル化反応及び遊離脂肪酸の回収を繰り返すことにより、６，９−オクタデカジエン酸又はミード酸の含量を高めることもできる。
【００４３】
加水分解１によって得られたミード酸含量の高いグリセリドからミード酸を高濃度に含有する遊離脂肪酸混合物を得るためには、６，９−オクタデカジエン酸よりミード酸によく作用するリパ−ゼで加水分解するとより効果的である。用いるリパ−ゼはミード酸に作用しやすいものであれば、微生物、動植物などどの起源の酵素であってもよく、例えばセラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）(例えば、田辺製薬（株）社製)の酵素が利用できる。
【００４４】
しかし、脂肪酸に対して特異性を持たない酵素、例えばシュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）のリパ−ゼ（例えば、天野製薬（株）社製；「Lipase PS」、昭和電工社製；「LIPOSAM」)であってもよいし、高い加水分解率が得られる酵素、例えばキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼ（例えば、名糖産業（株）社製「Lipase OF」）、ペニシリウム・アベアナム（Penicillium abeanam）のリパ−ゼであってもよい。さらに、アルカリ性で行うケン化分解を採用してもよい。
【００４５】
このような６，９−オクタデカジエン酸とミード酸を分別して高濃度化する方法を採用することにより、例えばミード酸含量が１０％以下で６，９−オクタデカジエン酸含量が２０％以上の遊離脂肪酸混合物、好ましくはミード酸含量が１０％以下で６，９−オクタデカジエン酸含量が２５％以上の遊離脂肪酸混合物、より好ましくはミード酸含量が２０％以下で６，９−オクタデカジエン酸含量が４０％以上の遊離脂肪酸混合物、最も好ましくはミード酸含量が２５％以下で６，９−オクタデカジエン酸含量が５０％以上の遊離脂肪酸混合物を得ることができる。
【００４６】
また、例えばミード酸含量が２０％以上で６，９−オクタデカジエン酸含量が１５％以下の遊離脂肪酸混合物、好ましくはミード酸含量が３５％以上で６，９−オクタデカジエン酸含量が２０％以下の遊離脂肪酸混合物、より好ましくはミード酸含量が５０％以上で６，９−オクタデカジエン酸含量が２５％以下の遊離脂肪酸混合物、最も好ましくはミード酸含量が６０％以上で６，９−オクタデカジエン酸含量が２５％以下の遊離脂肪酸混合物を得ることもできる。
【００４７】
一方、加水分解１によって得られるグリセリド画分では、６，９−オクタデカジエン酸含量が低くなりミード酸含量が高くなる。しかしこれだけでは、ミード酸の含量を30％以上に高めることは困難である。グリセリド画分のミード酸含量を高めるためには、ミード酸に作用しにくいリパ−ゼを触媒として用い、グリセリドの加水分解を繰り返すとよい。繰り返し加水分解を行うときには、反応系に蓄積しいる脂肪酸を除去すると効果的である。反応液から遊離脂肪酸を除去するには、いかなる方法を採用してもよいが、ヘキサン抽出、薄膜蒸留、水蒸気蒸留などが有効である。
【００４８】
この反応には、ミード酸より６，９−オクタデカジエン酸によく作用するリパ−ゼを選択すればよく、その起源は微生物、動植物などいかなる酵素でもよい。例えば、最初の加水分解反応（加水分解１）ではシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパ−ゼ(東洋紡績社製；「LPL」)を用い、２回目の加水分解（加水分解２）では同じ酵素を触媒として用いてもよいし、他の酵素、例えばキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼ（名糖産業（株）社製「Lipase OF」）を触媒として用いてもよい。なおこのリパーゼはわずかであるがミード酸より６，９−オクタデカジエン酸によく作用する。
【００４９】
したがって、「Lipase OF」を触媒として用いたとき、加水分解率を50％以上に制御するとミード酸を優先的に濃縮できる。加水分解率は濃縮したい脂肪酸の種類および反応条件により異なるため、目的に応じて適宜設定すればよく、特に規定されるものではない。なお、加水分解率の制御は酵素量、反応時間、反応温度、攪拌速度などいずれかの方法またはその組み合わせによって制御することができる。
【００５０】
例えばSUN-TGM17を出発原料として、最初にシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパ−ゼ(東洋紡績社製；「LPL」)で加水分解し、次にキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼを加水分解率を50％以上に制御すると、ミード酸含量37％、６，９−オクタデカジエン酸の含量14％のグリセリドを製造することができる。ただしミード酸および６，９−オクタデカジエン酸の最終含有量は、原料として用いた油脂中のそれぞれの脂肪酸の含量が多ければそれだけ多くなる。
【００５１】
また加水分解率を低下させて製造すれば、ミード酸含有率は20％程度にしか向上させることができないが、ミード酸含有グリセリドの回収率を向上することができる。この様に用途に従って、高価でも高い含有率のミード酸が含有グリセリドの製造、比較的安価で比較的低含有量のミード酸含有グリセリドも任意に製造することができる。
次に、グリセリド中にミード酸および６，９−オクタデカジエン酸を濃縮する方法を説明する。
【００５２】
ミード酸17％、６，９−オクタデカジエン酸14％、オレイン酸35％のトリグリセリド（SUN−TGM17）、5〜90%の水、および反応混液１ｇ当たり１〜10000単位(1単位はオリーブ油を基質として１分間に１マイクロモルの遊離脂肪酸を生成する酵素量)のリパ−ゼからなる反応混液を10〜50℃で１〜72時間加水分解する。触媒として用いるリパ−ゼは目的とするｎ−９系不飽和脂肪酸に作用しにくくオレイン酸には比較的作用しやすいものであれば、微生物、動植物などの起源の酵素であってもよく、例えばキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa) (名糖産業(株)製; Lipase OF)、ゲオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum）などの酵素が好ましい。このリパ−ゼはわずかであるがミード酸より６，９−オクタデカジエン酸によく作用するが、加水分解率を50%以下に制御することによりミード酸と６，９−オクタデカジエン酸を濃縮することができる。
【００５３】
酵素は遊離の状態で使用してもよいし、セオライト、イオン交換樹脂、セラミックス、膜などに固定化して使用してもよい。反応形態は静置するだけでもよいが、反応効率を高めるために攪拌、振盪などにより油滴を細かく分散させる手段を採用すればより効果的である。この加水分解反応により、ミード酸を30％以上、より具体的には30〜35%、６，９−オクタデカジエン酸を15％以上、より具体的には15〜22%に濃縮することができる。
【００５４】
次にグリセリド中にミード酸だけを１回で濃縮する方法を説明する。
例えばキャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea）のリパ−ゼを用いSUN−TGM17の加水分解率を75%以上に制御することにより、ミード酸含量３５％、６，９−オクタデカジエン酸の含量１５％のグリセリドを製造することができる。ただしミード酸および６，９−オクタデカジエン酸の最終含有量は、原料として用いた油脂中のそれぞれの脂肪酸の含量が多ければそれだけ多くなる。またグリセリド中に６，９−オクタデカジエン酸を濃縮する方法を説明する。
【００５５】
６，９−オクタデカジエン酸にはあまり作用せず、オレイン酸およびミード酸によく作用する酵素を触媒として用いると６，９−オクタデカジエン酸を未分解グリセリド中に濃縮することができる。この脂肪酸特異性を持ったリパ−ゼであれば、微生物、動植物などいずれの起源の酵素であってもよく、例えばキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名シリンドラシア（cylindracea））のリパ−ゼ（例えば、Lipase OF；名糖産業（株）社製）、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）のリパーゼ（例えば、Lipase AK; 天野製薬（株）社製)、リゾプス・スピーシーズ(Rhizopus sp.）のリパ−ゼ（例えば、Lipase UL；名糖産業（株）社製）、フザリウム・ヘトロスポラ(Fusarium hetrosporus)のリパ−ゼ、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescence）のリパ−ゼ（例えば、田辺製薬（株）社製）、ペニシリウム・アベアヌム(Penicillium abeanum）のリパ−ゼ（例えば、栗田工業（株）社製）などが好ましい。これらの酵素を用いて、SUN−TGM17を上述した方法によって加水分解することにより、ミード酸と６，９−オクタデカジエン酸がほぼ同じか、６，９−オクタデカジエン酸の含量がミード酸の含量より高いグリセリドを製造することができる。
【００５６】
実施例１．
SUN−TGM17を各種のリパ−ゼで加水分解した。50ml容量のバイアル瓶に、SUN−TGM17 3g、水3g 、各種のリパ−ゼ300〜600単位からなる反応液を30℃で16時間、攪拌(500rpm)しながらインキュベートした。加水分解率は反応後の酸価と原料のケン化価から算出した。反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出し未分解グリセリドを抽出する。水層のpHを塩酸で酸性に戻し、ヘキサン抽出により遊離脂肪酸を回収した。得られたグリセリド画分と脂肪酸画分に含まれている脂肪酸の組成は、それぞれの画分をNa−メチレート, 塩酸飽和メタノールでメチル化し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。結果を表２及び表３に示す。
【００５７】
【表２】

【００５８】
【表３】

【００５９】
Lipase OF；名糖産業（株）社製、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名シリンドラシエ（cylindracea））のリパ−ゼ
Lipase PL；名糖産業（株）社製、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパ−ゼ
Lipase TL；名糖産業（株）社製、シュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパ−ゼ
Lipase SL；名糖産業（株）社製、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）のリパ−ゼ
Lipase QLM；名糖産業（株）社製、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパ−ゼ
【００６０】
Lipase UL；名糖産業（株）社製、リゾープス・スピーシーズ（Rhizopus sp.)のリパ−ゼ
Lipase AL；名糖産業（株）社製、アクロモバクター・スピーシーズ（Achromobacter sp.)のリパ−ゼ
Lipase PS；天野製薬（株）社製、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）のリパ−ゼ
Lipase AK；天野製薬（株）社製、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）のリパ−ゼ
Lipase AP；天野製薬（株）社製、アスペルギルス・ニガー（Aspergilus niger)のリパ−ゼ
【００６１】
Rhizopus；田辺製薬（株）社製、リゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）のリパ−ゼ
Fusarium；フザリウム・ヘトロスポルス（Fusarium hetrosporus）のリパ−ゼ KWI-56；栗田工業（株）社製、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.)のリパ−ゼ
LPL；東洋紡績社製、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパ−ゼ
【００６２】
Serratia；田辺製薬（株）社製、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens)のリパ−ゼ
Pen.；栗田工業（株）社製、ペニシリウム・アベアヌム（Penicillium abeanum)のリパ−ゼ
lipase OF（名糖産業（株）社製)で反応させたものは、グリセリド画分のミード酸の全脂肪酸に対する含有率が反応前の17％から32.48％に増加した。
【００６３】
lipase AK（名糖産業（株）社製)で反応させたものは、グリセリド画分の18:2n-9の全脂肪酸に対する含有率が反応前の14.3%から20.4%に増加した。
さらに、lipase-PL（名糖産業（株）社製)、 lipase-TL（名糖産業（株）社製)、lipase-AL（名糖産業（株）社製) 、lipase-AP（天野製薬（株）社製)、KWI56（栗田工業（株）社製)、LPL（東洋紡績社製)で反応させたものは、原料のトリグリセリドのSUN-TGM1７中の18:2n-9が14.3％に対して遊離脂肪酸画分の18:2n-9の全脂肪酸に対する含有率がそれぞれ、20.9％、21.7％、19.7％、16.9％、16.2％、17.3％と増加した。
【００６４】
実施例２．
キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名シリンドラシエ（cylindracea））のリパ−ゼ（「lipase OF」；名糖産業（株）社製）を用いてSUN-TGM17を加水分解した。50ml容量のバイアル瓶に、SUN-TGM17 3g、水3g、種々の量のリパ−ゼからなる反応液を30℃で16時間、攪拌(500rpm)しながらインキュベートした。加水分解率は反応後の酸価と原料のケン化価から算出した。
【００６５】
反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出し未分解グリセリドを抽出する。水層のpHを塩酸で酸性に戻し、ヘキサン抽出により遊離脂肪酸を回収した。得られたグリセリド画分と脂肪酸画分に含まれている脂肪酸の組成は、それぞれの画分をNa−メチレート, 塩酸飽和メタノールでメチル化し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。結果を表４に示す。
【００６６】
【表４】

【００６７】
キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名シリンドラシエ（cylindracea））のリパ−ゼはパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸にはよく作用し、６，９−オクタデカジエン酸やミード酸には作用しにくい。さらに、６，９−オクタデカジエン酸とミード酸に対する作用性を比較するとミード酸により作用しにくい。したがって、加水分解率が低いときには６，９−オクタデカジエン酸とミード酸の両方ともグリセリド画分に濃縮される。しかし、加水分解率を高めると、グリセリド画分の６，９−オクタデカジエン酸の含量は低下する。
【００６８】
実施例３．
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパ−ゼ（「LPL」；東洋紡績社製）を用いてSUN-TGM17を加水分解した。50ml容量のバイアル瓶に、SUN-TGM17 3g、水3g、種々の量のリパ−ゼからなる反応液を30℃で16時間、攪拌(500rpm)しながらインキュベートした。加水分解率は反応後の酸価と原料のケン化価から算出した。反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出し未分解グリセリドを抽出する。水層のpHを塩酸で酸性に戻し、ヘキサン抽出により遊離脂肪酸を回収した。得られたグリセリド画分と脂肪酸画分に含まれている脂肪酸の組成は、それぞれの画分をNa−メチレート, 塩酸飽和メタノールでメチル化し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。結果を表５に示す。
【００６９】
【表５】

【００７０】
LPLはミード酸より６，９−オクタデカジエン酸によく作用する。したがって、加水分解率が低いときには遊離脂肪酸中の６，９−オクタデカジエン酸の含量がより高く、ミード酸の含量はより低くなる。また、グリセリド画分の６，９−オクタデカジエン酸の含量とミード酸の含量は、それぞれ減少および増加するが、原料油と比べて大きな変化は期待できない。一方、加水分解率を高く制御すると、脂肪酸画分中の６，９−オクタデカジエン酸とミード酸含量は原料油の組成に近くなる。また、グリセリド画分の６，９−オクタデカジエン酸の含量はより低く、ミード酸含量はより高くなる。これより、６，９−オクタデカジエン酸およびミード酸の分別濃縮においては酵素の種類だけでなく、反応条件特に加水分解率にも起因することを示している。
【００７１】
実施例４．
６，９−オクタデカジエン酸含量が高く、ミード酸含量の低い遊離脂肪酸混液を多段酵素反応により製造した(表６)。第１段階では１００ｇのSUN-TGM17に１００ｇの水と反応混液１ｇ当たり50 UのLPLを加え、30℃で16時間攪拌(500rpm)しながらインキュベートした(加水分解率33.2%)。反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出し、グリセリドを回収した(59.8 g)。水層画分のpHを塩酸で酸性に戻した後、ヘキサン抽出により遊離脂肪酸を回収した(35.2 g)。遊離脂肪酸画分には長鎖の飽和脂肪酸が含まれており、30℃で固体状である。そこで、飽和の脂肪酸を尿素包括法により除去した。
【００７２】
遊離脂肪酸35.2ｇに尿素35.2ｇ、水4.6ｇ、メタノール176ｇを加え55℃で攪拌しながら溶解させる。溶液の温度を徐々に下げ、5℃で攪拌しながら１晩放置する。沈澱物を濾紙で濾別し、上澄に1.5倍容量の0.2 Nの塩酸を加えてからヘキサン抽出した。尿素包括法により長鎖飽和脂肪酸が除去され、30℃で液体状の脂肪酸混液25.1ｇが得られた。この脂肪酸混液に水10.5ｇ、ラウリルアルコール 16.7ｇ(脂肪酸に対して１モル等量)、キャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea）のリパ−ゼであるlipase OF(名糖産業（株）社製）15700 Uを加え、30℃で16時間エステル化反応を行った(エステル化率は42.7%)。
【００７３】
反応後、ヘキサン抽出により未反応の脂肪酸13.7ｇを得、６，９−オクタデカジエン酸の含量を46.8%まで高めることができた。この６，９−オクタデカジエン酸の含量をさらに高めるために、回収した脂肪酸に水4.6ｇ、ラウリルアルコール4.5ｇ(脂肪酸に対して0.5モル等量)、キャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea）のリパ−ゼであるlipase OF(名糖産業（株）社製）12300 Uを加え、30℃で16時間エステル化反応を行った（エステル化率は21.9%)。反応後、ヘキサン抽出により未反応の脂肪酸11.5ｇを得た。得られた脂肪酸画分中の６，９−オクタデカジエン酸の含量は54%でミード酸含量は19.9%であった。
【００７４】
【表６】

【００７５】
実施例５．
実施例４で得られた59.8ｇのグリセリドをケン化分解し、53.5ｇの遊離脂肪酸を得た。この脂肪酸を原料としてミード酸の濃縮を試みた(表７)。脂肪酸混液53.5ｇに尿素53.5ｇ、水7.1ｇ、メタノール268mlを加え55℃で攪拌しながら溶解させた後、溶液の温度を徐々に下げ、5℃で攪拌しながら１晩放置した。生じた沈澱物を濾紙で濾別し、上澄に1.5倍容量の0.2 Nの塩酸を加えてからヘキサン抽出した。
【００７６】
この尿素包括により長鎖飽和脂肪酸が除去され、30℃で液体状の脂肪酸混液39.3ｇが得られた。この脂肪酸混液に水16.4ｇ、ラウリルアルコール 26.1ｇ(脂肪酸に対して１モル等量)、キャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea)リパ−ゼであるlipase OF(名糖産業（株）社製）24500 Uを加え、30℃で16時間エステル化反応を行った(エステル化率は46.6%)。
【００７７】
反応後、ヘキサン抽出により未反応の脂肪酸19.9ｇを得、ミード酸の含量を54.7%まで高めることができた。ミード酸の含量をさらに高めるために、回収した脂肪酸に水6.6ｇ、ラウリルアルコール6.6ｇ(脂肪酸に対して0.5モル等量)、キャンディダ・シリンドラシエ(Candida cylindracea)のリパ−ゼであるlipase OF(名糖産業（株）社製）9900 Uを加え、30℃で16時間エステル化反応を行った（エステル化率は14.9%)。反応後、ヘキサン抽出により未反応の脂肪酸15.2ｇを得た。得られた脂肪酸画分中のミード酸の含量は60.2%で６，９−オクタデカジエン酸の含量は20.1%であった。
【００７８】
【表７】

【００７９】
実施例６．
実施例４と同じ条件でSUN-TGM17をシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパ−ゼ(「LPL」；東洋紡績社製）で加水分解し61.5ｇのグリセリド画分（加水分解率31.7％）を得た。この画分にはミード酸が23.0％、６，９−オクタデカジエン酸が10.2％含まれていた。このグリセリドをキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名シリンドラセー(cylindracea））のリパ−ゼ（「lipase OF」；名糖産業（株）社製)で加水分解し、ミード酸含量の高いグリセリドを製造した(表８)。
【００８０】
グリセリド61.5ｇに水61.5ｇ、上記と同様のキャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼ8600Uを加え30℃で16時間、攪拌(500 rpm)しながら加水分解した(加水分解率は63.4%)。反応後、ヘキサン抽出により20.7ｇのグリセリド画分を回収した。このグリセリド画分のミード酸と６，９−オクタデカジエン酸の含量は、それぞれ36.9%、14.2%であった。また２回の加水分解を行なった後、得られたグリセリド画分のトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの重量比は88：10：２であった。
【００８１】
【表８】

【００８２】
加水分解1：シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパ−ゼ（「LPL」；東洋紡績社製）
加水分解2：キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)（旧名 cylindracea）のリパ−ゼ（「lipase OF」；名糖産業（株）社製)

Claims

少なくともオレイン酸、6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる5,8,11−エイコサトリエン酸よりも6,9−オクタデカジエン酸に作用するリパーゼにより加水分解して６，９−オクタデカジエン酸を除去し、反応後グリセリドを回収し、このグリセリド画分を、5,8,11−エイコサトリエン酸に作用しにくいキャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）のリパーゼで加水分解し、反応後グリセリドを回収することを特徴とする、5,8,11−エイコサトリエン酸を脂肪酸全量に対して30重量％以上含有し、6,9−オクタデカジエン酸含量が脂肪酸全量に対して20重量％以下であるグリセリドの製造方法。
前記キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼを、加水分解率50％以上で用いることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
少なくともオレイン酸、6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）のリパーゼ、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパ−ゼにより加水分解し、反応後グリセリド画分を回収する、ことを特徴とする脂肪酸全量に対して15重量％以上の6,9−オクタデカジエン及び脂肪酸全量に対して30重量％以上の5,8,11−エイコサトリエン酸を含有するグリセリドの製造方法。
少なくともオレイン酸、6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa)のリパ−ゼ、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ(Alcaligenes sp.) のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ(Pseudomonas stutzeri)のリパーゼから選択される5,8,11−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパーゼにより加水分解してオレイン酸及び6,9−オクタデカジエン酸を除去し、反応後グリセリドを回収する、ことを特徴とする脂肪酸全量に対して20重量％以上の5,8,11−エイコサトリエン酸を含有するグリセリドの製造方法。
少なくともオレイン酸、6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）のリパーゼ、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる6,9−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパーゼにより加水分解してオレイン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を除去し、反応後グリセリド画分を回収する、ことを特徴とする脂肪酸全量に対して20重量％以上の6,9−オクタデカジエンを含有するグリセリドの製造方法。
少なくともオレイン酸、6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる5,8,11−エイコサトリエン酸よりも6,9−オクタデカジエン酸に作用するリパーゼにより加水分解して6,9−オクタデカジエン酸を遊離せしめ、遊離脂肪酸を回収し、この遊離脂肪酸画分を脂肪族アルコールと、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）のリパーゼ、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる6,9−オクタデカジエン酸に作用しにくいリパーゼ、によりエステル化し、反応後遊離脂肪酸を回収することを特徴とする、6,9−オクタデカジエン酸を脂肪酸全量に対して20重量％以上含有する遊離脂肪酸混合物の製造方法。
前記エステル化反応後、遊離脂肪酸を回収し、さらにエステル化反応と遊離脂肪酸の回収とを繰り返すことを特徴とする、請求項６記載の製造方法。
少なくともオレイン酸、6,9−オクタデカジエン酸及び5,8,11−エイコサトリエン酸を含有する油脂を、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる5,8,11−エイコサトリエン酸よりも6,9−オクタデカジエン酸に作用するリパーゼにより加水分解して6,9−オクタデカジエン酸を除去し、反応後グリセリドを回収し、このグリセリド画分を加水分解し、これにより生成した遊離脂肪酸を、脂肪族アルコールと、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）のリパーゼ、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼ、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）のリパーゼ又はシュードモナス・スツッエリ（Pseudomonas stutzeri）のリパーゼから選ばれる5,8,11−エイコサトリエン酸に作用しにくいリパーゼによりエステル化し、反応後遊離脂肪酸を回収することを特徴とする、5,8,11−エイコサトリエン酸を脂肪酸全量に対して20重量％以上含有する遊離脂肪酸混合物の製造方法。
前記のエステル化反応後、遊離脂肪酸を回収し、さらにエステル化反応と遊離脂肪酸の回収とを繰り返すことを特徴とする、請求項８記載の製造方法。