JP2002537442A - 海産油のリパーゼ触媒したエステル化 - Google Patents
海産油のリパーゼ触媒したエステル化Info
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Abstract
(57)【要約】
遊離酸としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物を、減圧下にしかも本質的に有機溶剤無含有条件下にリパーゼ触媒の存在下でグリセロールでエステル化して、ＥＰＡおよびＤＨＡの少なくとも１種で富化された遊離脂肪酸フラクションを形成する。
Description
【０００１】
本発明は海産油（marine oil）のリパーゼ触媒したエステル化に関する。
【０００２】
海産油を含めて種々の種類の油製品を、リパーゼ触媒の助けをかりて精製する
ことは技術的に周知であり、用いた精製条件下でリパーゼ触媒の特異性は所望の
製品の回収を促進する。
ことは技術的に周知であり、用いた精製条件下でリパーゼ触媒の特異性は所望の
製品の回収を促進する。
【０００３】 例えばPCT/WO95/00050号では、本出願人は、エステル交換反応条件下にトリグ
リセリドの形で飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を、飽和脂肪
酸およびモノ不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するのに活性なリパー
ゼの存在下に実質的に無水の条件下でエタノールの如きC1〜6アルコールで処理
する方法を開示している。好ましいリパーゼ、シュードモナス属（Pseudomonas
sp.）リパーゼ(PSL）および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）リパーゼ（PFL
）を用いると、海産油供給源から、グリセリドの形で工業上および医療上重要な
オメガ-3ポリ不飽和脂肪酸ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸Ｃ20：5）およびＤＨ
Ａ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ22：6）の70重量％以上を含有する濃厚液を製造す
ることができた。
リセリドの形で飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を、飽和脂肪
酸およびモノ不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するのに活性なリパー
ゼの存在下に実質的に無水の条件下でエタノールの如きC1〜6アルコールで処理
する方法を開示している。好ましいリパーゼ、シュードモナス属（Pseudomonas
sp.）リパーゼ(PSL）および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）リパーゼ（PFL
）を用いると、海産油供給源から、グリセリドの形で工業上および医療上重要な
オメガ-3ポリ不飽和脂肪酸ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸Ｃ20：5）およびＤＨ
Ａ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ22：6）の70重量％以上を含有する濃厚液を製造す
ることができた。
【０００４】 多数のリパーゼ触媒した精製法ではグリセロールを利用した。
【０００５】 例として日本特許公開62-91188号はポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）のグリセリ
ドの製造方法を教示しており、該方法では熱安定性リパーゼの存在下に遊離酸ま
たはエステルとしてのＰＵＦＡをグリセロールと反応させるものである。得られ
るグリセリド生成物の脂肪酸組成は原料ＰＵＦＡにおけるのと実質的に同じであ
る。
ドの製造方法を教示しており、該方法では熱安定性リパーゼの存在下に遊離酸ま
たはエステルとしてのＰＵＦＡをグリセロールと反応させるものである。得られ
るグリセリド生成物の脂肪酸組成は原料ＰＵＦＡにおけるのと実質的に同じであ
る。
【０００６】 WO91/16443号はＰＵＦＡをトリグリセリドに転化する方法を開示している。リ
パーゼ、特にカンジダ アンタークチカ（Candida antarctica）の存在下に本質
的に無水の有機溶剤無含有の上昇した温度条件下に水および揮発性アルコールを
連続的に除去しながら、遊離脂肪酸例えばＥＰＡとＤＨＡとの混合物を大体化学
量論量のグリセロールと反応させるものである。この方法ではＥＰＡとＤＨＡと
の間には識別が殆んどないかまたは全くないことを本出願人は気付いている。
パーゼ、特にカンジダ アンタークチカ（Candida antarctica）の存在下に本質
的に無水の有機溶剤無含有の上昇した温度条件下に水および揮発性アルコールを
連続的に除去しながら、遊離脂肪酸例えばＥＰＡとＤＨＡとの混合物を大体化学
量論量のグリセロールと反応させるものである。この方法ではＥＰＡとＤＨＡと
の間には識別が殆んどないかまたは全くないことを本出願人は気付いている。
【０００７】 Int. J. Food Sci. Technol. (1992） 27, 73~76の論文では、リーおよびモー
リン（Lie and Molin）は、ＭＭＬを含めて３種の相異なるリパーゼを用いて魚
油脂肪酸濃厚物をグリセロールでエステル化することを記載している。用いた条
件（５％の水）下では、ＤＨＡ−枯渇した遊離酸フラクション（原料の約50％）
と、元の魚油濃厚物と同じＥＰＡ含量を有するグリセリドフラクションとを得た
。即ち若干の選択性が見られる。
リン（Lie and Molin）は、ＭＭＬを含めて３種の相異なるリパーゼを用いて魚
油脂肪酸濃厚物をグリセロールでエステル化することを記載している。用いた条
件（５％の水）下では、ＤＨＡ−枯渇した遊離酸フラクション（原料の約50％）
と、元の魚油濃厚物と同じＥＰＡ含量を有するグリセリドフラクションとを得た
。即ち若干の選択性が見られる。
【０００８】 ミルネス（Myrnes）等によるJAOCS, 72巻、11号（1995）の論文では、海産油
の有機溶剤無含有、リパーゼ触媒したグリセロール分解を開示している。種々の
相異なるリパーゼを試験し、反応は比較的高含量（3.6％）の水の存在下に低温
（12℃又はそれ以下）で操作している。得られるモノグリセリドフラクションを
分析すると若干の場合には不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸との間で良好な選択性を示
すが、個々のＰＵＦＡ同志間では有意な差違は示さなかった。
の有機溶剤無含有、リパーゼ触媒したグリセロール分解を開示している。種々の
相異なるリパーゼを試験し、反応は比較的高含量（3.6％）の水の存在下に低温
（12℃又はそれ以下）で操作している。得られるモノグリセリドフラクションを
分析すると若干の場合には不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸との間で良好な選択性を示
すが、個々のＰＵＦＡ同志間では有意な差違は示さなかった。
【０００９】 JAOCS、73巻、11号（1996）、1409〜1414においてムーア（Moore）等は、カン
ジダ ルゴサ（Candida rugosa）リパーゼ（CRL）の存在下に魚油を加水分解し
て、別個のＤＨＡ富化フラクションとＥＰＡ−富化フラクションとを製造するこ
とを教示している。
ジダ ルゴサ（Candida rugosa）リパーゼ（CRL）の存在下に魚油を加水分解し
て、別個のＤＨＡ富化フラクションとＥＰＡ−富化フラクションとを製造するこ
とを教示している。
【００１０】 続いて、ＥＰＡ−富化遊離脂肪酸を、リゾムコール ミエヘイ（Rhizomucor m
iehei）リパーゼ（ＭＭＬ）の存在下でグリセロールで再エステル化する。
iehei）リパーゼ（ＭＭＬ）の存在下でグリセロールで再エステル化する。
【００１１】 マクネイル（McNeill）等によるJAOCS、73巻、11号（1996）、1403〜1407の論
文では、水を連続的に除去しながらn-3ＰＵＦＡ濃厚物を55℃で化学量論量のグ
リセロールでMML−触媒したエステル化することを開示している。得られるトリ
グリセリドフラクションは供給原料と同じ程度のＤＨＡを含有した。
文では、水を連続的に除去しながらn-3ＰＵＦＡ濃厚物を55℃で化学量論量のグ
リセロールでMML−触媒したエステル化することを開示している。得られるトリ
グリセリドフラクションは供給原料と同じ程度のＤＨＡを含有した。
【００１２】 最後に、WO96/37586号およびWO96/37587号を挙げる。WO96/37586号の実施例３
は、チリ産の魚油から得られしかも25％のＥＰＡと18％のＤＨＡとを含有する（
ナトリウム塩の溶剤分別後）遊離脂肪酸濃厚物を、35℃で10％の水の存在下に固
定したカンジダ ルゴサ リパーゼ（CRL）を用いてグリセロールで直接エステ
ル化する方法を開示している。120分後には、転化の程度は約60％に達した。得
られたグリセリド混合物において、トリグリセリドは28.2％のＥＰＡと3.8％の
ＤＨＡとを含有し、モノグリセリドフラクションは28.9％のＥＰＡと4.5％のＤ
ＨＡとを含有した。残留遊離脂肪酸は23.2％のＥＰＡと31.5％のＤＨＡとを含有
した。これはＥＰＡとＤＨＡとの間で良好な選択性を示している。
は、チリ産の魚油から得られしかも25％のＥＰＡと18％のＤＨＡとを含有する（
ナトリウム塩の溶剤分別後）遊離脂肪酸濃厚物を、35℃で10％の水の存在下に固
定したカンジダ ルゴサ リパーゼ（CRL）を用いてグリセロールで直接エステ
ル化する方法を開示している。120分後には、転化の程度は約60％に達した。得
られたグリセリド混合物において、トリグリセリドは28.2％のＥＰＡと3.8％の
ＤＨＡとを含有し、モノグリセリドフラクションは28.9％のＥＰＡと4.5％のＤ
ＨＡとを含有した。残留遊離脂肪酸は23.2％のＥＰＡと31.5％のＤＨＡとを含有
した。これはＥＰＡとＤＨＡとの間で良好な選択性を示している。
【００１３】 対照的に、WO96/37586号の実施例１および２においては、遊離脂肪酸フラクシ
ョンを分析をグリセロールでＭＭＬ触媒した再エステル化を行なうとＥＰＡとＤ
ＨＡとの間で有意な程の選択性を示さなかった。
ョンを分析をグリセロールでＭＭＬ触媒した再エステル化を行なうとＥＰＡとＤ
ＨＡとの間で有意な程の選択性を示さなかった。
【００１４】 WO96/37587号の開示はWO96/37586号の開示と同様である。これの実施例１、４
、６および８は、ＥＰＡとＤＨＡとの間で何等識別することなくＰＵＦＡをＭＭ
Ｌでグリセロール分解することを示している。
、６および８は、ＥＰＡとＤＨＡとの間で何等識別することなくＰＵＦＡをＭＭ
Ｌでグリセロール分解することを示している。
【００１５】 決して完全ではないけれどもこの従来技術の論述からは、比較的低濃度でＥＰ
ＡおよびＤＨＡを含有する魚油の如き油組成物からＥＰＡおよびＤＨＡとしてか
かる工業上重要なＰＵＦＡを単離するリパーゼ触媒した（lipase-catalysed）方
法を開発するために広範な研究が成されていたことは明らかであろう。
ＡおよびＤＨＡを含有する魚油の如き油組成物からＥＰＡおよびＤＨＡとしてか
かる工業上重要なＰＵＦＡを単離するリパーゼ触媒した（lipase-catalysed）方
法を開発するために広範な研究が成されていたことは明らかであろう。
【００１６】 本発明者は今般、魚油から遊離脂肪酸の直接エステル化によりＥＰＡおよびＤ
ＨＡの濃厚物を製造するリパーゼ触媒した方法を見出し、該方法はリパーゼの選
択により、得られる濃厚物のＥＰＡ／ＤＨＡ含量を顧客の種々の要求に合致する
ように仕立てることができる。
ＨＡの濃厚物を製造するリパーゼ触媒した方法を見出し、該方法はリパーゼの選
択により、得られる濃厚物のＥＰＡ／ＤＨＡ含量を顧客の種々の要求に合致する
ように仕立てることができる。
【００１７】
更に詳しく言えば、本発明は遊離脂肪酸としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する
海産油組成物をエステル化して、原料組成物と比較してこれらの脂肪酸の少なく
とも１種で富化された遊離脂肪酸フラクションを形成する、海産油組成物のエス
テル化方法において、次の工程即ち前記の海産油組成物を、減圧下にしかも本質
的に有機溶剤無含有条件下にリパーゼ触媒の存在下でグリセロールと反応させる
工程と、ＥＰＡおよびＤＨＡの少なくとも１種で富化された遊離脂肪酸フラクシ
ョンを分子蒸留により分離する工程とを包含してなる海産油組成物のエステル化
方法を提供する。
海産油組成物をエステル化して、原料組成物と比較してこれらの脂肪酸の少なく
とも１種で富化された遊離脂肪酸フラクションを形成する、海産油組成物のエス
テル化方法において、次の工程即ち前記の海産油組成物を、減圧下にしかも本質
的に有機溶剤無含有条件下にリパーゼ触媒の存在下でグリセロールと反応させる
工程と、ＥＰＡおよびＤＨＡの少なくとも１種で富化された遊離脂肪酸フラクシ
ョンを分子蒸留により分離する工程とを包含してなる海産油組成物のエステル化
方法を提供する。
【００１８】 本発明は、或る限定的な反応条件に従うのであれば、グリセロールが海産油遊
離脂肪酸のリパーゼ触媒した直接エステル化用の優れた基質として作用できると
いう発見に基づくものである。この発見は前記したグリセロールを用いての従来
の研究から見て全く予期されるものではない。主たるエステル化反応はリパーゼ
触媒がリゾムコール ミエヘイ（ＭＭＬ）である次の方程式により図解的に表す
ことができる： 生成物はまた別形式のＥＰＡ−富化グリセリドを含有するが、図解方程式には
示していない。
離脂肪酸のリパーゼ触媒した直接エステル化用の優れた基質として作用できると
いう発見に基づくものである。この発見は前記したグリセロールを用いての従来
の研究から見て全く予期されるものではない。主たるエステル化反応はリパーゼ
触媒がリゾムコール ミエヘイ（ＭＭＬ）である次の方程式により図解的に表す
ことができる： 生成物はまた別形式のＥＰＡ−富化グリセリドを含有するが、図解方程式には
示していない。
【００１９】 以下に詳細に論述する如くしかも実施例８で例証した如く、リパーゼ触媒の選
択は生成物の性状に決定的に影響し得る。例示した反応図式で用いたＭＭＬの場
合には、生成物はＤＨＡ−富化遊離脂肪酸フラクションとＥＰＡ−富化グリセリ
ドフラクションとである。
択は生成物の性状に決定的に影響し得る。例示した反応図式で用いたＭＭＬの場
合には、生成物はＤＨＡ−富化遊離脂肪酸フラクションとＥＰＡ−富化グリセリ
ドフラクションとである。
【００２０】 本法の有意な特徴は、個々の脂肪酸に対するリパーゼの選択性は、リパーゼの
領域選択性または位置選択性に関する複雑性が回避されるので脂肪酸がグリセリ
ドとしてよりもむしろ遊離酸の形である時の方がより大きいという事実を利用す
ることである。驚くべきことには、グリセロールとの反応は、以下の実施例10（
比較例）で示す如く、ＥＰＡおよびＤＨＡが遊離酸として存在するよりもむしろ
エステルとして存在する時はずっと成功するものではない。
領域選択性または位置選択性に関する複雑性が回避されるので脂肪酸がグリセリ
ドとしてよりもむしろ遊離酸の形である時の方がより大きいという事実を利用す
ることである。驚くべきことには、グリセロールとの反応は、以下の実施例10（
比較例）で示す如く、ＥＰＡおよびＤＨＡが遊離酸として存在するよりもむしろ
エステルとして存在する時はずっと成功するものではない。
【００２１】 本発明により基質としてグリセロールを用いると、グリセロールは分子蒸留に
よりグリセリドフラクションと遊離脂肪酸生成物フラクションとの分離を助力す
るという別の利点がある。これの理由は、グリセロールの如き三価（trioic）ア
ルコールのエステルはメタノール、エタノールおよびプロパノールの如き短鎖ア
ルコールの同様なエステルよりも余り揮発性ではないことであると考えられる。
よりグリセリドフラクションと遊離脂肪酸生成物フラクションとの分離を助力す
るという別の利点がある。これの理由は、グリセロールの如き三価（trioic）ア
ルコールのエステルはメタノール、エタノールおよびプロパノールの如き短鎖ア
ルコールの同様なエステルよりも余り揮発性ではないことであると考えられる。
【００２２】 エステル化反応を成功させるにはグリセロールの相対量が重要であると見出さ
れた。グリセロールと原料組成物中の遊離脂肪酸とのモル比を1：1.5乃至1：3で
用いるのが好ましく、1：1.5乃至1：2.5で用いるのがより好ましい。今日までの
実験研究において本発明者が見出した所によれば、グリセロールと脂肪酸との約
1：2のモル比（1.5：1の利用し得るヒドロキシル基と遊離脂肪酸との比率に対応
する）が最適である。
れた。グリセロールと原料組成物中の遊離脂肪酸とのモル比を1：1.5乃至1：3で
用いるのが好ましく、1：1.5乃至1：2.5で用いるのがより好ましい。今日までの
実験研究において本発明者が見出した所によれば、グリセロールと脂肪酸との約
1：2のモル比（1.5：1の利用し得るヒドロキシル基と遊離脂肪酸との比率に対応
する）が最適である。
【００２３】 エステル化反応は水が生成するにつれて反応系から水を除去するために減圧下
で行なうのが必須である。これは反応を非可逆性とさせるために必要であり、こ
れによって高回収率の所望ＥＰＡ／ＤＨＡ生成物を得ることができる。即ち、エ
ステル化は一般に50トル以下の圧力で行われ、通常は10トル以下例えば1〜10ト
ルで行われるが、最適なリパーゼ活性に対する減圧条件は或る程度まで用いた特
定のリパーゼに応じて左右されるという驚くべき所見を見出した。即ち、若干の
場合には、0.01〜1トルの圧力を用いるのが有利であり、次の実施例では0.01〜0
.1トル程の低い圧力で優れた結果を報告している。勿論、用いられる特定のリパ
ーゼに対する最適な低圧条件は定常実験により容易に決定し得る。
で行なうのが必須である。これは反応を非可逆性とさせるために必要であり、こ
れによって高回収率の所望ＥＰＡ／ＤＨＡ生成物を得ることができる。即ち、エ
ステル化は一般に50トル以下の圧力で行われ、通常は10トル以下例えば1〜10ト
ルで行われるが、最適なリパーゼ活性に対する減圧条件は或る程度まで用いた特
定のリパーゼに応じて左右されるという驚くべき所見を見出した。即ち、若干の
場合には、0.01〜1トルの圧力を用いるのが有利であり、次の実施例では0.01〜0
.1トル程の低い圧力で優れた結果を報告している。勿論、用いられる特定のリパ
ーゼに対する最適な低圧条件は定常実験により容易に決定し得る。
【００２４】 有機溶剤は、多数の従来技術のリパーゼ基質系とは異なって本法では存在すべ
きでない。何故ならば、有機溶剤は揮発性であり、真空条件下では蒸発するから
である。
きでない。何故ならば、有機溶剤は揮発性であり、真空条件下では蒸発するから
である。
【００２５】 エステル化反応を行なう温度は、処理される海産油組成物並びに用いられるリ
パーゼに応じて左右される。海産油組成物の粘度は該組成物を反応中は適度に攪
拌しうるように十分な程低いのが望ましく、この理由で少なくとも20℃の温度を
用いるのが必要であることが多い。他方、余りにも高い温度は望ましくない。何
故ならばならば、高温は脂肪酸リパーゼ識別に基づく運動解析に対して作用する
からであり、しかもまたＥＰＡおよびＤＨＡは高温への長期の暴露により破壊さ
れてしまい、然るにリパーゼもまた高温には耐えられないからである。これらの
如き因子を考慮して、20〜40℃の範囲内で操作するのが一般に好ましく、37〜40
℃で操作するのが多くは最も好ましいが、高いＥＰＡおよび／またはＤＨＡ含量
の魚油組成物については0〜20℃の温度を使用でき、その際該組成物はこれらの
低温でも十分な程に液体のままであり、しかも逆に40〜70℃の範囲の高温はＭＭ
ＬおよびＣＡＬのような安定な固定したリパーゼについては可能であり得る。
パーゼに応じて左右される。海産油組成物の粘度は該組成物を反応中は適度に攪
拌しうるように十分な程低いのが望ましく、この理由で少なくとも20℃の温度を
用いるのが必要であることが多い。他方、余りにも高い温度は望ましくない。何
故ならばならば、高温は脂肪酸リパーゼ識別に基づく運動解析に対して作用する
からであり、しかもまたＥＰＡおよびＤＨＡは高温への長期の暴露により破壊さ
れてしまい、然るにリパーゼもまた高温には耐えられないからである。これらの
如き因子を考慮して、20〜40℃の範囲内で操作するのが一般に好ましく、37〜40
℃で操作するのが多くは最も好ましいが、高いＥＰＡおよび／またはＤＨＡ含量
の魚油組成物については0〜20℃の温度を使用でき、その際該組成物はこれらの
低温でも十分な程に液体のままであり、しかも逆に40〜70℃の範囲の高温はＭＭ
ＬおよびＣＡＬのような安定な固定したリパーゼについては可能であり得る。
【００２６】 本法の原料は、遊離酸系でＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産供給源からの何
れかの組成物であり得る。かかる組成物は、魚油加工工業における当業者に周知
の標準方法により、粗製の魚油を例えば水酸化ナトリウムでケン化し、続いて例
えば硫酸で酸性化することにより得ることができる。典型的には、該組成物は15
〜35重量％、好ましくは25〜35重量％の遊離酸形でのＥＰＡおよびＤＨＡの全含
量を含有する。約５重量％のＥＰＡと25重量％のＤＨＡとを含有するまぐろ油の
如きＤＨＡに富む魚油は本発明の方法によりＤＨＡ濃厚物を製造するのに特に適
当であり、然るにＥＰＡに富む魚油（例えば約18重量％のＥＰＡと12重量％のＤ
ＨＡとを有するイワシ油）およびチリ魚油（20重量％のＥＰＡと７重量％のＤＨ
Ａとを有する）はＥＰＡ濃厚物を形成するのに特に適当な原料である。然しなが
ら、本明細書の以下で記載する実施例で示した如く、ニシン油（約６重量％のＥ
ＰＡおよび約８重量％のＤＨＡを有する）の如きＥＰＡとＤＨＡとの全含量が低
いより安価な魚油を本発明の方法によりＥＰＡおよび／またはＤＨＡ−富化フラ
クションの製造用原料として用い得るのは本発明の利点である。
れかの組成物であり得る。かかる組成物は、魚油加工工業における当業者に周知
の標準方法により、粗製の魚油を例えば水酸化ナトリウムでケン化し、続いて例
えば硫酸で酸性化することにより得ることができる。典型的には、該組成物は15
〜35重量％、好ましくは25〜35重量％の遊離酸形でのＥＰＡおよびＤＨＡの全含
量を含有する。約５重量％のＥＰＡと25重量％のＤＨＡとを含有するまぐろ油の
如きＤＨＡに富む魚油は本発明の方法によりＤＨＡ濃厚物を製造するのに特に適
当であり、然るにＥＰＡに富む魚油（例えば約18重量％のＥＰＡと12重量％のＤ
ＨＡとを有するイワシ油）およびチリ魚油（20重量％のＥＰＡと７重量％のＤＨ
Ａとを有する）はＥＰＡ濃厚物を形成するのに特に適当な原料である。然しなが
ら、本明細書の以下で記載する実施例で示した如く、ニシン油（約６重量％のＥ
ＰＡおよび約８重量％のＤＨＡを有する）の如きＥＰＡとＤＨＡとの全含量が低
いより安価な魚油を本発明の方法によりＥＰＡおよび／またはＤＨＡ−富化フラ
クションの製造用原料として用い得るのは本発明の利点である。
【００２７】 本明細書で先に記載した如く、用いたリパーゼの選択により富化フラクション
の性状を変化させ得るのは本法の特徴である。例えばリパーゼに注目しながら次
の作用が観察される： i リゾムコール ミエヘイ リパーゼ（ＭＭＬ）、ムコール ジャバニクス（M
ucol javanicus）リパーゼ（ＭＪＬ）および黒色コウジ菌（Aspergillus niger
）リパーゼ（ＡＮＬ）を用いて、ＤＨＡ−富化遊離脂肪酸フラクションとＥＰＡ
−富化グリセリドフラクションとが得られ；および ii シュードモナス属−アマノ（Amano）ＡＫ（ＰＳＬ）、蛍光菌−アマノＰＳ
（ＰＦＬ）、リゾプス オリザエ（Rhizopus oryzae）−アマノＦ（ＲＯＬ）お
よびヒューミキュラ ラヌギノサ（Humicula Lanuginosa）−アマノＣＥ（ＨＬ
Ｌ）を用いてＥＰＡ／ＤＨＡ−富化遊離脂肪酸フラクションと飽和脂肪酸で富化
したグリセリドフラクションとが得られる。
の性状を変化させ得るのは本法の特徴である。例えばリパーゼに注目しながら次
の作用が観察される： i リゾムコール ミエヘイ リパーゼ（ＭＭＬ）、ムコール ジャバニクス（M
ucol javanicus）リパーゼ（ＭＪＬ）および黒色コウジ菌（Aspergillus niger
）リパーゼ（ＡＮＬ）を用いて、ＤＨＡ−富化遊離脂肪酸フラクションとＥＰＡ
−富化グリセリドフラクションとが得られ；および ii シュードモナス属−アマノ（Amano）ＡＫ（ＰＳＬ）、蛍光菌−アマノＰＳ
（ＰＦＬ）、リゾプス オリザエ（Rhizopus oryzae）−アマノＦ（ＲＯＬ）お
よびヒューミキュラ ラヌギノサ（Humicula Lanuginosa）−アマノＣＥ（ＨＬ
Ｌ）を用いてＥＰＡ／ＤＨＡ−富化遊離脂肪酸フラクションと飽和脂肪酸で富化
したグリセリドフラクションとが得られる。
【００２８】 リパーゼ触媒を適度に選択することにより生成物の性状を変化させるこの能力
は、本法の操作によって顧客の特定の要求に合致するように仕上げ得るという利
点がある。例えば或る顧客は乳児食補充用にＤＨＡ濃厚物を要求するかもしれず
、然るに別の顧客は健康食品を製造するために混合したＥＰＡ／ＤＨＡ濃厚物を
要求するかもしれないが、両方の顧客の要求は用いたリパーゼ触媒を変更するこ
とにより簡単に適合させ得る。
は、本法の操作によって顧客の特定の要求に合致するように仕上げ得るという利
点がある。例えば或る顧客は乳児食補充用にＤＨＡ濃厚物を要求するかもしれず
、然るに別の顧客は健康食品を製造するために混合したＥＰＡ／ＤＨＡ濃厚物を
要求するかもしれないが、両方の顧客の要求は用いたリパーゼ触媒を変更するこ
とにより簡単に適合させ得る。
【００２９】 勿論、最終生成物の組成を仕立てる尚一層の可能性は、種々の工程で相異なる
リパーゼ触媒を用いながら、２個またはそれ以上の別個の工程で本法を実施する
ことにより有し得る。
リパーゼ触媒を用いながら、２個またはそれ以上の別個の工程で本法を実施する
ことにより有し得る。
【００３０】 本法で好ましいリパーゼは、ＥＰＡとＤＨＡとの間で強力に識別するリゾムコ
ール ミエヘイ（ＭＭＬ）；および一方ではＥＰＡとＤＨＡとの間で識別し他方
では魚油中に残りの脂肪酸を識別するシュードモナス属（ＰＳＬ）である。
ール ミエヘイ（ＭＭＬ）；および一方ではＥＰＡとＤＨＡとの間で識別し他方
では魚油中に残りの脂肪酸を識別するシュードモナス属（ＰＳＬ）である。
【００３１】 少なくとも工業的な規模では、固定した形の選択済みリパーゼを用いるのが好
ましい。何故ならば、固定化は特に0.01〜1トルの程度のごく低い圧力では酵素
の活性を増大することが多いのみならず、酵素の安定性を改良し且つ酵素の回収
を助力することもまた見出されたからであり、これらは全て本法の経済性に作用
する要素である。
ましい。何故ならば、固定化は特に0.01〜1トルの程度のごく低い圧力では酵素
の活性を増大することが多いのみならず、酵素の安定性を改良し且つ酵素の回収
を助力することもまた見出されたからであり、これらは全て本法の経済性に作用
する要素である。
【００３２】 所望のエステル化反応を行なうためには十分量のリパーゼを用いるべきである
。固定したＭＭＬを用いた本発明者の研究では、処理される海産油組成物中の脂
肪酸の含量に基づいて、約10重量％の固定化生成物を用い、これは約１重量％の
ＭＭＬの濃度に相当する（市販されて入手しうる固定化ＭＭＬは約10％のリパー
ゼと90％の担体とからなる）。
。固定したＭＭＬを用いた本発明者の研究では、処理される海産油組成物中の脂
肪酸の含量に基づいて、約10重量％の固定化生成物を用い、これは約１重量％の
ＭＭＬの濃度に相当する（市販されて入手しうる固定化ＭＭＬは約10％のリパー
ゼと90％の担体とからなる）。
【００３３】 対照的に、非固定化リパーゼを用いると、本発明者は脂肪酸含量の10重量％の
リパーゼ濃度を利用した。
リパーゼ濃度を利用した。
【００３４】 エステル化反応の完了に続いて、生成物は分子蒸留によりそれぞれ遊離脂肪酸
とグリセリドとを主として含有するフラクションに分離する。
とグリセリドとを主として含有するフラクションに分離する。
【００３５】 遊離脂肪酸フラクションをグリセリドフラクションから分離する分子蒸留工程
は100〜20℃の範囲の温度で実施し得るが、通常は140〜180℃の範囲にあるもの
である。達成しうる比率の残留物／留出物から見て分子蒸留の成功度は真空条件
に左右されるものである。真空は混合物中に存在する揮発性成分の如き因子に応
じて変化し得る。真空は一般には1×10-4〜1×10-2mbar（ミリバール）の範囲に
あるが、当業者ならば、若干の場合には前記した範囲外でもあり得る達成可能な
真空と、所望の最終結果を達成するのに適当な温度とを組合せて用いることがで
きる。
は100〜20℃の範囲の温度で実施し得るが、通常は140〜180℃の範囲にあるもの
である。達成しうる比率の残留物／留出物から見て分子蒸留の成功度は真空条件
に左右されるものである。真空は混合物中に存在する揮発性成分の如き因子に応
じて変化し得る。真空は一般には1×10-4〜1×10-2mbar（ミリバール）の範囲に
あるが、当業者ならば、若干の場合には前記した範囲外でもあり得る達成可能な
真空と、所望の最終結果を達成するのに適当な温度とを組合せて用いることがで
きる。
【００３６】 勿論、先ずリパーゼ触媒したエステル化からの生成物は次いで、同じまたは異
なるリパーゼを用いて１回またはそれ以上の次後のリパーゼ触媒したエステル化
で更に濃縮し得る。
なるリパーゼを用いて１回またはそれ以上の次後のリパーゼ触媒したエステル化
で更に濃縮し得る。
【００３７】 本法の終了時に得られる遊離酸フラクションはそのまま使用することができ、
あるいは遊離酸形の生成物が意図した用途に許容できないならば、その時はこれ
を先ず何れか適当な方法によりエチルエステル、グリセリドまたは別のより許容
できる形に転化できる。
あるいは遊離酸形の生成物が意図した用途に許容できないならば、その時はこれ
を先ず何れか適当な方法によりエチルエステル、グリセリドまたは別のより許容
できる形に転化できる。
【００３８】 同様に、分離したグリセリドフラクションが経済上価値のある濃度でＥＰＡま
たはＤＨＡを含有する場合には、このフラクションに別に処理を施すこともでき
、例えば遊離酸を形成する水性アルカリでの加水分解あるいは脂肪酸のエチルエ
ステルを形成するエタノールでのエステル化を施すことができる。かくして形成
した遊離脂肪酸またはエチルエステルフラクションは次いで所望ならば例えば分
子蒸留により更に濃縮し得る。
たはＤＨＡを含有する場合には、このフラクションに別に処理を施すこともでき
、例えば遊離酸を形成する水性アルカリでの加水分解あるいは脂肪酸のエチルエ
ステルを形成するエタノールでのエステル化を施すことができる。かくして形成
した遊離脂肪酸またはエチルエステルフラクションは次いで所望ならば例えば分
子蒸留により更に濃縮し得る。
【００３９】 本発明のエステル化法は、これを工業化するのに特に適当とさせる多数の利点
がある。特にリパーゼ触媒の選択により生成物の組成を仕立てる能力は既に前記
したが、本法を工業上魅力的とする別の利点には次のものがある： i 形成し得る高度に濃厚なＥＰＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡ＋ＤＨＡ生成物の高
収率 ii 何らの有機溶剤が不在であること、即ちかかる溶剤の存在が生起するかも
しれない精製の問題を回避するのみならず、本法の嵩高性を低減もしこれは経済
上重要である（エネルギーの要求量がより少なくなる等）、 iii 若干の操業で、恐らくは20回までまたはそれ以上の連続操業で固定した
リパーゼ触媒を再使用する能力、かくして再び経費削減に寄与する、 iv 興味あるポリ不飽和脂肪酸を含有する何れか適当な海産油組成物を使用す
る能力、および ｖ エステル化方法および次後の分離方法の全体の簡素化。
がある。特にリパーゼ触媒の選択により生成物の組成を仕立てる能力は既に前記
したが、本法を工業上魅力的とする別の利点には次のものがある： i 形成し得る高度に濃厚なＥＰＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡ＋ＤＨＡ生成物の高
収率 ii 何らの有機溶剤が不在であること、即ちかかる溶剤の存在が生起するかも
しれない精製の問題を回避するのみならず、本法の嵩高性を低減もしこれは経済
上重要である（エネルギーの要求量がより少なくなる等）、 iii 若干の操業で、恐らくは20回までまたはそれ以上の連続操業で固定した
リパーゼ触媒を再使用する能力、かくして再び経費削減に寄与する、 iv 興味あるポリ不飽和脂肪酸を含有する何れか適当な海産油組成物を使用す
る能力、および ｖ エステル化方法および次後の分離方法の全体の簡素化。
【００４０】 本発明を次の実施例により例証するが、実施例中の面積％(area percentage）
はＧＬＣ分析により得られた。
はＧＬＣ分析により得られた。
【００４１】実施例１ この実験においては、5.5面積％のＥＰＡと8.0面積％のＤＨＡとを（両者とも
遊離酸として存在）含有するニシン油の加水分解生成物をリゾムコール ミエヘ
イ リパーゼ〔MML；ノボ社のリポチーム（Novo's Lipozyme）〕の存在下にグリ
セロールと反応させた。エステル化条件は次の如くである；
遊離酸として存在）含有するニシン油の加水分解生成物をリゾムコール ミエヘ
イ リパーゼ〔MML；ノボ社のリポチーム（Novo's Lipozyme）〕の存在下にグリ
セロールと反応させた。エステル化条件は次の如くである；
【００４２】 ＭＭＬ：脂肪酸基質に基づいて10重量％の施用量 グリセロール：遊離脂肪酸の２当量当り１当量 （ヒドロキシル基よりも1.5化学量論量過剰） 温度：40℃ 圧力：0.01〜0.1トル 有機溶剤：なし
【００４３】 実験手法は次の如くである。ニシン油の遊離脂肪酸（10g；分子量 大体290g/
モル；大体34.5ミリモル）およびグリセロール（1.56g；分子量92.1g/モル；17.
3ミリモル）に、固定したムコール ミエヘイ リパーゼ(ノボ社のリポチーム、
1.0g）を添加した。該混合物を0.01〜0.1トルの持続した真空下で磁気攪拌器の
熱板上で40℃で温和に攪拌した。反応の進行中に生成した揮発性の水は液体窒素
で冷却したトラップ中に連続的に凝縮した。滴定を用いて反応の進行を監視した
。選択した時間後に、反応は濾過により酵素を分離することによって中断した。
分別はシリカゲル上の分取ＴＬＣにより行ない、各々の脂質フラクションは標準
法でのメチル化後にＧＬＣにより続いて脂肪酸分析した。
モル；大体34.5ミリモル）およびグリセロール（1.56g；分子量92.1g/モル；17.
3ミリモル）に、固定したムコール ミエヘイ リパーゼ(ノボ社のリポチーム、
1.0g）を添加した。該混合物を0.01〜0.1トルの持続した真空下で磁気攪拌器の
熱板上で40℃で温和に攪拌した。反応の進行中に生成した揮発性の水は液体窒素
で冷却したトラップ中に連続的に凝縮した。滴定を用いて反応の進行を監視した
。選択した時間後に、反応は濾過により酵素を分離することによって中断した。
分別はシリカゲル上の分取ＴＬＣにより行ない、各々の脂質フラクションは標準
法でのメチル化後にＧＬＣにより続いて脂肪酸分析した。
【００４４】 結果を以下の表１に示す： 80％の転化率で７時間後には、ＤＨＡとＥＰＡとの比率は残留遊離脂肪酸の31
％を成すＤＨＡと５％以下のＥＰＡとを有して6.6：1である。ＤＨＡの回収率は
83％である。12時間後にＤＨＡとＥＰＡとの比率は13：1に上昇し、89％の転化
率で24時間後には前記の比率は27：1に上昇し、その際ＤＨＡの回収率は尚殆ん
ど70％である。このレベルを越えると、明らかに平衡が達成された。
％を成すＤＨＡと５％以下のＥＰＡとを有して6.6：1である。ＤＨＡの回収率は
83％である。12時間後にＤＨＡとＥＰＡとの比率は13：1に上昇し、89％の転化
率で24時間後には前記の比率は27：1に上昇し、その際ＤＨＡの回収率は尚殆ん
ど70％である。このレベルを越えると、明らかに平衡が達成された。
【００４５】 この実験が示す処によれば、リパーゼとしてＭＭＬを用いると本発明は高い転
化率でＤＨＡ濃厚物を製造することができる。
化率でＤＨＡ濃厚物を製造することができる。
【００４６】実施例２（比較例） グリセロールの濃度を低減させる（グリセロールの１当量当り遊離脂肪酸の３
当量）以外は実施例１を反復した。
当量）以外は実施例１を反復した。
【００４７】 結果を以下の表２に示す； 注目される如くこの実験の結果は実施例１で用いた2：1の比率で得られた結果
よりもずっと満足なものでない。この変化の理由は説明するのが容易でない。グ
リセロールの中央位置が余り利用されないかまたは少なくともその関与がずっと
緩慢であることを考慮した時には、ヒドロキシ基の不十分な利用度または脂肪酸
の過剰量に関連しているかもしれない。結果は、平衡にずっと早く達しＥＰＡと
ＤＨＡとの間で有効な分離はしないことである。
よりもずっと満足なものでない。この変化の理由は説明するのが容易でない。グ
リセロールの中央位置が余り利用されないかまたは少なくともその関与がずっと
緩慢であることを考慮した時には、ヒドロキシ基の不十分な利用度または脂肪酸
の過剰量に関連しているかもしれない。結果は、平衡にずっと早く達しＥＰＡと
ＤＨＡとの間で有効な分離はしないことである。
【００４８】実施例３ エステル化反応を行なう温度を30℃と60℃との間で変化させる以外は実施例１
をまた反復した。結果を以下の表３に示す； 結果が確立した処によれば、40℃はこれらの特定の反応条件に選択した温度で
ある。30℃では攪拌で困難であり、該温度での不十分な結果を示している。然し
ながら、40℃で8.0：1と比較すると60℃で8.6：1のＤＨＡとＥＰＡとの間の好ま
しい比率が認められる。何故ならば60℃ではより低い選択率が予期されるからで
ある。
をまた反復した。結果を以下の表３に示す； 結果が確立した処によれば、40℃はこれらの特定の反応条件に選択した温度で
ある。30℃では攪拌で困難であり、該温度での不十分な結果を示している。然し
ながら、40℃で8.0：1と比較すると60℃で8.6：1のＤＨＡとＥＰＡとの間の好ま
しい比率が認められる。何故ならば60℃ではより低い選択率が予期されるからで
ある。
【００４９】実施例４ 40℃と60℃とでグリセロールと遊離脂肪酸との間の比率を変化させる以外は実
施例１をまた反復した。得られた結果を以下の表４に示す； これらの結果は、有利なＤＨＡ／ＥＰＡ比並びにＤＨＡの高い回収率は40℃で
グリセロールと遊離脂肪酸との間の1：2のモル比で得られるという従来の発見を
確認している。
施例１をまた反復した。得られた結果を以下の表４に示す； これらの結果は、有利なＤＨＡ／ＥＰＡ比並びにＤＨＡの高い回収率は40℃で
グリセロールと遊離脂肪酸との間の1：2のモル比で得られるという従来の発見を
確認している。
【００５０】実施例５ この実験は触媒としてＭＭＬを用いてチリ魚油から加水分解により得られた遊
離脂肪酸組成物の直接エステル化を示している。
離脂肪酸組成物の直接エステル化を示している。
【００５１】 チリ油は16.8面積％のＥＰＡと12.3面積％のＤＨＡとを含有する。
【００５２】 エステル化反応条件は実施例１におけるのと同じである。
【００５３】 結果を以下の表５に示す。
【００５４】 表５の結果はチリ油がＭＭＬでＥＰＡとＤＨＡとの両方を有効に分離するため
の適当な原料であることを示している。例えば28時間の反応時間後には、当初Ｅ
ＰＡの86％がグリセリドフラクション中に分離され、然るにＤＨＡの78％が50％
のＤＨＡおよび13％のＤＨＡを含有する残留脂肪酸フラクション中に残留してい
る。
の適当な原料であることを示している。例えば28時間の反応時間後には、当初Ｅ
ＰＡの86％がグリセリドフラクション中に分離され、然るにＤＨＡの78％が50％
のＤＨＡおよび13％のＤＨＡを含有する残留脂肪酸フラクション中に残留してい
る。
【００５５】実施例６ 原料として5.0％のＥＰＡと18.2％のＤＨＡとを含有する粗製のマグロ油を用
いて実施例１をまた反復した。結果を以下の表６に示す； 用いたマグロ油が粗製であり、比較的少量のＤＨＡを含有していることに留意
すると、得られた結果は優秀である。
いて実施例１をまた反復した。結果を以下の表６に示す； 用いたマグロ油が粗製であり、比較的少量のＤＨＡを含有していることに留意
すると、得られた結果は優秀である。
【００５６】実施例７ 実施例１をより大きな規模（100g）で反復した。40℃で真空下にグリセロール
と遊離脂肪酸との1：2のモル比を用いて前記と同じ条件を用いた。10％のＭＭＬ
施用量を用い、各々の反応は16時間後に停止した。各々の操業後にリパーゼを窒
素雰囲気の気流下に焼結ガラス漏斗上に濾取した。必要な場合にはリパーゼを室
温で窒素下に各操業の間で貯蔵した。20回の連続操業の結果を表７に示す。
と遊離脂肪酸との1：2のモル比を用いて前記と同じ条件を用いた。10％のＭＭＬ
施用量を用い、各々の反応は16時間後に停止した。各々の操業後にリパーゼを窒
素雰囲気の気流下に焼結ガラス漏斗上に濾取した。必要な場合にはリパーゼを室
温で窒素下に各操業の間で貯蔵した。20回の連続操業の結果を表７に示す。
【００５７】 a）この試料は分子蒸留分離には採取されなかった。
【００５８】 b）この試料は分析されずまた分子蒸留用に採用されなかった。
【００５９】 表７から認められる通り、リパーゼは何ら有意な劣化を示すことなく20回の連
続操業中もその活性を保持した。
続操業中もその活性を保持した。
【００６０】実施例８ この実験の目的はＭＭＬ以外のリパーゼが本発明の方法で用い得ることを例証
するものである。
するものである。
【００６１】 １〜20トルの範囲のより高い圧力で、実施例７におけるのと同じニシン油を用
いてしかも16時間の一定反応時間を用いる以外は実施例１で用いたのと同じ反応
条件下で17種の相異なるリパーゼまたはリパーゼ製剤を試験した。滴定を用いて
転化の程度を監視した。グリセリド混合物は、若干の活性を示す場合には分取Ｔ
ＬＣによって残留遊離脂肪酸から分離され、２種の得られるフラクションの脂肪
酸の組成はＧＬＣにより測定した。結果を以下表８に示す。
いてしかも16時間の一定反応時間を用いる以外は実施例１で用いたのと同じ反応
条件下で17種の相異なるリパーゼまたはリパーゼ製剤を試験した。滴定を用いて
転化の程度を監視した。グリセリド混合物は、若干の活性を示す場合には分取Ｔ
ＬＣによって残留遊離脂肪酸から分離され、２種の得られるフラクションの脂肪
酸の組成はＧＬＣにより測定した。結果を以下表８に示す。
【００６２】 a）ノボ ノルディスク(Novo Nordisk）社からのリパーゼSP 382 b）ノボ ノルディスク社からのリパーゼSP 435 c）リパーゼＮ濃厚物05501 d）ＭＭＬは転化の程度の比較のため包含させた。更なる分析はしなかった。
【００６３】 アマノ（Amano）社からのムコール ジャバニクス リパーゼ（MJL）はこれら
の条件下でＥＰＡとＤＨＡとの間で強力に識別すると思われしかも高活性を示す
ことが表から認められるのが興味ある処である。ＥＰＡのためにＥＰＡとＤＨＡ
との間で識別する同様の挙動は黒色コウジ菌リパーゼ（ANL）およびまたリゾプ
ス ニベウス（Rhizopus niveus）リパーゼ（RNL）によっても示されるが、活性
はずっと低い。ＰＳＬおよびＰＦＬはＥＰＡとＤＨＡとの間で有意な程に識別す
ることなくこれらの条件下で活性を示した。それ故これらのリパーゼはこれらの
条件下で魚油からＥＰＡとＤＨＡとの両方を互いに濃縮するのに適当である。Ｌ
ＮＬ、ＲＯＬおよびＨＬＬはまた高活性を示すので魚油中のＥＰＡとＤＨＡとの
両方を濃縮するのに有用であると示される。
の条件下でＥＰＡとＤＨＡとの間で強力に識別すると思われしかも高活性を示す
ことが表から認められるのが興味ある処である。ＥＰＡのためにＥＰＡとＤＨＡ
との間で識別する同様の挙動は黒色コウジ菌リパーゼ（ANL）およびまたリゾプ
ス ニベウス（Rhizopus niveus）リパーゼ（RNL）によっても示されるが、活性
はずっと低い。ＰＳＬおよびＰＦＬはＥＰＡとＤＨＡとの間で有意な程に識別す
ることなくこれらの条件下で活性を示した。それ故これらのリパーゼはこれらの
条件下で魚油からＥＰＡとＤＨＡとの両方を互いに濃縮するのに適当である。Ｌ
ＮＬ、ＲＯＬおよびＨＬＬはまた高活性を示すので魚油中のＥＰＡとＤＨＡとの
両方を濃縮するのに有用であると示される。
【００６４】 対照的に、カンジダ アンタークチカ リパーゼはＭＭＬの活性に匹敵しうる
高活性を示すけれども、それらの作用がＥＰＡとＤＨＡとの間で識別しなかった
し、またこれらのＥＰＡおよびＤＨＡと魚油中に存在する他の脂肪酸との間で強
力な識別を示さなかった。それ故ＣＡＬはこれらの条件下で用いるには適当では
ない。
高活性を示すけれども、それらの作用がＥＰＡとＤＨＡとの間で識別しなかった
し、またこれらのＥＰＡおよびＤＨＡと魚油中に存在する他の脂肪酸との間で強
力な識別を示さなかった。それ故ＣＡＬはこれらの条件下で用いるには適当では
ない。
【００６５】実施例９（比較例） 0.01〜0.1トルのかなり高い真空を用いる以外はリパーゼの幾つかについて実
施例８を反復した。結果を以下の表９に示す；
施例８を反復した。結果を以下の表９に示す；
【００６６】 表９に示した結果は同じリパーゼについて表８に示した結果と全く対照的であ
る。
る。
【００６７】 即ち、転化の程度はＣＡＬ以外は全てのリパーゼについてずっと低く、リパー
ゼの何れについてもＥＰＡとＤＨＡとの間で何ら有意な程の識別を示さなかった
。ＣＡＬ以外の全てのリパーゼの低度の活性はリパーゼの活性にかなりの悪影響
を有してリパーゼの必須水分を除去するのに用いたきわめて高い真空に恐らく起
因すると考えられる。
ゼの何れについてもＥＰＡとＤＨＡとの間で何ら有意な程の識別を示さなかった
。ＣＡＬ以外の全てのリパーゼの低度の活性はリパーゼの活性にかなりの悪影響
を有してリパーゼの必須水分を除去するのに用いたきわめて高い真空に恐らく起
因すると考えられる。
【００６８】実施例10（比較例） この実験では、多数の相異なるリパーゼを用いてイワシ油のエチルエステルを
グリセロールで直接エステル化する。反応は10％の濃度でのリパーゼおよび１当
量のグリセロール当り２当量のエチルエステルを用いて、真空下に24時間40℃で
攪拌下に行なった。結果を以下の表10に示す。転化の程度は反応混合物に存在す
る残留エチルエステルの量に基づく。
グリセロールで直接エステル化する。反応は10％の濃度でのリパーゼおよび１当
量のグリセロール当り２当量のエチルエステルを用いて、真空下に24時間40℃で
攪拌下に行なった。結果を以下の表10に示す。転化の程度は反応混合物に存在す
る残留エチルエステルの量に基づく。
【００６９】 遊離脂肪酸とグリセロールとの直接エステル化と対比するとグリセロール分解
反応は転化についてずっと緩慢に進行することが表10から明らかである。ＭＭＬ
のみがわずかに認め得る程の転化率を示すが、別のリパーゼは活性をごくわずか
しか示さないかまたは全く活性を示さなかった。
反応は転化についてずっと緩慢に進行することが表10から明らかである。ＭＭＬ
のみがわずかに認め得る程の転化率を示すが、別のリパーゼは活性をごくわずか
しか示さないかまたは全く活性を示さなかった。
【００７０】 この実験が示す処によれば、エステルエステルは原料としてより有利であって
しかもより容易に利用し得るけれども、本発明では好ましい原料を表わさない。
しかもより容易に利用し得るけれども、本発明では好ましい原料を表わさない。
【００７１】実施例11 原料として5.2％のＥＰＡと24.5％のＤＨＡとを含有する半精製マグロ油を用
いて実施例１を反復した。結果を以下の表11に示す。
いて実施例１を反復した。結果を以下の表11に示す。
【００７２】 ＥＰＡとＤＨＡとの間で有効な識別を行ないながら良好な転化率が得られるこ
とが見られる。
とが見られる。
【００７３】実施例12 原料として20.0％のＥＰＡと7.2％のＤＨＡとを含有する粗製魚油を用いて実
施例１をもう１回反復した。結果を表12に示す。
施例１をもう１回反復した。結果を表12に示す。
【００７４】 高い転化率で高度に有利なＥＰＡ対ＤＨＡの比率のグリセリドが得られること
は表12の結果から明らかである。それ故例証した方法はＥＰＡの濃厚物を製造す
る方法の基準を形成し得る。
は表12の結果から明らかである。それ故例証した方法はＥＰＡの濃厚物を製造す
る方法の基準を形成し得る。
【００７５】実施例13 7.1％のＥＰＡと29.4％のＤＨＡとを含有するマグロ油（496g）からの遊離脂
肪酸と、グリセロール(79.9g）とＭＭＬ(25g）とを用いて、実施例１を再び反復
した。68.3％の転化率が4.5時間後に得られた。グリセリドの混合物は9.0％のＥ
ＰＡと11.2％のＤＨＡとを含有し、残留遊離脂肪酸は4.1％のＥＰＡと54.9％の
ＤＨＡとを含有した。反応混合物は３×10-3ミリバールの真空下にレイボールド
(Leibold）kDI-4蒸留器(レイボールド社、独国）を用いた短路蒸留に誘導した。
ガス抜きは60℃で行ない、予備蒸留は90℃で行なった〔90℃での蒸留はわずか6.
2％のＤＨＡの損失を生じた〕。予備蒸留からの残渣を140℃で蒸留した。結果を
表13に例証した。
肪酸と、グリセロール(79.9g）とＭＭＬ(25g）とを用いて、実施例１を再び反復
した。68.3％の転化率が4.5時間後に得られた。グリセリドの混合物は9.0％のＥ
ＰＡと11.2％のＤＨＡとを含有し、残留遊離脂肪酸は4.1％のＥＰＡと54.9％の
ＤＨＡとを含有した。反応混合物は３×10-3ミリバールの真空下にレイボールド
(Leibold）kDI-4蒸留器(レイボールド社、独国）を用いた短路蒸留に誘導した。
ガス抜きは60℃で行ない、予備蒸留は90℃で行なった〔90℃での蒸留はわずか6.
2％のＤＨＡの損失を生じた〕。予備蒸留からの残渣を140℃で蒸留した。結果を
表13に例証した。
【００７６】 １）略号；D-140は140℃での留出物であり、R-140は140℃での蒸留からの残渣
である。
である。
【００７７】 ２）個々に各々の蒸留からのフラクションの重量％。
【００７８】 ３）各々のフラクションにおける遊離脂肪酸の重量％。
【００７９】 ４）ＧＣ分析からの面積％に基づく如き各々のフラクションのＤＨＡ含量。
【００８０】 ５）酵素反応からの残留遊離脂肪酸の全重量％に基づく如き遊離脂肪酸の重量
％。
％。
【００８１】 ６）ＧＣ分析からの面積％に基づく如き各々のフラクションの遊離脂肪酸対応
部のＤＨＡ含量 表13から認められる通り、遊離脂肪酸の本体を140℃で蒸留し（全体ＦＦＡ含
量に基づいて73.7％）、これは52.3％のＤＨＡを含有した。このフラクションは
3.3％のＤＨＡ含量のモノグリセリドの15％で汚染されていた。残渣はなお74.1
％のＤＨＡを含有するＦＦＡの23.3％を包含する。尚、表13から見られる通り、
分子蒸留工程を施用した時本法によってＤＨＡ遊離脂肪酸含量の良好な富化が達
成し得る。
部のＤＨＡ含量 表13から認められる通り、遊離脂肪酸の本体を140℃で蒸留し（全体ＦＦＡ含
量に基づいて73.7％）、これは52.3％のＤＨＡを含有した。このフラクションは
3.3％のＤＨＡ含量のモノグリセリドの15％で汚染されていた。残渣はなお74.1
％のＤＨＡを含有するＦＦＡの23.3％を包含する。尚、表13から見られる通り、
分子蒸留工程を施用した時本法によってＤＨＡ遊離脂肪酸含量の良好な富化が達
成し得る。
【００８２】 蒸留を例えば150〜160℃のより高い温度でまたはより良い真空下で行なうなら
ば、更に良い結果が予期される。
ば、更に良い結果が予期される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年８月１７日（２００１．８．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】 エステル化反応は水が生成するにつれて反応系から水を除去するために減圧下
で行なうのが必須である。これは反応を非可逆性とさせるために必要であり、こ
れによって高回収率の所望ＥＰＡ／ＤＨＡ生成物を得ることができる。即ち、エ
ステル化は一般に6665Pa以下の圧力で行われ、通常は1333Pa以下例えば133.3〜1 333Pa で行われるが、最適なリパーゼ活性に対する減圧条件は或る程度まで用い
た特定のリパーゼに応じて左右されるという驚くべき所見を見出した。即ち、若
干の場合には、1.333〜133.3Paの圧力を用いるのが有利であり、次の実施例では 1.333〜13.33Pa 程の低い圧力で優れた結果を報告している。勿論、用いられる特
定のリパーゼに対する最適な低圧条件は定常実験により容易に決定し得る。
で行なうのが必須である。これは反応を非可逆性とさせるために必要であり、こ
れによって高回収率の所望ＥＰＡ／ＤＨＡ生成物を得ることができる。即ち、エ
ステル化は一般に6665Pa以下の圧力で行われ、通常は1333Pa以下例えば133.3〜1 333Pa で行われるが、最適なリパーゼ活性に対する減圧条件は或る程度まで用い
た特定のリパーゼに応じて左右されるという驚くべき所見を見出した。即ち、若
干の場合には、1.333〜133.3Paの圧力を用いるのが有利であり、次の実施例では 1.333〜13.33Pa 程の低い圧力で優れた結果を報告している。勿論、用いられる特
定のリパーゼに対する最適な低圧条件は定常実験により容易に決定し得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】 少なくとも工業的な規模では、固定した形の選択済みリパーゼを用いるのが好
ましい。何故ならば、固定化は特に1.333〜133.3Paの程度のごく低い圧力では酵
素の活性を増大することが多いのみならず、酵素の安定性を改良し且つ酵素の回
収を助力することもまた見出されたからであり、これらは全て本法の経済性に作
用する要素である。
ましい。何故ならば、固定化は特に1.333〜133.3Paの程度のごく低い圧力では酵
素の活性を増大することが多いのみならず、酵素の安定性を改良し且つ酵素の回
収を助力することもまた見出されたからであり、これらは全て本法の経済性に作
用する要素である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】 ＭＭＬ：脂肪酸基質に基づいて10重量％の施用量 グリセロール：遊離脂肪酸の２当量当り１当量 （ヒドロキシル基よりも1.5化学量論量過剰） 温度：40℃ 圧力：1.333〜13.33Pa 有機溶剤：なし
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】 実験手法は次の如くである。ニシン油の遊離脂肪酸（10g；分子量 大体290g/
モル；大体34.5ミリモル)およびグリセロール(1.56g；分子量92.1g/モル；17.3
ミリモル)に、固定したムコールミエヘイリパーゼ（ノボ社のリポチーム、1.0g)
を添加した。該混合物を1.333〜13.33Paの持続した真空下で磁気攪拌器の熱板上
で40℃で温和に攪拌した。反応の進行中に生成した揮発性の水は液体窒素で冷却
したトラップ中に連続的に凝縮した。滴定を用いて反応の進行を監視した。選択
した時間後に、反応は濾過により酵素を分離することによって中断した。分別は
シリカゲル上の分取ＴＬＣにより行ない、各々の脂質フラクションは標準法での
メチル化後にＧＬＣにより続いて脂肪酸分析した。
モル；大体34.5ミリモル)およびグリセロール(1.56g；分子量92.1g/モル；17.3
ミリモル)に、固定したムコールミエヘイリパーゼ（ノボ社のリポチーム、1.0g)
を添加した。該混合物を1.333〜13.33Paの持続した真空下で磁気攪拌器の熱板上
で40℃で温和に攪拌した。反応の進行中に生成した揮発性の水は液体窒素で冷却
したトラップ中に連続的に凝縮した。滴定を用いて反応の進行を監視した。選択
した時間後に、反応は濾過により酵素を分離することによって中断した。分別は
シリカゲル上の分取ＴＬＣにより行ない、各々の脂質フラクションは標準法での
メチル化後にＧＬＣにより続いて脂肪酸分析した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】 133.3〜2666Paの範囲のより高い圧力で、実施例７におけるのと同じニシン油
を用いてしかも16時間の一定反応時間を用いる以外は実施例１で用いたのと同じ
反応条件下で17種の相異なるリパーゼまたはリパーゼ製剤を試験した。滴定を用
いて転化の程度を監視した。グリセリド混合物は、若干の活性を示す場合には分
取ＴＬＣによって残留遊離脂肪酸から分離され、２種の得られるフラクションの
脂肪酸の組成はＧＬＣにより測定した。結果を以下の表８に示す。
を用いてしかも16時間の一定反応時間を用いる以外は実施例１で用いたのと同じ
反応条件下で17種の相異なるリパーゼまたはリパーゼ製剤を試験した。滴定を用
いて転化の程度を監視した。グリセリド混合物は、若干の活性を示す場合には分
取ＴＬＣによって残留遊離脂肪酸から分離され、２種の得られるフラクションの
脂肪酸の組成はＧＬＣにより測定した。結果を以下の表８に示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】実施例９（比較例） 1.333〜13.33Paのかなり高い真空を用いる以外はリパーゼの幾つかについて実
施例８を反復した。結果を以下の表９に示す；
施例８を反復した。結果を以下の表９に示す；
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】実施例13 7.1％のＥＰＡと29.4％のＤＨＡとを含有するマグロ油（496g）からの遊離脂
肪酸と、グリセロール（79.9g）とＭＭＬ(25g)とを用いて、実施例１を再び反復
した。68.3％の転化率が4.5時間後に得られた。グリセリドの混合物は9.0％のＥ
ＰＡと11.2％のＤＨＡとを含有し、残留遊離脂肪酸は4.1％のＥＰＡと54.9％の
ＤＨＡとを含有した。反応混合物は0.3Paの真空下にレイボールド(Leibold)KD1-
4蒸留器（レイボールド社、独国）を用いて短路蒸留に誘導した。ガス抜きは60
℃で行ない、予備蒸留は90℃で行なった〔90℃での蒸留はわずか6.2％のＤＨＡ
の損失を生じた〕。予備蒸留からの残渣を140℃で蒸留した。結果を表13に例証
した。
肪酸と、グリセロール（79.9g）とＭＭＬ(25g)とを用いて、実施例１を再び反復
した。68.3％の転化率が4.5時間後に得られた。グリセリドの混合物は9.0％のＥ
ＰＡと11.2％のＤＨＡとを含有し、残留遊離脂肪酸は4.1％のＥＰＡと54.9％の
ＤＨＡとを含有した。反応混合物は0.3Paの真空下にレイボールド(Leibold)KD1-
4蒸留器（レイボールド社、独国）を用いて短路蒸留に誘導した。ガス抜きは60
℃で行ない、予備蒸留は90℃で行なった〔90℃での蒸留はわずか6.2％のＤＨＡ
の損失を生じた〕。予備蒸留からの残渣を140℃で蒸留した。結果を表13に例証
した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B064 AD85 CA21 CB26 CC03 CC05 CC06 CC09 CC21 CD06 CD07 CD25 CE01 DA01 DA10 DA20 4H059 BA13 BA33 BB05 BB07 BC06 BC48 CA20 CA36 CA72 CA73 EA21
Claims (17)
- 【請求項１】 遊離脂肪酸としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成
物をエステル化して、原料組成物と比較してこれらの脂肪酸の少なくとも１種で
富化された遊離脂肪酸フラクションを形成する、海産油組成物のエステル化方法
において、次の工程即ち前記の海産油組成物を、減圧下にしかも本質的に有機溶
剤無含有条件下にリパーゼ触媒の存在下でグリセロールと反応させる工程と、Ｅ
ＰＡおよびＤＨＡの少なくとも１種で富化された遊離脂肪酸フラクションを分子
蒸留により分離する工程とを包含してなる海産油組成物のエステル化方法。 - 【請求項２】 グリセロールと原料組成物中の遊離脂肪酸とのモル比は1：1
.5ないし1：3である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】 グリセロールと原料組成物中の遊離脂肪酸とのモル比は1：1
.5ないし1：2.5である請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】 グリセロールと原料組成物中の遊離脂肪酸とのモル比は約1
：2である請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】 エステル化反応は50トル以下の圧力で行なう請求の範囲第１
項〜第４項の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】 エステル化反応は10トル以下の圧力で行なう請求の範囲第５
項記載の方法。 - 【請求項７】 エステル化反応は1〜10トルの圧力で行なう請求の範囲第６
項記載の方法。 - 【請求項８】 エステル化反応は0.01〜1トルの圧力で行なう請求の範囲第
１〜第６項の何れかに記載の方法。 - 【請求項９】 エステル化反応は0.01〜1トルの圧力で行なう請求の範囲第
８項記載の方法。 - 【請求項１０】 エステル化反応は20℃〜40℃の温度で行なう請求の範囲第
１項〜第９項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１１】 前記のリパーゼ触媒を担体上に固定する請求の範囲第１項
〜第10項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１２】 前記のリパーゼ触媒はリゾムコール メイヘイ(Rhizomuco
r meihei）である請求の範囲第１項〜第11項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１３】 前記のリパーゼはＤＨＡと比較してＥＰＡのエステル化を
優先的に触媒する請求の範囲第１〜第12項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１４】 前記のリパーゼはＥＰＡと比較してＤＨＡのエステル化を
優先的に触媒する請求の範囲第１項〜第12項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１５】 前記のリパーゼは海産油組成物に存在する別の脂肪酸と比
較するとＥＰＡとＤＨＡとの両方のエステル化を優先的に触媒する請求の範囲第
１項〜第12項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１６】 分子蒸留は１×10-4〜１×10-2ミリバールの真空下に100
〜200℃で、より好ましくは140〜160℃で行なう請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１７】 リパーゼ触媒したエステル化又は遊離の脂肪酸を形成する
加水分解又はエステルを形成するアルコールでのエステル化の如き１個又はそれ
以上の追加の処理工程を、請求の範囲第１項のエステル化工程後に行ない得る請
求の範囲第１項記載の方法。
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