ES2292341B1 - "procedimiento para la purificacion de acido eicosapentaenoico (epa)". - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la purificación de ácido eicosapentaenoico (EPA). La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de EPA mediante reacciones enzimáticas de esterificación, caracterizadas por lipasas, a partir de extractos de pescado y microalgas y al uso del factor adimensional de eficacia para la cuantificación de la eficacia de las lipasas para concentrar y recuperar de forma simultánea un ácido graso poliinsaturado en la fracción de ácidos grasos libres.
Description
Procedimiento para la purificación de ácido
eicosapentaenoico (EPA).
La invención se encuadra en el sector técnico de
procesos de purificación de ácidos grasos en condiciones suaves,
más concretamente mediante reacciones enzimáticas.
Los PUFAs se dividen en familias según la
posición del primer doble enlace dentro de la cadena carbonada
contando a partir del metilo terminal. Las tres familias más
importantes tienen ese primer doble enlace en las posiciones 3, 6 ó
9, dando lugar a las llamadas series n-3,
n-6 y n-9 (o \omega3, \omega6 y
\omega9), respectivamente.
El grupo de ácidos grasos n-3 (o
\omega-3) está constituido por los ácidos
docosahexaenoico (DHA, 22:6n3), eicosapentaenoico (EPA, 20:5n3),
estearidónico (SA, 18:4n3) y (\alpha-linolénico
(ALA, 18:3n3). Todos son de origen marino, excepto el ácido
\alpha-linolénico, que se encuentra en los
aceites de vegetales superiores (Herold, P. M. y Kinsella, J. E.
(1986). Fish oil consumption and decreased risk of cardiovascular
disease: a comparison of findings from animal and human feeding
trials. Am. J. Clin. Nutr., 43: 566-598).
Desde hace tres décadas se conocen muchos de los
beneficios en el cuidado de la salud que supone incluir PUFAs en la
dieta, (18-21). Los ácidos grasos poliinsaturados
(PUFAS) n-3, como el ácido eicosapentanoico (EPA),
han suscitado gran atención debido al importante papel que juegan
en la salud humana. EPA ha sido usado para la prevención y el
tratamiento enfermedades circulatorias (Simopoulos, A. P.
Omega-3 fatty acids in health and disease and in
growth and development. Am. J. Clin. Nutr. 54:
438-463 (1991)) e inflamatorias (Ziboh, V. A.
\omega3 polyunsaturated fatty acid constituents of fish oil and
the management of skin inflammatory and scaly disorders. In
Simopoulos AP, Kifer RR, Martin RE, Barlow SM (eds), Health Effects
of \omega3 Polyunsaturated Fatty Acid in Seafoods. Word Rev.
Nutr. Diet. 66: 425-435 (1991)), el etil éster EPA
ha sido usado para el tratamiento de arterosclerosis e
hiperlipidemia desde 1991 en Japón (Shimada, Y. Application of
lipase reactions to separation and purification of useful
materials. Inform Biotechnology
12:1168-1174 (2001)). Las aplicaciones farmacéuticas
y clínicas requieren altas concentraciones de PUFAs (Carsten, M.,
Molina Grima, E., Robles Medina, A., Giménez Giménez, A. and Ibáñez
González, M.J.. Eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n3) from the
microalga Phaeodactylum tricornutum. J. Am. Oil Chem.
Soc. 73: 1025-1031 (1996)).
Como se observa en la tabla 1, las fuentes más
usuales de obtención de PUFAs n-3 son aceites
vegetales y aceites de pescado, (Nettleton, J. A. (1991).
Omega-3 fatty acids: comparison of plant and
seafood sources in human nutrition. Journal of the American
Dietetic Association, 91 (3): 331-337), y las
algas marinas. El EPA y el DHA se encuentran principalmente en
aceites de pescado: la caballa, el arenque y el salmón son
especialmente ricos en PUFAs n-3, (Rose, D. P. y
Connolly, J. M. (1999). Omega-3 fatty acids as
cancer chemopreventive agents. Pharmacology &
Therapeutics, 83 (3): 217-244). Algunas algas
también contienen cantidades importantes de estos ácidos.
Actualmente, la concentración de PUFAs a partir
de extractos de ácidos grasos libres (AGLs) se lleva a cabo en los
laboratorios por distintos procedimientos, como por ejemplo el
método de los compuestos de inclusión de urea y la cromatografia
líquida. Sin embargo, este método no preserva al máximo la
estabilidad de los PUFAS.
Anteriormente nuestro grupo de investigación
desarrolló un método de tres pasos para obtener un PUFA altamente
puro a partir de extractos de ácidos grasos libres (AGLs), dicho
método suponía el aislamiento del PUFA mediante cromatografia
líquida (Robles Medina, A., Giménez Giménez, A., García Camacho,
F., Sánchez Pérez, J.A., Molina Grima, E., y Contreras Gómez, A.
Concentration and purification of stearidonic, eicosapentaenoic and
docosahexaenoic acids from cod liver oil and the marine microalga
Isochrysis galbana. J. Am. Oil Chem. Soc. 72:
575-583 (1995); Ibáñez González, M.J., Robles
Medina, A., Molina Grima, E., Giménez Giménez, A., Carstens, M., and
Esteban Cerdán, L. Optimization of fatty acid extraction from
Phaeodactylum tricornutum UTEX 640 biomass. J. Am. Oil
Chem. Soc. 75: 1735-1740 (1998)), sin embargo,
la implantación industrial de este método es complicada debido al
alto coste del paso de la cromatografia.
Las lipasas son conocidas por tener una pequeña
actividad sobre los PUFAs (Yang, L. Y., Kuksis, A. and Myher, J. J.
Lipolysis of menhaden oil triacylglycerols and the corresponding
fatty acid alkyl esters by pancreatic lipase in vitro: a
reexamination. J. Lipid Res. 31: 137-148
(1990); Shimada, Y., Sugihara, A., Maruyama. T., Nagao, T.,
Nakayama, H., Nakano, H., and Tominaga, Y. Enrichment of arachidonic
acid: selective hydrolisis of a single-cell oil
from Mortierella with Candida cylindracea lipase. J. Am.
Oil Chem. Soc. 72: 1323-1327 (1995)), algunos
autores, enriquecen los ácidos grasos (AG) mediante hidrólisis
selectiva (Shimada, Y., Maruyama, K., Nakamura, M., Nakayama,
S.,
Sughihara, A. y Tominaga, S. Selective hydrolysis of polyunsaturated fatty acid-containing oil with Geotrichum candidum lipase. J. Am. Oil Chem. Soc. 72: 1577-1581 (1995)), esterificación selectiva (Hills, M. J., Kiewitt, I. y Mukherjee, K. D. Enzymatic fractionation of fatty acids: enrichment of \gamma-linolenic acid and docosahexaenoic acid by selective esterification catalyzed by lipases. J. Am. Oil Chem. Soc. 67: 561-564 (1990)) y alcoholisis selectiva (Shimada, Y., Sugihara, A., Yodono, S., Nagao T., Maruyama, K., Nakano, H., Komemushi, S. and Tominaga, Y. Enrichment of ethyl docosahexaenoate by selective alcoholysis with immobilized Rhizopus delemar lipase. J. Ferment. Bioeng. 84: 138-143 (1997); Shimada, Y., Maruyama, K., Sugihara, A., Baba, T., Komemushi, S., Moriyama, S. and Tominaga, Y. Purification of ethyl docosahexaenoate by selective alcoholysis of fatty acid ethyl esthers with immobilized Rhizomucor miehei lipase. J. Am. Oil Chem. Soc. 75: 1565-1571 (1998)).
Sughihara, A. y Tominaga, S. Selective hydrolysis of polyunsaturated fatty acid-containing oil with Geotrichum candidum lipase. J. Am. Oil Chem. Soc. 72: 1577-1581 (1995)), esterificación selectiva (Hills, M. J., Kiewitt, I. y Mukherjee, K. D. Enzymatic fractionation of fatty acids: enrichment of \gamma-linolenic acid and docosahexaenoic acid by selective esterification catalyzed by lipases. J. Am. Oil Chem. Soc. 67: 561-564 (1990)) y alcoholisis selectiva (Shimada, Y., Sugihara, A., Yodono, S., Nagao T., Maruyama, K., Nakano, H., Komemushi, S. and Tominaga, Y. Enrichment of ethyl docosahexaenoate by selective alcoholysis with immobilized Rhizopus delemar lipase. J. Ferment. Bioeng. 84: 138-143 (1997); Shimada, Y., Maruyama, K., Sugihara, A., Baba, T., Komemushi, S., Moriyama, S. and Tominaga, Y. Purification of ethyl docosahexaenoate by selective alcoholysis of fatty acid ethyl esthers with immobilized Rhizomucor miehei lipase. J. Am. Oil Chem. Soc. 75: 1565-1571 (1998)).
Diferentes autores han descrito que algunas
enzimas muestran acil-selectividad en la
esterificación de ácidos grasos con alcoholes. La esterificación
preferente de ácidos grasos ha permitido un enriquecimiento de
algunos PUFAs, como el ácido \gamma-linolénico
(GLA) o el ácido docosohexaenoico (DHA), en la fracción de ácidos
grasos sin esterificar. Algunos autores concentraron ácido
docosahexaenoico (DHA) y ácido \gamma-linoleico
mediante reacciones enzimáticas y estos AG son producidos
industrialmente mediante hidrólisis selectiva (Shimada, Y.
Application of lipase reactions to separation and purification of
useful materials. Inform Biotechnology
12:1168-1174 (2001)). Sin embargo la concentración
de EPA es muy dificultosa. En este sentido (Miller, C., Austin, H.,
Posorske, L. y González, J. Characteristics of an immobilized lipase
for the commercial synthesis of esters. J. Am. Oil Chem.
Soc. 65: 927-931 (1988)) muestra que la
actividad de la lipozima RMIM de Rhizomucor miehei, sobre un
AG disminuye en proporción a la cercanía de un doble enlace del AG
con el grupo carboxilo. Este factor explica porque el DHA (22:6n3)
es concentrado más fácilmente que el EPA (20:5n3), ya que el EPA
tiene un doble enlace en el átomo de carbono número 5 y DHA en el
número 4, contando a partir del grupo carboxilo terminal.
Wanasundara and Shahidi (Wanasundara, U.N. and
Shahidi, F. Lipase-assisted concentration of
n-3 polyunsaturated fatty acids in acylglycerols
from marine oils. J. Am. Oil Chem. Soc. 75:
945-951 (1998)) concentraron DHA y EPA por
hidrólisis de grasa de foca y aceites menhaden usando lipasas. El
incremento de la concentración de DHA del aceite de grasa de foca
de 7.6% a 24% (una relación de 3.2) y la concentración de EPA de
6.4% a 9.8% (una relación de sólo 1.5); estos resultados fueron
obtenidos después de 35 horas de hidrólisis, pero a las 80 h el
contenido en EPA disminuyó a 8.5%.
Recientemente, se está prestando atención a las
larvas de pescado como fuente alternativa de PUFAs (Sargent, J.;
McEvoy, L.; Estevez, A.; Bell, G.; Bell, M.; Henderson, J. y
Tocher, D. (1999a). Lipid nutrition of marine fish during early
development: current status and future directions. Aquaculture, 179
(1-4), 217-229; Sargent, J. R. y
Tacon, A. G. (1999b). Development of farmed fish: a nutritionally
necessary alternative to meat. The Proceedings of the Nutrition
Society, 58 (2): 377-383). La composición y
contenido de PUFAs n-3 en los aceites de pescado
varía ampliamente con la especie, tamaño, sexo y alimentación de
los pescados, así como con la zona de pesca y época del año. Los
costes de producción de estos extractos de pescado son bajos y
poseen un alto contenido de vitaminas liposolubles, como las
vitamina A y E (esta última tiene además efecto antioxidante) pero
los concentrados de PUFAs procedentes de aceites de pescado
presentan algunos problemas, como son su olor desagradable, la
presencia de ciertos compuestos químicos (metales pesados en forma
alquílica y de partículas) presentes en el medio marino, (Plakas, S.
M. y Guarino, A. M. (1986). Omega-3 fatty acids and
fish oils: Is the news all good? Proceedings of eleventh Annual
Tropical and Subtropical Fisheries Conference of the Americas. Texas
Agricultural Extension Service. Marine Service Program), y un
elevado contenido en colesterol (Cohen, Z. y Cohen, S. (1991).
Preparation of eicosapentaenoic acid (EPA) concentrate from
Porphyridium cruentum. J. Am. Oil Chem. Soc., 68:
16-19; Bajpai, P. y Bajpai, P.K. (1993).
Eicosapentaenoic acid (EPA) production from microorganisms: a
review. J. Biotechnol., 30: 161-183). Por otra
parte, su producción puede fluctuar con la pesca y, además, la
composición de estos aceites es bastante compleja, (a menudo
contienen de 40 a 50 ácidos grasos diferentes). Akoh y Hearnsberger
(Akoh, C. C. y Hearnsberger, J. O. (1991). Effect of catfish and
salmon diet on platelet phospholipid and blood clotting in healthy
men. J. Nutr. Biochem., 2: 329-333) advierten
que el efecto beneficioso de la incorporación en la dieta de PUFAs
n-3 procedentes de pescados marinos puede ser
contrarrestado por el alto contenido en sodio de algunos pescados;
el contenido de sodio en la dieta es uno de los factores más
importantes que contribuyen a los desórdenes en la circulación
sanguínea e hipertensión.
Existe la necesidad de encontrar un
procedimiento de purificación de EPA que sea rápido, poco
contaminante, con bajo contenido en compuestos químicos y por tanto
más saludables y de bajo coste económico que satisfaga las
necesidades de la industria farmacéutica y agroalimentaria.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de EPA mediante reacciones
enzimáticas de esterificación, catalizadas por lipasas, a partir de
extractos de pescado y microalgas, por lo que la presente invención
proporciona un procedimiento de purificación alternativo a los
procesos industriales que existen, resolviendo los problemas
expuestos en el estado de la técnica.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para la purificación de ácido eicosapentaenoico
donde dicha purificación se realiza mediante la concentración del
ácido eicosapentaenoico en la fracción de ácidos grasos libres
mediante la esterificación de un extracto lipídico catalizada por
lipasas.
En una realización particular de la invención
las lipasas son seleccionadas mediante la determinación del factor
adimensional de eficacia.
En otra realización particular de la invención,
el proceso de purificación de ácido eicosapentaenoico se realiza
opcionalmente con un disolvente, preferentemente el disolvente es
n-hexano.
En otra realización particular de la invención,
el extracto lipídico es un extracto de microalgas.
En otra realización particular de la invención,
el extracto lipídico es un extracto de pescado.
Un aspecto de la presente invención se refiere
al uso del factor adimensional de eficacia para la cuantificación
de la eficacia de los catalizadores para concentrar y recuperar de
forma simultánea un producto en una fracción.
En una realización particular de la invención,
el producto es un ácido graso poliinsaturado.
En una realización particular de la invención,
la fracción es la fracción de ácidos grasos libres.
En una realización particular de la invención,
los catalizadores son enzimas.
En una realización particular la invención se
refiere al uso del factor adimensional de eficacia para la
cuantificación de la eficacia de las lipasas para concentrar y
recuperar de forma simultánea un ácido graso poliinsaturado en la
fracción de ácidos grasos libres.
Cuando en la presente invención hablamos de
factor adimensional de eficacia, nos referimos al producto de los
factores adimensionales de concentración y de recuperación, sin
embargo, este factor adimensional de eficacia puede ser utilizado
para la comparación de la adecuación de dos procedimientos basados
en el mismo fundamento, es decir, este factor adimensional de
eficacia se puede aplicar a cualquier procedimiento de purificación
en el que la purificación esté basada en la selectividad del
elemento responsable de la purificación, así será para todo caso en
el que un determinado producto está compuesto de diferentes
sustancias de las cuales queremos purificar una sustancia
determinada y esta purificación se realiza discriminando o
favoreciendo de que la sustancia a purificar pase a una determinada
fracción con respecto a un total o a otra sustancia que quedaría en
otra fracción. De esta manera conforme avance el proceso
purificador, el producto a purificar irá pasando a una fracción
determinada a una velocidad mayor o menor que el resto de
productos.
La Figura 1 se refiere a la influencia del grado
de esterificación en el factor de eficacia.
La Figura 2 se refiere a la influencia de la
relación molar AGLs/alcohol láurico en el Grado de Esterificación
(GE) a diferentes temperaturas
La Figura 3 se muestra la relación del GE con la
intensidad de tratamiento por unidad de masa de sustrato
La Figura 4 y la Figura 5 muestran la influencia
del GE en el Factor de concentración (F_{C}) y el Factor de
recuperación (F_{R}) de EPA en la fracción de AGLs sin esterificar
y en el grado de recuperación.
La Figura 6 muestra la variación del Factor
adimensional de eficacia (F_{AE}) con el GE.
Se concentró EPA en una fracción de AGLs
mediante esterificación de una mezcla de AGLs que contenía EPA.
Como fuente de AGLs se utilizaron:
- \sqbullet
- extracto de aceite comercial EPAX4510TG (Pronota Biocare, Norway) que contenía un 43.1% de EPA (tabla 2).
- \sqbullet
- mezcla de AGL rica en EPA, preparada a partir de células húmedas o un liofilizado de microalgas marinas Phaeodactylum tricornutum (UTEX 640), para ello las células fueron crecidas en un fotobio-reactor tubular, cultivadas por centrifugación a 1800 xg, y guardadas a -8ºC hasta su uso. La mezcla de células de P. tricornutum fueron obtenidas en tres pasos:
- a)
- saponificación directa de las células de las microalgas
- b)
- extracción de insaponificables
- c)
- extracción de AGLs
Las lipasas usadas, se muestran en la tabla 3:
Lipasa D de Rhizopus oryzae, M de Mucor javanicus, AK
de Pseudomonas fluorescens (Amano Pharmaceutical Co., Japan),
Lipozima RMIM de Rhizomucor miehei, Novozime 435 de
Candida antarctica (Novo Nordisk, A/S, Bagsvaerd, Denmark),
EU-093 de Rhizopus oryzae,
EU-034 de Pseudomonas stutzeri, (Europe
Bioproducts, Cambridge, UK), QLMex de Alcaligines sp., y
OFex de Candida rugosa (Meito Sangyo, Japan). Las lipasas D,
M, AK, EU-093, EU-034, QLMex, y
OFex fueron proporcionadas como polvo y con un contenido mínimo en
agua de 10%. En algunos experimentos las lipasas fueron
inmovilizadas en Celite 545 AW (Fluka Chemie). Esta inmovilización
fue llevada a cabo en nuestro laboratorio según Soumanou et
al. (Herold, P. M. y Kinsella, J. E. (1986). Fish oil
consumption and decreased risk of cardiovascular disease: a
comparison of findings from animal and human feeding trials. Am.
J. Clin. Nutr., 43: 566-598). La relación de
Celite/lipasa fue 2.5:1 y 4:1 (w/w).
La esterificación de los AGLs se llevó a cabo
utilizando alcohol láurico (1-dodecanol; Panreac,
Barcelona, Spain).
La mezcla final resultante de la reacción de
esterificación contenía AGLs, ésteres láuricos (EL), alcohol
láurico, hexano, y una pequeña cantidad de agua.
Con el fin de determinar si las lipasas
empleadas poseían alguna especificidad hacia el EPA o el DHA, se
determinó el factor de concentración y el factor de
recuperación.
El factor de concentración (F_{C}) de cada
ácido graso se expresó como la relación entre la concentración de
EPA o DHA en los AGLs que quedan sin esterificar y la concentración
de EPA o DHA en el extracto de AGLs inicial. Este valor se ha
calculado como la media aritmética entre el factor de concentración
F_{C1}, obtenido directamente a partir del análisis (por
cromatografía en capa fina (TLC) seguida de cromatografia en gas
(GC)) de la fracción de AGLs y el factor de concentración
F'_{C1}, obtenido mediante el balance de materia realizado a
partir del análisis (por TLC seguida de GC) de la fracción de
ésteres láuricos formados. Se hizo la media de los dos y se obtuvo
un dato procedente de dos análisis independientes (disminución del
error analítico) y compensamos los efectos de la posible mayor
oxidación de los PUFAs en los AGLs que en los ésteres.
Por un lado, F_{C1} se calculó con la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde C_{EA} fue la concentración
de cada PUFA (EPA o DHA) en la fracción de los AGLs sin esterificar
(porcentaje en peso sobre el AGs totales, obtenido por TLC seguida
de GC) y C_{EA0} fue la concentración de cada PUFA en el extracto
de AGLs inicial (porcentaje en peso sobre el AGs totales, obtenido
por GC
directa).
Por otro lado, del resultado del balance,
F'_{C1} se calculó con la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde XA fue la fracción másica de
estos AGLs sin esterificar, C_{EL} fue el contenido en cada PUFA
en los ésteres láuricos (ELs) formados y X_{L} es la fracción en
peso de estos
ELs.
El factor de recuperación (F_{R}) se definió
como el porcentaje del ácido graso de interés (EPA o DHA)
recuperado en la fracción de AGLs sin esterificar con respecto al
contenido del mismo en la mezcla final de AGLs y ELs. Se calculó a
partir de la ecuación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En experimentos anteriores se observó que
ninguna de las lipasas ensayadas era totalmente selectiva hacia el
EPA y además esta selectividad parcial se manifestaba
"discriminando" al EPA en mayor o menor grado cuando era
esterificado por el alcohol, es decir, la selectividad hacia el EPA
era tanto mayor cuanto menor era la velocidad de esterificación del
EPA con respecto a la velocidad de esterificación de los demás
ácidos grasos.
La selectividad de una lipasa no tiene porque
depender directamente de factores como la temperatura, la adición
de agua, la cantidad de lipasa o el procedimiento de
inmovilización. Estos factores afectarán más bien a la actividad de
la lipasa. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que la
selectividad de la lipasa sí dependía de la composición de la
mezcla de ácidos grasos en cada momento de la reacción. Para una
lipasa con cierta "selectividad" hacia el EPA, a medida que
aumentaba el grado de esterificación mayor era la concentración de
EPA libre, por lo que mayor fue la velocidad de esterificación de
este ácido y menor el efecto de su "selectividad" con respecto
a él. Por lo tanto, para comparar la selectividad de varias lipasas
no bastó con hacer ensayos en unas condiciones experimentales
concretas con cada lipasa, sino que hicimos experimentos en los que
se observó la variación de los factores de concentración y
recuperación del EPA con el grado de esterificación.
Así pues, planificamos una serie de experimentos
en el mismo rango de condiciones experimentales con cada una de las
tres lipasas seleccionadas. Con diferentes cantidades de lipasa se
consiguió obtener diferentes Grados de Esterificación (de los que
dependía la "selectividad"). También se buscó la temperatura
de trabajo más adecuada y el efecto de la presencia y la ausencia
de agua al inicio de la reacción. Las lipasas habían sido
suministradas sin inmovilizar por lo que se consideró interesante
estudiar la posibilidad de inmovilizarlas de manera que pudiera
incrementarse su estabilidad y su facilidad de recuperación. Se
ensayaron variaciones del método de inmovilización para encontrar la
relación lipasa/soporte más adecuada.
El grado de esterificación (GE) se calculó como
la media aritmética de los porcentajes de ésteres formados medidos
por CCF y volumetría ácido-base.
Como se ha comentado anteriormente, una lipasa
tendrá un comportamiento más selectivo en unas condiciones
determinadas cuanto más concentre con una mayor recuperación del
producto en la fracción deseada. Una forma de que la concentración y
la recuperación se consideren en igual medida es adimensionar sus
valores de manera que queden comprendidos entre 0 (mínimo) y 1
(máximo).
En este sentido, para cuantificar la
concentración del EPA también se empleó el factor adimensional de
concentración del EPA (F_{AC}), que se calculó mediante la
siguiente ecuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde C_{EA} fue el porcentaje de
EPA en la fracción de AGLs sin esterificar y C_{EA0} fue el
porcentaje de EPA en el extracto de ácidos grasos inicial. Los
valores de F_{AC} estaban comprendidos entre 0 y 1, ya que,
cuando el EPA no se concentra en absoluto puesto que es
esterificado a igual velocidad que los demás ácidos grasos,
C_{EA}=C_{EA0} y F_{AC}=0; por otra parte, en un caso
hipotético en el que el EPA no se esterificara en absoluto y todos
los demás ácidos grasos quedaran totalmente esterificados
C_{EA}=100 y F_{AC}=1. La introducción de F_{AC} tenía como
único objetivo proporcionar un parámetro que midiera el grado de
concentración del EPA en la fracción de ácidos grasos y variase
entre 0 y 1, igual que el factor de recuperación, F_{R}. De esta
manera F_{AC} y F_{R} unificamos en un sólo factor que sirvió
para comparar los resultados obtenidos con las distintas lipasas y
ayudando a elegir la
mejor.
Así, para tener en cuenta ambos factores
(concentración y recuperación del EPA), se definió el factor
adimensional de eficacia (F_{AE}) como el producto de los factores
adimensionales de concentración y de recuperación, es decir:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este parámetro se empleó para cuantificar
simultáneamente la eficacia de las lipasas para concentrar y para
recuperar el EPA en la fracción de AGLs y por tanto la selectividad
presentada para unas condiciones determinadas.
Los efectos de las variables elegidas sobre los
grados de esterificación hicieron que la selectividad de la lipasa
cambiase. Así, el aumento del grado de esterificación se tradujo en
una menor velocidad del aumento de los factores de concentración y
una mayor velocidad en la disminución de los rendimientos de
recuperación (y por lo tanto menor velocidad de aumento del
F_{AE} que llegó a anularse para empezar a disminuir).
La selectividad fue la pendiente del F_{AE}
que fue máxima al comienzo de la reacción y la reacción avanzó
mientras la selectividad fue positiva (en el F_{AE} máximo). De
esta forma, se obtuvieron diferentes grados de esterificación,
determinándose la evolución del F_{AE} y, por tanto, de su
selectividad.
Para obtener la mezcla de AGLs en la cual se
concentró el EPA, las fracciones de AGLs y ésteres láuricos (EL)
fueron separadas por adición de una solución KOH para neutralizar
los AGLs. El EL fue extraído con n-hexano, y los
AGLs (en forma de sal potásica) fueron recuperados en la fase
acuosa. Esta fase acuosa fue entonces acidificada con una solución
de HCL y los AGLs fueron extraídos con n-hexano.
Los presentes ejemplos pretenden ser
ilustrativos de la invención y nunca limitativos.
\newpage
Ejemplo
1
Partimos de 170-1780 mg de AGLs,
222-4440 mg de alcohol láurico con una relación
molar AGLs/alcohol láurico de 1:1-1:4,
0-25 ml/g-sustrato de
n-hexano y 1.25-200 mg de
lipasa/g-sustrato. Todos los reactivos fueron
introducidos en un erlenmeyer y se incubaron a una temperatura
variable (30, 40 o 55ºC) y a 400 r.p.m. (incubador Shaking SWB 20,
Haake Mess-Tecnik Gmbh u. Co., Germany) durante
diferentes tiempos. La reacción fue parada por adición de
6-8 ml de hexano y la mezcla fue filtrada (glass
plate con una porosidad 4), la fase acuosa fue separada con un
embudo de decantación. El volumen de la fase hexanico fue ajustada
a 25 ml por adición de hexano. La mezcla final fue almacenada bajo
atmósfera de argón a -20ºC hasta su análisis.
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Ejemplo
2
Las lipasas fueron seleccionadas según la
actividad de esterificación o por la especificidad por los PUFAs
(tabla 3). Para ello se llevó a cabo una reacción de esterificación
de una mezcla de extracto comercial EPAX4510TG con alcohol láurico
con diferentes lipasas, para calcular el GE, F_{R}, F_{C} en la
fracción de AGLs. Las condiciones de reacción fueron: 178 mg de
AGLs, 222 mg de alcohol (relación molar 1:2), 40 mg de lipasa y 4
ml de hexano, durante
24 h.
24 h.
Los resultados de la tabla 3, muestran que la
mayoría de los factores de concentración (F_{C}) son mayores que
uno, esto indica que el EPA estaba concentrado en la fracción de
AGLs no esterificados. El mayor FC fue obtenido por esterificación
con la lipasa QLM (F_{C}, 1.60 a 40ºC), Lipasa D (F_{C}, 1.27 a
40ºC), Lipasa EU-093 (F_{C}, 1.30 y 1.47 a 40ºC y
55ºC, respectivamente), y Lipasa AK (F_{C}, 1.32 a 55ºC). Además
de la alta concentración de EPA, la recuperación (F_{R}) en la
fracción de AGLs es importante para la concentración efectiva de
EPA. Entre las lipasas que muestran un alto F_{C}, las que
presentan una mayor proporción de EPA fueron la Lipasa AK (84% a
55ºC) y la Lipasa D (66.7% a 40ºC).
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Ejemplo
3
Para comprobar la influencia que ejercía el
grado de esterificación en el factor de eficacia se llevó a cabo la
esterificación de una mezcla de AGLs de un extracto de EPAX4510TG
con alcohol láurico con la lipasa EU-093, Lipasa D,
y Lipasa AK bajo diferentes condiciones. Las condiciones de
operación para la Lipasa EU-093 y Lipasa D fueron:
178 mg de FFA, 222 mg de alcohol (relación molar 1:2), 4 ml de
hexano, 24 h; para obtener diferentes GE, los experimentos se
llevaron a cabo con lipasas inmovilizadas y nativas a 40 y 55ºC,
usando de 40-400 mg de lipasa. Las condiciones de
operación para la lipasa AK fueron 178-1780 mg de
AGLs, 222-4440 mg de alcohol, relación molar
AGLs/alcohol de 1:1, 1:2, 1:3 y 1:4, temperatura entre 40 y 55ºC; 0,
4 y 10 ml de hexano, 24 y 48 h y 4-320 mg lipasa
nativa o inmovilizada.
Los resultados se muestran en la figura 1, las
lipasas D y EU-093, muestran un comportamiento
similar y los valores máximos de F_{AE} no exceden de 0.2. Sin
embargo, la lipasa AK dio un F_{AE} más alto, siendo el máximo
mayor de 0.35, por lo tanto esta lipasa es la más conveniente entre
las tres enzimas para la concentración de EPA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La tabla 4 muestra la esterificación de las
mezclas de AGLs a partir de EPAX4510TG y del extracto obtenido a
partir de células de P. tricornutum con alcohol láurico
catalizada por las lipasas AK.
Aunque el contenido inicial de EPA fue
diferente, las producciones de recuperación fueron similares
(F_{R}). El F_{C} fue bastante diferente pero tiene valores como
el contenido de EPA en la fracción final de AGLs, que es bastante
parecido en los dos sustratos. Todo ello demuestra que cuando el
contenido de EPA en la mezcla inicial de AGLs es bajo, el F_{C} y
GE requeridos para alcanzar un alto contenido en EPA son altos, y
consecuentemente la intensidad de tratamiento. Además, la
concentración final y la recuperación de EPA no dependen de la
concentración de EPA en la mezcla inicial de AGLs. Estos resultados
demuestran que la selectividad de la lipasa por el EPA se basa en
el hecho de que el EPA es esterificado en una relación menor que
otros AGLs, y por tanto, cuando la concentración de EPA es alta, su
relación de esterificación también es alta, la selectividad de la
lipasa es baja y el GE necesario para lograr la concentración de
EPA es también baja.
\newpage
Ejemplo
5
Para determinar la influencia de la intensidad
de tratamiento en los distintos factores, se llevó a cabo una
esterificación de una mezcla de AGLs de un extracto celular de P.
tricornutum con alcohol láurico y catalizado por lipasa AK. Las
condiciones de reacción fueron: 178 mg de AGLs, 222 mg de alcohol
(relación molar 1:2) y 4 ml de hexano, todo ello a 40ºC, se
combinaron distintas cantidades de lipasa y durante distintos
tiempos. Los resultados se muestran en la tabla 5.
La figura 6, muestra la variación de F_{AE}
con el GE. El FAE alcanza su valor máximo a 78% de GE, la tabla 4
muestra que para obtener un GE óptimo (78%) se debe aplicar una
intensidad de tratamiento de aproximadamente 2400 mg de lipasa x h,
para esta intensidad de tratamiento, se deben dar unos valores de
F_{C} y F_{R}, de 3.1, 76% respectivamente. El valor de F_{C}
corresponde con una pureza de EPA de 71% en la fracción final de
AGLs.
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Ejemplo
6
Se Llevó a cabo la esterificación de una mezcla
de AGLs de un extracto de EPAX4510TG con alcohol láurico con la
lipasa AK, las condiciones de operación fueron 178 mg de AGLs, 40
mg de lipasa nativa, 4 ml de hexano, durante 24 h.
El mayor GE fue obtenido con una relación molar
de 1:2. Estos resultados están acorde con los obtenidos por otros
autores (21). El GE disminuye cuando el contenido en alcohol
aumenta lo cual puede ser atribuido a un incremento en la
resistencia de transferencia de la masa, ya que el alcohol láurico
aumentó la viscosidad de la mezcla de reacción obstruyendo la
transferencia de sustratos y productos a la lipasa.
La figura 2 muestra también que los experimentos
llevados a cabo a 55ºC dieron un mayor GE que a 40ºC. A mayor
temperatura se indujo un mayor riesgo de oxidación de los PUFAs y
una pérdida de solvente volátil como es el hexano, por lo que como
no es necesario alcanzar un GE del 55-70% (donde
F_{AE} es máximo) es aconsejable operar a 40ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se llevó a cabo la esterificación de una mezcla
de AGLs de un extracto de EPAX4510TG con alcohol láurico con la
lipasa AK, las condiciones de operación fueron 178 mg de AGLs, 222
mg de alcohol láurico (relación molar 1:2), 40ºC.
La presencia de un solvente orgánico es
importante en las lipasas que catalizan reacciones, sin embargo, es
interesante estudiar la posibilidad de eliminarlo para aplicaciones
para la industria alimentaria, natraceutica y de la salud.
La figura 3 muestra la relación del GE con la
intensidad de tratamiento por unidad de masa de sustrato, la cual
se fue variando mediante la adición de diferentes cantidades de
n-hexano. No se apreciaron diferencias entre el GE
obtenido con 4 y 10 ml de hexano (que corresponde con una relación
hexano/sustrato de 10 y 25 ml/g respectivamente), esto indica que
esta variable no tiene influencia en la cinética de esterificación a
este rango de concentración. Ademas también se ha observado que la
velocidad en la esterificación con solvente es ligeramente más
rápida que sin solvente, en la reacción sin
n-hexano un ligero descenso en la relación de
esterificación puede ser debido a un descenso en la relación de
transferencia de masa por un incremento en la viscosidad de la
mezcla de reacción (Nettletoi, J.A. (1991). Omega-3
fatty acids: comparison of plant and seafood sources in human
nutrition. Journal of the American Dietetic Association, 91
(3): 331-337).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
La figura 4 muestra que el F_{C} máximo es
alcanzado cuando el GE es del 75%, y la figura 5 muestra cuando la
recuperación de EPA disminuye según el GE aumenta: cuando el GE es
75% (corresponde con el valor máximo de F_{C}) sólo el 45% de EPA
es recuperado en la fracción de AGLs. Estos valores de F_{C} (o
F_{AC}) y F_{R} fueron usados para calcular el F_{AE} que se
muestra en la figura 1. El GE óptimo (dando el máximo valor de
F_{AE}) fue aproximadamente 60%.
La figura 4 y 5 muestran que cuando el GE
alcanza el 60%, F_{C} y F_{R} tienen valores de 1.7 y 72%
respectivamente. Este F_{C} corresponde con una concentración de
EPA en la fracción de AGLs de 73%.
La figura 3 muestra que este GE es obtenido con
una IT por unidad de masa de sustrato de aproximadamente 2000 mg
lipasaxh/g sustrato, por ejemplo en las siguientes condiciones
experimentales: 178 mg de EPAX4510TG, 222 mg de alcohol láurico
(relación molar 1:2), 4 ml de hexano, 40ºC, y un IT de 800 mg de
lipasa AKxh (800 mg de lipasa xh (178+222) mg de sustrato= 2000
mgxh/g de sustrato. Este experimento fue llevado a cabo cuatro
veces, los valores de GE, F_{C}, F_{R}, F_{AE} se muestran en
la tabla 4. Estos resultados corresponden con una mezcla final de
AGLs con una concentración EPA de 71-72%, donde
72-74% del EPA inicial fue recuperado.
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Claims (7)
1. Procedimiento para la purificación de ácido
eicosapentaenoico donde dicha purificación se realiza mediante la
concentración del ácido eicosapentaenoico en la fracción de ácidos
grasos libres mediante la esterificación de un extracto lipídico
catalizado por lipasas.
2. Procedimiento para la purificación de ácido
eicosapentaenoico según la reivindicación 1 donde las lipasas son
seleccionadas mediante la determinación del factor adimensional de
eficacia.
3. Procedimiento para la purificación de ácido
eicosapentaenoico según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde la reacción se hace en presencia de un
disolvente.
4. Procedimiento para la purificación de ácido
eicosapentaenoico según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el extracto lipídico es un extracto de
microalgas.
5. Procedimiento para la purificación de ácido
eicosapentaenoico según la cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el extracto lipídico es un extracto de pescado.
6. Un procedimiento para la cuantificación de la
eficacia de los catalizadores para concentrar y recuperar de forma
simultánea un ácido graso poliinsaturado en una fracción de ácidos
grasos libres según lo descrito en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- determinar la relación entre la concentración de ácido graso poliinsaturado en la fracción de ácidos grasos libres sin esterificar y la fracción de ácido graso poliinsaturado en la fracción de ácidos grasos inicial,
- b)
- determinar el porcentaje de ácido graso poliinsaturado recuperado en la fracción de ácidos grasos libres sin esterificar con respecto al contenido del mismo en la mezcla final.
7. Un procedimiento para la cuantificación de la
eficacia de los catalizadores para concentrar y recuperar de forma
simultánea un producto en una fracción según la reivindicación 6,
donde los catalizadores son enzimas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200600777A ES2292341B1 (es) | 2006-03-13 | 2006-03-13 | "procedimiento para la purificacion de acido eicosapentaenoico (epa)". |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200600777A ES2292341B1 (es) | 2006-03-13 | 2006-03-13 | "procedimiento para la purificacion de acido eicosapentaenoico (epa)". |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2292341A1 ES2292341A1 (es) | 2008-03-01 |
| ES2292341B1 true ES2292341B1 (es) | 2009-03-16 |
Family
ID=39081645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200600777A Active ES2292341B1 (es) | 2006-03-13 | 2006-03-13 | "procedimiento para la purificacion de acido eicosapentaenoico (epa)". |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2292341B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO312973B1 (no) * | 1999-02-17 | 2002-07-22 | Norsk Hydro As | Lipase-katalysert forestring av marine oljer |
| NO319194B1 (no) * | 2002-11-14 | 2005-06-27 | Pronova Biocare As | Lipase-katalysert forestringsfremgangsmate av marine oljer |
-
2006
- 2006-03-13 ES ES200600777A patent/ES2292341B1/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ESTEBAN, L. et al.: "Synthesis of Polyunsaturated Fatty Acid- Enriched Triglycerides by Lipase-Catalyzed Esterification", JAOCS(1998), vol.75, (10), pp.: 1329-1337, todo el documento. * |
| FU, X. et al.: "Selectivity of Fatty Acid Incorporation into Acylglycerols in Esterification Reactions using Rhizomucor miehei and Burkholderia cepacia Lipases", Food Res. Int. (2004), vol.37, pp.:651-657; ver pág. 653, secciones 2.4 y 2.5. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2292341A1 (es) | 2008-03-01 |
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