JPH05507100A

JPH05507100A - トリグリセリドおよびトリグリセリド組成物を調製する方法

Info

Publication number: JPH05507100A
Application number: JP91508124A
Authority: JP
Inventors: ハラルドソン，グドムアンダー　ジー．; スバンホルム，ハンネ; ヤルタソン，バルダー
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティー　ゼルスカブ; リュシ　ホーエフ
Priority date: 1990-04-18
Filing date: 1991-04-16
Publication date: 1993-10-14
Also published as: IS3693A7; EP0528844A1; CA2080578A1; US5604119A; DK95490D0; WO1991016443A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トリグリセリドおよびトリグリセリド組成物を調製する方法技術分野本発明は、リパーゼの存在下にグリセロールを遊離多不飽和酸またはそのＣ，− Ｃ，低級アルコールエステルでエステル化することによって、すべての３つの脂肪酸が０２゜、多不飽和脂肪酸（少なくとも３つの二重結合をもつ）である、トリグリセリドを調製する方法に関する０本発明は、また、高い含量の多不飽和脂肪酸を有するトリグリセリド組成物に関する。

前景技術多不飽和脂肪酸（ＰｔＪＦＡ）、例えば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のトリグリセリドは有益な医学的作用を有することは知られており、そして過去１０年以内に、非常な注目が高い含量のこれらの酸、とくに高い含量の分子中に３つのこのような酸をもつトリグリセリドを有するトリグリセリド組成物を製造する方法に向けられてきている。

遊離脂肪酸または低級アルキル（例えば、メチルまたはエチル）エステルの形態のＰＵＦＡは、高い純度で入手可能であり、そして高いＰＵＦＡ含量をもつトリグリセリドの調製に使用されてきている。

こうして、日本国特許出１ｉｉ　（Ｊ　Ｐ−Ａ）第６１−４３１４３号（日清製粉■等）および欧州特許（ＥＰ）第３００．８４４号（Ｒ，Ｆ、Ａｚａｒ　ｅｔａｌ、　）は、低級アルキルＰＵＦＡエステルとトリアセチンまたはトリブチリンとの化学的エステル交換反応を記載している。ナトリウムメチラートを触媒として使用し、そして真空を使用してこの反応において形成した低級アルキルアセテートまたはブチレートを除去した。前者は９０％のＰＵＦＡ含量をもつトリグリセリドの製造を記載している。

日本国特許出願（ＪＰ−Ａ）第６１−２４６１４６号（田水製薬）は、ＰＵＦＡ遊離酸をハロゲン化し、次いでＰＵＦＡアシルクロライドをグリセリンと反応させることを記載している。第１工程はオキサリルクロライドを使用して６５〜９０“Ｃにおいて４時間実施し、そして第２工程はキノリンまたはピリジンの存在下にクロロホルム中で還流下に数時間の間実施した。

前述の方法は取り扱いに特別の予防手段を必要とする、高度に反応性の化学物質を使用し、そしてこれらの反応性化学物質は不安定なＰＵＦＡのアシル基の一部分と反応し、そして各場合において生ずる反応混合物は複雑な精製を必要とする。

日本国特許出１１１（ＪＰ−Ａ）第６２−９１１８８号（日永オイル）は、自然の形態のまたは弱塩基性アニオン交換樹脂上に固定化された、位置的に特異的なリパーゼを使用して、グリセロールおよびＰＵＦＡの遊離酸またはエチルエステルからＰＵＦＡのグリセリドのリパーゼを触媒とする製造を記載している。水の添加は必要であると述べられている。反応後および未反応の脂肪酸の除去後、グリセリド混合物は最大８６％のグリセリドならびに少なくとも１４％のジグリセリド＋モノグリセリドを含有した。生成物は最大８５％の多不飽和脂肪酸ならびに少な（とも１５％の他の脂肪酸を含有した。

本発明の１つの目的は、攻撃的な化学物質の使用を回避して、低い含量のモノグリセリドおよびジグリセリドをもち、高い含量のＰＵＦＡ、ことに高い含量の分子中に３つのＰＵＦＡをもつトリグリセリドを有する、トリグリセリドを生成する、簡単な方法を提供することである。また、本発明の目的は、高いＰＵＦＡ含量をもつトリグリセリド組成物を提供することである。

発明の説明反応の間に水または低級アルコール除去することによって、位置的に非特異的なリパーゼを使用することによって、あるいはアクリル型の粒状のマクロポーラスの吸着性樹脂上に吸着により固定化されたリパーゼを使用することによって、トリグリセリドの収率を増加しかつモノグリセリドおよびジグリセリドの量を減少することができることが発見された。

したがって、本発明は、リパーゼの存在下にグリセロールを遊離多不飽和酸またはそのＣ，−Ｃ，低級アルコールエステルでエステル化することによって、すべての３つの脂肪酸がＣＺ　Ｄ　＊多不飽和脂肪酸（少なくとも３つの二重結合をもつ）である、トリグリセリドを調製する方法を提供する。本発明の第１の面において、この方法は水または低級アルコールを反応の間に蒸発により除去することを特徴とする。他の面において、この方法はリパーゼが位置的に非特異的であることを特徴とする。第３の面において、この方法はリパーゼをアクリ型の粒状のマクロ多孔質の吸着性樹脂上に吸着により固定化することを特徴とする。

゛本発明は、また、トリグリセリド分子の中の脂肪酸の少なくとも９５重量％（好ましくは少なくとも９８％）は多不飽和ｃ＋５−ｚｚ酸であることを特徴とする、トリグリセリド組成物を提供する。

発明の詳細な説明炙玉悠租１肌並本発明の方法は、３またはそれ以上の二重結合をもっＣ２゜。ＰＵＦＡ、例えば、エイコサベンクエン酸（ＩＥＰＡ、Ｃｉ。：、）およびドコサヘキサエン酸（Ｄ　ＨＡ、Ｃｚｚ　：　ｈ　）に適用することができる。

こうして、本発明方法を使用して、遊離酸または低級アルキルエステルが少な（とも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％のＰＵＦＡを含有する、反応混合物を使用することによって、高い含量ＰυＦＡをもつトリグリセリド組成物を生成することができる。これに関して、純粋なＥＰＡまたはＤＭＡがとくに急速に組み込まれることは驚くべきことであった。

好ましくは、ＰＵＦＡ反応成分は遊Ｍ脂肪酸、メチルエステルまたはエチルエステルである；これらは容易に入手可能であり、そして生ずる水、メタノールまたはエタノールが非常に揮発性であるかつ容易に除去される。

ＰＵＦＡの遊離脂肪酸またはエステルは既知の方法により調製することができ、そしであるものは高い純度で、例えば、ＥＰＡおよびＤＭＡは遊離酸およびエチルエステルとして９９％の純度で、出光石油化学会社■（日本国）から商業的に入手可能である。

ユバニ亙リパーゼは対象の温度および反応時間、例えば、４０〜８０″Ｃにおいて２４時間に対し、十分に熱安定性であるべきである。固定化されたリパーゼを使用することは好ましい。

本発明の１つの面は、位置的に非特異的なリパーゼを使用する。

非特異的なリパーゼの例は、カンジダｆｉ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ことにカンジダ・アンタルクチ力（Ｃ，ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼ（ＷＯ８８１０２７７５、ここに引用によって加える）、およびカンジダ・ルゴサ（Ｃｌｒｕｇｏｓａ）（また、カンジダ・シリンドラセア（Ｃ，ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）’として知られている〕から誘導されたものである。前記参考文献に記載されているカンジダーアンタルクチカ（Ｃ，ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼＡおよびリパーゼＢの両者を含有するリパーゼ調製物を使用することは好ましい。

位置的に特異的（１，３−特異的）リパーゼは、本発明のある実施Ｉ！様において使用することができる０例はフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ことにフミコラ・ラヌギノサ（Ｈ，ｌａｎｕｇｉｎ。

ｓ　ａ　（ＷＯ８９１０６２７Ｂ）から誘導されたリパーゼおよび組み換えフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リパーゼ（ＥＰ３０５．２１６）およびｌ、コル（Ｍｕｃｏ？）リパーゼ（ＥＰ１４０．５４２）である。

本発明の１つの面は、ＷＯ３９１０２９１６に従うアクリル型の粒状のマクロポーラスの吸着性（すなわち、非イオン性樹脂上に吸着により固定化されたリパーゼを使用する。

使用することができるリパーゼ調製物の１つの例は、ノボ・ノルディスク（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）Ａ／Ｓがらの５Ｐ３Ｂ２（ＷＯ８９１０２９１６に従い固定化された、カンジダ・アンタルクチ力（Ｃ，ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼＡおよびＢの混合物）である。

反庭矢註リパーゼの適当な量は、一般に、固定化されたリパーゼの使用により反応混合物の１ｇ当たり０．５〜ｌ０ＢＩＵ（典型的には１〜５Ｂ■Ｕ）（ＢＩＵ＝バッチエステル交換単位、参照ＷＯ３９１０６２７Ｂ）の範囲であるか、あるいは自然の（非固定化）リパーゼの使用により油の１ｇ当たり５０〜５００ＬＵ（ＬＵ＝リパーゼ単位、参照Ｗ０８８１０２７７５）の範囲である。

化学量論的比でまたは適当に過剰の（例えば、０〜５０％、ことに０〜２０％）のＰＵＦＡの酸またはエステルを使用して、２つの反応成分を使用することは好ましい。グリセロールの少なくとも９０％（とくに９５％より多い、ことに９８％より多い）のグリセロールがトリグリセリドに転化してしまうまで、反応を続けることは好ましい。

一般に、この方法においてｐＨ緩衝剤または有機溶媒を使用することは必要ではない。

４０〜８０″Ｃ１ことに６０〜８０’Ｃの温度は、−ａに、反応および蒸発に適当である。反応時間は、一般に、２４〜４８時間であろう。

アルコール　たは　の揮発性アルコールまたは水の蒸発による除去は、撹拌した楢から連続的に実施することができる１反応酸分はバッチ式、半パンチ式または連続的に添加することができる。リパーゼを固定化する場合、それは反応後に分離し、そして再使用することができる。

あるいは、反応は２またはそれ以上の工程で実施することができ、そして蒸発は工程の間に実施することができる。各プロセスの工程は撹拌した槽において実施することができるか、あるいは固定化されたリパーゼは固定床で連続的に使用することができる。

蒸発は真空下に、例えば、２００Ｐａ以下、ことに２０Ｐａ以下最も便利に実施される。

実施例実施例１はぼ８５０のＥＰＡ　ＤＴ（Ａ　Ａ　るトｔグｌセ１ドの量カンジダ・アンタルクチ力（Ｃ，ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来の固定化されたリパーゼ〔ノボ・ノルディスク（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉ　ｓ　ｋ）Ａ／Ｓからの５Ｐ３８２　；活性はぼ３０ＢＩＵ／ｇ、湿気不含〕を、グリセロール〔シグマ社製の９９％；１．３７ｇ；１４゜９ミリモル〕および８７％のＰＵＦＡ　（遊離酸）！！縮物（５５％のＥＰＡおよび３２％のＤＨＡ；分子量３１１．０ｇ１モル；１４゜１ｇ、４５．３ミリモル）の混合物に添加した。この混合物を磁気撹拌機のホットプレート上で６５°Ｃにおいて０．１ｍｍ１ｇの連続的真空下でおだやかに撹拌した。

低級アルキルエステルの濃縮物を使用するとき、この反応の進行の間に生成した、揮発性の水または低級アルコールを液体窒素で冷却したトラップの中に連続的にａｍして入れ、これは乾燥した窒素またはアルゴンの雰囲気と真空を置換することにより反応を分離することによって、このプロセスの間に規則的に分離および秤量することができた。３０時間後、反応を停止し、ヘキサンを添加し、そして酵素を濾過により分離した。ヘキサンを回転蒸発器上で真空除去した０滴定を適用して、粗製の反応生成物の遊離脂肪酸含量を決定した（３％のＦＦＡ含量、９７％の組み込みに相当する、これは９１％のトリグリセリド含量に等しい）。

滴定の結果はラドロスキャン（ｌａｔｒｏｓｃａｎ）の研究により確証され、これは、有機相をｌ：ｌの水／エタノール溶液中の０゜２５モルの水酸化ナトリウムで数回洗浄することによって、生成物から脂肪酸を除去した後、９１％のトリグリセリドの含量を示した。

１００％純粋なトリグリセリドは調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりヘキサン中の１０％のエーテルで溶離して得られ、これはラドロスキャン研究により確証された０毛管ガス液状クロマトグラフィー（Ｃ，ＬＣ）分析は、もとのＰ　Ｕ　Ｆ　Ａ濃縮物と同一である脂肪酸組成物を示した。

次の方程式を使用して、重量の測定からグリセロールの中への脂肪酸の取り込み％を計した：取り込み％−１．７１・　〔水の重量／グリセロールの重量〕　・１００％これは次の方程式から推定した：取り込み％＝ｌ／３・　〔捕捉された水の当量数／使用したグリセロールの当量数〕・１００％−１／３・　〔水の重量／水の中位の重量／グリセロールの重量／グリセロールの中位の重量％〕　・１００％＝１７３・　〔水の重量／グリセロールの重量〕　・　〔グリセロールの中位の重置／水の中位の重量％〕　・１００％＝ｌ／３・　〔水の重量／グリセロールの重量〕　・［９２，１／１８．０］　・１００％＝１．７１・　〔水の重量／グリセロールの重量〕　・１００％次の結果が得られた：３０　１０３”　１０Ｂ＊　取り込みは捕捉された生成物の質量の測定により決定した。

最小の取り込みは、すべての湿分が固定化されたリパーゼから逃げたという仮定に基づいた。

＊本　質量の測定における不正確さのために、最小の取り込みは１００％の取り込みレベルを超過する。

実施例２はぼ６０〜７０％のＥＰＡ　ＤＨＡ　Ａ　るトリグリセ１　ドのへ袈実施例１の手順に詳細に従い、固定化されたリパーゼ５Ｐ３８２（１，１０ｇ；１０％の湿分含量）を使用し、これをグリセロール（１，ＯＯｇ、１０．９ミリモル）および６６％のＰＵＦＩＩ縮物（３８％　（７）　Ｅ　Ｐ　Ａ　オヨヒ２８　％０）　Ｄ　ＨＡ　；分子量３０９．５ｇ／％ル；１０．２ｇ、３３．０ミリモル）または５９％のＰＵＦＡ濃縮物（２９％のＥＰＡおよび３０％のＤＭＡ、分子量３０６．４ｇ１モル；１０．Ｉｇ；３３．Ｏミリモル）の混合物に添加した。

次の結果が得られた。

６　Ｂ９　１０８　７９　９７２４″１０６”　１２５　９０　１０９２８　１０６°　１２５　９０　１０９本　取り込みは捕捉された生成物の質量の測定により決定した。

実施例３９９ＧのＥＰＡ　Ａ　るトリグリセリドの量　＋１固定化されたリパーゼ５Ｐ３８２　（０，５０ｇ；湿気不合）を、グリセロール〔シダ？　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）からの９９％；０．４４ｇ；４．７８ミリモル］および遊離脂肪酸として９９％のＥＰＡ（分子量３０２．５ｇ１モル；４．４０ｇ、１４．５４ミリモル）の混合物添加した。この混合物を磁気撹拌機のホットプレート上で６５°Ｃにおいて０．５〜０．１ｍＨＨの連続的真空下におだやかに撹拌した。

この反応の進行の間に生成した揮発性の水を液体窒素で冷却したトラップの中に連続的に凝縮して入れ、これは乾燥した窒素またはアルゴンの雰囲気と真空を置換することにより反応を分離することによって、このプロセスの間に規則的に分離および秤量することができた。３０時間後、反応を停止し、ヘキサンを添加し、そして酵素を濾過により分離した。有機溶媒を回転蒸発器上で真空除去して、粗生成物をわずかに黄色がかった油（４，１８ｇ、９３％）として得られた。重量測定は１０５〜１０８％の組み込みを示したが、ＮＭＲスペクトルは９８％の組み込みを示し、これは４８時間後９９％に増加した。滴定を適用して、粗製の反応生成物の遊離酸含量を決定した（１％より少ないＦＦＡ含量、少なくとも９９％の組み込みに相当し、これは９７％のトリグリセリド含量に等しい）。この粗生成物をＨＰＬＣＯ中に直接導入し、ヘキサン中の１０％のエーテルで溶離すると、１００％純粋なトリグリセリドが得られ（３゜５１ｇ、ＨＰＬＣからの８４％の回収率、しかし７８％の全体の収率）、これはラドロスキャン研究により確証された。

（２５０ＭＨｚ’ＨＮＭＲ（Ｃ旦ｑ１□Σ：　σ５．４１−５．２６（ｍ、３１Ｈ，＝Ｃ−１１ａｎｄ−ＣＨｚ−ＣＨ−ＣＨｚ−）、４．３０　（ｄｄ、Ｊ　” ’１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝４．３４Ｈｚ、　２Ｈ，−ＣＨｔ−ＣＩ−ＣＬ−）。

４．１４（ｄｄ、Ｊ　”１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝５．９３１’ｌｚ、　２Ｈ，− ＣＨｚ−ＣＨ−ＣＨｚ−）、２．９０−２．７８（ｍ、　２４）１．＝Ｃ−ＣＨｘ−Ｃ＝）、　２．３３（ｔ、Ｊ　＝７．３４ＦＩｚ、２Ｈ，０ＯＣ−ＣＨｔ− ）、２．３２（ｔ、Ｊ　”＝７．３６Ｈｚ、４Ｈ，０ＯＣ−ＣＨｚ）、２．１５ −２．ＯＨｇｌ、　１２Ｈ，−ＣＨｚ−ＣＨｚ−Ｃ＝）。

１．７５４．６Ｈｍ、　６Ｈ１＝ＣＨ−ＣＦｌｚ−ＣＨ３）＋および０．９７ｐｐｍＣｔ、Ｊ　＝７．５２Ｈｚ、　９Ｌ４１、）、＋３虹琵紅堕■迂：δ１７２．９（ｓ）、　１７２．６（ｓ）、　１３２．０　（ｄ）、　１２８．９（ｄ）、１２８．７（ｄ）、１２８．５（ｄ）、１２８．２（ｄ）、１２Ｂ、Ｈｄ）、１２８．Ｈｄ）、１２８．０（ｄ）、１２７．８（ｄ）、１２７．０（ｄ）、６８．９（ｄ）、６２．Ｈｔ）、３３．５（ｔＬ　３３．３（ｔ）。

２６．４（ｔ）、２５．６（ｔ）、２５．６（ｔ）、２５．５（ｔ）、２４．７（ｔ）、２４．６（υ’＋　２０．５（ｔ）。

ａｎｄ　１４．２ｐｐ層（ｑ）　、　ｒＲに−トな液体）　：　ｖ　、、−３０２０（ｖｓ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）、　２９７０（ｓ、ＣＴｏ）、２９３５（ｓ、ＣＨｚ）、２８７５（ｓ、ＣＨｚ）、２８５０（ｗ、ＣＨｔ）、１７４５（ｖｓ、Ｃ＝Ｏ）ａｎｄ　１６４５ｃＩｌ−’（ｍｓ、Ｃ＝Ｃ）、ｍ／ｅ（Ｅｌ）　：９４５（Ｍ　”　、１００％）　；実測値９４４．６８７８４Ｃａ３ＨｗｚＯ＊の理論値９４４．６８９３９ａｍｕｌ　。

次の結果が得られた：６　９２　９Ｂ　９１１２　９５　ｌｏｔ　９６＊　取り込みは捕捉された生成物の質量の測定により決定した。

実施例４９９０のＤＨＡ　Ａ　るトリグ丁セリ′の　ｎ固定化されたリパーゼ５Ｐ３８２　（０，５０ｇ；湿気不合）を、グリセロール〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの９９％；０．４１ｇ；４．４５ミリモル〕および遊離脂肪酸として９９％のＤＨＡ（分子量３２８．５ｇ１モル；４．４３ｇ、１３．４８ミリモル）の混合物に添加した。この混合物を磁気撹拌機のホットプレート上で６，５°Ｃにおいで０．５〜Ｑ、ｌａｗ）ＩＨの連続的真空下におだやかに撹拌した。この反応の進行の間に生成した揮発性の水を液体窒素で冷却したトラップの中に連続的に凝縮して入れ、これは乾燥した窒素またはアルゴンの雰囲気と真空を置換することにより反応を分離することによって、このプロセスの間に規則的に分離および秤量することができた。３０時間後、反応を停止し、ヘキサンを添加し、そして酵素を濾過により分離した。有機溶媒を回転１発器上で真空除去して、粗生成物をわずかに黄色がかった油（４，３６ｇ、９５％）として得られた。重量測定は２４から７２時間まで一定に止まる１００〜１０６％の取り込みを示したが、ＮＭＲスペクトルは２４時間後９７％の取り込みを示し、これは７２時間後１００％に増加した。

この粗生成物をＨＰＬＣの中に直接導入し、ヘキサン中の１０％のエーテルで溶離すると、純粋なトリグリセリドが得られ（３，４６ｇ、ＨＰＬＣからの８０％の回収率、しかし７６％の全体の収率）、これはラドロスキャン研究により確証された。

［２５０Ｍｔ（ｚ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　：　σ５．４４−５．２５（ｓ＋、　３７Ｈ，−Ｃ−Ｆｌａｎｄ−ＣＨｚ−ＣＨ−ＣＨｚ−）、　４．３０　（ｄｄ、Ｊ　＝１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝４．３６Ｈｚ、　２Ｈ，−ＣＨｚ−ＣＨ−ＣＨｚ−）。

４．１５（ｄｄ、Ｊ　−１１，９０Ｈｚ、　Ｊ＝５．８９Ｈｚ、　２８．−ＣＨｚ−Ｃ）ｌ−ＣＨｚ−）、　２．９０−２．７９（ｍ、　３０１（、−Ｃ−ＣＨｚ−Ｃ＝）＋　２．３９−２．３８（ｍ、　ＡｚＢｚ、　１２Ｈ，＝ＣＨ−Ｃ４１ｚ−ＣＨｚ−Ｃ００Ｈ）、　２．１３−２．０２（Ｉｍ、６Ｈ，＝Ｃｔｌ−ＣＨｚＣＨｉ）、および０．９７ｐＨＩ（ｔ、Ｊ　＝７．５３Ｈｚ、　９Ｈ，−ＣＨ５）、”ＣＮＭＲ（ＣＤＣ１ｉ）　：δ１７２．５（ｓ）、　１７２．１（ｓ）、　１３２．０　（ｄ）。

１２９．５（ｄ）、　１２８．５（ｄ）、　１２８．３（ｄ）、　１２８．３（ｄ）、　１２８．２（ｄ）、　１２８．２（ｄ）。

１２８．０（ｄ）、　１２７．９（ｄ）、　１２７．８（ｄ）、　１２７．６（ｄ）、　１２７．０（ｄ）、　６９．０（ｄ）、　６２．２（ｔ）、　３４．０（ｔ）、　３３．８（ｔ）、２５．６（ｔ）、　２５．６（ｔ）、　２５．６（ｔ）、　２５．６０）。

２５．５（ｔ）、　２２．６（ｔ）、　２０．５（ｔＬａｎｄ　１４．２ｐｐｍ（ｑ）、ＩＲに−トな液体）：ｖ　、、、　３０２０（ｖｓ、Ｃ＝Ｃ−［＋）、２９７０（ｓ、　ＣＬ）、２９３０（３，ＣＨＩ）、　２８７０（Ｓ。

ＣＨｘ）、２８５０（ｗ、ＣＨｚ）、１７５０（ｖｓ、Ｃ＝Ｏ）ａｎｄ　１６５０Ｃ！ｌ−’（ＩＩｓ、Ｃ＝Ｃ）、ｍ／ｅ（Ｅｌ）　：　１１０２３（”　、１００％）；実測（Ｉ！１０２２．７３４０　ＣｂＪｗｓＯｉの理論値１０２２．７３６３　ａｍｕｌ。

次の結果が得られた：＊　取り込みは捕捉された生成物の質量の測定により決定した。

最小の組み込みは、すべての湿分が固定化されたリパーゼから逃げたという仮定に基づいた。

実施例５リパーゼ　るトリグリセリドｑ唐製固定化されたリパーゼ５Ｐ３８２　（９，３１ｇ１湿気不合）を、グリセロール（９，００ｇ；９７．７ミリモル）およびタラ肝臓油からの遊離脂肪酸（９％のＥＰＡおよび９％のＤＨＡ；分子量２８゜５０ｇ１モルｉ８４．Ｉｇ；２９５ミリモル）の混合物に添加した。

この混合物を磁気撹拌機のホットプレート上で６５”Ｃにおいて０９１ｍ［ＩＨの連続的真空下におだやかに撹拌した。この反応の進行の間に生成した揮発性の水を液体窒素で冷却したトラップの中に連続的に凝縮して入れ、これをプロセスの間に規則的に分離した。４８時間後、反応を停止し、そして有ｍ溶媒を使用しないで乾燥窒素雰囲気下に濾過により、焼結ガラスのフィルタープレートおよび窒素および真空ラインへの入口／出口を装備した存在均等化１斗の助けにより濾過を促進して、リパーゼを直接分離し、ここで濾過をテフロンキーのストップコックによりコントロールした。油をさらに分析のために集めた。

固定化されたリパーゼを反応器に再導入した。これを５回反復し、同一の固定化されたリパーゼを再使用した。

次の結果が得られた：５　９４　９Ｂ＊　４８時間後、捕捉された生成物の質量の測定により決定した。

浄書（内容に変更なり要約書全て三種の脂肪酸がＣｔ　Ｏ＊多不飽和酸（少なくとも３個の二重結合を有する）であるトリグリセリドを、リパーゼの存在下遊離多不飽和脂肪酸又はそのＣＩ４低級アルキルエステルを用いて、グリセロールをエステル化することにより調製する。トリグリセリドの収率は増加し、更にモノ−およびジグリセリドの量は、位置非特異性リパーゼを用いることにより、および／又はアクリルタイプの粉質のマクロポーラスな吸着剤樹脂に吸着させることにより、反応中に生じた水又は低級アルコールを除去することにより減少する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１０月１ｃｔ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．水または低級アルコールを反応の間に蒸発により除去することを特徴とする、リパーゼの存在下にグリセロールを遊離多不飽和酸またはそのＣ１−Ｃ４低級アルコールエステルでエステル化することによって、すべての３つの脂肪酸がＣ２０＋多不飽和脂肪酸（少なくとも３つの二重結合をもつ）である、トリグリセリドを調製する方法。
２．水または低級アルコールを真空下に２０Ｐａ未満で、好ましくは４０〜８０ ℃において除去する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
３．リパーゼは位置的に非特異的であることを特徴とする、リパーゼの存在下にグリセロールを遊離多不飽和酸またはそのＣ１−Ｃ４低級アルコールエステルでエステル化することによって、すべての３つの脂肪酸がＣ２０＋多不飽和脂肪酸（少なくとも３つの二重結合をもつ）である、トリグリセリドを調製する方法。
４．リパーゼがカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、好ましくはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃ，ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）から由来する、特許請求の範囲第３項記載の方法。
５．第１または２項におけるようにさらに特徴とする、請求の範囲第３又は第４項記載の方法。
６．リパーゼは固定化されている、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。
７．リパーゼをアクリ型の粒状のマクロポーラスの吸着性樹脂上に吸着により固定化することを特徴とする、リパーゼの存在下にグリセロールを遊離多不飽和酸またはそのＣ１−Ｃ４低級アルコールエステルでエステル化することによって、すべての３つの脂肪酸がＣ２０＋多不飽和脂肪酸（少なくとも３つの二重結合をもつ）である、トリグリセリドを調製する方法。
８．１〜５項のいずれかにおけるように特徴とする、請求の範囲第７項記載の方法。
９．反応混合物中の遊離脂肪酸またはそのエステルは少なくとも９０％の純度、好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９８％の純度である、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。
１０．緩衝剤または有機溶媒を使用しない、請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。
１１．反応時間は３０時間未満である、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法。
１２．多不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはこれらの組み合わせである、請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の方法。
１３．グリセロールに関して０〜５０％（好ましくは０〜２０％）の化学量論的過剰量の脂肪酸またはエステルを使用する請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の方法。
１４．グリセロールの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％がトリグリセリドに転化してしまうまで、反応を続ける、請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．反応成分の遊離酸またはエステルは遊離脂肪酸またはメチルエステルまたはエチルエステルである、請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の方法。
１６．トリグリセリド分子の中の脂肪酸の少なくとも９５重量％（好ましくは少なくとも９８％）は多不飽和Ｃ１■−２２酸であることを特徴とする、トリグリセリド組成物。１７．多不飽和酸はエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはこれらの混合物である、請求の範囲第１６項記載の方法。