JPH0672959A

JPH0672959A - エイコサペンタエン酸トリグリセリド及びその製造法

Info

Publication number: JPH0672959A
Application number: JP3133762A
Authority: JP
Inventors: Yoshiji Kosugi; 佳次小杉; Masaru Shiraki; 勝白木; Naoteru Azuma; 直輝東
Original assignee: BOOSOO YUSHI KK; Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: BOOSOO YUSHI KK; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1991-03-28
Filing date: 1991-03-28
Publication date: 1994-03-15
Anticipated expiration: 2012-04-23
Also published as: JP2602743B2

Abstract

(57)【要約】【目的】エイコサペンタエン酸トリグリセリドの提供
とその製造法にある。【構成】【化１】に示す化学構造式を有するエイコサペンタエン
酸トリグリセリド。エイコサペンタエン酸とグリセリン
とから成る基質を固定化リパーゼにより接触反応させる
と同時に該反応液の脱水処理を行うことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エイコサペンタエン酸
トリグリセリド及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ω−３系高度不飽和脂肪酸は、サ
バ、イワシなどの魚油等の海産食品に多く含まれ、これ
が人体に摂取され、コレステロールの低下、抗血栓症な
どに有用な物質として健康食品として利用され、医学的
な応用にも注目されているが、酸化され易く、変質、劣
化し、非常に高価なものである。又、そのエチルエステ
ルは知られているが、トリグリセリドより生理活性が劣
るとされている。ω−３系高度不飽和脂肪酸を摂取する
には、トリグリセリドが理想的であるとの報告がある。
（ＣａｒｏｌＭ．Ｈｏｊｅｎｓｋｉｅｔａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０８１
（１９９１）３３〜３８）更に一方、エイコサペンタエン酸、リノレン酸などのト
リグリセリド混合物のω−３系高度不飽和脂肪酸濃縮物
も公知であるが、オレイン酸、リノール酸などのω−６
系高度不飽和脂肪酸トリグリセリドが含まれているた
め、脂肪過多の患者には、純粋なω−３系高度不飽和脂
肪酸トリグリセリドが必要である。又、リパーゼによる
高度不飽和脂肪酸のグリセリド合成について検討され、
その研究報告がある。〔第２９回油化学討論会・油化学
研究発表会講演要旨集Ｐ１９２（１９９０）〕。これに
よれば、リパーゼＴＯＹＯ、リパーゼＯＦの２種類のリ
パーゼを夫々の酸素液に使用し、α−リイレン酸、エイ
コサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの各高度不
飽和脂肪酸単独とグリセリンとを各酵素と反応させてそ
の夫々のグリセリドを合成したものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来の
技術では、固定化リパーゼによりωー３系高度不飽和脂
肪酸のトリグリセリドを高濃度に収得することができな
かった。即ち、前記に報告されたグリセリドの合成法に
よっても、その固定化リパーゼを最適条件下においてさ
え、而もその生産物中に食用に適さない遊離脂肪酸を１
０〜２０％含んでいる。その上、リパーゼＴＯＹＯでは
２６〜３８％の、リパーゼＯＦでは１８〜３３％のトリ
グリセリドの合成率しか達成できず、これでは、そのト
リグリセリドを単品とすることができず、機能性食品そ
の他の分野に、例えば、医学用に、食品への添加物など
として利用する製品として得ることができない。特に、
ω−３系高度不飽和脂肪酸として代表的なエイコサペン
タエン酸のトリグリセリドを高収率に製造でき、又単離
することができることが望まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記従来の課
題を解決し、上記の要望を満足したもので、機能性食品
などとして極めて有効なエイコサペンタエン酸トリグリ
セリドを提供したもので、下記の化学構造式で示され、
且つ添付図面の図１及び図２に示す^−１ＨＮＭＲスペク
トラム及び図３に示すＦＴ一ＩＲスペクトラムを有す
る。

【０００５】

【化１】

【０００６】更に、本発明は、上記のエイコサペンタエ
ン酸トリグリセリドを高収率に得る製造法に係り、エイ
コサペンタエン酸とグリセリンとを所定の割合で混合し
て基質を調製し、該基質と固定化リパーゼとの接触反応
とその反応液の脱水処理とを同時に行うことを特徴とす
る。

【０００７】

【作用】本発明の上記物質は、エイコサペンタエン酸エ
チルエステルより吸収性が良好であった。本発明の上記
物質の製造法によれば、該基質を固定化リパーゼと反応
させると同時に脱水処理を行うので、７０％以上のエイ
コサペンタエン酸トリグリセリドを含む反応生成物が得
られるので、工業生産が可能となり、又、これから夾雑
物を除去して９９％の純度の該エイコサペンタエン酸ト
リグリセリドを得ることができる。

【０００８】上記の製造法において、該エイコサペンタ
エン酸トリグリセリドを高収率に得る好ましい条件は、
基質として、該エイコサペンタエン酸に対し９〜１１重
量％のグリセリンから成るものが好ましい。又、固定化
リパーゼの初期含水量は、１．３〜８．３％であり、該
基質の初期水分濃度は、約５０〜８０００ｐｐｍであ
り、反応温度は４０℃以上、一般に３０〜６０℃であ
る。又、脱水処理は、真空脱水方式又は乾燥不活性ガス
の通気方式で行い、これにより反応系内を１０００ｐｐ
ｍ以下の水分濃度の超微水系を保持するようにすること
であり、この場合、固定化リパーゼとして、ムコール属
又はキャンディダ属のリパーゼが特に最適である。尚、
上記の反応生成物からのエイコサペンタエン酸トリグリ
セリドの分離、精製は、該反応生成物を塩基性アルミナ
カラム或いはシリカゲルから成る液体クロマトクラフを
用い、夾雑物を除き、その溶出液を蒸発することにより
遂行され、純度９９％の精製品が得られる。

【０００９】

【実施例】次に本発明の実施例を詳述する。原料とし
て、従来法など所望の方法で単離した或いは市販のエイ
コサペンタエン酸とグリセリンを用意する。その両者の
配合割合は、通常、化学量論量又はその付近である。通
常エイコサペンタエン酸に対し９〜１１重量％のグリセ
リンを配合した基質を調製する。

【００１０】該基質に作用させる固定化リパーゼは、初
期含水量１．３〜８．３％が好ましく、又該基質の初期
水分濃度は、約５０〜８０００ｐｐｍが好ましい。固定
化リパーゼとしては、リパーゼＳＰ３８２（Ｃａｎｄｉ
ｄａ属リパーゼを固定化したもの）、リパーゼＡ（Ａｓ
ｐｅｒｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．）を固定化したもの、リ
パーゼＴＯＹＯ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖ
ｉｓｃｏｓｕｍ）を固定化したもの、ムコール属のリパ
ーゼ、例えば、リポザイムＩＭ６０（Ｍｕｃｏｒｍｉ
ｅｈｅｉのリパーゼを固定化したもの）などが使用でき
るが、好ましくは、ムコール属又はキャンディダ属のリ
パーゼを固定化したものである。該リポザイム及びリパ
ーゼＳＰ３８２はノボ社製のものであり、水分含有量が
１００ｐｐｍ以下で活性を維持できる。リパーゼの種類
によっては、レシチンやポリオールなどの存在下にリパ
ーゼを固定すれば、超微水系でも活性が維持できる。

【００１１】かくして、該基質を該固定化リパーゼに作
用させるのであるが、この場合、適宜の装置が使用でき
る。又、先に発明者が特願平２−３０７２１４号で提示
した「高酸価油の精製法」で用いた各種の装置が利用で
きる。即ち、その所望の装置を使用して、該基質を該固
定化リパーゼと接触反応させるが、この場合、同時にそ
の反応液の脱水処埋を行うことが重要であり、これによ
り約７０〜８０％の高含有のエイコサペンタエン酸トリ
グリセリドを合成することができる。

【００１２】この合成を確保するには、その脱水速度
は、該エイコサペンタエン酸の減少速度の１００．１％
以上になるように脱水し乍ら、反応液を固定化リパーゼ
に繰り返し接触させるようにすることにより、反応と脱
水処理を連続的に行うことが良い。この脱水処理を行う
には、真空脱水方式或いは乾燥不活性ガスの通気であ
る。而して、その反応系内を１００ｐｐｍ以下の水分濃
度に保持するように脱水処理を行うことが好ましい。

【００１３】尚、この場合の反応温度は、４０℃以上、
一般に３０〜６０℃の範囲とし、これにより、酵素反応
の効率性が特に良い。最適温度は４０〜６０℃である。
かゝる温度範囲で目的とする生産物、該エイコサペンタ
エン酸トリグリセリドの二重結合の移動などを防止する
ことができる。装置は、クローズト型連続製造装置が好
ましく、リアクター内の酸素を、窒素、アルゴン等の不
活性ガスで置換し、大気中の酸素が反応物質に触れない
ように、不活性ガス雰囲気下で反応させることが好まし
く、これにより、過酸化物価の上昇が防止される。

【００１４】次に、更に詳細な実施例につき説明する。［実施例１］容器中の大気を窒素で置換した反応容器
に、エイコサペンタエン酸０．３ｇとグリセリン０．０
３０５ｇ及び固定化リパーゼＳＰ３８２を０．０３ｇ加
え、１０ｍｍＨｇ程度まで真空乾燥し、６０℃で振とう
反応させた。エーテル・エタノールで反応を停止させ、
反応生成物をＧＰＣカラムを装備した高速液体クロマト
グラフで測定した。反応４６時間の該反応生成物には、
７５．２％のエイコサペンタエン酸トリグリセリドが得
られた。残りは、２２．３％のエイコサペンタエン酸ジ
グリセリド及び２．５％のエイコサペンタエン酸モノグ
リセリドであった。

【００１５】［実施例２］容器中の大気を窒素で置換し
た反応容器に、エイコサペンタエン酸１ｇとグリセリン
０．１ｇ、リポザイムＩＭ６０を０．０５ｇ加え、７５
０ｍｍＨｇ程度脱気し真空乾燥し乍ら、６０℃で振とう
反応した。５ｍｌのエーテル−エタノール（１：１）に
４滴の反応生成物液をとり反応を停止させた。該反応停
止させた反応生成物をＧＰＣカラムを装備した高速液体
クロマトグラフで測定した。反応時間４８時間の該反応
生成物には、８１％のエイコサペンタエン酸トリグリセ
リドが検出され、残りはエイコサペンタエン酸ジグリセ
リドであった。反応７２時間では、エイコサペンタエン
酸トリグリセリド８３％、エイコサペンタエン酸ジグリ
セリド１７％であった。［実施例３］容器中の大気を窒素で置換した反応容器
に、エイコサペンタエン酸０．５ｇとグリセリン０．０
５ｇ、リポザイムＩＭ６０を０．０５ｇ加え、７５０ｍ
ｍＨｇ程度脱気し真空乾燥し乍ら、４０℃で振とう反応
した。反応時間９４時間のサンプルには、７６％のエイ
コサペンタエン酸トリグリセリドが検出され、残りはエ
イコサペンタエン酸ジグリセリド２０％、エイコサペン
タエン酸４％であった。反応１９２時間では、エイコサ
ペンタエン酸トリグリセリド８３％、エイコサペンタエ
ン酸ジグリセリド１７％であった。

【００１６】一般に、このように本法の処理により、約
７０〜８５％のエイコサペンタエン酸トリグリセリドを
含有する反応生成物が得られ、夾雑物として大部分がエ
イコサペンタエン酸ジグリセリド、エイコサペンタエン
酸モノグリセリド、微量の過酸化物である。かゝる反応
生成物を下記のようにして９９％の高純度のエイコサペ
ンタエン酸トリグリセリドの精製品が得られる。

【００１７】上記の反応を停止させた反応生成物をエー
テルに溶かし、塩基性アルミナカラムから成る液体クロ
マトグラフにより該夾雑物を吸着除去する一方、エイコ
サペンタエン酸トリグリセリドを溶出し、その溶出液を
蒸散させて高純度の９９％の精製品を得た。或いは、該
反応生成物をヘキサンに溶かし、シリカゲルカラムから
成る液体クロマトグラフにより、該夾雑物を吸着させた
後、ヘキサンとエーテル（９５：５）混液で溶出させ、
その溶出液を蒸散させて９９％の高純度の精製品を得
た。

【００１８】次に、その精製法の実施例を詳述する。実
施例２で得られた反応生成物をジエチルエーテルに溶か
し固定化酵素を濾別した後、塩基性アルミナカラムにか
けた。塩基性アルミナカラムは、活性度を調節したアル
ミニウムオキシド９０（メルク製品番号１０７６）を
４ｇ充填したもので３本用意し、３度のクロマトを行つ
た。溶出液は、窒素を吹き込んでエーテルを飛ばし、ア
ルゴンガス中−６０℃で保存した。得られたエイコサペ
ンタエン酸トリグリセリドは、キャピラリーガスクロマ
トグラム（ＷＣＯＴＣＰ−Ｓｉｌ８８）及びＨＰＬＣ
カラム（ＳｈｏｄｅｘＧＰＣＫＦ−８０２３００
×３）にて純度が９９％以上であることを確認した。

【００１９】この精製品につき、^１ＨＮＭＲ（ＪＥＯＬ
ＪＮＨ−ＧＳＸ５００型）及びＩＲ分析（ＪＥＯＬ
ＪＩＲ−１００）を行った。その結果は図１及び図２及
び図３の如くである。即ち、図１示のＮＭＲスペクトル
のメインピークａ−ｈと図１示の化学結合との帰属関係
がエイコサペンタエン酸トリグリセリドと完全に一致す
ることが解る。ピークの大きさから判定される水素原子
数は、ｆ，ｇの大きさを４，０００として計算すると、
これも理論値とほぼ一致した。更に詳述すれば、エイコ
サペンタエン酸トリグリセリドのＣＤＣＬ_３を溶媒とし
た^１ＨＮＭＲではメインピークは図２示の如くである。
即ち、化学シフトδ５．３７，４．２９，４．１５，
２．８４，２．８０，２．３３，２．０８，１．６９，
０．９７ｐｐｍにピークがあり、それらの帰属は図１の
如くである。一方、ＮａＣｌ板に塗布したＦＴ−ＩＲス
ペクトルでは図３の如く、３０１２ｃｍ^−１にＣＨの吸
収、１７４５ｃｍ^−１にエステルＣ＝０の吸収、１６５
３ｃｍ^−１にＣ＝Ｃの吸収、１１４４ｃｍ^−１にＣ−０
の吸収があり、これらの存在が確認された。尚、プロト
ンピーク面積強度は、下記表１の通りであった。

【００２０】

【表１】

【００２１】表１より明らかな如く、ｆ＋ｇを基準とす
るとその他のピークは１〜３％理論値より弱い。積分強
度の理論誤差は、通常数〜５％以下と考えられるので、
この範囲は誤差の範囲内であることが判る。以上の測定
結果より、該精製品は、化１に示す構造式を有するエイ
コサペンタエン酸トリグリセリドであることを特定し
た。

【００２２】更に、該精製品は、下記の構造と理化学特
性を有する。即ち、その元素組成は、炭素、酸素、水素
である。ガスクロマトグラフィーのキャピラリーカラム
による溶出パターンより構成脂肪酸は、エイコサペンタ
エン酸のみである。又、高速液体クロマトグラフィーの
ＧＰＣカラム（ケルパーションカラム）による溶出位置
及びＮＭＲのプロトン強度と帰属から推定される構造式
より、分子量は９４５．４である。−４０℃においても
液体状態であり、ヘキサン、エーテル、アセトンに可溶
な無色透明な物質であり、塩基性アルミナカラムを素通
りするので、中性を示す脂肪である。シリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーのスポットは、ヨウ素蒸気下で褐色に
発色する。

【００２３】

【発明の効果】このように本発明により得られるエイコ
サペンタエン酸トリグリセリドは、精製品であるから、
エイコサペンタエン酸の生理機能の研究、コレステロー
ルの低下、抗血栓症などの循環器系疾病の予防、医学実
験用などに有効であり、又、更にその生埋的活性が解明
されることにより、医薬品としての利用の可能性を有
し、更に又、その所定量を食品などに機能性食品として
適確に添加でき、又必要に応じ、又、ωー６系高度不飽
和脂肪酸トリグリセリドとのバランスをとるなどに有用
であるなどの効果を有する。更に、本発明の製造法によ
れば、エイコサペンタエン酸とグリセリンの所定割合か
ら成る基質を固定化リパーゼにより反応させると同時
に、該反応液の脱水処理を行うようにしたので、著しく
高収率にエイコサペンタエン酸トリグリセリドを製造す
ることができる効果を有する。而して、かゝるエイコサ
ペンタエン酸トリグリセリドを高濃度に含有する反応生
成物が得られるので、これから夾雑物を分離し、生成す
ることが容易で、９９％の高純度の精製品が得られる効
果を有する。更に、上記の製造法において、基質として
該エイコサペンタエン酸に対し９〜１１重量％のグリセ
リンを配合した基質を使用し、固定化リパーゼにより、
特に、ムコール属又はキャディダ属のリパーゼにより、
３０〜６０℃の温度で反応させると共に脱水処理を反応
系内が１００ｐｐｍ以下の超微系を維持するように行う
ときは、上記の高収率の生産が適確に得られ、又その精
製法として、液体クロマトグラフによる夾雑物の除去す
る一方、該エイコサペンタエン酸トリグリセリドの溶出
を行うとき、高能率に９９％の精製品が得られる効果を
もたらす。

【図面の簡単な説明】

【図１】及び

【図２】エイコサペンタエン酸トリグリセリドの^１Ｈ
ＮＭＲスペクトラム及びそのメインピークの帰属を表す
図である。

【図３】エイコサペンタエン酸トリグリセリドのＦＴ
−ＩＲスペクトラムの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者白木勝茨木県つくば市東１丁目１番３号工業技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者東直輝千葉県船橋市日の出２丁目17番１号ボーソー油脂株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記化１に示す構造式で示されるエイコ
サペンタエン酸トリグリセリド。【化１】
【請求項２】図１及び図２に示す^１ＨＮＭＲスペクト
ラム及び図３に示すＦＴ−ＩＲスペクトラムを有する請
求項１記載のエイコサペンタエン酸トリグリセリド。
【請求項３】エイコサペンタエン酸トリグリセリドと
グリセリンとを所定の割合で混合して基質を調製し、該
基質と固定化リパーゼとの接触反応とその反応液の脱水
処理とを同時に行うことを特徴とするエイコサペンタエ
ン酸トリグリセリドの製造法。
【請求項４】請求項３記載の製造法で得られたエイコ
サペンタエン酸トリグリセリドを高濃度に含有する反応
生成物に対し夾雑物の除去と精製処理を行うことを特徴
とするエイコサペンタエン酸トリグリセリドの製造法。
【請求項５】該基質は、エイコサペンタエン酸と該エ
イコサペンタエン酸に対し９〜１１重量％のグリセリン
とから成る請求項３記載のエイコサペンタエン酸トリグ
リセリドの製造法。
【請求項６】該固定化リパーゼの初期含水量は、１．
３〜８．３％であり、該基質の初期水分濃度は、約５０
〜８０００ｐｐｍであり、反応温度は４０℃以上、一般
に、３０〜６０℃であり、又、該反応液の該脱水処理
は、真空脱水方式又は乾燥不活性ガスの通気方式で行
い、反応系内を１００ｐｐｍ以下の水分濃度の超微水系
を維持するようにすることを特徴とする請求項３記載の
エイコサペンタエン酸トリグリセリドの製造法。
【請求項７】該固定化リパーゼは、ムコール属又はキ
ャンディダ属のリパーゼを固定化したものである請求項
３又は６記載のエイコサペンタエン酸トリグリセリドの
製造法。
【請求項８】該反応生成物の夾雑物の除去、精製処理
は、塩基性アルミナカラム或いはシリカゲルから成る液
体クロマトグラフによる夾雑物の吸着と溶剤による該エ
イコサペンタエン酸トリグリセリドの溶出、溶出液の蒸
散を行うエイコサペンタエン酸トリグリセリドの製造
法。